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监测细胞微环境及活性分子的有机小分子荧光探针

王阳 ,  黄楚森 ,  贾能勤

化学进展 ›› 2020, Vol. 32 ›› Issue (2-3) :204-218

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化学进展 ›› 2020, Vol. 32 ›› Issue (2-3) :204-218 DOI: 10.7536/PC190513
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监测细胞微环境及活性分子的有机小分子荧光探针

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Molecular Fluorescent Probe for Monitoring Cellular Microenvironment and Active Molecules

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摘要

有机分子荧光探针因其灵敏度高,特异性强,对生物大分子和微环境扰动较少,同时可实现实时动态跟踪监测生物体中微环境的变化以及活性分子,已成为生物传感和生物成像领域的强大工具。本文总结了生物体微环境中常见的活性分子以及用于监测这些活性分子的有机分子荧光探针设计策略,并列举了近几年用于监测生物体中微环境变化以及活性分子的有机分子荧光探针,同时对这些荧光探针灵敏地监测与人类疾病相关的活性分子及其潜在应用价值做了讨论。

Abstract

Small molecular fluorescent probe technology has become a potential tool for biosensing and bioimaging since it can realize real-time dynamic tracking and monitoring of active molecules and microenvironment changes in living organisms with advantages of less disturbance to biological samples, extremely high sensitivity and specificity. In this review, we summarize some characteristics of cellular microenvironment and related bioactive molecules commonly found in them. The design strategies of the molecular fluorescent probes utilized to monitor changes of cellular microenvironments and active molecules are also discussed. Some recently developed molecular fluorescent probes used to monitor microenvironmental changes and active molecules in organisms have also been listed in this review. Additionally, sensing behavior and potential application of these fluorescent probes have also been discussed.

Graphical abstract

关键词

细胞微环境 / 活性分子 / 生物成像 / 有机小分子荧光探针

Key words

cellular microenvironment / bioactive molecule / bioimaging / molecular fluorescent probe

引用本文

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王阳, 黄楚森, 贾能勤. 监测细胞微环境及活性分子的有机小分子荧光探针[J]. 化学进展, 2020, 32(2-3): 204-218 DOI:10.7536/PC190513
Yang Wang, Chusen Huang, Nengqin Jia. Molecular Fluorescent Probe for Monitoring Cellular Microenvironment and Active Molecules[J]. Progress in Chemistry, 2020, 32(2-3): 204-218 DOI:10.7536/PC190513

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Contents

1 Introduction

2 Cellular microenvironments and its bioactive molecule

2.1 pH

2.2 Thiol biomolecules

2.3 ROS/RNS

2.4 Viscosity

2.5 Enzymes

2.6 ATP

3 Design strategy for molecular fluorescent probe to monitor cellular microenvironment and its bioactive molecules

4 Fluorescence probes for monitoring cellular microenvironment and its bioactive molecules

4.1 Fluorescence probes based on pH response

4.2 Fluorescence probes based on thiol biomolecules

4.3 Fluorescence probes based on ROS/RNS

4.4 Fluorescence probes based on viscosity response

4.5 Fluorescence probes based on enzyme detection

4.6 Fluorescence probes based on ATP detection

5 Conclusion and outlook

1 引言

有机小分子荧光探针因其灵敏度高,特异性强,反应速度快,技术简单,对生物大分子和细胞微环境扰动较少等优点已成为生物传感和生物成像领域的强大工具。在过去的十年中,研究人员在开发细胞微环境(如pH、黏度和极性)[1,2,3,4,5,6,7,8]或生物分子(如离子、活性氧类和酶)[9,10,11,12,13]的荧光探针方面取得了显著进展。细胞微环境中一些高表达的活性分子与细胞器失调有关,每一个细胞器都在细胞代谢过程中起着重要的作用。例如,细胞核调节基因表达,线粒体负责有氧代谢,溶酶体消化大分子。细胞器在细胞微环境中执行各自的功能,而生物分子的稳态分解或微环境突变会导致细胞器故障,这进一步导致癌症或疾病。而有机分子荧光探针针对特定的细胞器以及细胞微环境变化等情况能够及时报告细胞错误信息,并且可用于深入了解分析物对健康和患病状态的影响。

目前国内外各课题组设计出多种可监测生物体系中标志性活性分子(比如活性氧类、氟离子、硫化氢、锌阳离子、含巯基氨基酸和一些酶类)的有机分子荧光探针[14,15,16,17,18,19,20,21]。考虑到荧光探针分子可以提供活性生物分子的含量水平及细胞微环境等信息[22],比如近来发展的溶酶体分子转子[23]和内质网极性敏感传感器[24, 25]都是针对细胞微环境设计的荧光探针分子,因此我们有必要对监测细胞微环境(黏度、极性和pH值)[4, 17, 26~29]及相关活性分子的荧光探针做一梳理。本文将对细胞微环境(pH值、黏度)及相关活性分子(活性氧/活性氮分子、生物巯基分子、酶类、ATP)的有机分子荧光探针的设计策略和应用展开综述。虽然细胞微环境中存在着大量与细胞代谢和疾病相关的活性分子,但只有少数成为有机小分子荧光探针研究的重点。本综述也会为后续研究人员针对生物体系内各种多样的活性分子进一步设计多样、高效的小分子荧光探针提供借鉴。

2 细胞微环境及相关的活性分子

2.1 pH值

在细胞的增殖或凋亡过程、离子转运、细胞内吞作用等一系列的生物过程中pH值发挥着至关重要的作用[30],监测细胞内pH值的变化对研究细胞生理过程具有重要意义。在细胞内pH值的异常则影响细胞正常的生长和分裂,从而引发一些疾病,例如癌症[31]、阿尔兹海默症等相关疾病;同样一些细胞器功能异常与pH值的改变息息相关,如酸性细胞器溶酶体,pH值在4.5~5.5的酸性环境中有利于激活溶酶体内的酸性水解酶、核酸酶、脂肪酶等酶的功能[32, 33],当溶酶体pH值发生改变时,导致溶酶体功能紊乱,细胞内大分子代谢异常,从而引发一系列疾病[34,35,36,37];线粒体是产生能量的主要场所,线粒体独特的功能,主要依赖于线粒体的pH值,例如,在生理条件下,线粒体基质维持碱性(pH=8.0),通过呼吸链电子传递将质子挤出内膜[38],传递出的质子与ATP酶结合,产生ATP。当线粒体pH值发生异常时,这一功能受到破坏,引起活性氧(ROS)的产生,如超氧化物、羟基自由基和过氧化氢,同时活性氧(ROS)信号分子的出现,则引起细胞凋亡[39]。因此,设计合成监测活细胞内pH值变化的荧光探针是生命科学领域的一个重要目标。

2.2 巯基生物分子

巯基生物分子在维持生物系统正常运转中起着至关重要的作用,常见的巯基生物分子主要有半胱氨酸(Cys)、高半胱氨酸(Hcy)、谷胱甘肽(GSH),三者具有相似的结构,如图1所示。在细胞内生物巯基分子含量水平的变化与许多疾病相关,半胱氨酸(Cys)的缺乏,会使得儿童生长缓慢、毛色脱色、肝损伤、皮肤损伤等[40];高半胱氨酸(Hcy)水平异常,则会导致阿尔兹海默症[41, 42]、心血管疾病[43, 44];谷胱甘肽(GSH)是细胞中最为丰富的巯基分子,具有多种生物功能,包括维持细胞内氧化还原活性、细胞内信号传导和基因调控,谷胱甘肽可捕获自由基,从而保护细胞免受氧化应激[45, 46]。然而,这些生物巯基分子具有相似的结构和反应活性,它们之间的鉴别也受到了影响,因此设计出能够区分Cys、Hcy和GSH的有机分子荧光传感器非常重要,并引起了研究者关注。

2.3 活性氧/活性氮分子

活性氧(ROS)主要包括超氧阴离子( O 2 · -)、羟基自由基(HO·)、过氧自由基(ROO·)、过氧化氢(H2O2)、单线态氧(1O2)、以及次氯酸(HClO)和次氯酸盐(ClO-)[47]。 活性氧(ROS)的来源主要有两种途径:其一,内源性活性氧的产生来源于机体线粒体有氧呼吸过程,其二,外源性活性氧由紫外线、外源性感染因子产生。活性氧(ROS)不仅涉及不同的生理过程,还涉及各种病理过程,例如炎症、癌症[48]。在正常的细胞微环境中产生的活性氧在生命过程是必不可少的,但当细胞内活性氧(ROS)水平含量异常时,过量的活性氧(ROS)可氧化生物分子(如脂质、蛋白质和DNA),引起细胞氧化损伤,并诱导细胞死亡。

活性氮(RNS)主要包括一氧化氮(NO)、亚硝基自由基(N O 2 ·)、硝酸盐(N O 3 -)、过氧亚硝酸根(ONOO-)。这些活性氮参与心血管、神经和免疫系统的调节,一般活性氮都具有较强的亲核性和氧化性,在细胞内这些活性氮的过表达也可氧化生物分子(如脂质、蛋白质和DNA),并引起细胞氧化损伤,诱导细胞死亡[49]。活性氧(ROS)和活性氮(RNS)在人类健康和疾病中有着重要的意义,因此ROS/RNS的生物学功能已经成为一个重要的研究领域,有机分子荧光探针凭借其灵敏度高、易可视化动态成像等优点成为监测ROS/RNS的最有力的工具。

2.4 黏度

在生物系统中,黏度在细胞微环境中起着重要的作用[50]。然而许多黏度的测量方法都存在着极大的缺点,比如测量过程繁琐、耗时、仪器昂贵或者受到样本尺寸的限制,因此很难在细胞微环境中实现黏度的检测。而有机分子荧光染料具有较高的灵敏度、较高的分辨率,细胞膜透过性好以及测试简单。为解决这一问题,我们将分子转子和有机荧光染料结合,转子分子可以在无黏性或者低黏度环境中自由旋转,此时具有较低的荧光信号,随着黏度增大,旋转受到抑制,从而恢复荧光信号,因此这类探针可在细胞水平上实时监测细胞内的黏度变化[23, 51~55]。

细胞主要由细胞膜、细胞骨架和细胞质组成,细胞质和细胞膜都具有黏性[56],黏度的变化与细胞内各种生理过程的改变有关,尤其是与各种疾病相关,比如动脉粥样硬化、高胆固醇血症、糖尿病、阿尔茨海默病,白细胞中膜黏度的增加也与衰老过程有关[57]。而且,细胞器作为细胞的重要组成部分,当其黏度发生变化时,导致其功能絮乱,影响细胞的正常代谢[23, 53, 58]。

2.5 酶类

酶活性的异常与疾病、癌症的发生息息相关。例如氧化还原酶是调节生命系统中氧化还原稳态的酶,其异常调节与各种疾病相关:比如,酪氨酸氧化酶(酪氨酸酶)与黑素瘤癌症有关;单胺氧化酶(MAO)是帕金森综合症(PD)和阿尔兹海默症(AD)的生物标志物;半乳糖苷酶与衰老相关[11, 59~61]。因此,这些酶在细胞微环境中的分布情况和表达水平对癌症的早期诊断和监测具有重要意义。发展合适的高选择性有机分子荧光探针实现对于各类相应酶的实时可视化监控有利于我们深入理解癌症等各类疾病的发生机理和发展进程。

2.6 三磷酸腺苷(ATP)

三磷酸腺苷(ATP)是生物体的主要能量来源,为生物分子的合成和转运、肌肉收缩等生命活动提供能量,同时ATP也调节细胞内的信号分子传递[62],神经递质传递[63]。生物体内ATP含量异常,会导致缺血、帕金森病和低血糖等疾病。因此,ATP的检测和监测对于了解生物过程至关重要。而有机分子荧光探针具有较高的选择性、高灵敏度、快速响应、且可长期监测细胞微环境的变化,可实现对ATP的量化。

3 监测细胞微环境及其活性分子的有机分子荧光探针的设计策略

有机分子荧光探针被认为是监测和可视化细胞内分析物的有效分子工具,一般来说,用于监测细胞微环境及活性分子的有机分子荧光探针由三部分构成(如图2)。(1)受体(receptor)对检测物的选择性识别起决定性的作用,同时受体也决定了荧光团的光学性能。(2)荧光团(fluorophore)是光信号的发出者,可以将底物识别信息转化为荧光信号;另外,不同的荧光团具有不同的发射信号、量子产率以及Stokes位移。在设计探针选择荧光团母体时候,可以根据实际情况选择不同类型的荧光团。(3)连接臂(relay)是将荧光团母体与受体连接起来的桥梁,当受体识别分析物后,通过连接臂将信号传递给荧光团母体,同时荧光团释放信号,实现对分析物的检测[64]。其中主要常见的荧光团有萘酰亚胺类(Naphthalimide)、罗丹明类(Rhodamine B)、香豆素类(Coumarin)、氟硼吡咯类(BODIPY)、菁类(Cyanine dye)等(如图3)[65]。

根据有机分子荧光探针与细胞微环境及活性分子相互作用机理,主要有光诱导电子转移、分子内电荷转移、激发态分子内质子转移、荧光能量共振转移4种常见的识别机理。

光诱导电子转移(Photoinduced Electron Transfer, PET)是将非荧光分子转化为荧光分子最常用的方法之一[66,67,68]。PET效应是受体的电子转移到荧光团的激发态,同时受体电子的能量必须在荧光团π轨道和π*轨道之间,受体电子占据荧光团的π轨道,阻断荧光团π轨道上的电子回到原来的基态,从而导致了荧光团无法发射荧光。PET的电子转移过程如图4所示。

分子内电荷转移(Intermolecular Charge Transfer, ICT)[68,69,70,71]是在荧光团的两端同时连接了电子供体(Donor)和电子受体(Accepter),π键在二者之间提供电子转移的通道,形成推拉电子体系(如图5),其中电子供体或者电子受体可引入识别基团,阻断推拉电子体系,当受体识别检测物后,推拉电子再次形成,使得荧光团荧光恢复。

激发态分子内质子转移(Excited-State Intramolecular Proton Transfer,ESIPT)通常包括在荧光团激发下从羟基(或者氨基)单元到羰基(或亚胺氮)原子的快速质子转移。如图6所示,苯并噻唑类(HBO)首先以烯醇(E)的形式存在,在320 nm激发时,由于ESIPT效应,被激发的烯醇(E*)转化为激发态的酮,这个过程产生了一个巨大的斯托克斯发射带(500 nm);在回到基态后,又从酮形式(K)通过质子的反向转移回到烯醇形式,没有发生ESIPT效应的烯醇在 430 nm处具有发射带[68, 72~75]。

荧光能量共振转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET),当一个荧光团(能量供体,Donor)的发射光谱与另一荧光团(能量受体,Acceptor)的吸收光谱发生重叠,且两个荧光团之间的距离小于10 nm(如图7),就可以发生能量从供体荧光团到受体荧光团的转移[64, 76~81]。

4 监测细胞微环境及活性分子的有机小分子荧光探针

4.1 监测pH值的荧光探针

细胞内的pH值异常,会引起细胞功能障碍。由于传统的pH计无法监测细胞内pH值的变化,有机分子荧光探针可利用荧光信号的变化实现对细胞微环境中pH值变化的监测,且有机分子荧光探针易修饰,可实现对细胞器内pH值的可视化检测[28, 83]。

对于线粒体内pH值的监测,高丽大学Kim等报道了一种监测线粒体内pH值的探针1[84],该探针可定量监测线粒体内pH值的变化以及可实时监测活细胞内与pH值相关的生理过程。该探针由一个哌嗪连接萘酰亚胺作为荧光信号单元,线粒体靶向基团为阳离子三苯基膦,同时活性氯化苄基用于线粒体的固定。探针对线粒体内pH值的变化具有良好的信号响应。此外,该探针还可监测细胞缺乏营养时线粒体受损的自噬过程(如图8)。

对于溶酶体内pH值的监测,济南大学林伟英等设计一种具有双识别位点且靶向溶酶体的pH探针2(CN-pH)用于监测活细胞中溶酶体内pH值的变化(如图9)[85]。图9a该探针的构建巧妙地结合了ICT-PET-FRET三种机理,通过三种机理的调控,实现了对溶酶体内pH值的检测。从图9b可以看出该探针是由香豆素作为能量供体,萘酰亚胺作为能量受体构建的荧光探针,香豆素中的羟基和萘酰亚胺中吗啉环为pH值响应位点,分别利用ICT和PET控制香豆素和萘酰亚胺的荧光信号。该探针的荧光比值在pH=4.0~8.0与pH值呈现良好的线性关系,且该探针可实现对溶酶体内pH值的荧光成像。

以上两例pH探针主要监测细胞内细胞器的pH值变化,不能监测对pH值的比色变化。利用花菁和半花菁染料构建比值型pH探针,可裸眼观察实现比色检测pH值的探针鲜有报道。本课题组设计了一种新型基于半菁类染料的比值pH荧光探针3(CPH)[29]。该探针可很好地实现比色和荧光比值双模态监测pH值(如图10)。该探针设计简单,由两部分组成,一部分是连接在吲哚半花菁氮原子位置的苄基,另一部分作为pH值受体的酚羟基。该探针巧妙的是当pKa值在6.44时,探针3(CPH)在溶酶体中积累,能够实现对溶酶体的靶向。此外,探针3(CPH)可以固定在试纸上制成pH值试纸,该试纸对酸/碱蒸气具有快速、可逆的比色变化,并且可通过裸眼观察完成检测。

热休克可改变溶酶体膜通透性,导致溶酶体pH值的异常。因此,为了进一步研究溶酶体与活细胞热休克之间的相互作用,本课题组基于之前设计的比值pH荧光探针3(CPH)[29],设计了一种具有溶酶体靶向性的pH比值荧光探针4(CPY),用于监测细胞处于热休克状态下溶酶体的pH值的变化[86]。其中吗啉基团作为探针4(CPY)靶向溶酶体的基团,CPH部分作为监测pH值变化的荧光信号基团(图11 a);探针4(CPY)在pH值为3.0~11.0时,有着良好的荧光比值信号(图11 b);将HeLa细胞置于高温下,构建细胞热休克模型,如图11 c所示,随着温度的逐渐升高绿色通道的荧光逐渐减弱,同时黄色通道的荧光信号逐渐增强,实现了细胞处于热休克状态下溶酶体pH值变化的比值检测。

4.2 监测巯基生物分子的荧光探针

对于半胱氨酸(Cys),山西大学阴彩霞等报道了一例香豆素衍生物的荧光探针5,监测半胱氨酸(Cys)在活细胞内的代谢过程[20]。探针5的设计巧妙之处在于合成了一种香豆素衍生物且在该荧光团上具有双重识别位点,可对半胱氨酸(Cys)及其代谢物二氧化硫(SO2)进行实时监测(图12 a)。该探针对半胱氨酸(Cys)和二氧化硫(SO2)的检测可实现双通道模式,探针5与Cys响应,其发射位于514 nm,探针5与SO2响应其发射位于576 nm,因此该探针也成功地应用于斑马鱼的成像,如图12b。此外,探针5通过上述的比率方式成功监测了A549细胞中Cys转化为SO2的过程,如图12c,该有机分子荧光探针是第一个成像内源性SO2的荧光探针。

韩国高丽大学 Kim等设计了一种基于萘酰亚胺的ICT型荧光探针6用于肝癌细胞内硫醇成像[87]。该探针包含一个可被硫醇断裂的硫醇受体二硫键、一个荧光团母体萘酰亚胺和一个靶向基团半乳糖;在硫醇存在下,二硫键很容易断裂,释放出4-氨基萘酰亚胺,形成推拉电子体系,使得探针发射红移并产生明显的颜色变化,如图13所示。

相邻巯基主要以二硫键形式存在,当细胞外微环境发生变化时,相邻巯基对于维持正常细胞蛋白结构起着非常重要的作用。

为了定量研究相邻巯基在细胞中分布情况和动态变化,本课题组设计合成一种比值荧光探针7(VTAF),用于捕获活细胞中含有相邻巯基的蛋白(VDPs)[88]。合成的探针7(VTAF)对相邻巯基蛋白具有特异性响应,在470和540 nm处可以实现比值型检测,在细胞成像时可消除荧光背景干扰并定量内源性相邻巯基蛋白(如图14)。

血清白蛋白在生物体内具有多种生物学功能,异常的血清白蛋白与多种疾病相关,现有检测血样和尿样中血清白蛋白的方法具有一定的局限性,无法实现活体生物体内的内源性血清白蛋白的跟踪和探索。为此,本课题组设计一种多功能近红外荧光探针8(C7H),用于研究内源性血清白蛋白[89]。探针8(C7H)与血清白蛋白Ⅰ位点具有高度特异性的相互作用(图15a)。此外,探针8(C7H)可实时监测斑马鱼幼体创伤部位的荧光成像(图15 b)。因此,探针8(C7H)可作为一种可视化工具,用于追踪斑马鱼幼体的内源性血清白蛋白,且探针8(C7H)可以作为研究创伤部位愈合的有效手段,探针8(C7H)的成功设计对人类伤口愈合的研究具有重大的意义。

4.3 监测活性氧/活性氮的荧光探针

细胞内活性分子活性氧(ROS)和活性氮(RNS)可引起机体的氧化应激。这不仅涉及不同的生理过程,还涉及各种病理过程,包括衰老、癌症和神经性疾病[90]。此外,环境中的一些活性氧也威胁着人类健康。基于这些影响,需要使用灵敏的手段检测活细胞、组织和有机体中活性氧的含量[91]。

ROS作为线粒体中电子传递链的副产物[92],调节生物系统中各种不同的生理和病理过程。彭孝军等设计一种针对高活性氧类(hROS)的线粒体靶向荧光探针10(PTZ-Cy2)。该探针由半花菁-吩噻嗪构成(图16a)[14],探针10(PTZ-Cy2)可监测ClO-和·OH(图16b, c),这归因于吩噻嗪中硫原子的氧化和半花菁π共轭的破坏。探针10(PTZ-Cy2) 可在线粒体中实现hROS比率可视化成像(图16d)。

为了设计一个具有特异性的HClO特异性的荧光探针,彭孝军等在BODIPY的2位引入了一个肟基(图17a)[93]。探针11(MitoClO) 的荧光由于C＝N异构化而猝灭。

肟基团可以与NaClO反应迅速生成羧基, C＝N的异构化消失使荧光恢复。探针11(MitoClO)对NaClO 响应迅速,检测线低,选择性高。使用佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA)和脂多糖(LPS)刺激细胞产生内源性HClO,可实现探针11(MitoClO) 对内源性HClO成像(图17b)。

对于过氧化氢(H2O2)的检测,韩国梨花女子大学Yoon等开发了一种靶向溶酶体的荧光探针用于过氧化氢(H2O2)的检测[94]。如图18所示,在H2O2存在下,探针 12中的硼酸酯基断裂,形成苯酚,4-羟基苄氧羰基离去,产生游离的亚胺,使 528 nm处的荧光得以增强,而且该探针对其他活性分子如ClO-、·OH、·NO、t-BuO等无响应,说明该探针对H2O2具有较高的选择性。细胞成像研究表明,探针 12可靶向溶酶体,并可检测溶酶体中的H2O2。

James、Bull和Yoon 等设计一种基于硼酸酯的荧光探针13,用于选择性检测单糖激活的ONOO-[95]。如图19所示,在D-单糖存在下,探针13 用410 nm激发时,在525 nm处显示出最大发射。在ONOO-存在下,阻断了探针13与D-单糖的结合,荧光被猝灭,而其他的ROS和RNS只能使得探针13的荧光微弱下降。探针13 off-on的过程是由于探针13硼酸基团与单糖的结合,阻止电子从胺基转向氨基萘酰亚胺,PET被禁阻,荧光恢复,最后,ONOO-氧化硼酸转化为苯酚,使得PET效应恢复,荧光猝灭。而且探针13还可用于RAW264.7和HeLa细胞内源性和外源性ONOO-的检测。

4.4 监测黏度的荧光探针

细胞黏度是影响细胞内生物分子之间相互作用、化学信号传输以及活性代谢物在细胞内扩散的主要参数之一。因此,在细胞水平上,细胞黏度的变化与多种疾病息息相关。

线粒体作为真核细胞内重要的细胞器,在多种疾病中发挥着重要作用,线粒体异常与阿尔兹海默症(AD)密切相关。研究表明,线粒体黏度和过氧化氢浓度异常均与AD有关,因此林伟英等针对这一问题,设计合成第一个双检测探针14[96]。如图20所示,该探针可以用不同的荧光信号在活细胞中显示线粒体的黏度变化并监测过氧化氢。

如何设计一种简单且具有良好水溶性的双光子荧光探针用于细胞器黏度的监测,仍然是一个挑战。因此,田玉鹏等报道一种新型的水溶性比率黏度荧光探针15(EIN),可对活细胞中线粒体黏度变化进行监测[97],如图21所示。探针15(EIN)具有两个发射带,分别为384 nm和569 nm,随着黏度的增大,两个不同波长的发射带显著增加,成功实现了一种水溶性双光子荧光探针用于活细胞线粒体黏度的比率成像。

大连理工大学肖义等设计合成一种溶酶体黏度探针[23](图22),该探针16(Lyso-V)是第一个溶酶体黏度探针,该探针由BODIPY母体组成,吗啉环为溶酶体靶向基团,通过荧光寿命成像对细胞内溶酶体的黏度变化进行定量检测,同时可实时跟踪溶酶体的黏度变化。利用设计的溶酶体黏度探针首次获得了MCF-7细胞溶酶体黏度数据。

溶酶体是活细胞的主要消化中心,酸性最强的细胞器(pH值4.5~5.5),溶酶体黏度范围在47~190 cp(25 ℃)这一范围内。当溶酶体黏度异常时,会引发一系列的疾病,例如炎症、阿尔兹海默症等。绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP)助色团对生物体无毒无害,分子量小,易于修饰,因此非常适合用于细胞微环境及其生物分子的标记,基于以上,本课题组首次利用绿色荧光蛋白(GFP)助色团构建了一例溶酶体黏度探针17(Lys-V),用于绘制活细胞溶酶体黏度图谱[98]。探针17(Lys-V)的设计策略为利用Knoevenagel反应延长GFP助色团共轭体系(图23a所示),当黏度增加时会限制羟基苯酚与咪唑啉酮环之间的C＝C双键的转动,从而使探针17(Lys-V)荧光发射强度随黏度的增加而增加,且log FI515 nm与log viscosity具有良好线性关系(图23b所示)。探针17(Lys-V)具有较宽pH检测范围4~10(图23c)并且可实现对溶酶体的标记(图23d)。更重要的是,在地塞米松刺激下,探针17(Lys-V)可以捕捉到溶酶体的动态黏度变化(图23e)。探针17(Lys-V)为监测活细胞溶酶体黏度的变化提供一种新的化学工具,这对研究溶酶体相关疾病具有重要意义。

4.5 监测酶的荧光探针

酶在调节生命系统中起着至关重要的作用,它的异常可引起多种疾病。例如,酪氨酸氧化酶(酪氨酸酶)与黑素瘤癌症和帕金森氏病(PD)有关;细胞色素P450(CYP)是一种血红素蛋白,在物质的代谢降解中起重要作用,CYP 的异常表达是肝损伤的标志;单胺氧化酶(MAO)是帕金森氏病(PD)和阿尔茨海默氏病(AD)的生物标志物[59, 99~102]。

酪氨酸酶是作为疾病标志物最常见的氧化酶之一,是一种含铜酶,在黑色素瘤和帕金森氏病中起重要作用。如图24所示,马会民等[102]提出新的酪氨酸酶识别单元(3-羟基苄基),并以半花菁为母体,设计出了适用于活细胞及斑马鱼成像的近红外荧光探针18,该探针对酪氨酸酶具有较高的特异性,可准确检测活细胞中酶的活性;探针19也是基于类似的策略设计的,在酪氨酸酶的存在下,荧光信号恢复[103];周翔等[104]设计了一种双光子荧光探针20,用于成像活细胞中酪氨酸酶的活性,该探针是通过三光气将受体4-氨基苯酚基团连接到双光子荧光团上,酪氨酸酶引发4-氨基苯酚基团两步氧化产生邻醌中间体,在水环境下不稳定,发生一个快速的分子内环化释放出双光子荧光团;由于酪氨酸酶主要位于黑色素瘤细胞的黑素体中,马会民等又设计出新的探针21,该探针以吗啉环为靶向基团,4-氨基苯酚为受体,实现了监测黑色素瘤细胞的溶酶体中酪氨酸酶的分布情况。

硝基还原酶(NTR)是另一种还原酶,与辅酶NADH结合,可还原含硝基的化合物。NTR是乏氧肿瘤细胞的生物标志物。大多数监测NTR的荧光探针含有硝基苯或对硝基苄醇基团,因为它们能抑制荧光团电子传递[106,107,108,109,110,111,112]。

对于硝基还原酶的检测,马会民等开发了一种基于罗丹明(ATP)和4-硝基萘酰亚胺(NTR)双重荧光的探针,探针22可同时检测癌细胞中的NTR和ATP(图25)[106]。虽然NTR活性升高是癌细胞中常见的现象,但ATP过量在癌细胞中所起的作用尚不清楚。利用探针22成功地监测了缺氧和常氧HeLa细胞的NTR和ATP活性,发现缺氧环境下细胞内NTR和ATP水平的变化相反,说明ATP有可能作为缺氧细胞中新的标志物。

济南大学林伟英等报道设计一种基于ESIPT效应的黄酮类荧光团用于检测细胞中酯酶并用于区别死细胞和活细胞[113]。探针23是一种新型的荧光探针,它可以在双色模式下区别活细胞和死细胞。当细胞死亡,该探针23发出440 nm蓝色荧光标记死细胞,而活细胞中,该探针23可发出570 nm的橙色荧光。这种双色成像,可以有效地避免细胞自身荧光带来的干扰,为生物应用提供更准确的信息(图26)。

4.6 监测ATP的荧光探针

有机分子荧光探针对细胞微环境中的ATP、ADP、AMP、CTP、GTP、UTP、TTP等有机磷酸盐阴离子的选择性识别和监测,目前是一个很重要的研究课题。在上述有机磷酸盐阴离子中,ATP作为细胞中主要能量来源,参与细胞中各种代谢,因此监测细胞中ATP含量的变化具有重要意义。

湘潭大学李春燕等[114]设计合成一种比值型荧光探针用于细胞内ATP的检测,且该探针24具有较高的选择性。该探针的设计利用FRET策略,萘酰亚胺作为能量供体,罗丹明B作为能量受体,通过ATP诱导罗丹明开环来调控荧光信号(如图27 a和b)。利用ATP水解酶apyrase,将ATP转化为AMP和其他无机磷酸盐,进行细胞成像,从图27 c可以看出红色通道下,随着时间延长荧光强度明显减弱,而绿色通道荧光强度逐渐增强,这表明探针24对ATP具有较高选择性且探针24可以用于细胞微环境中ATP的比值成像。

三磷酸腺苷(ATP)主要由线粒体产生,目前已经成功构建多种ATP荧光探针,但大多数荧光探针都不适合监测线粒体中ATP含量变化。因此,该课题组进一步设计出一种可实现监测线粒体中ATP的荧光探针25,如图28所示[115]。如图28a所示,在探针25中,罗丹明输出荧光信号,二乙烯三胺作为与ATP反应位点,三苯基膦作为线粒体靶向基团。如图28b所示,探针25可以定位到线粒体,并实现线粒体中ATP的检测。探针25在实时监测线粒体ATP含量水平的变化这一应用中具有实用价值。

5 结论与展望

用于监测细胞微环境中活性分子的有机荧光探针已经取得了较大的研究进展,目前已设计开发出一系列高选择性、高灵敏度的荧光探针。最重要的是,有机分子荧光探针能够直接监测和成像细胞微环境中活性分子的分布情况以及含量变化,为疾病诊断和研究疾病发生以及治疗过程提供了强有力的工具。在细胞微环境中存在着大量与细胞代谢和疾病相关的活性分子,可只有少数成为有机分子荧光探针研究的重点。但我们相信随着化学生物学和光化学的不断发展,有关细胞微环境的活性分子和生物标志物的研究将会不断增加,有机分子荧光探针也会成为越来越重要的工具。

尽管在用于监测细胞微环境中活性分子的有机分子荧光探针已取得了较好的研究成果。但是将这些有机分子荧光探针转化为实际环境及临床应用方面存在一些障碍。首先,有机分子探针虽然易溶于有机溶剂,但在水介质中溶解度较差,因此,寻找新的水溶性基团修饰荧光团,这将有助于有机荧光探针的实际应用。其次,在生物机体成像中,为避免生物背景的干扰,应寻找穿透深度深和具有较低组织损伤能力的新型近红外二区有机分子荧光探针作为荧光信号基团。最后,随着越来越多的活性分子被报道出来,有必要开发出多色有机分子荧光探针可同时进行多种活性分子的分析以提高诊断的准确性并提供更有效的生物信息。

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基金资助

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国家自然科学基金项目(21302125)

德国洪堡基金会、上海科技启明星(19QA1406400)

教育部博士点新教师项目(20133127120005)

上海市科学技术委员会(18DZ2254200)

上海市科学技术委员会(17070503000)

教育部创新团队(IRT_16R49)

上海市稀土功能材料重点实验室和上海绿色能源化工工程技术研究中心资助()

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