金属调控蛋白的结构、性质及应用

郑亚楠; 王丹

doi:10.7536/PC190310

化学进展 ›› 2019, Vol. 31 ›› Issue (10) :1372-1383 DOI: 10.7536/PC190310

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金属调控蛋白的结构、性质及应用

郑亚楠 ,
王丹 ^**

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Structures, Properties, and Applications of Metalloregulatory Proteins

Yanan Zheng ,
Dan Wang ^**

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摘要

金属调控蛋白是微生物体内通过转录抑制或激活机制严格控制金属离子摄入、外排和储存的特异性金属离子结合蛋白,对维持体内适宜的金属离子浓度和平衡起着举足轻重的作用。本文综述了目前主要的七大家族金属调控蛋白的调控机制和拓扑结构,详细介绍了金属离子结合区域的结构特征和金属-配体的配位构型。基于金属-配体的配位构型,重点讨论了每类金属调控蛋白对目标金属离子特异性选择的机理。此外,本文还介绍了金属调控蛋白在重金属离子检测和吸附方面的应用,拓展了金属调控蛋白的研究和应用领域,同时为生物无机化学的研究方向开辟了新的思路。

Abstract

The metalloregulatory protein is the metal-specific binding protein in microorganisms that tightly regulates the intake, efflux, and storage of the metal ions through the regulatory mechanism of transcriptional repression or activation, which is particularly important for the maintaining of suitable metal concentration and homeostasis. In this review, the regulatory mechanism and topological structure are summarized within the current seven major families of metalloregulatory proteins, and the structural feature and metal-ligand coordination geometry of metal-binding domain are also introduced in detail. Based on the metal-ligand coordination geometry, the mechanisms are discussed for the metal selectivity of metalloregulatory proteins. In addition, the applications of metalloregulatory proteins in metal-ion detection and adsorption are also introduced, which not only broadens the research and application areas of metalloregulatory proteins, but also exploits new direction for the bioinorganic chemistry research.

Graphical abstract

关键词

金属调控蛋白 / 金属离子 / 调控机制 / 拓扑结构 / 配位构型

Key words

metalloregulatory protein / metal ions / regulatory mechanism / topological structure / coordination geometry

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郑亚楠, 王丹. 金属调控蛋白的结构、性质及应用[J]. 化学进展, 2019, 31(10): 1372-1383 DOI:10.7536/PC190310

Yanan Zheng, Dan Wang. Structures, Properties, and Applications of Metalloregulatory Proteins[J]. Progress in Chemistry, 2019, 31(10): 1372-1383 DOI:10.7536/PC190310

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1 Introduction

2 Brief description of the structure and function of metalloregulatory proteins

2.1 The Fur-family metalloregulators

2.2 The DtxR-family metalloregulators

2.3 The NikR-family metalloregulators

2.4 The MerR-family metalloregulators

2.5 The ArsR/SmtB-family metalloregulators

2.6 The CsoR/RcnR-family metalloregulators

2.7 The CopY-family metalloregulators

3 The application of metalloregulatory proteins

4 Conclusion

1 引言

金属离子在生物体内发挥着多种功能,几乎所有生理反应的正常进行都直接或间接地依赖于金属离子的参与。适宜浓度的金属离子是各项生命活动正常进行的基础,浓度不足或过量都会影响金属离子的生物效应,因此必须严格控制金属离子在生命体内的存量,维持适宜的金属离子浓度^[1]。在生物长期进化的过程中,已经衍化出一系列的平衡机制,这些平衡机制主要通过形成特异的金属-蛋白的复合物来调节和控制金属离子的摄入、体内迁移、胞内储存及外排,以保证生物体内各个区域适宜的金属离子浓度。另外,部分金属离子转移到特定部位成为金属酶的活性中心或生物大分子的结构组成部分对其在体内的平衡也起到一定作用^[2,3,4]。这些过程中所涉及的蛋白主要有金属转运蛋白、金属还原酶、金属螯合蛋白和金属调控蛋白等,它们通过有效的分工和合作共同维持金属离子的体内平衡^[5]。

在维持金属离子体内平衡的过程中,调控金属转运蛋白、金属还原酶、金属螯合蛋白及金属外排系统表达的蛋白质为金属调控蛋白,这类蛋白通过与金属离子形成特异性复合物的方式来抑制或激活启动子DNA的转录,亦或直接激活下游解毒系统的转录,从而有效地维持金属离子体内的动态平衡^[5,6,7]。金属调控蛋白的转录调控机制不仅用于生命体所需的过渡金属离子的调控,对有害的没有生物功能的重金属离子如Pb²⁺、Cd²⁺、Hg²⁺、As³⁺同样适用。依照金属调控蛋白的生物功能,可将其划分为两类:一类金属调控蛋白用于控制金属离子的外排和储存;另一类金属调控蛋白用来调控金属离子的摄入。负责金属离子摄入的金属调控蛋白通常以金属离子为共阻遏物,结合金属离子后的金属调控蛋白可直接抑制金属离子的吸收,而负责调控金属离子外排和储存的金属调控蛋白往往通过转录抑制或激活机制来调控相关基因的表达^[8]。在大多数情况下,金属离子的结合会使金属调控蛋白与启动子DNA的结合力减弱甚至解离,从而使暴露的启动子DNA被RNA聚合酶识别并开始转录。

近些年来,随着生物化学、分子遗传学、基因测序、结构生物学的广泛应用,大量已知和假定的金属调控蛋白的结构和性质已经被表征和鉴定。在金属调控蛋白的研究中,发现部分蛋白之间存在着相似的空间结构和调控机制,通常把这类蛋白统称为同一家族的金属调控蛋白。奇特的是,同一家族中结构彼此相似的金属调控蛋白可以特异性地感应和调控不同的金属离子,这也是研究金属调控蛋白的魅力之所在。目前,在原核生物体内主要存在七类可溶性金属调控蛋白,以每个家族中最先发现的成员命名,分别为Fur家族、DtxR家族、NikR家族、MerR家族、ArsR/SmtB家族、CsoR/RcnR家族和CopY家族^[9]。

2 金属调控蛋白结构与功能简述

2.1 Fur家族的金属调控蛋白

Fur家族的金属调控蛋白以最先发现于大肠杆菌调控铁离子吸收的Fur蛋白命名,主要存在于革兰氏阴性菌中,个别与植物共存的根瘤菌和其他密切相关的变形门菌中也有存在^[10]。在大肠杆菌中,Fur蛋白广泛调控多种基因,包括编码蛋白质的基因以及非编码RNAs共90多种,对铁离子的体内平衡、氧化应激以及酸碱平衡的调控至关重要^[10,11]。少数Fur蛋白的同源蛋白已经被充分研究,其中包括感应调控其他过渡金属离子的蛋白,如感应Zn²⁺的金属调控蛋白Zur^[12,13]、感应Mn²⁺和Fe²⁺的金属调控蛋白Mur^[14]、感应Ni²⁺的金属调控蛋白Nur^[15]等。脱辅基的Fur家族金属调控蛋白一般与启动子DNA的结合力较弱甚至可以忽略不计,而结合了同源金属离子的Fur家族金属调控蛋白以阻遏子的形式结合在启动子DNA上,抑制下游基因的转录。但是Fur家族的金属调控蛋白也存在少数例外,比如幽门螺杆菌中的Fur蛋白在没有Fe²⁺存在的情况下抑制铁蛋白基因和sodB编码的超氧化物歧化酶基因转录,相反在结合Fe²⁺的情况下激活转录^[16]。

绿脓杆菌中的金属调控蛋白Fur^[17]、天蓝色链霉菌的金属调控蛋白Nur^[18]以及结核杆菌中的金属调控蛋白Zur^[12]的结构研究显示这些蛋白有着相似的折叠,每个蛋白N端的DNA结合区域以翼螺旋结构折叠并通过柔性结构与C端的二聚区域连接(图1)。对于Fur家族的每个金属调控蛋白而言,所含金属位点的数目和功能都有可能不同,但是对于单个金属调控位点或区域Fur家族的所有调控蛋白根据金属离子的类型采用一致的配位构型^[19]。许多Fur家族的金属调控蛋白中,Zn²⁺通过与二聚区域的半胱氨酸残基配位形成四面体的几何构型(图1),NMR实验结果显示Zn²⁺的配位对大肠杆菌Fur蛋白二聚体结构的稳定性起了重要作用^[20]。结核杆菌Zur蛋白的晶体结构显示,除了与半胱氨酸配位的S₄结合位点外,还有两个额外的Zn²⁺结合位点,这两个结合位点与绿脓杆菌中铁离子调控蛋白Fur络合Zn²⁺的位点相对应^[12]。而大肠杆菌和炭疽杆菌Zur蛋白中含有两个金属离子结合位点,其中与半胱氨酸残基配位的S₄结合位点非常稳定,只有在蛋白变性的情况下才能去除,另外一个结合位点采用四面体的构型与半胱氨酸残基、组氨酸残基、谷氨酸残基等不同的配体形成配合物,这个金属离子结合位点类似于PerR蛋白中的调控位点^[21,22,23]。在枯草杆菌感应H₂O₂的调控蛋白PerR中,同样含有与Zn²⁺结合的S₄位点以及可以与Fe²⁺和Mn²⁺结合的调控位点(图1),这个调控位点连接了蛋白的N端区域和C端区域。金属离子与配体的结合可以把原本距离相对较远的N端区域和C端区域拉近,进而改变两个N端DNA结合区域的相对距离,形成与启动子DNA有高亲合力的构型^[24]。随着氧化的PerR-Zn-ox和PerR-Zn-Mn复合物晶体结构的获得,上述变构调节的机理模型再一次得到验证。

在PerR-Zn-Mn复合物的晶体结构中,Mn²⁺以四方锥的几何构型结合在调控位点上,将蛋白结构“锁定”在易于与启动子DNA结合的构象,同时形成开放的H₂O₂感应位点。与其他氧化应激的调控蛋白不同,PerR蛋白不利用半胱氨酸残基或者[Fe-S]簇感应H₂O₂,而是通过独特的铁离子催化的氧化反应感应H₂O₂。位于调控位点的两个组氨酸残基配体(His37和His91)的其中一个将被氧化转化为2-oxo-His,氧化后的PerR蛋白失去与启动子DNA结合的能力(图1)^[25]。有趣的是,组氨酸残基His37位点氧化后的蛋白仍以微摩尔的亲合力与Mn²⁺结合,仅仅低于野生型蛋白的20倍,这表明DNA结合区域的组氨酸残基His37是变构调节过程中的关键残基^[9,26],取代或者修饰此组氨酸配体将使蛋白N端区域和C端区域失去合适的与启动子DNA结合的构象。相比之下,氧化组氨酸残基His91将使蛋白完全失去与Mn²⁺和Fe²⁺的结合能力,使金属离子发生解离进而使蛋白失去与启动子DNA结合的能力^[27]。另外,在PerR-Zn-Mn复合物晶体结构中,组氨酸残基His93占据的轴向位置恰好位于结合H₂O₂开放位点的对立方向,因此很难在此位置上产生羟基自由基^[19,24],从而从结构的角度合理地解释了为什么配体His37和His91易于被Fe³⁺氧化而Mn²⁺的另一配体His93却难以被氧化。

2.2 DtxR家族的金属调控蛋白

DtxR家族的金属调控蛋白同样作为转录共阻遏蛋白主要负责Fe²⁺和Mn²⁺两个副族金属离子的调控。白喉杆菌中的DtxR蛋白是这个家族最先发现的成员并以其功能给予命名,DtxR蛋白主要负责白喉杆菌中白喉毒素的表达,而白喉毒素的表达与细胞中铁离子的状态密切相关^[10,28]。在细胞质中铁离子有限的条件下,与铁离子吸收和储存相关的蛋白基因持续表达,而提高的铁离子浓度将使这些基因的表达受到DtxR蛋白的调控而被抑制^[28]。在细菌体内上述基因的转录水平受Fe²⁺的特异性调控,而体外实验显示Ni²⁺和Co²⁺同样可以充当DtxR蛋白与启动子DNA结合的激活剂。因此,许多体外研究包括结构生物学的实验都使用Ni²⁺和Co²⁺作为辅助阻遏物^[29]。值得强调的是,到目前为止还没有获得DtxR蛋白和其同源诱导金属离子(Fe²⁺)的复合物结构,以下关于蛋白构象的变化都是基于Ni²⁺结合引起的,这些构象的转变可以部分但不能有效地反映细胞内部转录调控的真实情况。DtxR金属调控蛋白包含三个结构区域:N端翼螺旋结构的DNA结合区域、中间螺旋结构的二聚区域以及C端SH3结构区域(图2)。DtxR蛋白C端的SH3结构区域被认为有利于提高蛋白与启动子DNA的结合活性,主要通过稳定蛋白分子间和分子内的相互作用^[30]。在DtxR蛋白中有两个不同的金属离子结合位点,分别命名为辅助结合位点(位点1)和主要结合位点(位点2)。其中,辅助结合位点主要位于二聚区域,由配体His79、Glu83、His98和两个溶剂分子构成,对蛋白结构的稳定性起着重要作用。主要结合位点由配体Asp102、Glu105、His106、溶剂分子以及Met10构成(图2),其与金属离子的结合将使α1区域的结构发生转变,由螺旋结构变为卷曲结构^[31],这种结构的转变应该是由金属离子与N端DNA结合区域内氨基酸残基的相互作用有关。金属离子与N端DNA结合区域的相互作用主要通过与甲硫氨酸残基Met10配位作用以及水分子与亮氨酸残基Leu4的氢键作用构成。在没有金属离子结合时,蛋白N端的DNA结合区域处于松散状态,较大的位阻效应阻碍其与启动子DNA的结合^[32],而Ni²⁺结合引起的N端螺旋结构的转变将激活其与启动子DNA的结合活性。另外,金属离子的结合使蛋白N端的DNA结合区域轻微关闭,便于启动子DNA的识别。值得注意的是,溶液状态下DtxR蛋白在有无金属离子情况下的四级结构变化还未得到测定,是否会出现类似于PerR蛋白或者Fur家族其他蛋白^[24]中较大的结构变化对变构激活的重要作用现在还不得而知。

与Mn²⁺调控相关的DtxR家族金属调控蛋白的相关研究起源于枯草杆菌中MntR蛋白,MntR蛋白主要调控Mn²⁺吸收系统的转录,当细胞质中Mn²⁺浓度过高时,MntR蛋白将抑制mntABCD 和 mntH基因的表达,特异性减少Mn²⁺和Cd²⁺的吸收,而对其他金属离子如Mg²⁺、Ca²⁺、Fe²⁺、Co²⁺、Ni²⁺和Zn²⁺的吸收没有影响^[33,34]。MntRs蛋白与DtxR蛋白高度相似,其与金属离子复合物的结构解析也揭示了MntRs蛋白中金属结合位点的数目、性质和特异性等特点。最初得到的Mn²⁺结合的MntR蛋白结构中,两个相距3.3 Å的Mn²⁺即Mn_A和Mn_B构成双核的锰离子簇位于金属离子结合位点,分别采用八面体和扭曲八面体的几何构型^[35]。但之后室温获得的另一个构象的异构体中,双核的锰离子簇中两个Mn²⁺间隔为4.4 Å,分别命名为Mn_A和Mn_c(图2)^[34],尽管此构型中两个Mn²⁺所采用的配位构型与上述结构中相同,但是桥联配体和双齿配体的性质差别较大。室温下获得的构象中两个Mn²⁺的距离与液体EPR实验结果一致,此结构更接近金属调控蛋白MntR的生理构象^[36]。

随着脱辅基的MntR蛋白结构的获得以及其与Mn²⁺复合物结构的比对,为提出由Mn²⁺结合引起的蛋白变构调节进而结合启动子DNA的机理提供了可能性^[37]。结构对比结果显示,没有金属离子结合的MntR蛋白N端的DNA结合区域存在多种构象,与金属离子结合后MntR蛋白N端DNA结合区域和C端的二聚区域相对于轴中心的第75位氨基酸残基发生了较大的位移,位于α4螺旋的第72~75位氨基酸残基发生轻微的负向旋转调节(图2),从而使N端的翼螺旋区域相对于蛋白的二重旋转轴发生了约 3.4 Å的横向位移,缩短了两个单体DNA分子结合区域的距离,这一结论由MntR蛋白的液体EPR实验再次验证。MntR蛋白N端DNA结合区域受α4螺旋调节,并且α4螺旋含有与Mn²⁺配位的关键残基。另外,位于N端α1螺旋上的配体(Mn_A位点中的谷氨酸残基Glu11,Mn_C位点的天冬氨酸残基Asp8)对于构型的转变也有着重要作用,这与由DtxR蛋白提出的模型相似^[37]。

除此之外,与Ca²⁺、Cd²⁺及Zn²⁺结合的MntR复合物晶体结构也都得到了解析^[34]。与Mn²⁺结合的MntR蛋白不同, Zn²⁺结合的MntR蛋白中只有一个Zn²⁺位于类Mn_A位点上,但是此位点的Zn²⁺并未采用常规的四面体配位构型,这也许是Zn²⁺不能有效充当启动子DNA变构激活剂的原因。但是, Ca²⁺和Cd²⁺结合的MntR蛋白中,Ca²⁺和Cd²⁺都形成双核的金属离子簇Me_A-Me_C,与室温获得的Mn²⁺结合的MntR蛋白结构相似,这似乎能够解释为什么在细菌体内Cd²⁺也是MntR蛋白有效的底物。但是对于Ca²⁺,根据其配位的几何构型预测的结果与实际的生理效应存在矛盾。随后的生化实验显示,只有100 mM CaCl₂才能使50%的MntR蛋白与启动子DNA结合,而在细菌体内不可能达到如此高的生理浓度,如此合理地解释了为什么MntR蛋白只选择性地调控Mn²⁺和Cd²⁺,而对Ca²⁺没有调控作用^[34]。关于MntR蛋白的研究也说明了考虑细胞质中每个金属离子能够作用在调控蛋白上的实际浓度的重要性,这些都是在体外的生化实验和结构研究中不能体现的。

2.3 NikR家族的金属调控蛋白

金属调控蛋白NikR的基因存在于上百种革兰氏阴性菌和古细菌中,是分布最为广泛的Ni²⁺感应调控蛋白^[38]。其中,大肠杆菌中的NikR蛋白(简称EcNikR)是发现最早也是目前研究最为详细的,幽门螺旋杆菌^[39]、掘越氏热球菌^[40]、流产杆菌^[41]中的NikR蛋白也相继被发现和研究。在大肠杆菌中,脱辅基的NikR蛋白以较弱的亲合力非特异性地结合在启动子DNA上;而当体内Ni²⁺浓度过高时,过量的Ni²⁺将与NikR蛋白络合进而以较高的亲合力结合到启动子DNA上,抑制转运泵NikABCDE的转录及表达以此降低细菌对Ni²⁺的吸收。目前,已经获得NikR、Ni(Ⅱ)-NikR^[42]以及DNA-Ni(Ⅱ)-NikR^[43]的蛋白质晶体结构,结合大量的光谱学实验对诱导和非诱导状态下的NikR蛋白进行了深入研究,从而从分子水平上解释了NikR蛋白对金属离子的选择性。以四聚体形式存在于自然界的EcNikR蛋白在结构上与其他金属调控蛋白有着很大的不同,具有二重旋转轴对称性。两侧为启动子DNA的结合区域,分别由两个二聚体N端的带状-螺旋-螺旋(RHH)结构组成,中间为四聚的调控区域,由每个单体C端混合的α/β折叠组成。C端四聚的调控区域与响应氨基酸刺激的ACT功能域(A-天冬氨酸激酶、C-分支酸变位酶、T-酪氨酸酶)在结构上有很大的同源性,为金属离子的结合区域^[43]。NikR蛋白N端的启动子DNA结合区域和C端的金属离子结合区域都可以独自表达并保持基本的生物物理性质,但是只有全长的蛋白才能响应Ni²⁺的刺激对启动子DNA有较高的亲合性。在蛋白C端四聚的调控区域包含四个对Ni²⁺有高亲合性的His₃Cys结合位点,每个结合位点中Ni²⁺采用d8低自旋电子组态与3个组氨酸残基His87、His89、His76’的咪唑氮原子和一个半胱氨酸残基Cys95的巯基形成横跨四聚体界面的平面四边形构型(图3)^[43]。广泛的氢键网络在邻近的金属离子结合位点之间形成,对Ni²⁺的稳定结合和蛋白构象的转变有着重要作用。生化实验显示,NikR蛋白除了具有4个高亲合力的Ni²⁺结合位点以外,同时还具有两个低亲合力的Ni²⁺结合位点。大肠杆菌DNA-Ni(Ⅱ)-NikR复合物的X-Ray吸收光谱实验显示,低亲合力的Ni²⁺结合位点中Ni²⁺与两个组氨酸残基和4个N/O配体络合形成八面体的几何构型^[44]。令人惊奇的是,在掘越氏热球菌NikR-DNA复合物晶体结构中,并未看到预期的Ni²⁺填充在八面体配位构型的几何中心,取而代之的是金属离子K⁺,K⁺通过与氨基酸残基Glu30和Asp34的侧链及Ile 116、Gln 118和Val 121羰基上氧原子配位占据此位点(图3)^[45],连接了蛋白N端的启动子DNA结合区域和C端的金属离子结合区域。此位点中谷氨酸残基Glu30和天冬氨酸残基Asp34在整个NikR家族蛋白中高度保守,突变大肠杆菌NikR蛋白的Glu30和Asp34将明显减弱蛋白与启动子DNA的结合活性。这也说明Ni²⁺占据NikR蛋白中高亲合力的结合位点后所引起的构象的转变并不能充分激活NikR蛋白与启动子DNA的结合活性,还需要低亲合力结合位点上Ni²⁺的配位使蛋白转变为具有最佳启动子DNA分子结合活性的构象。在掘越氏热球菌NikR-DNA复合物晶体结构中,低亲合力位点上金属离子的结合使NikR蛋白N端启动子DNA结合区域构象发生了很大的转变,形成了“封闭的”顺式的RHH构型。

在NikR蛋白两组Ni²⁺结合位点中,C端四聚区域的高亲合力的结合位点得到了广泛的研究。实验表明,此位点不仅可以与Ni²⁺结合,对其他二价金属离子如Co²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺ 和Mn²⁺也具有较高的亲合活性(图3)^[44],其中在细胞中丰度较高的Cu²⁺和Zn²⁺与NikR蛋白的亲合力甚至超过Ni²⁺。X-Ray吸收光谱实验显示,不同的金属离子在高亲合力的结合位点上采用不同几何构型与NikR蛋白配位。其中,Cu²⁺采用平面四边形的几何构型,Co²⁺采用八面体的几何构型,Zn²⁺采用四面体的几何构型,对于还原态的Cu⁺则采用三角形的几何构型^[44]。如前所述,在金属调控蛋白中,金属离子的配位构型是促使蛋白构象发生转变实现特异性选择的主要原因。与NikR蛋白结合的金属离子中,只有Cu²⁺与Ni²⁺采用相同的配位构型。而在还原条件下的细胞质环境中,铜离子更多地以一价的Cu⁺存在,二价的Cu²⁺含量极低,因此,在细胞质中金属调控蛋白NikR只特异性识别Ni²⁺。

2.4 MerR家族的金属调控蛋白

MerR家族是目前存在最为广泛且唯一利用转录激活机制对金属离子进行调控的蛋白家族,以最先发现的特异性响应Hg²⁺的MerR蛋白命名^[46,47]。除此之外,这个家族的金属调控蛋白还可以特异性识别和调控Cu⁺、Ag⁺、Au⁺、Zn²⁺、Cd²⁺、Pb²⁺等多种金属离子,如CueR蛋白可特异性识别C

u + [48,49]

、ZntR蛋白可特异性识别Zn^2+[48]、CadR蛋白可特异性识别Cd^2+[50]、PbrR蛋白可特异性识别Pb^2+[51]、CupR蛋白可特异性识别Au^+[52]。MerR家族的蛋白以二聚体为功能单位发挥生物活性,每个单体都由N端的DNA结合区域、C端的金属离子结合区域及中间的连接区域组成^[53]。其中,N端的DNA结合区域由两个螺旋-折叠-螺旋(α1-α2-α3-α4)结构域组成,分别用来结合启动子DNA和传递金属离子诱导的变构信号;中间的连接区域由两亲的卷曲螺旋(α5)结构组成,是构成二聚界面的主要部分,对蛋白结构单元的稳定性起着重要作用;C端的金属离子结合区域由柔性的金属离子结合环和短螺旋(α6)结构组成,可以特异性识别和结合不同的金属离子(图4)^[51,53]。在没有金属离子的情况下,MerR家族的金属调控蛋白以阻遏子的形式下结合在启动子DNA上,抑制下游金属离子解毒和外排系统的转录;当目标金属离子被MerR家族的蛋白识别后,将结合到蛋白二聚体两侧的金属离子结合区域,使C端金属离子结合区域的构象发生改变,并通过蛋白骨架上的“信号传递通路”将变构调节效应传递给N端的启动子DNA结合区域,进而作用于启动子DNA使其构象发生扭曲从而易被RNA聚合酶识别并激活下游金属离子解毒和外排系统的转录(图4)^[53]。

序列比对研究表明,MerR家族的金属调控蛋白表现出较高的同源性,位于N端的DNA结合区域和中间的连接区域的序列极为相似。而位于C端的金属离子结合区域的序列有较大差异,使MerR家族的金属调控蛋白能够利用不同的配位构型与目标金属离子特异性结合^[53]。结构及光谱学实验研究表明,CueR蛋白利用C端金属离子结合区域的Cys112和Cys120与目标金属离子Cu⁺配位,形成二配位的线性构型^[48]。Tn501 MerR利用一个单体金属离子结合区域的Cys117和Cys126与另一个单体的Cys82与目标金属离子Hg²⁺配位,形成平面三角形的配位构型^[54]。PbrR691利用一个单体金属离子结合区域的Cys113和Cys122与另一个单体的Cys78与目标金属离子Pb²⁺配位,形成三角锥形的配位构型^[55](图4)。CupR利用金属离子结合区域的Cys112、Cys120和CHH区域的氨基酸残基与Au⁺形成三配位的几何构型^[52]。Tn501 MerR蛋白中与Hg²⁺配位的Cys117和Cys126,以及PbrR691蛋白中与Pb²⁺配位的Cys113和Cys122分别与CueR蛋白中与Cu⁺配位的Cys112和Cys120对应,而额外的半胱氨酸残基Cys82和Cys78为目标金属离子Hg²⁺和Pb²⁺提供了更高的配位数,有利于二价金属离子的稳定结合。相对于对Cu⁺有较高亲合力的CueR蛋白,CupR蛋白CHH区域的第三个氨基酸残基的参与使CupR蛋白对Au⁺的亲合力远高于Cu⁺。这些保守的半胱氨酸残基配体对MerR家族金属调控蛋白的功能至关重要,任何一个位点的突变则大大减弱MerR家族蛋白与目标金属离子的结合活性^[54]。同时,这些保守的半胱氨酸残基通过不同的几何构型与目标金属离子配位,为MerR家族不同金属调控蛋白的选择性奠定了基础。对于结合相同价态金属离子的MerR家族蛋白而言,金属离子结合区域内的微环境对MerR家族金属调控蛋白的选择性同样起着决定性作用。如CueR蛋白和GolS蛋白对Cu⁺、Ag⁺和Au⁺均有结合作用,并且都采用线性的二配位的几何构型与半胱氨酸残基的巯基配位,两者的区别在于CueR蛋白对Cu⁺的选择性高于Ag⁺和Au⁺,GolS蛋白对Au⁺的选择性高于Cu⁺和Ag⁺。当把GolS蛋白C端的金属结合区域置换为CueR蛋白的C端区域,GolS蛋白就会改变本身的选择性成为对Cu⁺特异性识别的蛋白^[56]。

2.5 ArsR/SmtR家族的金属调控蛋白

ArsR/SmtB家族是目前最大、研究最为广泛且功能多样化的金属调控蛋白家族,几乎每类细菌的基因组至少含有一个ArsR/SmtB家族的金属调控蛋白,初步估计ArsR/SmtB家族成员多达500多个^[57],尤其在放线菌中拥有较大数量的ArsR/SmtB家族的金属调控蛋白,这也许与细菌生活环境中变化的金属离子浓度或者新陈代谢的需要有关^[58]。ArsR/SmtB家族以最先发现于大肠杆菌的ArsR蛋白和聚球藻的SmtB 蛋白命名,包含多种功能各异的金属调控蛋白,能够响应一系列金属离子的刺激,从生命体必需的金属离子如Zn²⁺和Ni²⁺到有毒重金属离子如As³⁺、Sb³⁺、Pb²⁺、Cd²⁺等都属于其响应范围^[59]。ArsR/SmtB家族的金属调控蛋白主要调控细胞质中过量金属离子的外排、隔离及解毒系统,在没有金属离子存在的情况下,这类蛋白以阻遏子的形式结合在启动子DNA上,抑制下游外排或解毒系统基因的转录表达;当体内多余的金属离子或有毒重金属离子结合到ArsR/SmtB家族的金属调控蛋白,将减弱蛋白与启动子DNA的结合活性使两者发生解离,去除阻遏效应的启动子DNA将开始转录,诱导下游解毒系统基因的表达^[59]。

与MerR家族类似,ArsR/SmtB家族的金属调控蛋白同样以二聚体为功能单位发挥生物活性,同一家族的金属调控蛋白序列同源性高达25%~50%,并且含有相似的折叠-螺旋-折叠结构的N端区域用于结合启动子DNA,二聚界面主要是由N端的α1螺旋和C端的α5螺旋构成^[60]。与MerR家族不同的是,ArsR/SmtB家族的金属调控蛋白没有固定的金属离子结合区域,不同金属离子结合位点分布在相似蛋白结构的不同区域(图5),这也是ArsR/SmtB家族的金属调控蛋白另一显著特点。已知的ArsR/SmtB家族金属调控蛋白中金属离子的结合位点有α3螺旋与蛋白N端之间(简称α3 N)、α3螺旋、α4螺旋与蛋白的C端之间(简称α4C)、α5螺旋、α5螺旋与蛋白C端(简称α5C)等。并且,以二聚体为功能单位的ArsR/SmtB家族的金属调控蛋白,金属离子结合在两个单体对立的位置上,形成一对对称性相关的金属离子结合位点(图5)。对于结合半径较小的二价金属离子如Zn²⁺、Co²⁺和Ni²⁺,ArsR/SmtR家族的金属调控蛋白通常使用一个单体α5螺旋的N端与另一单体α5螺旋的C端上邻近的氨基酸残基作为配体结合金属离子。如调控金属离子Zn²⁺/Co²⁺的CzrA蛋白中,位于α5螺旋上的Asp84和His86与另一单体α5螺旋上的His97’和His100’组成对称的金属离子结合位点^[61]。对于亲硫的重金属离子Cd²⁺和Pb²⁺而言,AsrR/SmtR家族的金属调控蛋白通常采用α3 N或α4C的结合方式,来自蛋白中间区域的α3螺旋或α4螺旋的半胱氨酸残基与来自另一单体的N端或者C端的半胱氨酸残基共同构成金属离子的结合位点。对于部分AsrR/SmtR家族的金属调控蛋白,一个蛋白同时含有两种类型的位点用于结合不同的金属离子,如能够响应金属离子Cu⁺、Ag⁺、Zn²⁺、Cd²⁺的BxmR蛋白^[62,63,64]。蓝藻菌的BmrR蛋白使用α3螺旋与蛋白N端结合Cd²⁺、Ag⁺和Cu⁺,使用α5螺旋用来结合Zn²⁺,其中富含半胱氨酸的α3 N位点通过采用不同的配位构型与Cu⁺、Ag⁺、Zn²⁺、Cd²⁺配位,而α5位点只特异性结合Zn²⁺。

对于结合位点相似的不同金属离子,由于不同的ArsR/SmtB家族金属调控蛋白对其选择性存在差异,所提供的配位环境也有很大差别。如来自金黄色葡萄球菌的CzrA蛋白和结核杆菌的NmtR蛋白均可以与金属离子Zn²⁺、Co²⁺、Ni²⁺配位,但是这两种蛋白对Zn²⁺、Co²⁺、Ni²⁺三种金属离子特异性调控的能力却有很大的差异^[65]。如金属调控蛋白CzrA蛋白高灵敏地响应Zn²⁺,同时可以响应高浓度的Co²⁺,而对Ni²⁺几乎不响应;金属调控蛋白NmtR蛋白对Ni²⁺较为敏感,对Co²⁺有中等程度的响应,但对Zn²⁺的响应能力较差。在金黄色葡萄球菌CzrA蛋白中, Zn²⁺和Co²⁺采用四面体的几何构型与组氨酸残基的咪唑氮原子和天冬氨酸残基的羧基氧原子配位,而非诱导的Ni²⁺采用六配位的几何构型^[61,65];而肺结核分枝杆菌NmtR蛋白通过α5螺旋C端额外的两个组氨酸残基为Co²⁺和 Ni²⁺提供六配位的几何构型,而非功能的Zn²⁺采用四配位的几何构型^[65]。由于Co²⁺配位构型的多样性,对于金属调控蛋白CzrA和NmtR而言,采用不同几何构型的Co²⁺都是其有效的调控底物,而Zn²⁺和Ni²⁺分别“偏爱”四配位和六配位的几何构型。因此,相对于CzrA蛋白,NmtR蛋白α5螺旋C端额外的两个组氨酸残基有效地改变了两者对Zn²⁺和 Ni²⁺的选择性。有趣的是,虽然NmtR蛋白对Zn²⁺响应能力较差,但是两者的结合常数较大,基本等于甚至高于NmtR蛋白与Ni²⁺的结合。这也表明金属离子的配位数和几何构型是决定金属调控蛋白特异性选择的关键所在,与金属离子的结合常数和其他性质无关。

2.6 CsoR/RcnR家族的金属调控蛋白

CsoR/RcnR家族的金属调控蛋白是七大家族中结构最晚得到表征的,此家族的金属调控蛋白主要感应和调控金属离子Cu⁺、Ni²⁺、Co²⁺。其中,Cu⁺调控蛋白以结核分支杆菌中的CsoR蛋白为代表^[66],Ni²⁺和Co²⁺调控蛋白以大肠杆菌中的RcnR蛋白为代表^{[67,68,69,70]},这也是CsoR/RcnR家族金属调控蛋白命名的起源。CsoR蛋白是一种转录阻遏蛋白,没有金属离子结合的CsoR蛋白以阻遏子的形式结合在csoR 基因启动子的上游,只有当Cu⁺结合到CsoR蛋白,才能使其与启动子DNA解离,去除阻遏效应^[66]。结构研究表明,结核分枝杆菌CsoR蛋白以同源二聚体的形式存在,结构较为简单,每条单体主要由三个α螺旋α1、α2、α3组成,两个单体的α1-α2螺旋依次反向平行排列,构成二聚体的主要界面。位于C端较短的α3螺旋堆积在整个分子上,靠近另一单体的α2’螺旋。以二聚体为功能单位的CsoR蛋白可以同时结合两个Cu⁺,分别位于二聚界面的两端,其配位的残基主要由两个单体α2螺旋上保守的半胱氨酸和组氨酸残基构成。在单个结合位点中,Cu⁺以三配位的形式分别与两个半胱氨酸残基Cys36和Cys65’的巯基和一个组氨酸残基His61’的咪唑氮原子配位,并有着较高的结合常数^[66]。金属离子结合位点中保守的氨基酸残基Cys36、His61’及Cys65’分别对应图6中X、Y、Z的位置。体外实验研究表明,枯草杆菌中的CsoR蛋白同样采取S2N三配位的几何构型与Cu⁺以较高的结合常数配位^[71]。有趣的是,枯草杆菌CsoR蛋白也可以采用不同于Cu⁺的配位构型与Ni²⁺、Zn²⁺和Co²⁺结合,且具有较高的亲合力。但是,这些二价金属离子的结合并不能强烈地抑制蛋白与启动子DNA的结合活性。这又一次验证了金属调控蛋白的选择性取决于金属-配体的几何构型而不是两者的结合常数^[60,65]。

与感应Cu⁺的调控蛋白CsoRs不同,RcnR类的金属调控蛋白使用His-Cys-His-His特征序列结合金属离子^[68],但相关蛋白及蛋白与金属离子结合的结构至今未得到表征。金属离子Ni²⁺/Co²⁺的滴定实验、电子光谱及X-Ray衍射吸收光谱均显示Ni²⁺和Co²⁺都是以六配位八面体的几何构型(图6)与RcnR蛋白配位。RcnR蛋白特征序列中保守的三个组氨酸和一个半胱氨酸(W-X-Y-Z)都是Ni²⁺和Co²⁺的配体,此位点邻近的氨基酸残基的α-氨基可能成为第五个配体。两个金属离子的第六个配体目前还不是很清楚,可能是蛋白骨架中某个氨基酸残基的氨基基团或者是溶剂分子^[67]。与CsoRs蛋白中采取三配位的金属离子Cu⁺相比,二价金属离子Ni²⁺和Co²⁺需要更高的配位数,这也应该是金属调控蛋白CsoR和RcnR对Cu⁺、Ni²⁺和Co²⁺选择性存在差异的原因。氢-氘交换与质谱联用(HDX-MS)技术研究表明,同源金属离子Ni²⁺和Co²⁺ 与RcnR蛋白的结合将改变N端α1螺旋的灵活性,限制带正电荷的氨基酸残基Arg14和Lys 17与启动子DNA的结合活性,进而减弱RcnR-DNA的结合活性^[70]。

2.7 CopY家族的金属调控蛋白

CopY家族的金属调控蛋白大部分存在于厚壁菌门中,只特异性调控金属离子C

u + [66]

,其N端的DNA结合区域与MecI/BlaI家族的金属调控蛋白有着高度的序列同源性,且识别同源的DNA序列,因此有些分类中把CopY家族的金属调控蛋白归类为MecI/BlaI家族^[72]。大肠菌CopY蛋白是此家族中最先得到表征的,主要用来调控copYZBA操纵子,copYZBA操纵子编码的CopA蛋白和CopB蛋白是铜离子特异的P-型ATP酶,可能与Cu⁺的外排和吸收有关^[73]。研究表明在没有Cu⁺的情况下,Zn²⁺结合到CopY蛋白上并以复合物的形式与操纵子copYZBA的启动子区域结合,转录处于抑制状态;结合了Cu⁺的分子伴侣CopZ蛋白把Cu⁺转移给CopY蛋白,Cu⁺将置换Zn²⁺与CopY蛋白结合,结合了Cu⁺的CopY蛋白将与启动子DNA解离,使阻遏作用解除^[74]。大多数CopYs蛋白在C端附近都含有保守的CXCXXXXCXC区域被认为是Cu⁺的结合位点,光谱学研究显示二聚的CopY蛋白每个单体均可结合两个Cu⁺,形成类似于BxmR蛋白中双核的S₄-Cu₂簇^[74]。

乳酸乳球菌中的CopR蛋白是CopY家族中另一个跟Cu⁺调控有关的蛋白。表达分析实验表明,CopR蛋白不仅调控跟Cu⁺体内平衡相关的基因如copB 和copRZA,对氧化信号的相关基因也有一定的调控作用,如乳酸氧化酶(lctO)、硝基还原酶(ytjD)以及醛酮变位酶I(yaiA)^[75,76]。对结核分支杆菌CopR蛋白的表征也发现了相同的生理现象,过量的Cu⁺参与氧化还原的循环反应并且产生过氧自由基。液体NMR实验的结构解析与预期结果相同,CopR蛋白的N端DNA结合区域采用和金黄色葡萄球菌MecI蛋白和BlaI蛋白类似的螺旋-折叠-螺旋结构^[76]。为了进一步探究Cu⁺的配位构型及有无Zn²⁺存在下CopY家族金属调控蛋白的阻遏调控机制,需要更多的生物物理学和结构生物学的实验对其做进一步的研究。

3 金属调控蛋白的应用

基于MerR家族金属调控蛋白转录激活时“DNA分子的扭曲机制”, 芝加哥大学何川等设计了一系列的荧光探针用于特异性识别和检测不同的金属离子^[77,78,79]。此生物型的荧光探针通过人工合成的手段将启动子DNA中间区域的C替代成有强荧光的类似物C^#(例如Pyrrolo-C)。无金属离子时,由于C^#与G的氢键作用导致荧光猝灭,在350 nm激发不会产生荧光。但加入相应的金属离子后,金属的结合将导致MerR家族的金属调控蛋白构象发生改变,使与之结合的启动子DNA发生扭曲,破坏了C^#与G间的氢键作用,使得C^#能在350 nm处被激发产生强荧光(图7a)。基于这个原理,利用金属调控蛋白CueR^[77]、MerR^[78]和PbrR^[79]设计的荧光探针都得到成功制备和表征。这类荧光探针可快速灵敏地检测某一金属离子,且具有较好的生物相容性,不仅开拓了MerR家族金属调控蛋白的实际应用领域,还进一步验证了DNA扭曲调控机制的正确性。除了基于金属调控蛋白与DNA分子相互作用的研究以外,国内外有不少基于金属调控蛋白合成生物学改造的蛋白质水平和全细胞金属离子生物传感器的研究工作。如南京大学赵劲等分别利用GolB蛋白、PbrR蛋白以及MerR蛋白的调控机制及高选择性、高灵敏性识别目标金属离子的能力,构建了特异性检测和吸附重金属离子Au⁺、Pb²⁺、Hg²⁺的全细胞生物传感器,为水环境中重金属离子污染的有效防御及高效治理提供了可能性^[80,81,82]。

另外,基于NikR蛋白的晶体结构,何川等成功地对其施行蛋白质工程改造,使得工程化的NikR’蛋白能够结合U(Ⅵ)^[83]。其主要原理是将NikR蛋白中高亲合力金属离子Ni²⁺结合位点中的组氨酸残基His76和半胱氨酸残基Cys95突变为可作为单齿或双齿配体的天冬氨酸残基(H76D、C95D),同时将位阻较大的缬氨酸残基Val72突变为位阻较小并可形成氢键的丝氨酸(V72S),这样改造后的NikR’蛋白可特异性识别

U O 2 2 +

,并且失去了与Ni²⁺特异性配位的能力(图7b)。基于此种理念并结合计算的方法,他们又筛选出一种高稳定性、高灵敏性、高选择性识别和结合

U O 2 2 +

的人工蛋白(SUP),并提出将SUP蛋白固定到固体材料或细胞表面可再生地富集海水中铀的理念^[84]。这一研究工作很好地扩展了金属调控蛋白的应用领域,为生物无机化学的研究方向开辟了一个新的思路。

4 结论

细菌体内的金属调控蛋白可以利用多种调控机制对生命体内金属离子的浓度进行精密调控,以维持适宜的保证各项生命活动正常进行的金属离子浓度。金属调控蛋白对目标金属离子的特异性响应不仅取决于金属-配体配位的几何构型,同时与配体类型及周围精密的配位环境密切相关,另外金属离子在细菌体内所能达到的生理浓度同样会影响金属调控蛋白对不同金属离子的选择性。基于金属调控蛋白的调控机制、响应机理及空间拓扑结构,多种生物相容性良好、选择性强、灵敏度高的荧光探针及功能性人工蛋白被成功设计,不仅有助于更深刻的理解金属调控蛋白结构和功能的相互关系,同时拓宽了金属调控蛋白质的应用领域和范围。随着结构生物学和生物化学的快速发展,来源更为广泛的金属调控蛋白的结构和性质将会得到表征,为其在生物检测、生物医药和环境治理等相关领域的应用奠定重要基础。

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基金资助

国家自然科学基金青年基金项目(31800631)

广西自然科学基金青年基金项目(2018JJB120049)

广西高校中青年教师基础能力提升项目(2018KY0361)

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Received	Published
2019-03-12	2019-10-15
Online Date
2019-08-05

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