用于N-糖肽/糖蛋白分离富集的新型材料

梁阿新; 汤波; 孙立权; 张鑫; 侯慧鹏; 罗爱芹

doi:10.7536/PC190103

化学进展 ›› 2019, Vol. 31 ›› Issue (7) :996-1006 DOI: 10.7536/PC190103

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用于N-糖肽/糖蛋白分离富集的新型材料

梁阿新 ¹ ,
汤波 ¹ ,
孙立权 ¹ ,
张鑫 ¹^,² ,
侯慧鹏 ¹ ,
罗爱芹 ¹^,^*

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New Materials for the Separation and Enrichment of N-Glycopeptides/Glycoproteins

Axin Liang ¹ ,
Bo Tang ¹ ,
Liquan Sun ¹ ,
Xin Zhang ¹^,² ,
Huipeng Hou ¹ ,
Aiqin Luo ¹^,^*

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摘要

蛋白质糖基化在调节各种复杂的生物过程中,如分子识别、免疫应答和蛋白质折叠等起着至关重要的作用。由于糖肽/糖蛋白在复杂生物样品或临床样品中丰度较低,进行糖蛋白组学分析前往往需要进行目标蛋白的分离富集。研究开发具有高效糖蛋白分离富集能力的新型材料对糖蛋白/糖肽的研究具有重要意义。近年来报道了许多新型糖蛋白分离富集材料,如有机高分子材料、生物基材料、新型有机骨架材料和新型功能复合材料等。这些材料因其结构、生物相容性和理化性质等特点,从不同层面推动了糖蛋白分离富集技术的发展。本文就目前国内外有关糖肽/糖蛋白分离富集的新型材料进行了总结和讨论,并对其未来发展提出展望。

Abstract

Protein glycosylation plays a crucial role in regulating various complex biological processes, such as molecular recognition, immune response, and protein folding. Since glycopeptides/glycoproteins are less abundant in complex biological samples or clinical samples, separation and enrichment of target proteins are often required before glycoproteomics analysis. Research and development of novel materials with high-efficiency glycoprotein separation and enrichment ability are of great significance for the study of glycoprotein/glycopeptide. In recent years, many new glycoprotein separation and enrichment materials have been reported, such as organic polymer materials, bio-based materials, new organic framework materials and new functional composite materials. Due to their structure, biocompatibility and physical and chemical properties, these materials have promoted the development of glycoprotein separation and enrichment technology from different levels. In this paper, the new materials related to the separation and enrichment of glycopeptide/glycoprotein at home and abroad are summarized and discussed, and the future development is proposed.

Graphical abstract

关键词

蛋白质糖基化 / 糖蛋白 / 糖肽 / 分离富集 / 新型材料

Key words

protein glycosylation / glycoprotein / glycopeptide / separation and enrichment / new material

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梁阿新, 汤波, 孙立权, 张鑫, 侯慧鹏, 罗爱芹. 用于N-糖肽/糖蛋白分离富集的新型材料[J]. 化学进展, 2019, 31(7): 996-1006 DOI:10.7536/PC190103

Axin Liang, Bo Tang, Liquan Sun, Xin Zhang, Huipeng Hou, Aiqin Luo. New Materials for the Separation and Enrichment of N-Glycopeptides/Glycoproteins[J]. Progress in Chemistry, 2019, 31(7): 996-1006 DOI:10.7536/PC190103

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1 Introduction

2 Organic polymer separation and enrichment materials

3 Bio-based separation and enrichment materials

4 New types of organic frameworks materials

4.1 Metal organic frameworks,MOFs

4.2 Covalent organic frameworks,COFs

5 New composite separation and enrichment materials

5.1 SiO₂ nanoparticles

5.2 Magnetic nanocomposites

5.3 Molecular imprinting polymer materials

6 Other materials

7 Conclusion

1 引言

蛋白质糖基化是最重要和普遍的翻译后修饰之一,在调节各种复杂的生物过程中起着至关重要的作用,如细胞间相互作用、分子识别、蛋白质折叠和免疫反应等^[1,2,3,4]。糖蛋白的糖链结构和构型的变化往往和疾病的发生发展过程相关,如在癌症、肿瘤等疾病中有很多异常的糖基化蛋白^[5,6,7,8]。在生物检测中,糖蛋白被认为是重要的生物标记物和治疗靶点,并被用于医疗诊断。糖蛋白的准确定量分析是阐明糖基化蛋白质的生物学功能和研究糖蛋白与各种生理疾病的相关分子机制的基础,在生物学领域中具有重要意义。

近年来,质谱(Mass spectrometry, MS)因具有高通量、宽动态范围和超高灵敏度等特点,已经成为蛋白质糖基化表征的首要技术^[9,10,11]。但糖肽在复杂生物样品或临床样品中的含量较低(糖基化肽在蛋白质总酶解肽中占的比例为2%~5%)^[12],且样品中非目标物会对质谱信号产生严重的干扰,直接的质谱分析还非常困难^[13]。另一方面,由于糖肽的电离效率低于电喷雾电离肽的电离效率,在使用液相色谱与串联质谱联用进行分析之前也经常需要富集^[13]。因此,在质谱分析之前对样品中糖蛋白/糖肽进行分离富集处理非常重要^[14]。

在诸多糖蛋白质富集技术中,化学方法是富集技术的主导。邵文亚等^[15]对糖基化蛋白质样品不同富集方法进行了综述。根据其富集机理不同,主要分为凝集素亲和法、酰肼化学法、亲水作用色谱法及硼亲和法等^{[15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26]}。

现如今,对于糖蛋白质组的研究还处于技术发展的初级阶段,目前已研究报道的富集材料有有机高分子材料、生物基材料、新型有机骨架材料和新型功能复合材料等,这些材料分离富集糖蛋白的优势在于生物相容性好、稳定性高、结构独特以及应用潜力大等,在分离富集方面有较高的研究价值和宽广的应用前景^[27,28,29]。因此,分析总结新型糖蛋白/糖肽分离富集材料的设计和应用,不仅对蛋白质糖基化的研究意义重大,还能推动生物分离的新技术发展。

目前,糖蛋白/糖肽在复杂生物样品或临床样品中的丰度较低是蛋白质糖基化研究的重点和难点,本文就N-糖蛋白/糖肽分离富集材料的研究进展和应用进行了归纳总结和讨论分析。这些材料包括:常用材料——有机高分子分离富集材料和生物基分离富集材料;新型材料——新型有机骨架材料和新型功能复合材料;还包括TiO₂、亲水作用色谱柱(ZIC-HILIC)和石墨相氮化碳(Graphitic Carbon Nitride, g-C₃N₄)。

2 有机高分子分离富集材料

有机高分子材料因结构独特、大小可控、易于修饰等特点,在20世纪60年代就作为色谱介质用于生物大分子的分离,但受限于当时的聚合技术等因素,早期聚合物稳定性较差,应用受到了极大的限制。近年来随着聚合技术的发展,在多肽等生物分子分离纯化中的应用也越来越广泛^[30]。

Wang等^[31]通过均苯三甲酰肼(BTZ)和对苯二异氰酸酯(PDI)的聚合反应制备了一种新型的聚酰基氨基脲类有机高分子化合物(图1)。该有机高分子材料具有多孔性(比表面积166 m²/g)和良好的亲水性。将其用于低丰度糖肽的富集处理,并使用毛细管液相色谱-串联质谱(cLC-MS/MS)对样品酶解液进行分析,从100 μg鼠肝蛋白酶解液中鉴定出属于605个糖蛋白的1919个糖肽的1350个N-糖基化位点。这表明有机高分子材料在糖蛋白组学研究中具有较强的应用潜力。

Zhang等^[32]制备了新型3-氨基苯硼酸功能化的甲基丙烯酸缩水甘油酯-乙烯二甲基丙烯酸酯共聚物微球,用于糖肽/糖蛋白的固相萃取。结果表明,微球对糖蛋白有良好的吸附作用。此外,采用固相萃取微柱填充微球,有效地富集了人血清酶解物中的糖肽。

Sun等^[33]先采用悬浮聚合法合成单分散的大孔树脂(Macroporous Adsorption Resin, MAR),再通过层层自组装(Layer by Layer, LbL)进一步包覆玻尿酸(Hyaluronate, HA)和壳聚糖(Chitosan, CS),最后得到具有良好亲水性的MAR@(HA/CS)₂₀有机高分子材料。该材料作为固相萃取填料,对N-糖肽有较好的富集分离效果。实验结果表明:该分离富集材料对IgG酶解液的检出限低至5 fmol,回收率则高于73%;而对小鼠肝脏提取物富集分析中,共鉴定出1353个糖肽,属于379个N-糖蛋白中的744个糖基化位点。

3 生物基分离富集材料

生物基材料具有来源广、可再生、可降解、生物安全性好等优点,在生物医学领域有着广泛的应用前景。近年来,纤维素、环糊精、壳聚糖等生物材料及各种衍生物材料,已被广泛应用于蛋白的分离与富集^[34,35]。生物基材料因富含极性基团(氨基和羟基),具有良好亲水性的同时,可直接或进一步修饰和改性后用于对低丰度N-糖蛋白/糖肽的分离富集。

He等^[36]使用溶胶-凝胶法(sol-gel transition method)制备出粒径约40 μm、比表面积191 m²/g、平均孔径为10 nm、并具有高稳定性的壳聚糖多孔微球(CSMs)。利用CSMs 的高比表面积和丰富的亲和位点,通过与nanoLC-MS/MS联用,分别从2 μL人血清和0.1 mg大鼠脑组织酶解液中分离鉴定出194个和947个N-糖肽位点。

纤维素作为常见的生物质材料也被应用于糖蛋白的分离富集研究。Sha等^[37]利用溶胶-凝胶法制备了高亲水性的纤维素微球富集材料。填充了纤维素微球的移液枪枪头(CM-PTs)可用于糖蛋白的快速分离富集。

Liu等^[38]使用了一种天然生物基材料:来白木棉树(Bombax Ceiba, L)的木棉纤维(Kapok Fiber),将其制成kapfib-tip富集柱后用于唾液酸化糖肽的选择性富集,方法学考察中发现其具有较低的检测限和良好的重复性;在胎球蛋白和转铁蛋白中分别富集到45和25个唾液酸化糖肽。

Zou等^[39]对壳聚糖依次用甲基丙烯酸环氧丙酯(GMA)和亚氨基二乙酸(IDA)进行修饰,得到亲水性纳米材料CS@PGMA@IDA,对IgG和HRP酶解液中糖肽都有很好的富集效果,其中,从IgG酶解液中分离出39个N-糖肽,富集效果最好;在对复杂样品分析中,从1 μL人血清样品富集到217种糖肽,优于之前的报道。该方法的原理为:带氨基和羟基的CS与甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)共价相互作用,然后GMA自聚合并与CS共聚生成CS@PGMA(2),其聚合物链上具有大量的环氧活性官能团。其次,利用环氧化物与IDA氨基之间的亲核加成,通过在CS@PGMA上锚定亚氨基二乙酸(IDA)合成CS@PGMA@IDA(3)(见图2)。基于产物的产率,我们可以计算该聚合物包含约66.7 wt%的涂覆聚合物和33.3 wt%的CS。该方法基于大比表面积、良好的生物相容性和优异的亲水性,通过极高的检测灵敏度(0.1 fmol),高浓缩回收率(96%)评估了新型的CS@PGMA@IDA纳米球,高度特异性捕获HRP和BSA的胰蛋白酶消化物中的糖肽直至1:300的摩尔比,并从1 mL人血清消化物中鉴定出大量糖肽。可以预期CS@PGMA@IDA在糖蛋白组研究中具有巨大的潜力。

蛋白质糖基化在生物系统中普遍存在,是细胞生存所必需的。然而,多聚糖的异质性和许多糖蛋白的低丰度使它们的分析变得复杂。基于硼酸和多聚糖之间可逆共价相互作用的化学方法具有丰富糖肽的巨大潜力,但结合亲合力通常不足以捕获低丰度物种。基于此,Xiao等^[40]提出了一种用树状大分子-共轭苯并氧唑促进糖肽富集的策略。他们对几种硼酸衍生物的性能进行了测试,结果表明苯并口恶唑明显提高了人类细胞裂解物中糖肽的含量。通过将苯并口恶唑与树状大分子结合,进一步提高了富集效果,从而使苯并口恶唑与甘氨酸的相互作用具有协同作用。这种稳健和简单的方法对敏感的糖蛋白组学分析,特别是捕获低丰度的糖肽是非常有效的。更重要的是,浓缩的糖肽保持原状,使目前的方法与质谱方法相一致,以确定糖基化位点和糖基结构。

生物基富集糖肽的优势在于它是一种可再生的高分子材料,具有生物相容性好、稳定性高和比表面积大等特点,在吸附分离方面有较高的研究价值和宽广的应用前景^[41]。尽管已经报道了一些用天然多糖材料(例如凝集素、琼脂糖和纤维素)选择性富集糖肽的方法,但是这些方法耗时较长,并且不适用于亚微米级的样品。Ohat等^[13]将微晶纤维素填充到移液枪枪头中,制备成stop-and-go提取柱(StageTip),糖肽选择性富集可以在几分钟内达到纳克级,具有低成本、高通量、回收率高和易于使用等特点。将其用于N-糖肽和O-糖肽的富集,不仅能明显地增强质谱的信号,还能富集到之前不能检测出的多个糖蛋白。

4 新型有机骨架材料

分离富集是一个重要的工业步骤,在化学、石化、生物制药和核工业以及其他领域都发挥着关键作用。尽管已经取得了很大的进步与发展,但由于对诸如效率、健康和环境影响以及现有技术成本等因素的担忧,探索更好的分离富集技术,特别是通过发现高性能分离材料,继续引来越来越多的关注^[42]。近年来,作为新型有机骨架材料的新成员,二维金属有机骨架(MOFs)和共价有机骨架(COFs)被成功开发,并得到广泛的应用^[43]。

4.1 金属-有机骨架

金属-有机骨架(Metal Organic Frameworks,MOFs)是由金属离子或金属簇与有机配体组装而成的一种晶体材料,由于其良好的孔隙大小和几何形状加上前所未有的可调性,已经显示出解决各种分离难题的巨大希望。在过去十年中,人们对MOFs材料的应用进行了广泛的研究,包括分离和捕获许多气体和蒸气,以及液体混合物和溶液的液相分离。MOFs材料也为对映选择性分离带来了新的机会,并且可以进行形态控制,例如制造膜来提高分离效果^[44]。

Ma等^[45]用简单的两步法先将Au纳米修饰到MOFs(MIL-101)上,再通过Au—S键将L-半胱氨酸(Cys)结合上去,得到氨基酸衍生化的MOFs材料MIL-101(NH₂)@Au-Cys,该MOFs复合材料对模型蛋白和HeLa细胞溶解物中N-糖肽都具有很好的富集作用:①从辣根过氧化物酶(HRP)和IgG酶解液中分别富集出16和31个N-糖肽,并表现出孵育时间短(5 min)、吸附量大(150 mg/g),选择性好(1:50)、回收率高(>80%)和检测限低(1 fmol)等特点;②在HeLa细胞裂解物的检测中,共鉴定出1069个N-糖肽,属于614个糖蛋白的1069个糖基化位点,相比于之前的研究,具有更好的富集效果。

Wang等^[46]则合成了一种新型的MOFs(ZIF-8)修饰磁性石墨烯生物复合材料MG@Zn-MOFs,该复合材料在糖肽分析中表现出高灵敏度、强选择性以及良好的可回收性;在实际应用中该复合材料从1 μL人血清样品中可以鉴定出151个糖蛋白中的517个N-糖肽,这是迄今为止研究中最好的结果。

Liu等^[47]用水热法合成了具有游离羧基的亲水性MOFs材料(UiO-66-COOH),该材料可从1 pmol/μL的IgG酶解液中富集鉴定出24种糖肽,而直接质谱分析仅能检测出6种不同的糖肽;对于HRP酶解液,当浓度低至0.5 fmol/μL时,富集后溶液依旧能检测出糖肽的信号;对人血清的分析中,从2 μL人血清酶解液中共鉴定出来自93个不同蛋白的255种糖肽。

基于亲水作用色谱(HILIC)的纳米复合材料在糖肽富集中仍是一个热门话题。在各种底物中有不同的富集效率,如介孔二氧化硅、磁性纳米颗粒、天然多糖和金属-有机骨架材料(MOFs)。其中,MOFs材料的优势在于其超高活性表面、可调控纳米结构空腔、酸碱耐受性高和可定制化学结构等。因此,MOFs成功地在分离科学中成为气相和液相色谱的固定相、固相萃取材料和对映选择性分离材料。然而,MOFs的合成方法(包括固体研磨、化学气相沉积和模板合成)通常需要繁琐复杂的程序。利用MOFs材料对糖蛋白/糖肽大规模普适性的分离富集应用还需要进一步研究。

4.2 共价有机骨架

共价有机骨架(Covalent Organic Frameworks, COFs)是由强共价键连接的结晶性有机多孔材料。自从Yaghi等^[48]在2005年报道了第一个COFs以来,COFs的研究引起了大量的关注,并取得了显著的进展。COFs根据其结构特征的维度可以分为二维(2D)框架和三维(3D)框架。二维COFs通常由单层结构或多层堆叠结构组成,并借助π-π相互作用(如COF-5和ZnP-COF),多层结构具有周期性和无限的拓扑结构是由多功能砌块共价连接形成的。3D COFs通常通过四面体结构构建块将网络框架扩展到三维空间(如COF-105和COF-108)^[49]。共价有机骨架材料以轻元素C、O、N、B等的共价键连接而构建,经热力学控制的可逆聚合形成有序多孔结构,具有稳定性好、质量密度低、孔隙可控和比表面积大等特点,在催化、气体储存、分离和传感等领域有广泛的应用研究^[50,51]。

Ma等^[52]合成了一种亲水性的COFs TpPa-1(粒径6 μm)(图3),对IgG和HRP中的糖肽都有很好的富集效果,使用这种材料,可以有效地消除来自非糖肽的干扰,这促进了糖肽的质谱检测,且该材料在多次(10次)使用后,依旧具有很好的吸附性。在对健康人血清样品分析中,TpPa-1从10 μL人血清酶解液中富集鉴定出128个糖肽,属于70个糖蛋白,这证明了其在预处理复杂生物样品中的潜力。

COFs衍生材料在糖蛋白组学和临床诊断领域具有巨大的应用潜力,它还将为应用基于COFs的材料开创新的阶段。Wang等^[53]通过简单的自组装方法,合成了一种新型的COFs官能化磁性石墨烯生物复合材料(MagG@COF-5),并将其用于N-糖肽的富集,具有检测限低(0.5 fmol/μL)、选择性好(1:600)、回收率高和可重复使用等特点。该方法的原理为:Fe₃O₄纳米粒子通过水热反应均匀地装饰在石墨烯上(MagG);然后通过自组装生长策略在100 ℃下将COF-5涂覆在MagG纳米材料的表面上48 h以获得均匀的纳米多孔亲水性生物复合材料。该材料用于对人血清样品(1 μL)的分析,检测到来自85个糖蛋白的232个N-糖肽。

5 新型复合分离富集材料

5.1 多孔硅基纳米材料

二氧化硅属于无机非金属材料,具有吸附性强、可塑性良好、同时具有高磁阻性和低热导性等特性,已被广泛应用于电子冶金、航空航天以及医药卫生行业^[54]。目前,国内外研究者通过可控聚合方法,在二氧化硅材料表面嫁接含有多种官能团的聚合物来提高对糖蛋白的选择性、结合容量以及材料的亲水性,已成为现在发展新型糖蛋白/糖肽富集材料的主要方法^[55,56]。

Bibi等^[57]合成了介孔二氧化硅(SBA-15),在其表面进行磺酸修饰(SBA-15-SO₃H),功能化的SBA-15显示出大的比表面积(520 m²/g)和可进入的孔隙(4.8 nm)可以通过氢键和亲水作用选择性地吸附糖肽。该方法的原理为:SBA-15的官能化可方便地通过在SBA-15上固定3-巯基丙基三甲氧硅烷(MPTMS),然后用H₂O₂氧化—SH基团形成活性磺酸基团来实现;具有大量磺酸基团的SBA-15的多孔结构确保了糖肽的吸附选择性和容量(图4)。因此,该方法对于从不同糖蛋白的消化物中检测糖肽显示出高灵敏度,SBA-15-SO₃H在选择性富集和鉴定用于糖蛋白组学研究的糖肽方面提供了强有力的材料。

Sun等^[58]设计并合成了一种半胱氨酸基麦芽糖修饰的亲水性硅胶材料Cys-Mal@SiO₂(图5),并将其制备成固相萃取柱用于糖肽的富集:在以IgG酶解液为样品进行富集鉴定时,Cys-Mal@SiO₂鉴定糖肽的质谱信号强度和信噪比较商品化提取材料更高;在复杂的鼠肝蛋白质提取物的糖蛋白质组学分析中,Cys-Mal@SiO₂共鉴定出1551条N-糖肽,属于466个糖蛋白的906个N-糖基化位点,这表明Cys-Mal@SiO₂在蛋白质组学研究中具有一定的应用潜力。

Yao等^[59]将丙烯酰化脯氨酸(Acrylamide Proline, AA-Pro)通过原子转移自由基聚合(ATRP)成功地固定到介孔二氧化硅上,构筑了一种新型色谱材料Poly-Pro@SiO₂(图6),并应用于糖肽的高效分离与富集。通过一系列测试证明丙烯酰化脯氨酸成功接枝在硅球上。同时,在糖肽分离富集测试中,该材料表现出良好的效果,从Fetuin酶解液中共获得15条糖肽,与富集前相比,检测到糖肽的个数增多,且信号强度增强。实验证明丙烯酰化脯氨酸修饰介孔二氧化硅可用于糖肽的分离富集, 同时为开发糖肽富集材料提供了一个新途径。

5.2 磁性纳米材料

磁性纳米粒子作为一种新型的功能材料,具有超顺磁性、高分散性和生物相容性等特点,在生物医学、细胞学和生物工程等领域已经有了广泛应用^{[60,61,62,63,64,65]}。人们在磁性微粒表面进行修饰或者将其与其他材料进行结合,这些功能化的磁性纳米复合材料可进一步用于糖肽的富集。

生物样品中糖肽的低丰度使得在进一步分析之前需要富集样品。Jiao等^[66]将亲水性的离子液体MAC修饰到包覆有聚合物的Fe₃O₄磁性纳米材料上,得到Fe₃O₄@MPS@PMAC磁性纳米粒子(平均直径150 nm)(图7)。该方法的原理为:Fe₃O₄通过溶剂热反应合成并用TEOS修饰形成一层SiO₂;MPS被加载到Fe₃O₄上以提供用于反应沉淀聚合的双键;最后,用MAC作为单体,MBA作为交联剂,AIBN作为引发剂进行反应-沉淀聚合。该粒子在对糖肽的富集上表现出高灵敏度(10 fmol)、高吸附容量(100 μg/mg)和高回收率(82%)的特点,该磁性颗粒被用于HeLa外泌体蛋白中糖肽的富集,用MALDI-TOF/TOF MS检测富集物,结果表明,50 μg的HeLa外泌体蛋白中共鉴别出来自于536种糖蛋白的1274种不同糖肽,这些结果表明Fe₃O₄@MPS@PMAC纳米粒子用于糖蛋白质组学分析和外来体研究的潜力。

基于HILIC模式的研究重点是开发简便的低丰度糖肽富集方法。具有突出的生物相容性和亲水性的碳水化合物在动物和植物中无处不在,并且可以作为用于糖肽富集的功能组的极好选择。Li等^[67]将6-磷酸葡萄糖(G6P)修饰到合成的Fe₃O₄纳米粒子上,得到亲水性的Fe₃O₄@G6P磁性纳米微球,发现其在糖肽的富集应用中具有高灵敏度(0.5 fmol/μL)、高选择性(1:100)和良好的重复性(>10次)等特点。且Fe₃O₄@G6P磁性纳米微球对不同的生物样品都有吸附效果:将人类血清和唾液还原和烷基化处理后用胰蛋白酶分解得到多肽混合物,对混合物用Fe₃O₄@G6P磁性纳米微球富集处理,结果表明从2 μL血清和唾液中分别检测出243种和183种N-糖肽。

鉴于糖基化对人类健康的生物学意义,来自复杂生物样品的糖蛋白组分析对于发现疾病生物标志物和临床诊断具有高度倾向性。尽管如此,由于糖肽与非糖基化肽和聚糖微观不均一性相比丰度较低,因此需要从复杂生物样品中高选择性地富集糖肽以用于质谱分析。Liu等^[68]先用甲基丙烯酸修饰Fe₃O₄纳米粒子得到核-壳型的Fe₃O₄@聚甲基丙烯酸(Fe₃O₄@PMAA)材料,再用乙二酸二酰肼(ADH)对聚合物材料的表面改性处理得到Fe₃O₄@聚甲基丙烯酰肼(Fe₃O₄@PMAH)(图8),与商品化的酰肼产品的吸附效果对比发现,Fe₃O₄@PMAH富集的样品MS背景更干净,信噪比(S/N)提高了5倍,且磁性材料不需要离心操作,更节省时间。将该材料用于结肠癌患者血清(20 μL)中糖蛋白的富集,经MALDI-TOF分析后鉴定出175种糖肽,属于63种糖蛋白的181个位点。这种新型酰肼官能化的核壳型磁性纳米复合材料将为高通量复杂生物样品中的Nglyc蛋白质组分析揭开新的光芒。

磁性纳米材料因自身具有超顺磁性,所以很容易从反应体系中被分离出来,因此在生物分离或者富集领域具有很大优势。但影响磁性纳米颗粒大小和性能的因素较多(如温度和反应条件等),综合调控较难。此外,磁性纳米材料虽然近几年制备方法取得了较大的进展,但仍不能满足实际应用的需求。化学方法制备过程简单容易,但制备出的材料含有杂质。物理方法对制备条件要求较高,仪器设备复杂,成本高昂,但制备出的材料纯度较高。

5.3 分子印迹聚合物材料

含有与多肽侧链共价连接聚糖的糖蛋白在许多生物过程中起关键作用,如细胞间相互作用、分子识别和免疫应答^[69]。此外,由于它们与疾病的发生密切相关,尤其是癌症和炎症,已被视为治疗靶点和疾病生物标志物,对临床诊断具有重要的意义^[70,71]。然而,在没有任何预处理的复杂生物样品中,低丰度糖蛋白的测定仍然是个难题。

分子印迹技术(Molecular Imprinting Technology, MIT)制备的人工受体具有选择性识别能力,因其制备成本低、稳定性高、适用范围广,有望成为天然生物配体的替代物,即利用模板分子制备与之在空间形状、大小和功能基团上能够形成互补的印迹识别位点的分子印迹聚合物(Molecularly Imprinted Polymers, MIPs)^{[72,73,74,75]}。分子印迹聚合物可通过在模板存在下聚合可聚合试剂而制成;当模板被移除后,该材料可以用于传统抗体的许多应用。因此,MIP是抗体的仿生物,并已经实现了广泛的应用,例如感测、分离和诊断^[76,77]。

刘震等^[78]开发了一种称为硼酸盐亲和力可控面向印迹的方法,可以简便高效地制备糖蛋白、聚糖和单糖特异性MIP。该方法依赖于通过硼酸盐亲和相互作用将模板(糖蛋白、聚糖或单糖)固定在硼酸官能化的基底上,接着使生物相容性单体自聚合以在基底上形成具有合适厚度的印迹层。该方法中的印迹以可控的方式进行,允许根据模板的分子大小通过调整印迹时间来微调印迹层的厚度。这不仅简化了印迹程序,而且使得该方法广泛适用于大范围的含糖生物分子。通过这种方法制备的MIP表现出优异的结合特性并且可以应用于复杂的实际样品。由该方案制备的MIP已用于亲和分离、疾病诊断和生物成像。

作为许多疾病的生物标志物,糖蛋白对临床诊断具有重要意义。然而,在没有任何预处理过程的情况下确定复杂生物样品中的低丰度糖蛋白仍然是难点。Xie等^[79]基于pH双响应磁性纳米微粒(pH Double-Responsive Imprinted Magnetic Microspheres)提出一种快速简便的高效浓缩糖蛋白的分离方法。采用甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(DMA)为pH敏感单体,以4-乙烯苯硼酸(VPBA)为硼酸亲和单体,以卵清蛋白(OVA)为模板分子,通过自由基聚合在磁性微粒表面制备了薄层聚合物壳。结合pH敏感水凝胶和硼酸亲和材料的优点,通过改变溶液pH可以调节OVA快速溶胀/收缩性能。此外,该印迹材料在10 min达到81.2 mg/g的吸附量,为糖蛋白样品前处理开辟了新途径,并且在临床诊断中显示出糖蛋白检测的巨大潜力。

Kasper等^[80]提出了一种新的印迹方法来创建一种能够选择性地重新结合维生素K的MIP。由于维生素的天然结构不允许印迹,因此采用合成化合物甲二酮(维生素K)作为模板,开发了另一种印迹策略。结果表明,基于MIP的传感器对浓度越来越高的甲二酮和维生素K都有反应。两种化合物的检出限(LOD)分别为700 nmol和200 nmol。该传感器能够检测基线吸收样品和峰值吸收样品之间的差异,并能够用高效液相色谱法(HPLC)对维生素K浓度进行定量测定,与验证实验很好地吻合。通过这种方式,首次揭示了一种低成本、简单便捷的维生素K传感器的原理。

Li等^[81]采用基于硼酸盐亲和力的可控定向表面印迹技术制备了糖蛋白印迹磁性纳米颗粒。首次将糖蛋白固定在硼酸功能化磁性纳米颗粒表面。随后,对2-苯胺醇进行自聚合,在合适厚度的磁性纳米颗粒表面形成薄层印迹涂层。用含有十二烷基硫酸钠的酸性溶液去除模板后,在印迹层有效地形成了与模板互补的三维孔洞。印迹涂料亲水性强,残留硼酸含量有限,避免了非特异性结合。得到的MIPs具有良好的特异性、高的结合强度和低的结合pH值。MIPs已成功应用于人血清中转铁蛋白(TRF)的分析。

鉴于糖蛋白生物标志物在疾病早期诊断和治疗中的重要意义,开发高效、选择性的糖蛋白富集方法是十分必要的。分子印迹聚合物(MIPs)在糖蛋白的分离和富集方面有着重要的应用。分子印迹聚合物材料的主要优势在于可以特异识别目标分子,制备成本低、稳定性高、应用范围广以及灵敏性高。然而,目前许多印迹方法是不可控制的,并且广泛适用于各种各样模板的印迹方法仍然受限^[82,83]。该类材料还有很多改进空间,如应用控制聚合技术制备分子印迹聚合物,从而改变它的内部形态以及减少材料粒子粒径的大小形成纳米凝胶,向生物抗体转化接近等。

6 其他材料

蛋白质磷酸化和糖基化是蛋白质的两个最重要的翻译后修饰(PTM),可逆磷酸化过程参与细胞内许多活动。蛋白质糖基化在真核生物细胞等细胞分裂、识别、迁移和信号传导等多种生物学活动中也起着重要作用^[84]。异常磷酸化或糖基化可能导致或诊断各种疾病,因此蛋白质磷酸化和糖基化的研究可以促进发现某些疾病的潜在生物标记并有助于早期诊断^[85]。Lin等^[86]采用原子层沉积法(Atomic Layer Deposition, ALD)将TiO₂沉积在MALDI板上制备成均匀的TiO₂膜,并用(3-氨丙基)三甲氧基硅烷(APS)在TiO₂表面进行氨基修饰(TiO₂-NH₂),并用改性的材料对磷酸肽和糖肽同时进行富集分析,对糖肽该材料表现出检出限低(5 fmol HRP酶解液)、稳定性好和重现性好等特点,在对人体唾液的分析中能明显地提高信噪比,表明该材料在糖蛋白分析中具有很好的应用前景。

在质谱(MS)分析之前选择性富集糖肽/糖蛋白对于糖蛋白组研究是必不可少的^[87,88]。然而,迄今为止大多数报道的浓缩方法都有局限性^[89]。目前,亲水作用色谱柱(ZIC-HILIC)作为一种流行的HILIC材料已被广泛用于糖肽分离^[90]。ZIC-HILIC的独特特征是表面带有正负电荷,与其他亲水材料相比,对糖肽的亲水相互作用更好。由于这种材料易操作、高富集特异性和可保留完整糖肽,已经开发出一些基于ZIC-HILIC的材料用于糖肽富集分离^[91,92]。Cao等^[93]采用PAMAM树状分子衍生物合成用于糖肽富集的两性离子官能化(ZICF)材料。该材料的多支化结构和良好的溶解性使得能够与糖肽进行充分的相互作用,与现有方法相比,ZICF-PAMAM与FASP模式富集策略相结合,表现出更优越的性能。回收率达到90.01%,并且可以有效地富集来自复杂生物样品的糖肽,甚至仅仅0.1 μL人血清样品也可检测。 ZICF-PAMAM显著的糖肽富集能力突出了在深入糖蛋白组研究中的潜在应用,这可能为糖蛋白组学的发展开辟新思路。

石墨相氮化碳(Graphitic Carbon Nitride, g-C₃N₄)是一种类似于石墨烯的二维层状有机半导体材料,具有环保性好、制备简单、吸附性强、传质快、化学稳定性好等优点,在光催化和可持续化学领域引起了广泛的关注。Zhang等^[94]开发了一种新型石墨碳氮化合物(g-C₃N₄)用于唾液酸糖肽(SGs)的富集并取得了较好的效果;通过优化富集和洗脱条件,从牛肽球蛋白和转铁蛋白中分别富集到45种和38种SGs,从人血清酶解液中共富集出19种SGs,表明g-C₃N₄在SGs富集中具有很高的应用价值。

7 结论

如今,虽然估计有50%以上的蛋白质是糖基化的,但只有约10%的现有数据库条目被标注为糖蛋白,这也反映了研究蛋白质糖基化的难度和意义^[95]。对于糖蛋白质组的研究还处于技术发展的初级阶段,目前已研究报道的富集材料如有机高分子材料、生物基材料、新型有机骨架材料和新型功能复合材料等已得到了很好的应用,它们主要具有以下特点:①容易连接相应的功能基团;②容易从反应体系中分离;③具有很高的比表面积及使用效率;④对非糖肽具有低的非特异性吸附。

尽管新型糖蛋白/糖肽分离富集材料取得不错的成绩,但仍面临着许多挑战。首先,在细胞中富集所有糖蛋白的技术还不够成熟,如何实现更全面、更低丰度糖蛋白的鉴定和分析也是一个重要挑战;其次,在质谱(MS)分析之前选择性富集糖肽/糖蛋白对于糖蛋白组研究是必不可少的。然而,迄今为止大多数报道的浓缩方法都有局限性。例如,基于HC的策略虽然显示出良好的富集特异性,但其最大的限制在于由于HC的固有富集原理而不能通过富集获得完整的糖肽。基于凝集素亲和层析和HILIC的方法总是来自低特异性。因此,如何开发出一种具有高效率、良好特异性以及完整富集糖肽的材料用于糖蛋白组学研究也是一个重要挑战。最后,新型材料用于糖肽富集的过程包括孵育、清洗和洗脱三个步骤,而清洗这个步骤经常导致某些重要的低丰度目标糖肽的丢失。目前,大多数新型糖肽富集材料在实验中,还不能避免清洗这个过程,这就要求我们去探索新的技术,例如,可以采用多种材料协同富集,取其合集来扩大数据集,以防低丰度目标糖肽的丢失。

总之,先进而有效的糖肽富集新型材料有望推动糖蛋白研究的深入发展,为生命科学研究和促进人类健康提供强有力的科学支持。为了糖蛋白组学研究的深入展开,发展高灵敏度、高特异性的糖肽/糖蛋白预富集技术是首当其冲的任务。相信随着各项分析技术的不断完善与成熟,糖蛋白质组将会在表达蛋白质组逐步的完善、药物靶点的探索中发挥更大的作用。

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