循环肿瘤DNA的检测:从数字化到测序

范昭璇; 赵亮; 张学记

doi:10.7536/PC190320

化学进展 ›› 2019, Vol. 31 ›› Issue (10) :1384-1395 DOI: 10.7536/PC190320

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循环肿瘤DNA的检测:从数字化到测序

范昭璇 ¹^,²^,³^,⁴ ,
赵亮 ¹^,²^,³^,⁴^,^** ,
张学记 ¹^,²^,³^,⁴^,^**

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The Detection of Circulating Tumor DNA: From Digitalization to Sequencing

Zhaoxuan Fan ¹^,²^,³^,⁴ ,
Liang Zhao ¹^,²^,³^,⁴^,^** ,
Xueji Zhang ¹^,²^,³^,⁴^,^**

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摘要

液体活检的主要检测对象——循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)是人体血液循环系统中具有一定特征的(包括突变、缺失、插入、重排、拷贝数变异、甲基化等)来自肿瘤细胞基因组的DNA片段,其主要来源于凋亡或坏死的肿瘤细胞。ctDNA 的检测和分析能够提供肿瘤中的基因组信息,例如,基因组中的拷贝数变异、突变和甲基化富集等。相较于其他的肿瘤标志物,ctDNA相对稳定,提取技术相对成熟,与肿瘤的大小和发展具有一定的相关性,是一种新兴的、有前景的肿瘤生物标志物,在精准医疗中发挥着越来越重要的作用。不过ctDNA含量极低,背景游离DNA(cell free DNA, cfDNA)含量高,个体间差异大,且需要提前预判检测的位点和突变,因此,利用新方法和新技术对它进行全面检测分析是必不可少的。目前,针对 ctDNA 的检测方法和平台种类繁多,在此,我们总结了从数字PCR到下一代测序的ctDNA检测的研究进展,包括一些商业化的仪器和一些仍在实验室发展中的设备并对利用这些新兴技术分析检测ctDNA的发展趋势做了展望。

Abstract

Circulating tumor DNA(ctDNA), the main item of liquid biopsy, is DNA fragments from tumor genome that carries certain characteristics(including single nucleotide variation, deletion, insertion, rearrangement, copy number variation, and methylation) in the human blood circulation system. It mainly originates from apoptotic or necrotic tumor cells. The detection and analysis of ctDNA can provide genomic information in tumors, such as copy number variation, single nucleotide mutation, and methylation enrichment across the genome. It has a certain correlation with tumor size and development and considered as an emerging and promising tumor biomarker for cancer progression, reoccurrence, and routine monitoring after surgery. Compared with other tumor markers, the isolation method is relatively simple due to the stability of ctDNA. However, the extremely low abundance of ctDNA, the high content of background cell free DNA(cfDNA), the large difference between individuals, and the need of predicted detection sites in advance make it necessary to analyze ctDNA in a comprehensive way. Herein, we summarize the recent progress on ctDNA detection from digital PCR to next generation sequencing, including some commercialized apparatuses and certain methods that have recently been developed.

Graphical abstract

关键词

循环肿瘤DNA / 液体活检 / 数字PCR / 测序

Key words

circulating tumor DNA / liquid biopsy / digital PCR / sequence

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范昭璇, 赵亮, 张学记. 循环肿瘤DNA的检测:从数字化到测序[J]. 化学进展, 2019, 31(10): 1384-1395 DOI:10.7536/PC190320

Zhaoxuan Fan, Liang Zhao, Xueji Zhang. The Detection of Circulating Tumor DNA: From Digitalization to Sequencing[J]. Progress in Chemistry, 2019, 31(10): 1384-1395 DOI:10.7536/PC190320

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1 Introduction

2 ctDNA biology

3 Extraction of ctDNA

4 ctDNA detection technology advances

4.1 Digital PCR

4.2 Next generation sequencing

5 Conclusion and outlook

1 引言

循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)是肿瘤散落在血液中的信息密码^[1]。肿瘤患者病灶中的肿瘤细胞在体内循环系统中不断地转移、凋亡、坏死,将循环肿瘤DNA等细胞成分释放至血液循环系统中,并且这些介质携带肿瘤产生、发展、转移、复发等生物学信息,对于肿瘤的诊断、治疗及预后评估具有重要价值。组织活检是目前最常规的肿瘤检测手段,但组织活检具有一定的局限性,如侵入性、辐射暴露^[2,3,4]、取样的临床风险等。液体活检(liquid biopsy)作为一种便捷、无创、能够动态反映肿瘤基因谱全貌的方法在肿瘤精准医疗中发挥着越来越重要的作用。液体活检是采用人体体液(包括血液、尿液^[5]、唾液^[6],甚至胸水^[7]和脑脊液^[8,9]等)作为检测样本的一类非侵入性的检测方法,能够方便快捷地进行疾病诊断和辅助治疗。液体活检最早由Sorrells提出,其研究采用了关节腔内的滑液来诊断滑膜炎^[10]。

ctDNA检测是当前液体活检领域的检测热点。对ctDNA检测不仅可以揭示肿瘤综合性的遗传信息,还能够更准确地反映肿瘤组织的异质性以及肿瘤基因组的动态进化能力,具有极高的科研价值和临床应用前景。但是ctDNA在外周血中含量很少,不同病人中的含量和核酸多态性差异很大,因此,对ctDNA的分析检测有很大的技术挑战性。目前常用的ctDNA检测方法有基于数字PCR(digital polymerase chain reaction, dPCR)和下一代测序(next generation sequencing, NGS)的技术方法。数字PCR技术具有高特异性和高灵敏度,通常针对已知突变的ctDNA而言,而下一代测序技术可实现对多基因核酸片段进行高通量平行深度测序,能够同步检测多个基因、不同形式及未知突变。

2 循环肿瘤DNA的生物学特性

早在1948年,Mandel和Métais通过高氯酸沉淀的方法首次在人类血液中发现了非细胞游离核酸,即cfDNA,当时人类还并未意识到DNA是遗传物质,所以这一报道并没有得到足够的重视,但他们在这一领域做了重要的铺垫工作^[11]。1977年,Leon等首次在癌症患者中发现了非细胞游离DNA,但不确定非细胞游离DNA是来自正常组织还是肿瘤细胞^[12]。1989年,Stroun等通过比较DNA链的热力学稳定性,首次证实肿瘤患者外周血中的一部分cfDNA来源于肿瘤细胞,因此称之为ctDNA^[13]。1994年,Sorenson等^[14]和Vasioukhin等^[15]采用PCR技术分别在胰腺癌和急性髓细胞白血病患者血浆DNA中检测到了K-ras2和N-ras基因点突变。至此,ctDNA开始受到研究者的关注。近年来,随着高灵敏和高特异检测技术的发展,ctDNA作为肿瘤生物标志物的研究在相关领域飞速发展。

循环肿瘤DNA是癌症患者血液中不断地流动着的来自肿瘤细胞基因组的循环DNA片段,主要来源于凋亡或坏死的肿瘤细胞内涵遗传物质的释放和肿瘤细胞分泌的外泌体^{[16,17,18,19]}。就肿瘤患者而言,循环肿瘤DNA主要通过三种机制的组合释放到血液循环系统中,(如图1所示:(1)细胞凋亡;(2)细胞坏死;(3)肿瘤细胞分泌的外泌体)^[20]。在健康个体中,浸润性吞噬细胞负责清除包括cfDNA在内的凋亡和坏死的细胞碎片,导致cfDNA水平非常低,而在肿瘤患者中,慢性炎症和细胞死亡导致了细胞碎片积聚,血液中的有效清除机制受到了阻碍,最终表现为cfDNA的水平显著增加^[21,22,23]。相比cfDNA,ctDNA在血液中的含量相当低,仅占cfDNA的1%,甚至不到0.01%^[24],大多数ctDNA片段的长度范围为160至200 bp^[25],比没有突变的cfDNA短^[26,27,28]。

一些研究表明,ctDNA含有与其起源的肿瘤DNA相同的分子特征,如单核苷酸变异(single nucleotide variation, SNV)、短的插入缺失(insertion& deletion, InDel)、拷贝数变异(copy number variant, CNV)^[29,30]和甲基化^[31,32,33]。一些研究发现,进入血液循环的ctDNA具有约15 min~2.5 h的半衰期^[34,35,36],与可能需要数周的蛋白质标志物相比,这一特征确保了ctDNA作为“实时”肿瘤生物标志物,可以更准确地反映肿瘤负荷。

3 循环肿瘤DNA的提取

由于体液样本的复杂性,外周血样品需要经过一系列生物化学处理和分离纯化才能够得到cfDNA。通常来讲,ctDNA检测的第一步就是把ctDNA从体液中提取出来。由于ctDNA在血液中浓度很低^[37],且高度片段化^[38],在外周血中易被降解和清除^[39,40],对其进行直接检测极具挑战性,任何可利用的ctDNA丢失都可能影响其评估的准确性,因此,ctDNA的富集和分离方法就显得尤为重要。

实际上,每位肿瘤患者血液中的ctDNA含量相当有限,通常在不同的个体和肿瘤类型中波动较大。因此,就ctDNA的定量分析而言,应当考虑以下预分析因素。

首先,从血样上看,血浆比血清更适合ctDNA分析^[41]。血清中也含有ctDNA,但血清样品制备过程中血细胞裂解可从非癌细胞中释放DNA,稀释ctDNA信号并干扰其检测^[42,43]。收集ctDNA试管的类型也是一个重要因素^[44,45],含有抗凝剂的收集管可以很大程度地稳定细胞并防止细胞裂解^[46,47]。有研究指出,样品收集过程中使用抗凝血剂是必要的^[48,49]。经过对同一样品的ctDNA收集含量的测试发现,乙二胺四乙酸(EDTA)的效果优于柠檬酸盐和肝素^[50]。

其次,样品处理过程可能会显著影响ctDNA的含量水平和实验结果。一些血液预处理步骤,例如抽血后离心和血浆分离之间的时间间隔^[51]、血液储存温度^[52,53]、血液的离心力和速度^[54]、低温下的样品保存时间也会影响最终待测样本中ctDNA的含量水平^[55]。

目前已经报道了多种ctDNA的提取技术,例如基于磁珠的提取方法^[56]和基于苯酚-氯仿的提取方法^[57],以及一些商业化的试剂盒。经过对同一样本用不同的提取方法测试,结果显示,不同的提取方法回收ctDNA特定片段的能力具有一定的差异性^[58,59]。目前还很少有研究比较不同试剂盒的纯化性能,并为获得ctDNA的提取产量提供可靠的评估数据。由于不同实验室之间的检测方法和检测平台不同,ctDNA检测的差异从样本核酸提取的步骤就已开始形成。不同实验室的检测平台最低检测限、方法灵敏度等性能相差甚远,造成了检测结果之间的横向对比分析较为困难。目前为止,还没有标准化的ctDNA分离提取和纯化方案。标准化和优化的提取方案有利于获得ctDNA更高的提取产率。

4 循环肿瘤DNA的检测进展

当前,循环肿瘤DNA(ctDNA)的检测已从单位点突变延伸到特定区域、外显子,甚至整个基因组。ctDNA 在外周血总游离DNA中所占的比例非常小(在许多情况下<1.0%),所以对ctDNA的检测一直以来充满了挑战性,并且需要灵敏的技术手段。科学技术的进步发展使得分析化学领域的许多方法可以用于肿瘤基因突变的检测,一些突出的例子如下,电化学方法DNA离合器探针(DNA clutch probes, DCPs)^[60]和组合探针(combinatorial probes, CPs)^[61],基于表面等离子体共振(surface plasmon resonance, SPR)的纳米等离子体生物传感器^[62,63,64],基于表面增强拉曼散射(surface enhanced Raman scattering, SERS)原理的单壁碳纳米管(single-walled carbon nanotubes, SWNTs)^[65]。

实时定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)是目前生物实验室中使用最普遍的方法,其操作简便,结果可靠,是广泛认可的金标准。例如,QIAGEN theras screen© KRAS RGQ PCR 试剂盒和QIAGEN therascreen© EGFR RGQ PCR试剂盒已被FDA批准并且广泛商业化。然而,qPCR技术所谓的“定量”是相对的(往往需要另外一组探针作为“参比”),不能满足越来越严格的量化要求,特别是当目标浓度非常低,表达差异非常小,且反应系统包含大量背景序列或抑制剂时,检测的敏感性和准确性会受到很大的限制。

ctDNA的检测策略日趋成熟和完善,根据所依赖的技术平台,ctDNA检测方法大致可以分为两类:一类是针对少量已知突变的基于PCR的检测方法,以数字PCR技术为代表,另一种是靶向多基因的基于下一代测序技术的方法。了解ctDNA检测的技术方法,便于进一步探索ctDNA在个体化医疗中的巨大潜在价值。本文讨论了ctDNA的检测进展,着重讨论了从数字PCR技术到下一代测序技术。

4.1 数字PCR

PCR技术的革命性发展,使其从终点PCR通过实时荧光PCR发展到当前的数字PCR。最初的PCR技术在20世纪80年代发展,是一种半定量终点PCR^[66,67]。第二代PCR是基于荧光探针或染料检测的实时荧光PCR(quantitative PCR, qPCR),只能实现相对定量。此外,qPCR高度依赖于标准参照物(无论是内部参照还是标准曲线),这些参照物可能来自不同的实验室,甚至在重复实验中也不一致。分子生物学领域的检测技术趋向于精确定量,第三代PCR技术——数字PCR的出现把检测水平引向了一个新的高度,digital PCR不再需要标准参照物,摆脱了传统qPCR方法存在的依赖性,检测的灵敏度也大幅度提高^[68,69]。

1992年,Sykes等首次提出了数字PCR的概念,他们认识到有限稀释、终点PCR和泊松统计相结合可以产生核酸浓度的绝对测量,这种方法虽然没有贴上“数字PCR”的标签,但为以后数字PCR的发展奠定了基础^[70]。1999年,Bert Vogelstein和Ken Kinzler正式提出了“数字PCR”的概念^[71]。数字PCR技术的原理是将一份无限稀释的PCR反应样品分隔成众多个独立的微反应单元,使得每个反应单元包含不多于一个模板分子,大量独立的反应单元在相同的条件下进行PCR扩增,反应结束后,根据“终点信号的有无”来统计阳性反应的比例,通过泊松分布计算目标序列的浓度和绝对数目。数字PCR的灵敏度极高,标准反应体系分隔的过程可以极大程度地降低与目标序列有竞争性作用的背景序列浓度,把目标信号从噪音信号中“拎”出来,因此特别适合在复杂背景中检测稀有突变。

虽然数字PCR技术的原理并不复杂,但在早期的样本分隔过程中遇到了一个难以克服的问题,它不能满足实验中对分散度越来越精确和分散群体数量越来越多的要求,这极大地限制了数字PCR技术的发展。数字PCR的灵敏度,除了与检测设备的灵敏度和PCR扩增效率等因素有关外,很大程度上取决于反应单元的数目。反应单元的数目越多,数字PCR的灵敏度越高,准确度也越高。早期的数字PCR在96/384孔板中进行^[71]。Morrison等^[72]在25 mm×75 mm不锈钢芯片上蚀刻了3072个微反应单元,极大地提高了当时数字PCR的灵敏度,在当时引起了轰动。近几十年来,微流控数字PCR和液滴数字PCR的出现使突破技术瓶颈成为可能。Quake等^[73]于2006年在Science上发表了一项引人注意的工作,使用了其研究小组之前发展的一种由软光刻层组成的新型结构——“Quake valve”对反应单元进行分离,制作出具有1000个6.5 nL微反应室的第一片数字PCR芯片,这种芯片上排列了交织的液体和气体通道,通过微阀实现反应体系的分隔,Quake等开创性的工作从此打开了以微阀实现反应体系分隔的大门。后来,为了实验室中的数字PCR实验免去微泵微阀等复杂性结构以及繁琐的微流控芯片制作工艺,Du等^[74]发明了滑动芯片(SlipChip)的技术。滑动芯片不但避免了复杂的外部控制,而且在灵敏度上相比qPCR也有明显的优势^[75,76,77]。尽管SlipChip还处于发展的早期阶段,但它展示了一个新的微流控平台,为小型但强大的芯片实验室开辟了一种新的可能性。2006年,Fluidigm公司率先嗅到了市场商机,开创了商业化的微流控数字PCR芯片,该芯片具有12.765个阵列,并将这种芯片称为IFC(integrated fluidic circuit)^[78],Fluidigm后继推出了BioMark HD系统,BioMark HD系统采用微泵阀式芯片为基础,通过通道与微阀的开闭实现反应体系的分隔。Life Technologies公司在2009年收购了一个长期合作伙伴BioTrove后开始商业化数字PCR技术,2013年,Life Technologies公司推出了QuantStudio 3D数字PCR系统^[79,80,81]。

液滴数字PCR技术(droplets digital PCR, ddPCR)的出现将digital PCR技术的发展推向了另一个高峰^[82]。液滴数字PCR技术与之前微流控数字PCR技术不同的是不依赖于复杂的微加工分隔,反应样品被流体剪切分隔成数百万个高度分散且均一的液滴,每个独立的液滴都是一个微反应单元,可以通过荧光单独识别,并通过光电倍增管(photomultiplier tube, PMT)或流式细胞仪(flow cytometer, FCM)进行计数分析^{[83,84,85,86,87]}。与传统的qPCR相比,ddPCR显示出更高的灵敏度^[88]。ddPCR系统的灵敏度取决于液滴的数量^[89]。商业上,QuantaLife使用油包水技术推出了第一个商用ddPCR系统,然后被Bio-Rad在2011年以1.62亿美元的价格收购,其ddPCR仪器更名为QX100^TM Droplet Digital PCR继续在市场上销售。这种早期的仪器在推广ddPCR概念和扩大应用领域方面发挥了重要作用。2013年,Bio-Rad推出了它的升级版QX200^TM Droplet Digital PCR系统,该系统可一次性产生20 000个纳升大小的液滴。Rain Dance也是最早使用油包水技术的公司之一,Rain Drop^TM Droplet Digital PCR系统可以实现数量为1000万个皮升级别的液滴^{[79,80,81,82]}。

相对于传统的实时荧光PCR,数字PCR的优势在于其灵敏度,以及消除了对标准曲线或内源对照的依赖。因此数字PCR是扩增和检测核酸,尤其是低水平核酸的理想技术平台,所以特别适用于ctDNA检测。一系列的研究报道了数字PCR技术作为不同癌症中ctDNA检测的技术,如乳腺癌^[90,91]、肺癌^[92,93]和结直肠癌^[94,95]。但是数字PCR技术应用于ctDNA分析的研究普遍依赖于成熟的商业化设备,实验室中的数字PCR技术仍然在不断的发展中。2012年,Men等^[96]使用聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane, PDMS)作为芯片材料,通过微阀压迫PDMS材料壁阻断通道实现每个微反应室的分隔,在2 mm×2 mm的面积区域内制作了一个包含82 000个36 fL的独立分隔微反应单元的微流控芯片,这是迄今为止单个分隔反应体积最小的芯片结构,芯片密度超过了20 000/mm²(如图2a所示)。数字PCR众多独立的反应单元,使得实现高灵敏度成为可能。2011年,Heyries等^[97]制作了一种微流控百万像素数字聚合酶链式反应装置(如图2b所示),利用液体表面张力将核酸样本分隔成100多万个10 pL(20 μm × 20 μm × 25 μm)体积的微反应室,这是迄今为止分隔份数最多的数字PCR芯片,其密度高达每平方厘米440 000个反应室。2017年,Yeh等^[98]报道了一种自供电集成微流控即时低成本启用(SIMPLE)芯片,通过芯片上集成的真空电池能够将血浆自动分离成224个100 nL的微反应室并且通过数字PCR技术定量检测血液样本(如图2c所示)。这种相当简单的装置将繁杂的实验室步骤融合在一个小型芯片上,这种实验室芯片技术是目前为止最便捷、经济、快速、人性化的,或将即时医学诊断(point-of-care medical diagnostic)带入千家万户中。为了克服商品化digital PCR设备较为昂贵、使用过程中液滴生成速度有限制、操作较为复杂等局限性,Nie等^[99]采用自制的玻璃微流控芯片和阶梯乳化生成纳升级微液滴(0.31 nL)的方式,利用digital PCR技术进行乳腺癌基因HER2的拷贝数变异分析。该装置可同时对8个样品进行多重荧光数字PCR检测,利用喷嘴的不对称阵列设计,可以快速产生均一性很高的微液滴(CV=±2.49%)。通过对16例临床样品中HER2基因拷贝数变异的dPCR分析,结果与商品化仪器QuantStudio 3D dPCR的分析结果一致(如图3所示)。

另一种由数字PCR技术发展而来的方法BEAMing,最初由 Vogelstein等^[100]在2003年提出,这种方法是基于珠子(bead)、乳液(emulsion)、扩增(amplification)、磁性(magnetic)这四个主要组分来构建的,所以被称作为BEAMing。BEAMing技术利用链霉亲和素磁珠与生物素标记的寡核苷酸结合,并分隔成油包水的微滴进行PCR反应,通过流式细胞仪检测荧光标记以达到评估ctDNA的目的。2005年,Vogelstein等^[101]首次应用BEAMing技术的临床数据来分析结直肠癌患者的血浆样本。Higgins等^[102]通过筛选来自外周血中的PIK3CA突变来评估BEAMing用于ctDNA检测的可行性,并报告了100%的敏感度。

在努力提高灵敏度的同时,人们发现仅在特定位点的突变检测是不充分的,因此迫切需要一种能够快速准确地提供多个特定位点信息的技术,而二代测序技术恰好能够满足这种需求。

4.2 下一代测序

下一代测序又称为高通量测序(high throughput sequencing),相对于传统的Sanger测序而言,它极大地降低了测序成本,节省测序时间,是测序史上的里程碑^[103]。传统的Sanger测序应用于ctDNA检测有其固有的限制,例如依赖于毛细管电泳、耗时、昂贵且低通量。为了解决Sanger测序中存在的问题,以罗氏454为代表的第二代测序技术以高通量、低成本、高自动化程度的特点问世,打破了Sanger测序近30年的市场垄断。

DNA-seq技术近年来发展迅速,自2005年以来,以商用下一代测序仪Roche/454 FLX^[104]、illumina Novaseq、Hiseq系列^[105]和ABI SOLiDTM^[106]为代表的高通量测序技术相继问世。NGS现在可以在两周内以大约5000美元的价格完成单个人类基因组测序,与传统的Sanger测序相比成本降低了四倍^[107,108]。基于下一代测序的方法如全基因组测序(whole genome sequencing, WGS)、全外显子组测序(whole exome sequencing, WES)等的大规模并行测序功能使其成为以合理的成本进行全基因组遗传变异分析以用于研究和诊断目的的有效工具。通过下一代测序对循环肿瘤DNA进行大量平行分析,有利于掌握患者的全部基因组信息。

2008年,Ley等^[109]首次报道了癌症全基因组序列,这是对急性髓系白血病DNA的描述,该研究建立了一种用全基因组测序作为检测未知癌症突变的方法。Lebofsky等^[110]使用NGS技术(PGM, Life Technologies)同时分析107个血浆样本中的多个基因(包括EGFR、ERBB2、KRAS、BRAF和PIK3CA),与组织样本相比,灵敏度为58%,特异性为87%。最近,Lebifsky等^[111]利用NGS技术检测了27例不同癌症患者的ctDNA中的46个基因。

为了更快地利用NGS技术检测感兴趣的基因突变,靶向测序(targeted sequencing, TS)正受到越来越广泛的关注。代表性方法有靶向扩增子深度测序(targeted amplicon deep sequencing, TAm-Seq)和深度测序肿瘤个体化建档法(cancer personalized profiling by deep sequencing, CAPP-Seq)。

TAm-Seq技术最初于2012年由Forshew等提出,其原理是针对目标区域设计引物进行15个循环的预扩增,产生大小200 bp以下末端重叠覆盖整个区域的扩增子,然后通过PCR选择性扩增含有突变的扩增子区从而排除非特异性产物,最后在回收的产物两端加上测序接头及特异性条形码序进行单端测序。Forshew等^[112]通过跟踪来自46个卵巢癌患者血液样本的ctDNA,能够在2%至65%的等位基因频率下鉴定TP53。该方法鉴定出ctDNA突变率低至2%,特异性高于97%,并且证明了TAm-Seq是对ctDNA大区域进行深度测序的合适方法(如图4a所示)。继TAm-Seq之后,Lawson和Forshew等^[113]开发了一种用于ctDNA数据分析的增强型TAm-Seq平台(TAm-Seq^TM),同时保持了高水平的特异性和灵敏度。

CAPP-Seq技术最初于2014年Newman等^[114]提出,并用于血浆的ctDNA检测,其研究结果显示该方法具有0.02%的超敏感性和96%的特异性(如图4b所示)。CAPP-Seq法是一种联合数据库检索和多阶段生物信息学方法,设计一个由生物素化的寡核苷酸组成的“筛选器”,靶向肿瘤的突变区域,直接应用于待测的循环DNA,来识别肿瘤相关的基因突变,从而直接进行ctDNA的定量测定。为了解决CAPP-seq技术中存在的许多测序片段出现错误的问题,Newman等开发了一种基于CAPP-Seq的集成数字误差抑制增强平台的新方法(iDES-enhanced CAPP-Seq),实现了液体活检的EGFR分析,在非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer, NSCLC)患者水平上检测灵敏度为90%,特异性为96%。该方法允许监测NSCLC ctDNA低至0.004%,这是迄今为止通过深度测序检测到的最小量级的ctDNA^[115]。CAPP-Seq证明了其在非小细胞肺癌检测方面的优势^[115,116],但针对不同癌症类型需要定制不同的筛选器,对其临床推广应用具有一定的限制。CAPP-Seq技术现已被Roche公司收购。下一代测序技术的巨大进步将人类基因组学研究带入了一个新的阶段,并为肿瘤研究领域提供了前所未有的机会。

随着人类全基因组计划的完成,人们对测序技术的要求愈来愈高,一种针对基因组选定区域的新方法出现了,即全外显子组测序(whole exome sequencing, WES)。简单地说,它是一种高通量测序方法,通过杂交捕获来获取和富集所有编码蛋白区域的外显子的DNA序列基因组。2009年Ng等^[117]报道了首次利用外显子组测序来鉴定疾病的可行性研究。这一极具意义的技术后来被Agilent Technologies和Roche NimbleGen公司商业化。Adalsteinsson等对520例转移性前列腺或乳腺患者进行组织活检,结果表明cfDNA全外显子测序结果与转移性肿瘤具有高度一致性,并证实了cfDNA全外显子测序作为许多转移性肿瘤组织活检的潜在替代物的可行性^[118](如图4c所示)。外显子组测序的高覆盖率将DNA测序工作集中在最感兴趣的选定区域,并且可以用比全基因组测序更少的原始序列和成本来分析肿瘤基因突变。目前,基于毛细血管的全外显子测序可以用于分析乳腺癌、直肠癌和胰腺癌的所有已知编码基因^{[119,120,121]}。

在过去的几十年中,人们对循环肿瘤DNA甲基化作为癌症早期检测和筛查的生物标志物的潜在价值产生了极大的兴趣^{[122,123,124,125]}。2015年,Wen等^[126]开创了首个全基因组检测ctDNA甲基化的技术。Guo等探索了一种高通量甲基化无创技术来量化59例肺癌或结直肠癌患者cfDNA中的肿瘤负荷和组织起源,并在47 888个区块水平进行甲基化分析。该技术的核心是利用DNA中的甲基化CpG岛特异性检测信号,是肿瘤ctDNA液体活检和甲基化检测的全新组合。他们的工作标志着液体活检向前迈进了一大步,为癌症的早期诊断策略开辟了一条新的道路^[127]。

种种迹象表明,单一的肿瘤标志物对于检测和病情走向的预判并非完美,因此是否能够将不同生物水平(核酸、蛋白)的多重标志物同时进行液体活检成为人们越来越感兴趣的新策略。Cohen等^[128]首次将KRAS基因突变与蛋白质生物标记物结合用于胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC)的早期检测,并预测这种组合方法可能对早期检测许多癌症类型有用。此后,Cohen等^[129]又报道了一种将PCR和NGS技术相结合用于检测循环肿瘤DNA的无创血液检测的方法,通过对ctDNA和蛋白质生物标志物的综合分析,可以较早地检测出8种常见癌症,并命名为“CancerSEEK”,他们成功地使用了8种蛋白质生物标志物和16种循环肿瘤DNA,并在1005名非转移性癌症患者中进行了测试,灵敏度范围为69%~98%(取决于不同癌症的类型),最终证明了它是一种更敏感、不增加假阳性结果的新型液体活检方法。CancerSEEK是液体活检领域的后起之秀,蛋白质和ctDNA的结合可能是未来癌症早筛的一个趋势。

5 结论及展望

液体活检是一种新兴的癌症检测技术。ctDNA作为一种极具前景和重要价值的肿瘤标志物,能够在多方面,如单核苷酸多态性(SNP)、拷贝数变异(CNV)、DNA甲基化等多个水平对肿瘤的组织来源、产生与发展进行精准的评估,对其检测是当前精准医疗领域的研究热点。通过本文,我们对利用ctDNA进行液体活检的前期分离、纯化以及后期检测的技术路线,特别是从数字PCR技术到测序技术的发展过程和代表性工作的角度,进行了深入的回顾和讨论,并对一些方法进行了简单的比较。综上所述,基于数字PCR和基于下一代测序的方法在循环肿瘤DNA检测中都能够提供优于传统ctDNA检测方法的优越性。基于不同的检测目的和所使用的环境,两种方法可以有选择性地加以使用。例如,dPCR的方法更加适用于有针对性的肿瘤检测和预后评估,因为检测的位点和突变都是可以预判的。而在肿瘤转移、发展或是不明来源的筛查的情况下,测序技术无疑更加具有优势。同时我们注意到,由于样品需要量小,多步反应步骤可加成,甚至针对多种检测标志物的特异性检测可同时进行以及器件化带来的现场检测优势,在ctDNA的检测领域,微流控芯片技术正受到越来越多的关注,我们认为,这也是今后的技术发展新的增长点(如图5所示)。无论如何,我们需要不懈的努力,因为循环肿瘤DNA的检测仍然是一个很有价值但充满挑战的道路。希望在不久的将来,在精准医学领域,ctDNA的快速检测和定量技术能够大放异彩,惠及大众。

参考文献

原文顺序 | 出版日期 | 本文引用

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