肿瘤外泌体的分析检测

乔斌; 陈虹妃; 张卉; 蔡称心

doi:10.7536/PC181027

化学进展 ›› 2019, Vol. 31 ›› Issue (6) :847-857 DOI: 10.7536/PC181027

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肿瘤外泌体的分析检测

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Analysis and Detection of Tumor Exosomes

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摘要

肿瘤外泌体是由肿瘤细胞释放到细胞外环境的微小囊泡,其直径约为30~150 nm,主要存在于血液、尿液、唾液等多种体液中,是早期肿瘤诊断的标志物之一。肿瘤外泌体具有较好的稳定性且含量丰富,因此是液体活检标志物的研究热点。肿瘤外泌体携带母细胞相关的蛋白、脂质和核酸等生物活性物质,为生物检测提供了多种特征标志物。本文就肿瘤外泌体的生成、分离、表征及分析检测进行了论述,重点讨论了肿瘤外泌体检测的研究进展。

Abstract

Tumor exosomes are nanoscale membrane-enclosed vesicles with a diameter of 30~150 nm released from tumor cells into the extracellular environment. They are present in human blood, urine, saliva and many other body fluids and are one of the biomarkers for early tumor diagnosis. Tumor exosomes have the characteristics of good stability and abundance, which is a hot spot in liquid biopsy. Tumor exosomes carry a considerable amount of molecular information derived from the originating cell such as proteins, lipids and nucleic acids, providing a variety of characteristic biomarkers that can be used for cancer detection. In this paper, the formation, isolation, characterization and detection of tumor exosomes are discussed, and the research progress of the detection of tumor exosomes is discussed in detail.

Graphical abstract

关键词

外泌体 / 表面蛋白 / 液体活检 / 分离 / 分析检测

Key words

exosomes / surface proteins / liquid biopsy / isolation / analysis and detection

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乔斌, 陈虹妃, 张卉, 蔡称心. 肿瘤外泌体的分析检测[J]. 化学进展, 2019, 31(6): 847-857 DOI:10.7536/PC181027

Bin Qiao, Hongfei Chen, Hui Zhang, Chenxin Cai. Analysis and Detection of Tumor Exosomes[J]. Progress in Chemistry, 2019, 31(6): 847-857 DOI:10.7536/PC181027

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1 Introduction

2 Formation of exosomes

3 Isolation of exosomes

4 Characterization of exosomes

5 Detection of cancerous exosomes

5.1 Colorimetric detection of cancerous exosomes

5.2 Fluorescence detection of cancerous exosomes

5.3 Surface enhanced Raman detection of cancerous exosomes

5.4 Surface plasmon resonance detection of cancerous exosomes

5.5 Electrochemical detection of exosomes

6 Conclusion

1 引言

2015年,液体活检被评为年度十大突破性技术之一。液体活检作为体外诊断的一个分支,是指通过对血液、唾液、尿液等体液中与疾病相关的循环肿瘤细胞(CTCs)、循环肿瘤核酸(ctDNA)和癌细胞分泌的外泌体(exosomes)等生物组分的检测,从而对癌症等疾病作出诊断的方法。它是一种非侵入性的检测,是一种快速、简便、无痛苦、微创伤且具有高性价比的方法^[1,2,3]。其中,循环肿瘤细胞是存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称。由于循环肿瘤细胞在体液中的含量较低(每7.5 mL血液中含有1~1000+个),对其精确检测相对比较困难^[1]。循环肿瘤核酸是人体外周血中肿瘤基因的核酸片段^[2]。

它在血液中容易降解^[4],且检测结果容易受到坏死和凋亡的非肿瘤细胞的干扰,因此实现对其真实表达量的检测具有较大的挑战性。肿瘤外泌体是由肿瘤细胞释放到细胞外环境的微小囊泡,直径大约为30~150 nm,密度为1.13~1.19 g/mL(其结构如图1所示)^[5,6,7,8]。肿瘤外泌体携带母细胞相关的蛋白、脂质和核酸等活性物质,为生物检测提供了多种特征标记物;在体液中,外泌体数量远高于循环肿瘤细胞(每7.5 mL血液中含有10⁶个)^[4],且更易富集;其脂质双分子层膜结构可以保护外泌体不被酶类物质降解,因而具有更高的稳定性,在肿瘤诊断中显示出更大的优势。因此,建立灵敏度高、选择性好、操作简易的肿瘤外泌体的检测方法,不仅有助于一些肿瘤的早期诊断,而且有助于肿瘤的临床监控、疗效评估以及预后判断。本文针对肿瘤外泌体的生成、分离、表征及其检测进行了论述,重点论述了肿瘤外泌体检测的研究进展。

2 外泌体的生成

外泌体来源于细胞的胞吞作用(如图2所示)^[9,10~12]。首先,真核细胞内的细胞质膜内向出芽形成早期内涵体,早期内涵体与高尔基体通过复合作用形成晚期内涵体,晚期内涵体会从外细胞质转移靠近到细胞核的位置,形状也从管状变化到球形^[13],晚期内涵体内会产生腔内囊泡^[14]。在此过程中,胞质内容物、跨膜蛋白和外周膜蛋白质掺入内膜中^[15]。此时的晚期内涵体又被称为多泡体(multiple vesicular bodies, MVBs)。MVBs有两种命运:与溶酶体融合或与细胞质膜融合。一旦与溶酶体融合,囊泡内容物即会降解^[16]。若与细胞质膜融合,腔内囊泡则会被释放到细胞外环境中^[17],这些释放的囊泡即为外泌体。由于双重内陷过程,外泌体中的蛋白质拓扑结构与细胞质膜中的蛋白质拓扑结构相同。

3 外泌体的分离

外泌体广泛存在于各种体液中,因此,要想获得较纯的外泌体需要对这些体液进行处理,分离除去细胞碎屑、DNA和其他类型的囊泡^[18,19,20]。目前,常见的分离方法有超速离心法、超滤离心法、聚合物沉降法、免疫亲和法^[21]等。

超速离心法被认为是分离外泌体的黄金标准方法^[5,22,23],利用此方法能够从细胞培养基和人体液中提取外泌体^[5,24~26]。超速离心法有两种类型:差速离心法和密度梯度离心法。差速离心法是指控制离心的速度,通过低速、高速、超高速离心交替进行的方式去除细胞、死细胞、细胞碎片、蛋白质等,得到外泌体。该方法应用广泛,但长时间的超速离心会使外泌体中的蛋白质和RNA大量流失^[27,28],费时费力^{[29,30,31,32]},且在较高转速下,离心管底部得到的是蛋白质、凋亡小体和外泌体的共同沉淀物^[33],分离效果难以保证。为了解决这一问题,研究者们在高速离心的基础上,利用蔗糖密度梯度或蔗糖缓冲液去悬浮相对密度较低的外泌体^[5],使其不易聚沉^[5,34],而蛋白质或杂质则会在离心管的底部沉淀成团,从而进一步实现对外泌体的分离纯化。

超滤离心法是一种通过利用截留相对分子质量不同的超滤膜对样品进行分离的方法,与超速离心法相比,该方法耗时少,不需要使用特殊的仪器设备^[35,36,37]。与之相类似的,Bioo Scientific推出了一套试剂盒(ExomiR)来提取外泌体,试剂盒内置两台微型过滤器,第一台微过滤器(0.22 μm)可以除去所有的细胞、细胞碎片和血小板,之后利用第二台微过滤器(0.02 μm)捕获外泌体。另外,在此过程中,外泌体所携带的RNA可直接被第二台微过滤器上的物质提取出来,用于聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)分析^[38]。超滤离心法快速简单,但得到的物质中可能含有与外泌体大小相同的纳米颗粒(一些非泡状结构),而不是纯的外泌体。如Wang等^[39]发现大量的miRNA会包裹在细胞外的蛋白质复合物中,且复合物尺寸与外泌体相当,从而对外泌体内miRNA的真实含量的检测造成干扰。

聚合物沉降法是一种根据不同物质在聚合物中的溶解度不同,结合低速离心把所需要的外泌体沉降下来的方法。常用的聚合物为聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)。该方法同样快速简单,但也存在一些问题,如其他大分子颗粒会与外泌体一起沉淀,使分离得到的外泌体纯度不高^[5,40,41]。最近,一种名为ExoQuick的试剂盒就是利用该方法来提取外泌体^[42]。尽管试剂盒提取外泌体的过程非常快速和直接,但是对于沉淀外泌体来说,不可避免地会缺乏特异性,并且血清的沉淀物很难再悬浮。

免疫亲合法是借助CD81、CD82、CD63、CD9、EpCAM等抗体的特异性作用来进行分离的方法。这些抗体可以单独使用,也可以组合使用,从理论上讲,它是特异性分离外泌体的最佳选择。对于这种方法的应用,可以把抗体固定在各种媒介上,例如:磁珠、色谱基质、孔板和微流控装置等^{[7, 43]}。但是,由于需要昂贵的抗体,且一些同类型的细胞可能不表达该目标蛋白,使得该方法的使用成本高、效率低、分离量小^[44]。

尽管目前对外泌体的研究不断深入,但是仍然缺乏标准化的分离和定量方法,阻碍了外泌体的研究进展^[45,46]。在实验研究中,我们应该根据方案的需要,选择相应的分离方法。

4 外泌体的表征

对于分离得到的肿瘤外泌体,需要对其物理性质进行一系列表征,主要包括外泌体的大小、结构、形貌、浓度及表面蛋白含量。

利用常见电镜,如扫描电子显微镜(scanning electron microscopy, SEM)、透射电子显微镜(transmission electron microscopy, TEM)、冷冻电子显微镜(cryo-electron microscopy, Cyro-EM)及原子力显微镜(atomic force microscopy, AFM)可对外泌体的结构、形貌及大小进行表征。

SEM采用聚焦的电子束扫描样品表面来得到外泌体的图像。由于巨大的真空作用,样品通常是被局部固定,且处于脱水状态,如图3a 所示,在SEM下,外泌体呈现扭曲的杯状形态^[5]和均匀的尺寸分布^[47]。TEM是另一种用于表征外泌体的技术,通过聚焦的电子束透射薄的样本形成样本图像。TEM具有优异的分辨率,采用重金属染料如四氧化锇和醋酸双氧铀,对外泌体进行负染,可以产生脂质膜的对比(如图3b所示)^[47,48],可获得高辨识度的外泌体成像效果。Cryo-EM是在非常低的温度(如-100 ℃)下对样品进行分析的方法^[49,50]。与需要大量样本固定和染色的SEM、TEM不同,Cryo-EM可以分析冷冻样品中的外泌体,避免了脱水和化学固定剂的影响。在Cryo-EM下,外泌体呈现圆形状态(图3c),这表明在其他电子显微镜下观察到的杯形结构是受外力影响的结果^[50]。AFM是另一种高分辨成像技术^[51,52]。在AFM中,机械悬臂梁通过一个表面,偏转指示表面结构和形态分布。AFM的表征不需要复杂的样品制备过程,外泌体可以直接吸附到云母基底上,经过干燥后即可成像。轻敲模式的AFM显示在外力作用下,单个的外泌体呈现环状结构,且颜色不均匀,中心颜色较深(图3d),说明了其密度的不均匀性^[51]。

动态光散射(dynamic light scattering, DLS)是根据固定的角度检测散射光强度的波动来表征粒子的分布^[53],可有效检测外泌体的粒径分布,是一种非侵入性的技术^{[54,55,56,57]}。而且,DLS具有自动化识别的特点,检测结果不易受人为的影响,且不需要大量的样本进行分析。因此,DLS技术能够达到快速、准确分析外泌体粒径的目的^[58,59,60]。然而,虽然DLS可以根据散射光强度的波动来测量颗粒尺寸的分布,但是在没有算法分析的情况下,它不能自行确定颗粒的浓度^[61],需要与其他技术结合来完成对外泌体的定量和表征,而与其他的技术结合可能会降低检测的准确性^[62]。另外,散射光强度也可能掩盖了更小的颗粒,使DLS获得的数据偏向尺寸较大的颗粒^[63]。

纳米粒子追踪分析(nanoparticle tracking analysis, NTA)也是一种光散射技术,可用于外泌体的大小和浓度的分析^[64]。对于悬浮在液体中的外泌体,它的布朗运动速率与其大小之间存在着直接的关系^[65]。利用这种相关性,通过NTA技术追踪外泌体在悬浮液中的布朗运动,可以检测出外泌体的大小和浓度。与DLS相比,NTA能够更准确地估算外泌体的数量^[66,67],且可以在没有任何预处理的情况下,同时分析大小不同的外泌体^[68]。另外,NTA技术避免了纯化外泌体的繁琐步骤,大大降低了样本被污染的可能性。但作为一种相对较新的外泌体定量技术,NTA缺少对外泌体分析标准化的方法^[69,70]。一些实验样品需要通过预处理来消除细胞和细胞外囊泡的干扰,而有些实验样品只需要简单的连续稀释,以防止样品聚集。由于实验操作步骤的不同,其重复性也会受到影响。使用NTA需要对仪器和软件的设置进行手动调整,来消除测量中的偏差,但这样比较耗时且容易出现人为偏差^[71]。

蛋白质印记技术(western blotting, WB),也称为免疫印记技术,常用于蛋白质的分析。在外泌体蛋白质的鉴别中,WB是最常用的技术。在这个过程中,首先,用含有变性剂和蛋白酶抑制剂的缓冲液处理外泌体,使其裂解。然后通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白裂解物,再转移到膜上进行特异性蛋白质靶标的免疫印记^[72]。虽然该方法需要大量的准备时间和冗长的处理过程(>10 h),但分析结果能够提供关于不同蛋白质含量的有用信息。通常外泌体检测的蛋白质包括四跨膜蛋白(如CD9、CD63和CD81)、细胞骨架相关蛋白(如埃兹蛋白)、热休克蛋白(如Hsc70)和涉及多泡生物基因组的蛋白质(如Tsg101和Alix)^[73]。由于内质网和高尔基体也会产生纳米级囊泡,因此,需要通过检测外泌体中是否含有Calnexin、Grp78(内质网)和GM130(高尔基体)这些特异性标志物来排除非外泌体的干扰^[74]。

5 肿瘤外泌体的检测

肿瘤外泌体表面具有多种来源于母细胞的特征蛋白,目前的检测多使用相应蛋白的抗体或适配体技术,结合多种检测方法如比色法、荧光法、表面增强拉曼法、表面等离子体共振法及电化学方法。

5.1 比色分析法检测肿瘤外泌体

比色分析法是一种通过测量特定波长的光吸收程度来测定有色物质浓度的方法,具有简单快速、价格低廉、肉眼可见等优势。比色分析法主要包括目视比色法和光电比色法。

金纳米粒子(Au NPs)由于具有超高的消光系数而被广泛应用于比色分析中。由于受表面等离子体共振(SPR)效应的影响,Au NPs之间距离的变化可引起Au NPs紫外吸收强度的变化从而使溶液颜色产生显著的变化^[75]。基于此,Jiang等^[76]构建了一种新颖的传感平台用于外泌体的检测。在高盐溶液中,适配体与Au NPs的络合作用使得Au NPs不会聚集。在外泌体存在的情况下,其表面蛋白与适配体之间较强的特异性结合使得适配体离开Au NPs表面,导致Au NPs的聚沉,溶液的颜色由红色变成蓝色,这一过程的变化可以通过紫外吸收光谱来检测。该方法不仅实现了对肿瘤外泌体的高灵敏度检测,且通过选择不同适配体实现了对肿瘤外泌体表面多种蛋白表达情况的分析,为外泌体表面蛋白的研究提供了有价值的参考数据。

Xia等^[77]通过单壁碳纳米管(s-SWCNTs)和适配体的相互作用建立了一种肉眼可见的比色方法检测外泌体。该体系中,他们将识别外泌体跨膜蛋白CD63的适配体与s-SWCNTs混合在一起,该适配体会吸附在s-SWCNTs表面,形成DNA-capped s-SWCNTs,提高了SWCNTs的过氧化氢催化性能,可有效催化H₂O₂介导的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)的氧化,导致溶液颜色由无色变为蓝色。当加入外泌体后,吸附在s-SWCNTs表面的适配体与外泌体上的CD63蛋白特异性结合,适配体离开s-SWCNTs的表面,使其催化性能降低,导致溶液的颜色从深到浅,通过肉眼可以定性观察到这一现象,并且可以通过UV-vis光谱法对外泌体含量进行定量分析。

He等^[78]通过胆固醇标记的DNA链式杂交反应(HCR),实现了对外泌体的灵敏检测。如图4所示,首先,将CD9抗体修饰到磁珠表面,用于与外泌体表面的跨膜蛋白特异性识别,从而把外泌体捕获到磁珠表面。之后引入胆固醇标记的DNA探针,由于外泌体为脂质双分子层结构,胆固醇能够嵌插到该双分子层中,从而将该DNA探针连接到外泌体上,并以此探针作为引发链,引发HCR反应。之后通过链霉亲和素-生物素的相互作用将辣根过氧化物酶(HRP)引入反应系统中。HRP能够有效催化H₂O₂介导的TMB的氧化,通过紫外吸收光谱检测由HRP催化氧化引起的溶液吸光度的变化,实现对外泌体浓度的有效检测。

比色分析方法快速、简单、操作方便且经济有效,不需要大量样品,利用该方法,不仅可以实现对外泌体的定量检测,而且可以对外泌体表面的多种蛋白质的含量进行定量分析。

5.2 荧光法检测肿瘤外泌体

某些物质经特定波长的入射光照射,吸收光能后会形成激发态,激发态分子很不稳定,返回基态时,会伴随荧光的产生。当在肿瘤外泌体表面修饰上可以发射荧光的物质,就可以利用荧光强度的大小对外泌体进行定性或定量的分析。另外荧光法可以和微流控相结合,实现对特定的肿瘤外泌体的定量分析^[79,80]。

Kanwar等^[81]研发了一种简单、低成本的定量检测外泌体的方法。该方法基于微流控平台,可以从血清中直接分离得到外泌体,通过CD63抗体结合外泌体表面的CD63蛋白将肿瘤外泌体捕获在装置中。随后用特异性标记外泌体的荧光羰花菁染料(DiO)染色,用标准平板读数器定量外泌体,该方法的检测限可以达到0.5 pM。同样,He等^[82]报道了一种集成微流控的方法,该方法能够直接从患者血浆中通过免疫分离得到外泌体,并且实现对外泌体蛋白质的原位分析。与传统的方法相比,该技术能显著提高检测的灵敏度,同时将测定的时间和样品的需求减少两个数量级。

最近,He等^[83]提出一种基于铜介导的信号放大的方法直接、快速地检测肿瘤外泌体,如图5所示。该方法分为三个步骤:首先,利用修饰了胆固醇的磁性纳米颗粒捕获外泌体;之后,修饰了适配体的氧化铜纳米颗粒特异性识别磁性纳米颗粒捕获的外泌体,形成磁性颗粒-外泌体-氧化铜三明治结构。最后,形成的三明治复合物被硝酸溶解,氧化铜转化为Cu²⁺,在聚胸腺嘧啶存在下,抗坏血酸钠可将Cu²⁺还原为Cu 荧光纳米簇。随着被还原的Cu 荧光纳米簇的增多,测得的荧光强度也随之增强,该荧光强度与外泌体的浓度成正比,从而实现对外泌体的检测。

荧光法具有较好的灵敏度,且可以实现实际样品的在线分析,在临床上具有很好的应用前景,但需要使用大型的仪器,价格比较昂贵。

5.3 表面增强拉曼法(SERS)检测肿瘤外泌体

表面增强拉曼光谱(surface enhanced raman scattering, SERS)是一种分子振动光谱,可以通过将分子吸附在粗糙金属表面或纳米结构上来实现拉曼散射信号的增强^[84],如等离子体磁性二氧化硅纳米管等。近年来,许多基于金属纳米材料的表面增强拉曼光谱技术被应用于肿瘤外泌体的检测。

Zong等^[85]利用表面增强拉曼光谱技术,构建了一个基于SERS纳米探针和磁性纳米珠检测肿瘤外泌体的平台。该方法利用了外泌体上携带的不同蛋白和相应抗体之间的免疫亲和作用。在磁性纳米珠和SERS纳米探针的表面分别修饰两种特异性抗体,与肿瘤外泌体形成三明治夹心结构。通过测得的SERS信号可以对肿瘤外泌体进行定性和定量检测。Park等^[86]通过表面增强拉曼的数据分别对肺癌患者和非癌症患者来源的外泌体进行区分。如图6所示,比较了肺癌细胞来源的外泌体和正常细胞分泌的外泌体的整个SERS谱图,显示出两者具有明显的差别。

Wang等^[87]利用磁性颗粒修饰CD63适配体,结合三种不同的适配体组装成三种SERS探针,实现了对乳腺癌细胞SKBR3、前列腺癌细胞LNCaP及结肠癌细胞T84分泌的外泌体的同时检测。Li等^[88]开发了一种聚多巴胺修饰的免疫捕获底物和聚多巴胺包裹的抗体-信标-银-金的多层复合物作为SERS的信标,使用超小体积的血清就可以实现对外泌体的诊断、分类和胰腺癌的转移监控。在2 μL的样品溶液中,检测限可达一个外泌体,从而实现了对胰腺癌外泌体的超灵敏和特异性检测。此外,由于临床需要,这种液体活检的方法还可以区分出转移性肿瘤和非转移性肿瘤,p1-2期和p3期的肿瘤,无需组织病理学的检查。

表面增强拉曼法具有操作简单、所需样品少、光谱分辨率高、多种外泌体可同时检测等优点,在外泌体快速分析检测上具有较大的应用前景。

5.4 表面等离子体共振法检测肿瘤外泌体

表面等离子体共振(surface plasmon resonance, SPR)是一种物理光学现象。当光线入射到由贵金属构成的纳米颗粒上时,如果入射光子频率与贵金属纳米颗粒或金属岛传导电子的整体振动频率相匹配时,纳米颗粒或金属岛会对光子能量产生很强的吸收作用,产生局域表面等离子体共振(localized surface plasmon resonance, LSPR)现象^[89,90]。

基于局域表面等离子体共振的原理,Thakur等^[91]构建了一个基于金纳米岛(SAM-AuNIs)的LSPR效应的生物传感器,用于癌细胞来源的外泌体的直接检测。在这个工作中,他们构建的生物传感器,可用于检测和区分从A549细胞、SH-SY5Y细胞、血清和来自肺癌小鼠模型尿液分离出来的外泌体。结果表明,未功能化修饰的LSPR生物传感器可以对不同癌细胞来源的外泌体产生不同响应,从而实现区分。除此之外,Im等^[92]报道了一种用纳米等离子体激元传感器对外泌体进行无标记检测的方法,该方法基于周期性纳米孔的非凡光学传输^{[93,94,95,96,97,98]},等离子体纳米孔的探测深度(<200 nm)与外泌体的大小尺寸相当,可以提高检测的灵敏度。他们设计了一种新型的SPR芯片,名为纳米等离子体激元(nPLEX)传感器,其主要使用金属膜图案化的周期性纳米孔阵列,每个阵列都使用功能化的抗体用于识别不同外泌体的蛋白标记物。通过与外泌体的特异性结合,nPLEX传感器显示与目标标记蛋白质含量水平成比例的光谱偏移或强度变化。与传统方法相比,nPLEX提供了高灵敏度和无标记的外泌体分析技术,实现了对外泌体进行实时和连续的监控。Sina等^[99]提出了一种基于SPR的生物传感器,用于从患者血清样本中分离出用于临床分析的外泌体,并对分离出的外泌体进行量化。量化的结果可以反应出疾病的分期,并能无创地监测肿瘤受体表达水平的个体差异。该方法首先使用四跨膜生物标志物(如CD9、CD63)初步分离外泌体,随后使用肿瘤特异性标志物(如HER2)检测捕获的大量外泌体中与临床相关的外泌体。

SPR技术具有能实时检测、分析样品无需标记、灵敏度高、无背景干扰等特点,使其在外泌体检测中具有很大的优势。

5.5 电化学方法检测肿瘤外泌体

电化学分析方法具有灵敏度高、测量范围宽、仪器设备简单、价格低廉等特点,有利于复杂生物基质中的生物分子检测。目前已经有多篇文献报道将该方法应用于肿瘤外泌体的检测^[48,100~106]。

Yadav等^[100]利用电化学检测的方法,能够直接量化细胞培养基中某特定疾病对应的外泌体。该测定方法主要分为两个步骤。首先,使用通用抗体(即四跨膜生物标志物,如CD9)捕获大量外泌体;随后使用癌症特异性抗体,即人类表皮生长因子受体2(HER2)抗体,与乳腺癌来源的外泌体特异性结合,从而能够量化HER2阳性表达的外泌体。利用差示脉冲伏安法(differential pulse voltammetry, DPV),在[Fe(CN)₆]^3-/4-溶液中检测每一步修饰的过程。结果显示该方法对复杂体液样品中的外泌体有很好的响应。Kilic等^[101]构建了一个免标记的电化学生物传感器测量在乏氧和常规情况下乳腺癌细胞分泌的外泌体。实验结果表明,乳腺癌细胞在CoCl₂ 诱导的乏氧条件下产生的外泌体是常规条件下的1.23倍。除此之外,Jeong等^[102]报道了一个融合磁化学和电化学于一体的外泌体检测平台(integrated magnetic-electrochemical exosome, iMEX)。iMEX平台的独特功能是将外泌体的分离、富集和检测整合在一起。首先,磁珠表面修饰了能与外泌体膜上四跨膜蛋白特异性识别的抗体,用于选择性地捕获血清、血浆和尿液等体液(无细胞)中的外泌体。随后,再将标记有HRP的二抗加入信号单元中,与外泌体上的蛋白特异性结合,形成手拉手式的结构。最后,通过酶催化TMB的氧化还原实现电化学信号的放大。iMEX平台充分利用了抗原-抗体之间的高度特异性结合的优势,磁珠的使用也极大地简化了测定程序,样品基质和过量的试剂可以通过简单的洗涤除去,并且捕获的外泌体都集中在检测单元上。Boriachek等^[103]报道了一种电化学溶出伏安法。该方法通过免疫分析结合外泌体,利用量子点中金属的溶出作为信号来检测疾病中的外泌体。该测定主要包括三个步骤,首先,通过修饰了四跨膜蛋白(如CD9或CD63)抗体(一抗)的磁珠来捕获外泌体。随后选择CdSe量子点(CdSe QD),在其表面修饰生物素,之后与HER-2和FAM-134B抗体结合(二抗),作为乳腺癌和结肠癌的标志物。该二抗与之前的外泌体、一抗形成夹心结构。在磁性清洗和纯化之后,首先将CdSe QDs在酸性条件下溶解,随后在裸露的玻碳电极上用阳极溶出伏安法检测Cd²⁺的含量。通过检测Cd²⁺的信号,可以实现对不同肿瘤外泌体的定量检测。Wang等^[104]基于DNA纳米结构和便携式电化学装置的优势,构建了DNA四面体纳米传感器(nanotetrahedron, NTH),用于直接捕获和检测肝癌细胞来源的外泌体。他们首先把四面体DNA修饰到电极上,其中四面体DNA结构中含有适配体的DNA序列,用于特异性识别外泌体。该适配体是通过体外筛选技术得到,能够特异性地识别肝癌细胞分泌的外泌体。随后,外泌体被捕获到电极上,在K₃[Fe(CN)₆]/KCl 溶液中检测每一步的修饰过程。通过差示脉冲伏安法实现了对外泌体的高灵敏度检测。Zhou等^[105]利用适配体与蛋白质EpCAM和PSMA的特异性识别,构建了检测外泌体和微粒体的生物传感器。该方法是把两种分别识别EpCAM和PSMA蛋白的核酸适配体固定在芯片上,实现特异性捕获目标物,修饰了核酸适配体的铜纳米粒子(Cu NPs)和银纳米粒子(Ag NPs)与芯片上的外泌体和微粒体作用,通过线性扫描伏安法(linear sweep voltammetry, LSV),读出Cu NPs和Ag NPs在相应电位下的电化学氧化信号,利用此方法可以简单快速的检测外泌体。除此之外,Zhou等^[106]基于CD63适配体建立了电化学生物传感器。首先,把适配体固定在电极表面,一端与修饰了氧化还原标记物的DNA链杂交,当目标物外泌体存在时,CD63适配体能识别外泌体膜结构上的CD63蛋白,使固定在电极上的探针DNA弯曲,从而释放出信号探针DNA链,电化学信号发生“ON-OFF”的变化过程,达到检测的目的。

Dong等^[48]利用电化学方法间接检测了人前列腺癌细胞来源的外泌体。该方法主要分为两个部分A和B(如图7所示)。A部分主要是在磁珠表面修饰适配体以及与之部分互补的M1、M2和M3 DNA,外泌体能够与适配体结合,将M1、M2和M3释放出来,将外泌体的检测转化为DNA的检测,理论上一个外泌体可以释放出三条DNA链,从而有效地提高检测的灵敏度。B部分是利用差示脉冲伏安法(differential pulse voltammetry, DPV)对A中分离的M1、M2和M3进行检测。通过核酸外切酶Ⅲ(Exo Ⅲ)的循环剪切作用实现信号的扩增,从而进一步提高检测的灵敏度。结果表明,DPV峰电流值与外泌体个数(1000~120 000)的对数呈现线性关系,检出限为70 particles/μL。

对肿瘤细胞来源的外泌体进行检测分析是外泌体研究中的一项很大的挑战,常用的检测方法有比色法、荧光法、表面增强拉曼法、表面等离子共振法及电化学方法。在这些方法中,比色分析法和表面增强拉曼法快速、简单、操作方便且经济有效,不仅可以实现对外泌体的定量检测,而且可以对外泌体表面的多种蛋白质的含量进行定量分析,在外泌体快速分析检测上具有较大的应用前景。其次,荧光法操作也比较方便、具有较好的灵敏度,还可以实现对实际样品的在线分析,在临床上有很好的应用前景,但需要使用大型的仪器,价格比较昂贵并且有较大的背景信号。与荧光法相比,电化学分析方法具有仪器设备简单、价格低廉、灵敏度高、测量范围宽等特点,有利于复杂生物基质中的生物分子检测,但实验的重现性较差。相比于其他几种方法,表面等离子体共振技术具有无需标记,无背景干扰,能够实现对样品的实时检测、灵敏度高等特点,但是其也存在不足,在检测成本、稳定性、检测效率等方面还存在欠缺。因此,可以根据实验目、试验方法的优缺点、实验条件,选择一种相对较好的检测外泌体的方法,这不仅有助于一些肿瘤的早期诊断,而且有助于肿瘤的临床监控、疗效评估以及预后判断。

6 结论

液体活检是一种先进的癌症检测技术。作为新兴的液体活检标志物,外泌体的检测成为目前研究的热点。迄今为止,越来越多的技术手段应用于体液中外泌体的检测。本综述概括介绍了外泌体的生成、分离、表征及检测的研究进展。到目前为止,研究者利用抗体或适配体对外泌体表面蛋白的特异性识别作用,结合多种检测技术,已经实现了多种癌症来源的外泌体的高灵敏度检测。外泌体表面蛋白的表达与肿瘤的发展及治疗具有紧密的联系,结合生物研究应用和医学诊断的需求,目前迫切需要开发和完善新型实验技术,实现对临床样品的外泌体进行持续性动态检测,从而获得癌症发展与外周血中肿瘤外泌体数量的相关性数据,并且,利用二代测序分析技术能够更准确地分析外泌体中与肿瘤相关的基因序列,为癌症诊断和治疗提供可靠参考。另外,外泌体含有许多的miRNA,其表达量与肿瘤细胞的发生有较大的关系,由于外泌体脂质双分子层的性质可以保护miRNAs不被体液中的细胞RNA酶降解,这些发现和优势使外泌体中的特定miRNAs成为早期诊断和预后的非侵入性生物标记物的理想来源。相信随着技术的逐渐发展完善,基于外泌体的液体活检在临床应用方面将会取得进一步发展。

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