多功能基因递送系统促进内皮细胞增殖

白凌闯; 赵静; 冯亚凯

doi:10.7536/PC180621

化学进展 ›› 2019, Vol. 31 ›› Issue (2/3) :300-310 DOI: 10.7536/PC180621

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多功能基因递送系统促进内皮细胞增殖

白凌闯 ¹ ,
赵静 ¹ ,
冯亚凯 ¹^,²^,^**

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Multifunctional Gene Delivery Systems to Promote the Proliferation of Endothelial Cells

Lingchuang Bai ¹ ,
Jing Zhao ¹ ,
Yakai Feng ¹^,²^,^**

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摘要

由于自体血管供应不足,人工血管在心血管疾病的临床治疗中发挥着非常重要的作用。人工血管由于表面缺乏活性内皮层,经常面临术后再狭窄等问题,严重限制了其在临床中的应用。人工血管内皮化能够提高其血液相容性并维持其长期通畅率。大量研究表明,多功能基因递送系统可以促进血管内皮细胞增殖,从而实现人工血管快速内皮化。近年来,功能多肽和阳离子聚合物为开发低毒且高效的多功能基因递送系统提供了有效途径。本文详细介绍了目前用于血管内皮细胞基因转染的功能多肽和聚阳离子基因载体,重点阐述了促进内皮细胞增殖的多功能逐级靶向基因递送系统的研究进展,对采用基因转染方式促进人工血管快速内皮化进行了分析和展望。

Abstract

Artificial vascular grafts play an important role in the clinical treatment of cardiovascular diseases due to the lack of autografts. Artificial vascular grafts, especially for small-diameter artificial vascular grafts, usually encounter the problems such as in-stent restenosis, thus limiting their application in clinical treatment. Endothelialization of artificial vascular grafts can improve their hemocompatibility and maintain their long-term patency. It has been confirmed that multifunctional gene delivery systems can promote the proliferation of vascular endothelial cells(ECs) and help achieve the rapid endothelialization of artificial vascular grafts. Recently, functional peptides and cationic polymers have provided an effective approach for the development of low-toxic and highly efficient multifunctional gene delivery systems. In this review, functional peptides, target genes and polycationic gene carriers used in the transfection of vascular ECs are detailedly introduced. Based on polycationic gene carriers, the current development of multifunctional step-by-step targeting gene delivery systems for promoting the proliferation of ECs and endothelialization are highlighted. Finally, some perspectives on achieving rapid endothelialization via gene transfection are also presented.

Graphical abstract

关键词

人工血管 / 内皮化 / 基因递送系统 / 功能多肽 / 基因载体

Key words

artificial vascular graft / endothelialization / gene delivery system / functional peptide / gene carrier

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白凌闯, 赵静, 冯亚凯. 多功能基因递送系统促进内皮细胞增殖[J]. 化学进展, 2019, 31(2/3): 300-310 DOI:10.7536/PC180621

Lingchuang Bai, Jing Zhao, Yakai Feng. Multifunctional Gene Delivery Systems to Promote the Proliferation of Endothelial Cells[J]. Progress in Chemistry, 2019, 31(2/3): 300-310 DOI:10.7536/PC180621

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1 Introduction

2 Functional peptides

3 Polycationic gene delivery systems

4 Targeting gene delivery systems

5 Multifunctional step-by-step targeting gene delivery systems

6 Conclusion and outlook

1 引言

心血管疾病和外周血管疾病是全球发病率和死亡率高的疾病,严重威胁着人类健康^[1]。目前,利用自体血管进行心脏搭桥手术是一种较为有效的临床治疗手段,尤其是自体隐静脉和乳内动脉移植成为治疗血管闭塞的黄金标准^[2]。然而,自体血管来源有限,难以满足临床需求。因此,人工血管在心血管疾病的临床治疗中受到广泛关注,如聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)和膨体聚四氟乙烯(ePTFE)人工血管。但是,人工血管表面缺乏活性内皮层,当其作为小口径血管(直径< 6 mm)使用时,容易引起炎症反应以及血管平滑肌细胞的过度增殖和迁移,进而导致血栓形成、内膜增生以及术后再狭窄等^[3],最终导致血管移植的失败^[4]。

为了促进人工血管表面的快速内皮化,研究人员尝试了各种各样的方法,其中两种主要方法是表面形貌调控和表面功能改性^[5,6,7]。人工血管的表面微观形貌能够调节血管细胞的迁移,从而影响内皮化进程^[8]。人工血管表面功能化改性对于血液相容性、细胞相容性及内皮化起着决定性作用^[7]。在人工血管表面固定生物活性大分子^[9]、利用层层自组装技术构建仿生涂层^[10]、构建一氧化氮(NO)释放系统^[11]是人工血管表面改性的常用方法。

捕获性配体如多肽、抗体、磁性分子、寡糖、适配体等常用来调节人工血管表面的细胞黏附和增殖^[7,12~14]。将内皮细胞特性结合分子固定在人工血管表面可以明显促进内皮细胞的黏附和铺展。Qiao等^[15]利用疏水蛋白将可以特异性结合内皮细胞的抗CD31抗体固定到聚己内酯(PCL)支架表面,研究结果表明疏水蛋白和抗CD31抗体共同修饰的PCL支架对血管内皮细胞黏附性能提高约15倍。Masters等^[16]将透明质酸(HA)寡糖固定到聚氨酯(PU)表面,提高了血液相容性,而且促进了内皮细胞的黏附和生长。此外,血管内皮生长因子(VEGF)、促血管生成素(Ang)、成纤维细胞生长因子(FGF)等血管生成因子在内皮化进程中也发挥着重要作用^[17]。但是,这些生物活性分子稳定性差,在血管组织工程领域的应用受到一定限制。

此外,基因治疗也是一种促进人工血管快速内皮化的方法。该方法利用外源性目的基因转染内皮细胞,促进其增殖和迁移,并快速形成新生内皮层。然而,外源性目的基因在体内易被核酸酶降解,因此,通常需要低毒、高效的基因载体将目的基因递送到靶细胞中,使其发挥作用^[18]。

通常,基因载体携载目的基因构成基因复合物,它们需要通过细胞膜内吞作用进入细胞,经内涵体/溶酶体逃逸,最终目的基因进入细胞核并成功表达^[19,20]。现有很多研究探索高转染效率、低细胞毒性和无免疫原性的基因载体^{[21,22,23,24,25,26,27,28]},但是,用于血管内皮细胞选择性转染的基因载体研究仍然面临一系列挑战。首先,基因载体对血管内皮细胞膜和细胞核缺乏靶向性,不能被血管内皮细胞选择性吸附和摄取,因此目的基因进入细胞核几率很低;其次,基因载体的内涵体逃逸能力差,导致基因很容易被内涵体/溶酶体降解,从而造成转染效果很差。因此,血管内皮细胞摄取不足、内涵体/溶酶体逃逸能力弱和细胞核定位能力差造成内皮细胞转染效率低。结合功能多肽和聚阳离子聚合物的各自优点,构建多功能靶向基因递送系统有利于克服上述多种基因递送瓶颈,增强内皮细胞的转染能力。

利用基因促进内皮细胞生长和增殖能够有效促进人工血管的内皮化过程。Sun等^[29]利用负载有VEGF基因和紫杉醇的L-丙交酯与乙交酯共聚物(PLGA)纳米粒涂覆大孔316 L不锈钢冠状动脉支架,在小型猪体内移植一个月,该支架能够完全内皮化,并且避免了再狭窄。Yang等^[30]发现血小板衍生生长因子(PDGF-BB)基因和成纤维细胞生长因子(FGF-2)基因可以协同促进局部缺血组织的血管新生。Zhang等^[31,32,33]发现锌指核转录因子基因(ZNF580)过表达可以促进基质金属蛋白酶2(MMP2)和VEGF的表达,并有利于内皮细胞迁移和增殖。此外,ZNF580基因的过表达还可以通过eNOS/NO途径促使内皮祖细胞向内皮细胞分化并使其具有明显增强的血管化能力。ZNF580基因在血管组织工程领域具有广阔的应用前景。

基于此,本文介绍了用于提高基因载体转染效率的功能多肽,综述了多功能靶向基因递送系统促进内皮细胞增殖的最新研究进展,并对现阶段存在的问题及其应用前景进行了分析。

2 功能多肽

生理环境下,细胞表面受体与其配体之间的生物识别是调节细胞迁移和黏附的关键。整合素作为一类主要的细胞表面受体,是细胞表面与细胞外基质蛋白作用的主要区域,整合素-配体间的相互作用对于细胞的黏附、铺展和增殖都具有非常重要的作用^[34]。

RGD(Arg-Gly-Asp)肽是纤维黏连蛋白中最小的细胞粘附性多肽序列。RGD肽因其与多种β整合素(如α₅β₁、α_vβ₃和α_vβ₅)结合,不仅能够有效促进内皮细胞的黏附,也可促进平滑肌细胞和血小板的黏附^[35]。Chollet等^[36]将RGD肽接枝到PET人工血管表面,发现成骨细胞和内皮细胞在材料表面的黏附具有多肽接枝密度依赖性。随着多肽接枝密度的增大,细胞黏附性增强,并且有利于形成细胞黏着斑。然而,RGD肽缺乏特异性黏附内皮细胞的能力,需要寻找内皮细胞特异性黏附的多肽。

REDV(Arg-Glu-Asp-Val)肽是纤维黏连蛋白衍生的四肽,它可以特异性地结合α₄β₁整合素受体。此类受体在内皮细胞表面表达丰富,而在平滑肌细胞表面几乎不表达^[37]。为此,REDV肽以其对血管内皮细胞的高度选择性在生物材料表面改性领域应用广泛。Feng等^[38]将REDV肽、亲水性单体和抗菌性单体共同接枝到聚碳酸酯聚氨酯(PCU)表面,改性表面不仅具有良好的血液相容性和抗菌能力,而且可以增强内皮细胞的竞争性黏附,有利于其快速内皮化。Ji等^[39,40,41]研究证明REDV肽具有选择性黏附内皮细胞的能力。此外,Gao等^[42]在PCL表面构建REDV接枝密度梯度表面,该REDV梯度表面不仅选择性地黏附内皮细胞,而且可以促使其定向迁移,其迁移速度是空白对照组的两倍。

CAG(Cys-Ala-Gly)肽来源于Ⅳ型胶原蛋白,是近年才被发现的一种内皮细胞特异性多肽^[43,44]。它可以选择性地黏附内皮细胞,而且能够抑制平滑肌细胞的生长^[45]。Narita等^[46]利用CAG肽和PCL进行共混电纺,得到纤维膜,在体外无血清条件下,能够显著增强内皮细胞的黏附。将纤维膜进一步制备成小口径人工血管,在大鼠体内移植六周,其内皮化程度是不含多肽PCL组的1.3倍。Feng等^[45]将CAG肽接枝到聚乙二醇(PEG)修饰的PCU表面,高接枝密度(CAG肽10~18 pmol/cm²)对内皮细胞具有特异性选择黏附能力,同时,CAG肽和PEG共修饰PCU表面能够抑制血小板和血管平滑肌细胞的黏附,有利于材料表面的快速内皮化。

REDV和CAG肽不仅应用于生物材料表面改性,而且应用于内皮细胞靶向性基因载体。利用REDV和CAG靶向功能多肽修饰基因载体,可以增强基因载体对内皮细胞的特异性靶向能力,为设计制备低毒、高效靶向性载体提供了可行性。

理想的基因载体不仅需要能够特异性靶向内皮细胞、顺利实现内涵体/溶酶体逃逸,而且还需要具有细胞膜穿透能力和细胞核靶向能力。TAT-NLS多肽是一种细胞穿透肽(cell-penetrating peptide, CPP)和核定位信号肽(nuclear localization signal, NLS)的串联肽^[47]。TAT多肽可以与细胞膜发生作用,不仅可以介导治疗性粒子穿透细胞膜进入细胞,而且有助于内涵体/溶酶体逃逸^[48]。小尺寸粒子(<10 nm)可以通过核膜进入细胞核,而大尺寸粒子则难以通过核膜^[49]。NLS多肽具有优异的细胞核靶向能力,可以将大尺寸粒子转运进入细胞核。TAT多肽可以赋予基因载体细胞膜穿透能力和内涵体/溶酶体逃逸能力,而NLS多肽能够使基因载体具有细胞核靶向能力,增加基因载体在细胞核的富集。TAT-NLS多肽修饰的基因载体具有多重功能,从而有利于增强基因载体在靶细胞中的转染能力。

为了提高转染效率,基因递送系统需要具有对血管内皮细胞膜和细胞核逐级靶向功能,并且能够从内涵体/溶酶体中顺利逃逸。这些功能必须集成于一个基因载体,才能实现对血管内皮细胞的高效转染,从而促进人工血管快速内皮化。将促进内皮细胞生长的目的基因和上述功能多肽集成在一个纳米粒中,构建多功能基因递送系统,有利于特异性识别对血管内皮细胞及其高效转染。

3 聚阳离子基因递送系统

聚阳离子基因递送系统在基因治疗领域已应用广泛。阳离子聚合物包括聚乙烯亚胺(PEI)、聚L-赖氨酸(PLL)、聚酰胺-胺树枝状大分子聚合物(PAMAM)等^{[50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61]},常见阳离子聚合物的化学结构如图1所示。PEI因其具有较高的转染效率和独特的质子海绵效应,成为研究最为广泛的阳离子聚合物^[62,63]。PEI具有较高的电荷密度,可以有效压缩质粒DNA(pDNA)形成纳米粒子。此外,PEI在内涵体/溶酶体的酸性环境中容易发生质子化,有利于内涵体/溶酶体逃逸。PEI的转染效率与PEI的化学结构和分子量密切相关。高分子量PEI通常具有较高的转染效率,同时也伴随着较高的毒性。理想的PEI型聚阳离子基因递送系统不仅需要维持高转染效率,而且能够有效降低细胞毒性。

生物可降解聚合物修饰PEI,不仅能够降低PEI型聚阳离子基因载体的细胞毒性,而且能够使基因载体具有核-壳结构和生物可降解性^[64]。相对于PEI/pDNA或PEG-b-PEI/pDNA基因复合物,生物可降解性疏水内核可以增强PEI基因复合物的稳定性,并延长其体内循环时间^[64]。此外,Oh等^[65]制备出聚乙烯亚胺-b-聚(L-丙交酯)-b-聚乙二醇(PEI-b-PLA-b-PEG)三嵌段共聚物作为基因载体。体外研究结果表明,相对于PEI, 当氮磷比为16时,该基因载体表现出较高的转染效率,同时也具有相对较低的细胞毒性。Merkel等^[66]利用PLLA-PEI-PLLA和PLLA-PEG-PLLA制备出三层生物可降解胶束作为基因载体,该基因载体具有优异的稳定性,并且可以在弱酸性环境(pH=4.5)中将90%所负载的基因快速释放出去。此外,Li等^[67]将负电性低密度脂蛋白(LDL)通过静电相互作用包裹PEI/pVEGF制得基因复合物,LDL的引入提高了基因载体的生物相容性和细胞亲和能力。该基因载体在海拉细胞和内皮细胞中均表现出较低的细胞毒性,而且即使在有血清存在条件下,仍然表现出较高的转染效率。

Feng等^{[68,69,70,71,72,73]}在利用PEI和生物可降解聚合物制备基因载体方面开展了许多研究。他们以PLGA为疏水核心,考察了疏水链段长度对基因载体转染效率的影响,结果发现,当疏水链段分子量高于6 kDa时,基因载体表现出较高的转染效率^[70]。然而,脂肪族聚酯类疏水核心通常会产生酸性的降解产物,容易诱发炎症反应。聚缩肽是α-羟基酸和α-氨基酸的共聚物,此类聚合物主链上含有酯键和酰胺键,其降解产物有利于维持生理环境中酸碱度的稳定,避免炎症反应的发生。在此基础上,Feng等^[71]以3(S)-甲基-吗啉-2,5-二酮(MMD)、L-丙交酯、乙交酯为原料,制备出具有不同疏水核心的PEI阳离子基因载体,其合成过程如图2所示。他们研究了疏水核心对pZNF580可控释放行为和内皮细胞转染效率的影响。研究结果表明,这些基因载体有效地将pZNF580基因递送入内皮细胞,并降低细胞毒性。通过调节疏水核心的降解能力,可以使pZNF580基因的体外释放时间长达25天。

PEI型阳离子基因载体的细胞毒性和转染效率是相互矛盾的两个方面,高转染效率往往伴随着较高的细胞毒性,这是一个关键技术挑战。为了使基因载体的细胞毒性和转染效率方便可调,Feng等^[72]以L-丙交酯和MMD共聚物(PLMD)为疏水核心,分别制备出mPEG-b-PLMD和PEI-b-PLMD-b-PEI两种嵌段共聚物,并将它们自组装得到复合胶束载体,通过调节复合胶束中两种聚合物的质量比例可以较为方便地调控转染效率和细胞毒性,从而实现基因载体高转染效率和低细胞毒性之间的平衡。在此基础上,为了进一步增加复合胶束疏水核心的稳定性,Feng等^[73]制备出具有星型结构的两亲性嵌段共聚物作为疏水核心,并以此制备的复合胶束作为基因载体,该载体对内皮细胞表现出较强的转染能力。

4 靶向性基因递送系统

内皮细胞对外来载体具有高度敏感性,不利于外源性基因的细胞转染,是最难转染的细胞之一。基因被递送到靶向组织后,基因转染主要取决于细胞的识别和摄取。细胞摄取通常是通过细胞膜的各种内吞作用实现的,阳离子基因复合物能够与细胞表面负电性蛋白多糖产生静电相互作用,进而被细胞摄取,因此基因复合物合适的正电性和粒径是实现细胞摄取的首要条件。与细胞摄取不同,基因复合物的细胞识别通常需要某些特异性配体的协助才能实现。靶向性基因载体通过靶向细胞膜受体,能显著增强基因向特定组织和细胞的递送,表现出特异性促进基因转染的功能。而非靶向聚阳离子基因递送系统不能选择性识别血管内皮细胞,造成基因复合物进入内皮细胞的几率较低,转染效果差,从而无法实现快速内皮化。鉴于此,利用靶向功能多肽对内皮细胞的特异性识别作用,构建低毒、高效的靶向性基因递送系统是促进内皮细胞转染的重要策略。

Kim等^[74]将RGD肽通过PEG柔性链段间隔臂接枝到PEI-g-PEG上,合成了PEI-g-PEG-RGD基因载体。PEI-g-PEG-RGD/pDNA不仅更加稳定,而且转染效率提高了5倍多。Feng等^[75]也利用RGD肽修饰聚酰胺-胺制备了靶向性基因载体(CDG2-cRGD),该基因载体不仅在体外实验中表现出了对人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)的高转染效率,而且在为期四周的兔血管损伤动物模型实验中抑制了血管损伤后的内膜增厚。此外,Yuan等^[76]将REDV肽接枝到PEG修饰的三甲基壳聚糖(TMC),合成出TMC-g-PEG-REDV靶向性基因载体,用于miRNA-126递送转染血管内皮细胞,9天后发现其基因表达水平是其他对照组的两倍。

Feng等^{[77,78,79,80,81,82,83,84,85]}也开展了靶向性基因递送系统促进内皮细胞增殖的研究。他们^[79]以PLGA为疏水核心制备了mPEG-b-PLGA-g-PEI-CREDVW靶向性聚阳离子基因载体,其合成过程如图3所示。该靶向性载体的ZNF580蛋白表达水平比对照组增加了76.9%。由于该基因载体的粒径和电位与对照组相似,它们之间转染效果的差异主要是由REDV肽对内皮细胞表面的α₄β₁整合素的特异性识别所引起的。为了进一步增强基因载体的靶向性,他们^[80]在嵌段共聚物两端都引入REDV肽,所得基因载体不仅具有较低的细胞毒性,而且在内皮细胞和平滑肌细胞共培养系统中可以明显促进内皮细胞的增殖和迁移。

Feng等^[81]制备了REDV-PEG-PLMD和PEI-PLMD-PEI两种嵌段共聚物,通过自组装形成复合胶束。这种方法可以通过控制两种共聚物的比例,很方便地调节基因载体的转染效率和细胞毒性。为了进一步增强胶束的稳定性和研究聚合物结构对基因载体转染性能的影响,Feng等分别制备了REDV肽修饰的星型^[82]和梳型^[83]共聚物,这些特殊结构聚合物基因载体均对内皮细胞表现出较高的转染效率。

此外,他们还研究了CAG肽修饰的靶向性基因递送系统,制备了CAG靶向性基因载体,随后与pZNF580质粒复合形成靶向性基因复合物,并研究了其转染效率和体内体外血管化能力^[84]。CAG肽可以明显提高基因转染效率,在体外血管形成实验中,经CAG靶向性基因复合物转染的内皮细胞生成的血管数目是阴性对照组的两倍,而且多于阳性对照组生成的血管数目,体外血管形成实验结果如图4所示。体内血管形成实验也证实了CAG靶向性基因复合物可以明显增强HUVECs的血管形成能力。体内血管形成实验的H&E染色和抗CD31组织免疫荧光染色结果如图5所示。为了增强基因载体的转染效率,Feng等^[85]设计了CAG肽修饰的星型基因载体,该基因载体表现出了较高的基因转染效率,体外转染结果如图6所示。上述研究结果表明,靶向肽的引入增强了基因复合物的内皮细胞识别能力,提高了基因载体的转染效率。

5 多功能逐级靶向基因递送系统

内皮细胞特异性识别多肽可以增强基因复合物和内皮细胞的相互作用,从而增强内皮细胞对基因复合物的摄取。基因表达需要经历复杂的细胞内运输途径,其中内涵体/溶酶体逃逸和核转染是极为关键的两步。TAT多肽作为最常用的细胞穿透肽,可用于促进基因载体的细胞摄取和内涵体/溶酶体逃逸。此外,基因表达是通过目的基因在细胞核内转录形成mRNA来实现的,这决定着基因治疗的成功与否。NLS核定位信号肽可以增强向细胞核内运送DNA的能力。将TAT细胞穿透肽和NLS核定位信号肽相结合,设计构建多功能靶向基因递送系统,可以极大地增强基因载体对内皮细胞的转染能力。

TAT多肽因其富含带正电荷的精氨酸片段而具有聚阳离子的特点,可以直接用于负载基因。然而,由于TAT多肽分子的电荷密度不足,难以获得高转染效率。

为此,Kim等^[86]利用二硫键把多个TAT多肽分子连接起来,得到支化TAT大分子(BTAT),其分子量高达294 kDa。该基因载体稳定性强,而且在还原条件下可以发生降解,其转染效率是TAT多肽的40倍。He等^[87]利用RGD和TAT多肽功能化壳聚糖(CS)基基因载体,合成出CS-g-PEI-PEG-PEP。研究结果表明,RGD和TAT多肽增强了基因载体的靶向能力和细胞摄取能力,其转染效率明显提高。Hughes等^[88]向阳离子脂质体中引入NLS多肽用作基因载体,研究结果表明,含有NLS多肽基因载体的转染效率比对照组高出三倍。Doh^[89]将TAT和NLS多肽串联起来得到TAT-NLS,再利用其与阳离子脂质体和基因之间的静电相互作用负载基因,得到基因复合物。研究结果表明,相对于TAT、NLS和阳离子脂质体,TAT-NLS大幅提高了基因复合物的转染效率,并且不会引起细胞毒性的增加。Liu等^[90]直接利用RGD-TAT-NLS串联肽来功能化PEI, 结果表明RGD-TAT-NLS引入不仅降低了PEI的细胞毒性,而且其转染效率比阳性对照PEI(25 kDa)高出两倍多。

基于REDV、CAG和TAT-NLS多肽,Feng等^{[91,92,93,94]}设计制备了多种多功能逐级靶向基因递送系统。在生理条件(pH=7.4)下,组氨酸表现出疏水性,而在酸性条件(pH=5.4)下,例如内涵体/溶酶体中,组氨酸的咪唑基团质子化而成为亲水性,故富含寡聚组氨酸的基因载体有利于内涵体膜破裂,促进内涵体/溶酶体逃逸。Feng等^[91]向REDV-TAT-NLS串联肽引入不同数目的寡聚组氨酸,研究组氨酸数目对REDV-TAT-NLS-H_n(n为0,4, 8或12)基因载体的转染效率和内涵体/溶酶体逃逸能力的影响,多功能基因复合物转染内皮细胞过程如图7所示。

研究结果表明,当组氨酸数目由4增加到12时,基因复合物的细胞摄取和平均荧光强度(MFI)明显增加,转染效率也明显提高。REDV-TAT-NLS-H_n基因载体中REDV和TAT多肽有利于内皮细胞的细胞识别和细胞摄取,TAT多肽和组氨酸序列有利于提高内涵体/溶酶体逃逸能力,而NLS多肽可以增强核定位能力。

考虑到REDV-TAT-NLS串联肽直接将多肽序列连接起来,这有可能会影响其相应功能的发挥。Feng等^[92]在相邻两种多肽序列之间引入不同数目寡聚甘氨酸(简记为G_m)作为柔性链段,考察REDV-G_m-TAT-G_m-NLS(寡聚甘氨酸数目m为0, 1和4)作为基因载体对内皮细胞的转染能力。研究结果表明,当m为4时,REDV-G_m-TAT-G_m-NLS/pZNF580基因复合物的内在化效率明显提高,体内、体外血管形成能力明显增强。此外,HUVECs对该基因复合物的内在化效率是人脐动脉平滑肌细胞的1.36倍。寡聚甘氨酸柔性链段的引入和多肽功能的正常发挥,增强了内皮细胞的内在化效率和血管再生能力。

多功能性REDV-TAT-NLS串联肽基因载体几乎没有细胞毒性,然而其分子量小且电荷密度低,基因负载能力相对较弱。为进一步提高多功能载体的转染效率,Feng等^[93]将多功能串联肽引入到聚阳离子基因递送系统中,通过静电相互作用将TAT-NLS、REDV-PEG-PEI-PCLGA和pDNA制备成三元基因复合物。体外转染实验结果表明,TAT-NLS多肽的引入明显提高了三元基因复合物的转染效率。如图8所示,利用激光共聚焦显微镜(CLSM)观察三元基因复合物在内皮细胞中的胞内运输行为,结果表明,TAT-NLS多肽的引入使三元基因复合物的内涵体逃逸能力和核靶向能力均得到明显提高。

为了增强基因复合物的稳定性,Feng等^[94]以八氨基笼型倍半硅氧烷(POSS-(NH₂)₈)和溴代异丁酰溴反应产物为引发剂,通过原子转移自由基聚合(ATRP)依次引发甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(DMAEMA)和聚乙二醇单甲基丙烯酸酯(PEGMA)聚合,制备出具有良好生物相容性的八臂星型梳状共聚物POSS-PD;并在PEGMA末端引入双键,进而连接CAG-TAT-NLS多肽,得到POSS-DP-CAG-TAT-NLS,合成过程如图9所示。体外转染实验结果表明,该基因载体具有较高的转染效率,甚至高于阳性对照组(PEI 25 kDa)。此外,伤口愈合实验和体外血管形成实验均表明该基因载体能够促进内皮细胞的迁移和新生血管形成。

REDV和CAG肽可以增强基因载体的内皮细胞识别能力,TAT多肽可以增强基因载体的细胞摄取和内涵体/溶酶体逃逸能力,NLS多肽可以增强基因载体的核定位能力。将REDV特异性靶向多肽,TAT细胞穿透肽和NLS核定位信号肽集成于一个基因递送系统中,有效发挥这些多肽的各自功能,有利于基因递送系统高效跨越基因递送过程中的多个屏障,提高转染效果。

6 结论和展望

小口径人工血管在临床使用过程中经常面临栓塞和内膜增生等问题,快速内皮化最有希望彻底解决这些问题。基因治疗技术在人工血管快速内皮化方面展现出巨大的应用前景,然而,内皮细胞作为较难转染的细胞,传统的基因递送系统对其转染能力有限,限制了该技术在人工血管快速内皮化方面的应用。近年来,多肽被广泛应用于各种基因递送系统的设计之中。将内皮细胞特异性靶向多肽、细胞穿透肽和核定位信号肽集成于一个基因递送系统,该多功能逐级靶向递送系统有望克服基因递送中的多个屏障,为基因递送技术促进快速内皮化开拓了美好前景。

当然,该研究领域依然存在着许多问题和挑战,例如研发新一代低毒、高效的多功能基因载体;如何将多功能基因递送系统和人工血管有机结合;以及如何确保基因递送系统在体内复杂环境中依然保持其逐级靶向和高效转染能力等。鉴于内皮细胞内生理环境的复杂性,可以针对其特有微环境,如pH值和还原性,在载体材料中引入响应性化学结构,构建智能性基因递送系统,也是一种提高转染效率的有效策略。例如,针对内涵体/溶酶体逃逸能力差,设计构建具有电荷反转能力的载体材料,通过响应内涵体的低pH值, 发生电荷反转,促使内涵体破裂,实现有效逃逸;为了降低基因载体的细胞毒性,可以在阳离子聚合物中引入氧化还原敏感键,响应细胞内高含量的谷胱甘肽,促使阳离子聚合物发生降解,从而有效降低细胞毒性。

随着多功能逐级靶向基因递送系统深入研究,相信新型低毒、高效多功能基因递送系统将会用于促进小口径人工血管的快速内皮化。

参考文献

原文顺序 | 出版日期 | 本文引用

[1]

Benjamin E J, Blaha M J, Chiuve S E, Cushman M, Das S R, Deo R, Ferranti S, Floyd J, Fornage M, Gillespie C, Lsasi C R, Jiménez M C, Jordan L C, Judd S E, Lackland D, Lichtman J H, Lisabeth L, Liu S, Longenecker C T, Mackey R H, Matsushita K, Mozaffarian D, Mussolino M E, Nasir K, Neumar R W, Palaniappan L, Pandey D K, Thiagarajan R R, Reeves M J, Ritchey M, Rodriguez C J, Roth G A, Rosamond W D, Sasson C, Towfighi A, Tsao C W, Turner M B, Virani S S, Jenifer H, Voeks J HS, Willey J Z, Wilkins J T, Wu J, Alger H M, Wong S S, Muntner P . Circulation, 2017,135:e146.

[2]	Seifu D G, Purnama A, Mequanint K, Mantovani D . Nat. Rev. Cardiol., 2013,10:410.

[3]	Ward M R, Stewart D J, Kutryk M J B . Catheter Cardiovasc. Intervention, 2007,70:983.

[4]	Shin Y M, Lee Y B, Kim S J, Kang J K, Park J C, Jang W, Shin H . Biomacromolecules, 2012,13:2020.

[5]	Lu S, Zhang P, Sun X, Gong F, Yang S, Shen L, Huang Z, Wang C . ACS Appl. Mater. Interfaces, 2013,5:7360.

[6]	Bedair T M, ElNaggar M A, Joung Y K, Han D K . J. Tissue Eng., 2017,8:1.

[7]	Ren X, Feng Y, Guo J, Wang H, Li Q, Yang J, Hao X, Lv J, Ma N, Li W . Chem. Soc. Rev., 2015,44:5680.

[8]	Palmaz J C, Benson A, Sprague E A . J. Vasc. Interv. Radiol., 1999,10:439.

[9]	Mel A, Jell G, Stevens M M, Seifalian A M . Biomacromolecules, 2008,9:2969.

[10]	Meng S, Liu Z, Shen L, Guo Z, Chou L, Zhong W, Du Q, Ge J . Biomaterials, 2009,30:2276.

[11]	Taite L J, Yang P, Jun H W, West J L . J. Biomed. Mater. Res. Part B, 2008,84:108.

[12]	Liu T, Liu S, Zhang K, Chen J Y, Huang N . J. Biomed. Mater. Res. Part A, 2014,102:3754.

[13]	Lin Q, Ding X, Qiu F, Song X X, Fu G S, Ji J . Biomaterials, 2010,31:4017.

[14]	Avci-Adali M, Paul A, Ziemer G, Wendel H P . Biomaterials, 2008,29:3936.

[15]	Zhang M, Wang Z, Wang Z, Feng S, Xu H, Zhao Q, Wang S, Fang J, Qiao M, Kong D . Colloids Surf. B, 2011,85:32.

[16]	Chuang T W, Masters K S . Biomaterials, 2009,30:5341.

[17]	Carmeliet P . Nat. Med., 2003,9:653.

[18]	Sinn P L, Sauter S L, McCray P B . Gene Ther., 2005,12:1089.

[19]	Grigsby C L, Leong K W . J. R. Soc. Interface, 2010,7:S67.

[20]	Morille M, Passirani C, Vonarbourg A, Clavreul A, Benoitet J . Biomaterials, 2008,29:3477.

[21]	Zhou Z, Liu X, Zhu D, Wang Y, Zhang Z, Zhou X, Qiu N, Chen X, Shen Y . Adv. Drug Delivery Rev., 2017,115:115.

[22]	Liu X, Xiang J, Zhu D, Jiang M, Zhou Z, Tang J, Liu X, Huang Y, Shen Y . Adv. Mater., 2016,28:1743.

[23]	Yang B, Dong X, Lei Q, Zhuo R, Feng J, Zhang X . ACS Appl. Mater. Interfaces, 2015,7:22084.

[24]	Wang J, Wu W, Jiang X . Nanomedicine, 2015,10:1149.

[25]	Zhu Y, Zheng X, Yu B, Yang W, Zhao N, Xu F . Macromol. Biosci., 2014,14:1135.

[26]	Ping Y, Liu C, Tang G, Li J, Li J, Yang W, Xu F . Adv. Funct. Mater., 2010,20:3106.

[27]	Gao Y, Yang C, Liu X, Ma R, Kong D, Shi L . Macromol. Biosci., 2012,12:251.

[28]	Gao H, Cheng T, Liu J, Liu J, Yang C, Chu L, Zhang Y, Ma R, Shi L . Biomacromolecules, 2014,15:3634.

[29]	Yang J, Zeng Y, Zhang C, Chen Y, Yang Z, Li Y, Leng X, Kong D, Wei X, Sun H, Song C . Biomaterials, 2013,34:1635.

[30]	Yin T, He S, Su C, Chen X, Zhang D, Wan Y, Ye T, Shen G, Wang Y, Shi H, Yang L, Wei Y . Mol. Med. Rep., 2015,12:5093.

[31]	Sun H Y, Wei S P, Xu R C, Xu P X, Zhang W C . Biochem. Biophys. Res. Commun., 2010,395:366.

[32]	Luo Y, Hu W, Xu R X, Hou B, Zhang L, Zhang W C . Cell Biol. Int., 2011,35:1153.

[33]	Wei S P, Huang J, Li Y, Zhao J, Luo Y, Meng X, Sun H Y, Zhou X, Zhang M, Zhang W C . J. Mol. Cell. Cardiol., 2015,87:17.

[34]	Liddington R C, Ginsberg M H . J. Cell Biol., 2002,158:833.

[35]	Pierschbacher M, Ruoslahti E . Nature, 1984,309:30.

[36]	Chollet C, Chanseau C, Remy M, Guignandon A, Bareille R, Labrugère C, Bordenave L, Durrieu M . Biomaterials, 2009,30:711.

[37]	Humphries M J, Akiyama S K, Komoriya A, Olden K, Yamada K M . J. Cell Biol., 1986,103:2637.

[38]	Yang J, Khan M, Zhang L, Ren X, Guo J, Feng Y, Wei S, Zhang W . J. Mater. Chem. B, 2015,3:7682.

[39]	Wei Y, Ji Y, Xiao L L, Lin Q K, Xu J P, Ren K F, Ji J . Biomaterials, 2013,34:2588.

[40]	Wei Y, Ji Y, Xiao L L, Lin Q K, Ji J . Colloids Surf. B, 2011,84:369.

[41]	Ji Y, Wei Y, Liu X, Wang J L, Ren K F, Ji J . J. Biomed. Mater. Res. Part A, 2012,100:1387.

[42]	Yu S, Gao Y, Mei X, Ren T, Liang S, Mao Z, Gao C . ACS Appl. Mater. Interfaces, 2016,8:29280.

[43]	Kanie K, Narita Y, Zhao Y, Kuwabara F, Satake M, Honda S, Kaneko H, Yoshioka T, Okochi M, Honda H, Kato R . Biotech. Bioeng., 2012,109:1808.

[44]	Kato R, Kaga C, Kanie K, Kunimatsu M, Okochi M, Honda H . Mini-Rev. Org. Chem., 2011,8:171.

[45]	Khan M, Yang J, Shi C, Lv J, Feng Y, Zhang W . Acta Biomater., 2015,20:69.

[46]	Kuwabara F, Narita Y, Yamawaki-Ogata A, Kanie K, Kato R, Satake M, Kaneko H, Oshima H, Usui A, Ueda Y . Ann. Thorac. Surg., 2012,93:156.

[47]	Zhao J, Li Q, Hao X, Ren X, Guo J, Feng Y, Shi C . J. Mater. Chem. B, 2017,5:8035.

[48]	Yang B S, Mallick S, Kwon Y E, Kim Y J, Kim G H, Choi J S . Bull. Korean Chem. Soc., 2015,36:2477.

[49]	Hu Q, Wang J, Shen J, Liu M, Jin X, Tang G, Chu P K . Biomaterials, 2012,33:1135.

[50]	Pack D W, Hoffman A S, Pun S, Stayton P S . Nat. Rev. Drug Discovery, 2005,4:581.

[51]	Zhao B, Zhou Z, Shen Y . Chin. J. Polym. Sci., 2016,34:94.

[52]	Liu, Q, Hong C, Pan C . Acta Polym. Sin., 2015,1:15.

[53]	Cheng Y . Acta Polym. Sin., 2017,8:1234.

[54]	Zhang W, Xu N, Yao Z, Li K, Yu Z, Chen L, Ye W, Deng W . Chin. J. Org. Chem., 2016,36:2039.

[55]	Lu Y . Biotechnol. Bull., 2013,2:61.

[56]	Zhang Y, Zhou Z . Appl. Chem. Ind., 2018,47:145.

[57]	He Y, Cheng G, Xie L, Nie Y, He B, Gu Z . Biomaterials, 2013,34:1235.

[58]	Xie L, Jiang Q, He Y, Nie Y, Yue D, Gu Z . Biomater. Sci., 2015,3:446.

[59]	Gu Z, Luo K, She W, Wu Y, He B . Sci. China Chem., 2010,53:458.

[60]	Luo K, Li C, Li L, She W, Wang G, Gu Z . Biomaterials, 2012,33:4917.

[61]	Wei H, Zhang X, Cheng C, Cheng S, Zhuo R . Biomaterials, 2007,28:99.

[62]	Godbey W T, Wu K K, Mikos A G . J. Control. Release, 1999,60:149.

[63]	Neu M, Fischer D, Kissel T . J. Gene Med., 2005,7:992.

[64]	Yang J, Feng Y, Zhang L . Polym. Adv. Technol., 2015,26:1370.

[65]	Sim T, Park G, Min H, Kang S, Lim C, Bae S, Lee E S, Youn Y S, Oh K T . J. Bioact. Compat. Polym., 2017,32:280.

[66]	Abebe D G, Kandil R, Kraus T, Elsayed M, Merkel O M, Fujiwara T . Macromol. Biosci., 2015,15:698.

[67]	Li J, Yang G, Feng M, Liang H, Zhang J, Huang D, Deng S, Shen Y . Biotechnol. Bioprocess Eng., 2012,17:1182.

[68]	Li Q, Shi C, Zhang W, Behl M, Lendlein A, Feng Y . Adv. Healthcare Mater., 2015,4:1225.

[69]	Shi C, Yao F, Huang J, Han J, Li Q, Khan M, Feng Y, Zhang W . J. Mater. Chem. B, 2014,2:1825.

[70]	Duo X, Li Q, Wang J, Lv J, Hao X, Feng Y, Ren X, Shi C, Zhang W . Langmuir, 2017,33:13315.

[71]	Shi C, Yao F, Li Q, Khan M, Ren X, Feng Y, Huang J, Zhang W . Biomaterials, 2014,35:7133.

[72]	Lv J, Yang J, Hao X, Ren X, Feng Y, Zhang W . J. Mater. Chem. B, 2016,4:997.

[73]	Feng Y, Guo M, Liu W, Hao X, Lu W, Ren X, Shi C, Zhang W . Int. J. Nanomed., 2017,12:137.

[74]	Suh W, Han S O, Yu L, Kim S W . Mol. Ther., 2002,6:664.

[75]	Tian S, Cao D, Zou H, Bai F, Wang Z, Pan S, Feng M . Int. J. Nanomed., 2015,10:5751.

[76]	Zhou F, Jia X, Yang Q, Yang Y, Zhao Y, Fan Y, Yuan X . Biomater. Sci., 2016,4:849.

[77]	Wang H, Feng Y, Yang J, Guo J, Zhang W . J. Mater. Chem. B, 2015,3:3379.

[78]	Yang J, Liu W, Lv J, Feng Y, Ren X, Zhang W . J. Mater. Chem. B, 2016,4:3365.

[79]	Hao X, Li Q, Lv J, Yu L, Ren X, Zhang L, Feng Y, Zhang W . ACS Appl. Mater. Interfaces, 2015,7:12128.

[80]	Shi C, Li Q, Zhang W, Feng Y, Ren X . ACS Appl. Mater. Interfaces, 2015,7:20389.

[81]	Li Q, Hao X, Lv J, Ren X, Zhang K, Ullah I, Feng Y, Shi C, Zhang W . J. Mater. Chem. B, 2017,5:1673.

[82]	Lv J, Hao X, Li Q, Akpanyung M, Nejjari A, Neve A L, Ren X, Feng Y, Shi C, Zhang W . Biomater. Sci., 2017,5:511.

[83]	Wang H, Li Q, Yang J, Guo J, Ren X, Feng Y, Zhang W . J. Mater. Chem. B, 2017,5:1408.

[84]	Yang J, Hao X, Li Q, Akpanyung M, Nejjari A, Neve A L, Ren X, Guo J, Feng Y, Shi C, Zhang W . ACS Appl. Mater. Interfaces, 2017,9:4485.

[85]	Duo X, Wang J, Li Q, Neve A L, Akpanyung M, Nejjari A, Ali Z S S, Feng Y, Zhang W, Shi C . Polymers, 2017,9:158.

[86]	Jeong C, Yoo J, Lee D Y, Kim Y C . Biomater. Res., 2016,20:28.

[87]	Wu D, Zhang Y, Xu X, Guo T, Xie D, Zhu R, Chen S, Ramakrishna S, He L . Acta Biomater., 2018,72:266.

[88]	Aronsohn A I, Hughes J A . J. Drug Targeting, 1998,5:163.

[89]	Doh K O . J. Microbiol. Biotechnol., 2015,25:788.

[90]	Zhao W, Liu K, Chen S, Zhu M, Lv H, Hu J, Mao Y . Bio-med. Mater. Eng., 2014,24:1933.

[91]	Li Q, Hao X, Zaidi S S A, Guo J T, Ren X K, Shi C C, Zhang W C, Feng Y K . J. Nanobiotechnol., 2018,16:29.

[92]	Hao X, Li Q, Guo J T, Ren X K, Feng Y K, Shi C C, Zhang W C . ACS Appl. Mater. Interfaces, 2017,9:35613.

[93]	Yang J, Li Q, Yang X, Feng Y K, Ren X K, Shi C C, Zhang W C . Macromol. Rapid Commun., 2016,37:1926.

[94]	Wang J, Zaidi S S A, Hasnain A, Guo J T, Ren X K, Xia S, Zhang W C, Feng Y K . ACS Biomater. Sci. Eng., 2018,4:2155.

[1]	Benjamin E J, Blaha M J, Chiuve S E, Cushman M, Das S R, Deo R, Ferranti S, Floyd J, Fornage M, Gillespie C, Lsasi C R, Jiménez M C, Jordan L C, Judd S E, Lackland D, Lichtman J H, Lisabeth L, Liu S, Longenecker C T, Mackey R H, Matsushita K, Mozaffarian D, Mussolino M E, Nasir K, Neumar R W, Palaniappan L, Pandey D K, Thiagarajan R R, Reeves M J, Ritchey M, Rodriguez C J, Roth G A, Rosamond W D, Sasson C, Towfighi A, Tsao C W, Turner M B, Virani S S, Jenifer H, Voeks J HS, Willey J Z, Wilkins J T, Wu J, Alger H M, Wong S S, Muntner P . Circulation, 2017,135:e146. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28122885
[2]	Seifu D G, Purnama A, Mequanint K, Mantovani D . Nat. Rev. Cardiol., 2013,10:410. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23689702
[3]	Ward M R, Stewart D J, Kutryk M J B . Catheter Cardiovasc. Intervention, 2007,70:983.
[4]	Shin Y M, Lee Y B, Kim S J, Kang J K, Park J C, Jang W, Shin H . Biomacromolecules, 2012,13:2020. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22617001
[5]	Lu S, Zhang P, Sun X, Gong F, Yang S, Shen L, Huang Z, Wang C . ACS Appl. Mater. Interfaces, 2013,5:7360. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23859593
[6]	Bedair T M, ElNaggar M A, Joung Y K, Han D K . J. Tissue Eng., 2017,8:1.
[7]	Ren X, Feng Y, Guo J, Wang H, Li Q, Yang J, Hao X, Lv J, Ma N, Li W . Chem. Soc. Rev., 2015,44:5680. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26023741
[8]	Palmaz J C, Benson A, Sprague E A . J. Vasc. Interv. Radiol., 1999,10:439. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10229473
[9]	Mel A, Jell G, Stevens M M, Seifalian A M . Biomacromolecules, 2008,9:2969. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18831592
[10]	Meng S, Liu Z, Shen L, Guo Z, Chou L, Zhong W, Du Q, Ge J . Biomaterials, 2009,30:2276. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19168214
[11]	Taite L J, Yang P, Jun H W, West J L . J. Biomed. Mater. Res. Part B, 2008,84:108. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17497680
[12]	Liu T, Liu S, Zhang K, Chen J Y, Huang N . J. Biomed. Mater. Res. Part A, 2014,102:3754. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24243819
[13]	Lin Q, Ding X, Qiu F, Song X X, Fu G S, Ji J . Biomaterials, 2010,31:4017. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20149438
[14]	Avci-Adali M, Paul A, Ziemer G, Wendel H P . Biomaterials, 2008,29:3936. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18640715
[15]	Zhang M, Wang Z, Wang Z, Feng S, Xu H, Zhao Q, Wang S, Fang J, Qiao M, Kong D . Colloids Surf. B, 2011,85:32. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21123036
[16]	Chuang T W, Masters K S . Biomaterials, 2009,30:5341. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19577800
[17]	Carmeliet P . Nat. Med., 2003,9:653. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12778163
[18]	Sinn P L, Sauter S L, McCray P B . Gene Ther., 2005,12:1089. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16003340
[19]	Grigsby C L, Leong K W . J. R. Soc. Interface, 2010,7:S67. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19734186
[20]	Morille M, Passirani C, Vonarbourg A, Clavreul A, Benoitet J . Biomaterials, 2008,29:3477. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18499247
[21]	Zhou Z, Liu X, Zhu D, Wang Y, Zhang Z, Zhou X, Qiu N, Chen X, Shen Y . Adv. Drug Delivery Rev., 2017,115:115. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28778715
[22]	Liu X, Xiang J, Zhu D, Jiang M, Zhou Z, Tang J, Liu X, Huang Y, Shen Y . Adv. Mater., 2016,28:1743. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26663349
[23]	Yang B, Dong X, Lei Q, Zhuo R, Feng J, Zhang X . ACS Appl. Mater. Interfaces, 2015,7:22084. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26398113
[24]	Wang J, Wu W, Jiang X . Nanomedicine, 2015,10:1149. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25929571
[25]	Zhu Y, Zheng X, Yu B, Yang W, Zhao N, Xu F . Macromol. Biosci., 2014,14:1135. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24789347
[26]	Ping Y, Liu C, Tang G, Li J, Li J, Yang W, Xu F . Adv. Funct. Mater., 2010,20:3106.
[27]	Gao Y, Yang C, Liu X, Ma R, Kong D, Shi L . Macromol. Biosci., 2012,12:251. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22076739
[28]	Gao H, Cheng T, Liu J, Liu J, Yang C, Chu L, Zhang Y, Ma R, Shi L . Biomacromolecules, 2014,15:3634. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25308336
[29]	Yang J, Zeng Y, Zhang C, Chen Y, Yang Z, Li Y, Leng X, Kong D, Wei X, Sun H, Song C . Biomaterials, 2013,34:1635. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23199742
[30]	Yin T, He S, Su C, Chen X, Zhang D, Wan Y, Ye T, Shen G, Wang Y, Shi H, Yang L, Wei Y . Mol. Med. Rep., 2015,12:5093. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26239842
[31]	Sun H Y, Wei S P, Xu R C, Xu P X, Zhang W C . Biochem. Biophys. Res. Commun., 2010,395:366.
[32]	Luo Y, Hu W, Xu R X, Hou B, Zhang L, Zhang W C . Cell Biol. Int., 2011,35:1153. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21599657
[33]	Wei S P, Huang J, Li Y, Zhao J, Luo Y, Meng X, Sun H Y, Zhou X, Zhang M, Zhang W C . J. Mol. Cell. Cardiol., 2015,87:17. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26268592
[34]	Liddington R C, Ginsberg M H . J. Cell Biol., 2002,158:833. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12213832
[35]	Pierschbacher M, Ruoslahti E . Nature, 1984,309:30. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/6325925
[36]	Chollet C, Chanseau C, Remy M, Guignandon A, Bareille R, Labrugère C, Bordenave L, Durrieu M . Biomaterials, 2009,30:711. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19010529
[37]	Humphries M J, Akiyama S K, Komoriya A, Olden K, Yamada K M . J. Cell Biol., 1986,103:2637. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3025221
[38]	Yang J, Khan M, Zhang L, Ren X, Guo J, Feng Y, Wei S, Zhang W . J. Mater. Chem. B, 2015,3:7682. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/32264578
[39]	Wei Y, Ji Y, Xiao L L, Lin Q K, Xu J P, Ren K F, Ji J . Biomaterials, 2013,34:2588. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23352039
[40]	Wei Y, Ji Y, Xiao L L, Lin Q K, Ji J . Colloids Surf. B, 2011,84:369. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21333506
[41]	Ji Y, Wei Y, Liu X, Wang J L, Ren K F, Ji J . J. Biomed. Mater. Res. Part A, 2012,100:1387.
[42]	Yu S, Gao Y, Mei X, Ren T, Liang S, Mao Z, Gao C . ACS Appl. Mater. Interfaces, 2016,8:29280. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27723284
[43]	Kanie K, Narita Y, Zhao Y, Kuwabara F, Satake M, Honda S, Kaneko H, Yoshioka T, Okochi M, Honda H, Kato R . Biotech. Bioeng., 2012,109:1808.
[44]	Kato R, Kaga C, Kanie K, Kunimatsu M, Okochi M, Honda H . Mini-Rev. Org. Chem., 2011,8:171.
[45]	Khan M, Yang J, Shi C, Lv J, Feng Y, Zhang W . Acta Biomater., 2015,20:69. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25839123
[46]	Kuwabara F, Narita Y, Yamawaki-Ogata A, Kanie K, Kato R, Satake M, Kaneko H, Oshima H, Usui A, Ueda Y . Ann. Thorac. Surg., 2012,93:156. 119e7bd1-8bde-4a08-9dab-6397e0430666http://dx.doi.org/10.1016/j.athoracsur.2011.07.055
[47]	Zhao J, Li Q, Hao X, Ren X, Guo J, Feng Y, Shi C . J. Mater. Chem. B, 2017,5:8035. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/32264643
[48]	Yang B S, Mallick S, Kwon Y E, Kim Y J, Kim G H, Choi J S . Bull. Korean Chem. Soc., 2015,36:2477.
[49]	Hu Q, Wang J, Shen J, Liu M, Jin X, Tang G, Chu P K . Biomaterials, 2012,33:1135. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22071097
[50]	Pack D W, Hoffman A S, Pun S, Stayton P S . Nat. Rev. Drug Discovery, 2005,4:581. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16052241
[51]	Zhao B, Zhou Z, Shen Y . Chin. J. Polym. Sci., 2016,34:94.
[52]	Liu, Q, Hong C, Pan C . Acta Polym. Sin., 2015,1:15.
[53]	Cheng Y . Acta Polym. Sin., 2017,8:1234.
[54]	Zhang W, Xu N, Yao Z, Li K, Yu Z, Chen L, Ye W, Deng W . Chin. J. Org. Chem., 2016,36:2039.
[55]	Lu Y . Biotechnol. Bull., 2013,2:61.
[56]	Zhang Y, Zhou Z . Appl. Chem. Ind., 2018,47:145.
[57]	He Y, Cheng G, Xie L, Nie Y, He B, Gu Z . Biomaterials, 2013,34:1235. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23127334
[58]	Xie L, Jiang Q, He Y, Nie Y, Yue D, Gu Z . Biomater. Sci., 2015,3:446. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26222288
[59]	Gu Z, Luo K, She W, Wu Y, He B . Sci. China Chem., 2010,53:458.
[60]	Luo K, Li C, Li L, She W, Wang G, Gu Z . Biomaterials, 2012,33:4917. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22484048
[61]	Wei H, Zhang X, Cheng C, Cheng S, Zhuo R . Biomaterials, 2007,28:99. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16959312
[62]	Godbey W T, Wu K K, Mikos A G . J. Control. Release, 1999,60:149. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10425321
[63]	Neu M, Fischer D, Kissel T . J. Gene Med., 2005,7:992. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15920783
[64]	Yang J, Feng Y, Zhang L . Polym. Adv. Technol., 2015,26:1370.
[65]	Sim T, Park G, Min H, Kang S, Lim C, Bae S, Lee E S, Youn Y S, Oh K T . J. Bioact. Compat. Polym., 2017,32:280.
[66]	Abebe D G, Kandil R, Kraus T, Elsayed M, Merkel O M, Fujiwara T . Macromol. Biosci., 2015,15:698. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25644720
[67]	Li J, Yang G, Feng M, Liang H, Zhang J, Huang D, Deng S, Shen Y . Biotechnol. Bioprocess Eng., 2012,17:1182.
[68]	Li Q, Shi C, Zhang W, Behl M, Lendlein A, Feng Y . Adv. Healthcare Mater., 2015,4:1225.
[69]	Shi C, Yao F, Huang J, Han J, Li Q, Khan M, Feng Y, Zhang W . J. Mater. Chem. B, 2014,2:1825. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/32261519
[70]	Duo X, Li Q, Wang J, Lv J, Hao X, Feng Y, Ren X, Shi C, Zhang W . Langmuir, 2017,33:13315. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29100464
[71]	Shi C, Yao F, Li Q, Khan M, Ren X, Feng Y, Huang J, Zhang W . Biomaterials, 2014,35:7133. dd5d0dee-a88d-423a-91b9-5255c9b48858http://dx.doi.org/10.1016/j.biomaterials.2014.04.110
[72]	Lv J, Yang J, Hao X, Ren X, Feng Y, Zhang W . J. Mater. Chem. B, 2016,4:997. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/32263173
[73]	Feng Y, Guo M, Liu W, Hao X, Lu W, Ren X, Shi C, Zhang W . Int. J. Nanomed., 2017,12:137. https://www.dovepress.com/international-journal-of-nanomedicine-journal
[74]	Suh W, Han S O, Yu L, Kim S W . Mol. Ther., 2002,6:664. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12409265
[75]	Tian S, Cao D, Zou H, Bai F, Wang Z, Pan S, Feng M . Int. J. Nanomed., 2015,10:5751.
[76]	Zhou F, Jia X, Yang Q, Yang Y, Zhao Y, Fan Y, Yuan X . Biomater. Sci., 2016,4:849. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27055482
[77]	Wang H, Feng Y, Yang J, Guo J, Zhang W . J. Mater. Chem. B, 2015,3:3379. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/32262332
[78]	Yang J, Liu W, Lv J, Feng Y, Ren X, Zhang W . J. Mater. Chem. B, 2016,4:3365. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/32263272
[79]	Hao X, Li Q, Lv J, Yu L, Ren X, Zhang L, Feng Y, Zhang W . ACS Appl. Mater. Interfaces, 2015,7:12128. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26011845
[80]	Shi C, Li Q, Zhang W, Feng Y, Ren X . ACS Appl. Mater. Interfaces, 2015,7:20389. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26373583
[81]	Li Q, Hao X, Lv J, Ren X, Zhang K, Ullah I, Feng Y, Shi C, Zhang W . J. Mater. Chem. B, 2017,5:1673. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/32263940
[82]	Lv J, Hao X, Li Q, Akpanyung M, Nejjari A, Neve A L, Ren X, Feng Y, Shi C, Zhang W . Biomater. Sci., 2017,5:511. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28094352
[83]	Wang H, Li Q, Yang J, Guo J, Ren X, Feng Y, Zhang W . J. Mater. Chem. B, 2017,5:1408. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/32264633
[84]	Yang J, Hao X, Li Q, Akpanyung M, Nejjari A, Neve A L, Ren X, Guo J, Feng Y, Shi C, Zhang W . ACS Appl. Mater. Interfaces, 2017,9:4485. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28117580
[85]	Duo X, Wang J, Li Q, Neve A L, Akpanyung M, Nejjari A, Ali Z S S, Feng Y, Zhang W, Shi C . Polymers, 2017,9:158.
[86]	Jeong C, Yoo J, Lee D Y, Kim Y C . Biomater. Res., 2016,20:28. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27606074
[87]	Wu D, Zhang Y, Xu X, Guo T, Xie D, Zhu R, Chen S, Ramakrishna S, He L . Acta Biomater., 2018,72:266. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29578088
[88]	Aronsohn A I, Hughes J A . J. Drug Targeting, 1998,5:163. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9606006
[89]	Doh K O . J. Microbiol. Biotechnol., 2015,25:788. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25588561
[90]	Zhao W, Liu K, Chen S, Zhu M, Lv H, Hu J, Mao Y . Bio-med. Mater. Eng., 2014,24:1933.
[91]	Li Q, Hao X, Zaidi S S A, Guo J T, Ren X K, Shi C C, Zhang W C, Feng Y K . J. Nanobiotechnol., 2018,16:29.
[92]	Hao X, Li Q, Guo J T, Ren X K, Feng Y K, Shi C C, Zhang W C . ACS Appl. Mater. Interfaces, 2017,9:35613. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28948764
[93]	Yang J, Li Q, Yang X, Feng Y K, Ren X K, Shi C C, Zhang W C . Macromol. Rapid Commun., 2016,37:1926. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27677898
[94]	Wang J, Zaidi S S A, Hasnain A, Guo J T, Ren X K, Xia S, Zhang W C, Feng Y K . ACS Biomater. Sci. Eng., 2018,4:2155.