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数字PCR技术的发展及应用

李慧调 ,  潘建章 ,  方群

化学进展 ›› 2020, Vol. 32 ›› Issue (5) :581-593

PDF (18667KB)
化学进展 ›› 2020, Vol. 32 ›› Issue (5) :581-593 DOI: 10.7536/PC190913
综述
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数字PCR技术的发展及应用

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Development and Application of Digital PCR Technology

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摘要

数字PCR(Digital PCR, dPCR)是继实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR, qPCR)之后发展的高灵敏核酸绝对定量分析技术,通过把反应体系均分到大量独立的微反应单元中进行PCR扩增,并根据泊松分布和阳性比例来计算核酸拷贝数实现定量分析。与传统PCR技术相比,数字PCR 技术不依赖于标准曲线,具有更高灵敏度、准确度及高耐受性,可实现对样品的绝对定量分析。近年来,随着微流控技术日臻成熟,基于微流控技术的数字PCR技术得到了快速的发展,在基因突变检测、拷贝数变异检测、病毒微生物检测、转基因食品检测以及测序等方面均得到广泛的应用。本文对数字PCR的原理、技术发展和应用进行了概述。

Abstract

Digital PCR(dPCR) assay is a highly sensitive absolute quantitative analysis technique for nucleic acids. Digital PCR systems perform amplification by equally dividing the reaction mixtures into a large number of independent reaction units, and calculates the nucleic acid copy number based on the Poisson distribution and the positive ratio. With the advantages of high sensitivity, accuracy and tolerance, digital PCR assay enables absolute quantitative analysis of samples. In recent years, with the maturity of microfluidic technology, digital PCR assay based on microfluidic technology has been rapidly developed, and widely applied in the analysis of gene mutation, copy number variation, viral microbial, genetically modified foods and DNA sequencing. In this article, the principle, development and applications of the digital PCR technique are reviewed.

Contents

1 Introduction

2 Principle of dPCR technology

3 Development and classification of dPCR technology

3.1 Microchamber-based digital PCR assay

3.2 Microfluidic chip-based digital PCR assay

3.3 Droplet-based digital PCR assay

4 Applications of dPCR technology

4.1 Single cell genetic analysis

4.2 Tumour research

4.3 Prenatal diagnosis

4.4 Virus and microbial analysis

4.5 Food safety and environmental monitoring

4.6 Next generation sequencing validation and gene editing

5 Conclusion and outlook

Graphical abstract

关键词

微流控技术 / 数字PCR / 绝对定量

Key words

microfluidics technology / digital PCR / absolute quantification

引用本文

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李慧调, 潘建章, 方群. 数字PCR技术的发展及应用[J]. 化学进展, 2020, 32(5): 581-593 DOI:10.7536/PC190913
Huitiao Li, Jianzhang Pan, Qun Fang. Development and Application of Digital PCR Technology[J]. Progress in Chemistry, 2020, 32(5): 581-593 DOI:10.7536/PC190913

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1 引言

1985年,Mullis等[1]首次提出PCR扩增技术,这种体外酶促合成特异DNA片段的技术通过特异性的引物设计和温度条件的控制,使目标DNA在短时间内得以迅速扩增。PCR技术主要经历由高温变性、低温退火、适温延伸等反应组成的热循环过程,使目标DNA得以成指数倍扩增,其过程包括:目标DNA在高温(约95 ℃)时变性解离成单链;在低温(55~60 ℃)下单链DNA与设计的引物对杂交,形成DNA-引物的复合物;在合适的温度(约72 ℃)下以dNTP为反应原料,靶序列为模板,根据“碱基互补”原则进行延伸,获得新的DNA分子[2,3]。PCR技术因具有特异性强、灵敏度高、重复性好、操作简便和省时等优势,在生物医学基础研究和临床诊断等领域已经得到了广泛的应用。传统的PCR分析利用琼脂糖凝胶电泳技术鉴定PCR产物,但存在着操作繁琐和不能定量分析等缺点。为了弥补传统PCR技术的不足,实现对PCR扩增产物的定量分析,发展了实时荧光定量PCR技术(Real-time quantitative PCR, qPCR)。该技术在扩增过程中实时采集反应体系的荧光信号,利用扩增曲线的循环阈值(Cycle threshold, CT)与DNA起始浓度间存在相关性的特点,可定量分析基因拷贝数或基因表达水平[4]。然而qPCR是一种相对定量分析技术,依赖于校准物的标准曲线,且定量的准确性会受到样品的扩增效率或抑制剂等因素的影响。此外,因其检测灵敏度和精确度较低,qPCR技术无法检测到低拷贝数的目标DNA分子,不能在单分子水平对样品进行准确的定量分析。在低丰度检测、稀有突变检测等日益增大的应用需求背景下,数字PCR(digital PCR, dPCR)技术应运而生。近年来,为了简单、快速地实现核酸扩增,等温扩增技术得到了快速的发展。该技术可在等温条件下,短时间(通常是1 h内)内完成核酸扩增,如环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)、滚环扩增(Rolling circle amplification, RCA)技术等。研究者们在数字PCR的基础上发展了数字等温扩增技术(Digital isothermal amplification),但PCR作为应用最广泛、最成熟的技术,其衍生的数字PCR技术目前仍是发展的主流。

2 数字PCR技术的原理

数字PCR(Digital PCR, dPCR)是20世纪90年代末发展起来的一种核酸分子绝对定量技术[5, 6]。该技术可理解为在大规模平行微反应器内进行单分子水平的荧光PCR扩增与计数式检测,相较于qPCR技术,能够直接计数DNA分子的个数,可实现样品的绝对定量分析。数字PCR过程主要包括样品的分散、PCR扩增以及荧光信号的采集与数据分析。该技术在有限稀释模式下,使样品模板随机分散到数百个至数百万个的独立反应单元中,每个反应单元中可能包含有零个、一个或多个DNA模板分子,模板分子的分散符合泊松分布。PCR扩增结束后有荧光信号单元记为1,无荧光信号则记为0,即根据荧光信号的有和无将反应单元分别定义为阳性和阴性。通过对反应单元总数和阳性反应单元数目进行统计,根据泊松分布公式即可计算出DNA模板分子的起始浓度,原理如图1所示[7, 8]。

理想情况下,当待测样品的DNA浓度被稀释到很低水平时,样品溶液被分散到大量的反应单元中,使每个反应单元所含有的DNA分子数最多只有一个,这种条件下,可通过对阳性反应单元的数目进行统计,直接确定DNA模板分子的起始数目。但当测定高浓度模板时,部分反应单元中含有两个或两个以上DNA分子,大量DNA模板分子的随机分布情况符合泊松分布。因此,DNA模板分子的绝对浓度可以采用泊松分布概率公式计算[9]。

p x = k = λ κ k ! e - λ

式(1)[10]中,λ是DNA模板分子在每个反应单元中的平均拷贝数,p是反应单元中含有k拷贝DNA模板分子的概率。λ相当于样品中DNA模板分子的起始拷贝数(c)稀释了m倍(m为稀释倍数,相当于独立反应单元的体积),λ=cm;当k=0时,即反应单元中没有DNA模板分子的情况,式(1)可简化为:

p ( x = 0 ) = e - λ = e ⁃ cm

同时,当k=0时,其概率p(x=0)相当于无DNA模板分子的反应单元数与总的反应单元的比值,即:

e - λ = n - f n

式(3)中,n是反应单元总数,f是阳性反应单元数。

将式(3)两边同时取对数即得到:

cm = λ = - ln 1 - f n

因此,采用数字PCR技术进行核酸定量分析时,在已知反应单元总数、稀释倍数以及阳性反应单元数目的条件下,可得到样品中DNA模板分子的起始拷贝数。在数字PCR技术中,待测物原始浓度的定量既不依赖于校准物的标准曲线,也不受扩增效率的影响——避免了由于样品与校准物扩增效率的不同而导致的结果不确定性与不准确性。与qPCR技术相比,其定量结果具有更高的准确性和灵敏度[11, 12]。

3 数字PCR技术的发展及分类

早在1988年,PCR技术的发明人Mullis等[2]在Science上发表文章指出:将目的基因稀释到1/106的浓度时,经过40个PCR循环过程,扩增的基因能够被检测到。1990年,Stephens等[13]应用单分子稀释PCR和泊松统计的方法研究单倍体DNA。1992年Sykes等[5]基于样品有限稀释、PCR扩增、泊松分布数据校正定量的方法,对低丰度的免疫球蛋白重链突变基因进行了定量检测。虽然当时并无“数字PCR”的提法,但数字PCR分析的基本流程已被确立,并提出了数字PCR检测的判断标志——“终点信号的有或无”,形成了数字PCR技术的雏形。1999年,Vogelstein等[6]提出了数字PCR的概念,以96孔板和384孔板作为反应器,定量研究了结肠癌的KRAS基因突变。

虽然数字PCR技术的原理并不复杂,然而早期在完成样品分散这一步操作时却遇到了较大的困难,在样品分散的数量和均匀性上都很难达到数字PCR的分析要求,极大地限制了数字PCR技术的发展。直到近些年来,随着微流控技术的发展,数字PCR技术突破了原有的技术瓶颈,得到了快速的发展。先后发展了基于微反应腔室、集成化微流控芯片和液滴的数字PCR系统。在Web of Science数据库中,以“digital PCR”或“dPCR”为关键词,搜索1999年至2018年20年间数字PCR技术的论文发表情况,结果显示与数字PCR 分析相关的研究论文数量呈现逐年上升的趋势,近10年内该领域发表论文总数已超过6000篇(图2)。

数字 PCR 技术提出至今,基于微流控技术的数字PCR系统已逐渐发展成为主流平台。以下将根据不同的结构类型对其系统进行分类介绍。

3.1 基于微反应腔室的数字PCR系统

数字PCR技术的检测灵敏度取决于反应单元的总数,反应单元数越多越有利于提高分析灵敏度和准确度。传统的96/384孔板无法满足数字PCR分析对反应单元数的要求。在96/384孔板中进行的PCR反应体系的体积通常在微升级,由试剂消耗引起的高成本和工作量成倍增加也限制了反应单元数量的提升。随着微加工技术的发展,可以通过在平面基材上加工高密度微孔阵列的方法来进行高通量的纳升级或皮升级数字PCR反应,而且能够同时兼顾高精度、高准确度和宽动态检测范围及对样本并行定量分析的能力。

Morrison等[14]采用光刻与湿法刻蚀的加工技术,在25×75 mm的不锈钢芯片上加工了3072个直径为320 μm的通孔结构作为微反应室,将反应孔的体积降为33 nL。该芯片经过一系列的亲疏水方法处理使得微孔内部表面亲水且具有良好的生物相容性,而芯片其他区域是疏水性质,亲疏水性的差异性有利于实现样品精确的加载和划分。该芯片通过使用专门的试样引入装置,借助表面张力的作用,将样品分散到通孔微反应室中,如图3a所示。2013年,Life Technologies公司以此芯片为基础,推出了芯片式数字PCR系统——QuantstudioTM 3D[15],如图3b所示。该系统由数字PCR芯片、芯片加样仪、PCR热循环仪和芯片检测仪组成。其中数字PCR芯片包含20 000个微通孔结构,每个反应单元的反应体积为0.86 nL。基于微反应室结构的商品化数字PCR系统还有ClarityTM数字PCR系统[16]和Constellation数字PCR系统[17],如图3c、d所示。ClarityTM设计“管内芯片”的结构,借助PCR管内的高密度芯片,实现每个管内10 000个独立反应单元的划分,其反应体积为1.5 nL。Constellation的芯片是由多个相互独立的微孔阵列组成,总共可实现96×496个反应单元的分隔,反应体积为4 nL。这类芯片均可与商品化PCR 仪相兼容,用于数字PCR扩增和荧光检测。

3.2 基于集成化微流控芯片的数字PCR系统

基于集成化微流控芯片的数字PCR系统主要采用微加工技术加工出具有大量微通道和微腔室的芯片,通过微通道将PCR反应液引入微腔室内,最后间隔形成独立的微反应室阵列。样品的引入与分隔可采用集成化微泵微阀进行控制。其中,应用最为广泛的是基于聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane, PDMS)材质的微流控芯片的数字PCR系统。

2000年,Unger等[18]利用PDMS材料具有高弹性和易变性的特点,采用多层软光刻技术在芯片上加工具有微反应室阵列、液体通道和微阀气体控制通道等微结构,通过精准控制PDMS 微阀的开启与关闭即可快速地将流体分隔成上千个独立的微反应单元,进行平行反应。2006年,Ottesen等[19]将这种具有PDMS微阀结构的芯片用于数字PCR分析,通过对微阀开启和关闭的精准控制,即可完成将一个样品快速分散成体积为6.25 nL的1176个反应单元中的操作(图4a)。他们同时进行了6个样品7056个单元的数字PCR分析,单块芯片最多可同时进行12个样品的分析。Men等[20]采用多层软光刻技术加工出具有微反应室阵列结构的PDMS芯片,其微反应器密度高达20 000/mm2,利用液压使PDMS形变从而将82 000个36 fL的微反应室一步密封和分隔(图4b)。采用该数字PCR芯片对不同浓度的Hoxa1基因样品进行定量分析检测,其动态检测范围可达5个数量级。

微反应室内样品溶液的分隔除了通过PDMS微阀结构实现外,还可以利用与样品水溶液不互溶的油相(如矿物油、氟油等)分隔各微反应室内的样品溶液,形成大量独立的反应单元。Hansen等[21]采用多层软光刻技术加工了具有106个结构单元的微流控芯片用于数字PCR 分析,其中每个反应单元的体积可降低至10 pL,芯片密度达到440 000/cm2。通过对液体通道两端微阀的压力进行控制,可完成PCR试剂注入所有微反应室的操作,然后通道中多余的反应液被引入的油相FC40驱赶,从而形成独立的反应单元,如图5a所示。采用此芯片可实现对DNA浓度的定量检测,检测的浓度范围达到7个数量级。该芯片被应用于检测野生型JAK2 kinase和V617 Fvariant的单核苷酸变异,灵敏度达到了十万分之一,同时还对1%差别的染色体拷贝数进行了定量分析。

集成单细胞捕获与逆转录反应单元的芯片结构还被用于进行单细胞的逆转录数字PCR(Reverse transcription-dPCR, RT-dPCR)分析,实现单细胞中mRNA和miRNA的绝对定量分析[22]。Thompson等[23]发展了一种自分散型(Self-digitization, SD)数字PCR芯片,利用数字PCR方法对单细胞mRNA转录物进行绝对定量。该芯片利用表面张力使RT-PCR反应液自发进入预先充满不相溶油相的微反应室中,再次通入油相即可将各微反应室的溶液相互分隔,从而形成独立的反应单元(图5b)。此外,Zhu等[24]利用PDMS材料具有透气性的特点,设计了一种自吸分液式微流控芯片用于数字PCR分析,实现了对三种非小细胞肺癌相关基因的定量分析。该芯片不需要外加动力驱动,通过真空脱气形成的负压环境,可驱使样品溶液自动进入与通道连通的5120个、体积为5 nL的微反应室中。用相同的方法油相可被引入到通道中,从而使每个微反应室实现分隔(图5c)。

除了PDMS材料外,也有报道采用其他材质加工微流控芯片用于数字PCR分析。Sundberg等[25]提出了一种基于旋转圆盘芯片的数字PCR系统。该芯片采用聚对苯二甲酸乙二醇酯(Polyethylene terephthalate, PET)的材质,加工有加样储液腔、螺旋形通道、呈放射状面向通道的1000个微反应室及溢流通道,利用离心力驱动样品溶液进入各个反应室完成纳升级液体的分配,再驱动油相进入通道分隔各个反应孔。每个反应室的体积约为33 nL,其体积变异系数为16%。利用空气加热的方式在圆盘芯片上进行快速PCR扩增(图5d)。

3.3 基于液滴的数字PCR系统

基于液滴的数字PCR(Droplet digital PCR, ddPCR)技术的基本原理就是把PCR反应液分隔成大量的纳升级至皮升级的小液滴,在这些小液滴中同时进行PCR扩增,并对扩增后液滴的荧光信号进行统计分析来计算目标基因的拷贝数。液滴数字PCR源于二代测序中的“乳液PCR(Emulsion PCR)技术”[26, 27],即PCR扩增是在包裹了极低浓度的DNA模板(比如单拷贝)与连接引物的磁性微球的液滴中进行。以液滴为反应单元的PCR体系,比微反应腔室和集成化微流控芯片系统更容易实现反应体系的微型化和高通量,而且系统结构简单,成本低,因此目前成为比较理想的数字PCR技术平台。

3.3.1 基于微乳化液滴的数字PCR系统

微乳液数字PCR方法的早期发展源于二代测序中的“乳液PCR技术”,即DNA模板和磁珠包裹在乳液中进行PCR扩增,通常采用高速涡流搅拌油水混合物的方法形成大量油包水液滴。基于此,Dressman等[28]提出了一种基于磁珠和乳液的固相数字PCR技术——EAMing,如图6所示。该技术先对磁珠进行修饰,包被链霉亲和素,同时将引物连接在磁性微球上,将样品溶液和磁性微球的极低浓度的混合液包裹在皮升至纳升的液滴中,进行PCR扩增。扩增后,PCR产物会被固定在液滴中的磁性微球上。将液滴破乳后,利用磁场分离纯化磁珠。然后将能区分不同DNA模板序列的探针与磁珠进行杂交,利用带有荧光基团的抗体结合磁珠上杂交的探针进行标记。最后利用流式细胞仪高通量检测、分选磁性微球。采用聚丙烯酰胺凝胶固定液滴破乳后释放的磁性微球制成微球阵列亦可实现高通量和高灵敏的荧光检测[29]。然而搅拌法形成的液滴体积分布在飞升至纳升之间,体积均一性较差,限制了其在核酸定量检测方面的应用。同时,这类数字PCR系统,依赖于磁珠包被的技术,增加了系统的复杂性和定量分析的难度。

随着液滴微流控技术的发展,液滴的生成与操纵技术越来越成熟,通过基于微流控芯片或毛细管的装置可实现高通量的液滴生成,且液滴的大小较为均一,有利于准确地定量分析及获得较宽的动态检测范围,显著促进了液滴数字PCR技术的应用与发展。目前,微乳化液滴数字PCR系统主要采用具有十字通道或T型通道构型的微流控芯片,利用多相流体间的流体剪切力,使水相的PCR反应液在微通道中被不互溶的油相分隔形成大量的高单散性的油包水液滴。如Beer等[30]提出了一种集成化的液滴PCR系统,该系统由液滴生成、PCR扩增及实时荧光定量检测模块组成。该系统利用T型通道结构的微流控芯片生成大规模单分散的皮升级液滴,并结合了商业化的PCR热循环仪和荧光成像检测系统,成功地在10 pL液滴中定量检测出单个病毒基因组DNA分子。此后,相似的系统也被应用于液滴中单个RNA分子的定量检测[31]。Hindson等[32]利用流动共聚焦芯片生成20 000~2 000 000个体积为1 nL的液滴,并将液滴转移到96孔板中进行PCR扩增,然后将扩增后的液滴从96孔板中转移出来,在微流控芯片中控制液滴逐个通过双通道荧光检测器,以1000液滴/秒的速度采集荧光信号并对阴/阳性液滴进行计数。

Mazutis等[33]发展了一种基于液滴的微流控系统对单个DNA分子进行高通量等温扩增(超分支滚环扩增(Hyperbranched rolling circle amplification, HRCA))。该系统集成液滴生成、液滴重注入、电致液滴融合和在线荧光检测等模块,使用嵌入荧光染料分析液滴中的DNA扩增结果,采用流体聚焦通道生成大量的2 pL液滴,基于液滴中DNA分子的泊松分布对模板DNA进行快速且准确的定量(图7a)。

随后,该系统被用于高度灵敏的KRAS基因突变检测[34],其分辨率可达1/20 000。同时通过生成包含不同荧光探针和DNA模板的液滴,还可对KRAS基因的6种突变位点进行并行多重突变分析,如图7b所示。这一系统也被进一步用于多重数字PCR分析,仅以两个荧光基团进行了脊髓性肌萎缩的5重测定,同时测量两个基因(SMN1和SMN2)的拷贝数并对单核苷酸多态性进行基因分型(c.815 A> G,SMN1)[35]。

Hatch等[36]采用多层软光刻技术加工了一种能够满足高通量和高动态检测范围应用需求的微流控液滴芯片,并开发了相应的PCR热循环控制和大视场成像检测模块。在该芯片上可依次完成液滴生成、分裂、排布、热循环和大视场荧光检测等过程,如图8所示。其中,大视场荧光检测模块可一次性检测1 000 000个液滴的荧光信号。

阶梯乳化是生成液滴的主要方法之一,也常被用于液滴数字PCR分析中。Dangla等[37]发展了一种基于阶梯乳化高通量生成液滴的方法,并构建了阶梯乳化体系的几何模型,研究液滴分裂的机制和影响液滴尺寸的因素。后来这一技术被用于商品化NaicaTM液滴数字PCR系统。此后,Schuler等[38]基于阶梯乳化技术设计了集成液滴数字PCR芯片的装置,该装置结合离心微流控与数字PCR技术,可依次在芯片上实现液滴生成、PCR扩增及荧光读取分析等功能,如图9所示。基于该数字PCR系统,实现了囊泡性纤维的突变基因(p.Phe508del)的定量检测。

近期,Xu等[39]提出了一种利用毛细管在油相界面上下振动而产生液滴的方法,利用该方法生成了不同体积的液滴用于数字化环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP),实现了核酸的绝对定量分析。Chen等[40]发展了一种基于离心力和毛细管微通道阵列生成液滴的方法,可在数分钟内高通量生成100 000液滴。该方法被应用于核酸的绝对定量分析(图10)。

为了在数字PCR技术的基础上完成后续的基因表达检测和测序分析等应用,研究者们在微乳化液滴的基础上,引入BEAMing技术,将引物交联在凝胶液滴上或将交联引物的磁珠包裹在液滴里用于回收完成PCR扩增的液滴。

在BEAMing技术的基础上,Novak等[41]发展了一种基于十字流动聚焦通道形成琼脂糖液滴的数字PCR系统。因琼脂糖液滴具有熔点低、易固化、分子透过性好等特点,该系统将细胞包裹、DNA纯化、乳液PCR扩增及后续流式分析与测序等操作集成于一体,并被应用于单个哺乳细胞的基因分析,实现了对滤泡型淋巴瘤t(14:18)染色体易位变异频率的检测(图11a)。Leng等[42]直接在琼脂糖基质内包裹引物,而不需要引物微球的共同封装即可进行PCR扩增,该方法简化了操作,提高了对液滴的利用率,且PCR扩增效率也得到了提高(图11b)。

现有的一些液滴数字PCR系统,在由液滴生成器产生液滴之后,需将液滴转移到其他模块中进行扩增和检测。在转移过程中可能造成液滴的损失,从而导致目标分子定量的低估。此外,液滴转移过程中也面临着交叉污染的风险。针对上述问题,研究者们提出了“流动数字PCR(on flow dPCR)”的方案,通过将液滴生成器和热循环仪连接起来,形成流动的热循环系统,在线完成液滴的PCR扩增。如Chen等[43]提出了一种基于毛细管的集成液滴数字PCR系统。该系统将高效液相色谱T型接头用于产生液滴,用长毛细管将液滴生成器与热循环仪和流式细胞仪连接起来,形成流动的热循环扩增与检测装置,成功实现了对肺癌(LunX)特异基因的绝对定量(图12a)。Zhang等[44]发展了一种基于喷墨打印技术的在线检测的数字PCR系统。该系统集成了用于产生液滴的喷墨器,用于热循环的盘绕熔融石英毛细管以及用于液滴计数的激光诱导荧光检测器(Laser-induced fluorescence detector, LIFD)。液滴在油相中连续生成后以稳定的分散液形式引入盘绕在圆柱形热循环仪上的毛细管中进行PCR扩增,扩增结束后,液滴荧光信号可通过位于毛细管下游的激光诱导荧光检测器进行检测。该系统被应用于动态范围跨越4个数量级的Caski细胞中HPV序列的绝对定量(图12b)。

3.3.2 基于二维液滴阵列的数字PCR系统

在具有亲疏水性差异的开放表面或高密度微坑结构内可快速生成二维液滴阵列。与微乳化液滴数字PCR系统相比,二维液滴阵列具有可原位实时检测、每个液滴有准确的寻址位置、便于对液滴进行后续操纵等优点。如本课题组[45]发展了基于表面辅助多因素流体间隔(Surface assisted multifactor fluid segmentation, SAMFS)的方法,可在二维微柱阵列芯片上快速形成多种不同体积的液滴,如图13a所示。该液滴阵列系统被应用于多体积数字PCR分析,定量检测的动态范围可达4个数量级。此外,该系统还被应用于定量检测不同乳腺癌细胞系中的HER2基因表达水平。

Li等[46]发展了一种基于微孔阵列的乳化方法,可在PDMS微孔阵列中快速地产生单分散琼脂糖液滴,并将其应用于数字PCR的绝对定量分析(图13b)。基于琼脂糖液滴的溶胶-凝胶转换特性使得能够通过在-20 ℃下冷却液滴阵列来形成稳定的微珠,可保持每个液滴的单克隆性并对所需液滴进行选择性回收。利用DNA测序和流式细胞分选方法证明了液滴的单克隆性,显示了该方法对单分子扩增分析所具有的稳定性和灵活性。

Shen等[47, 48]提出了一种基于滑动芯片的数字PCR系统,可对核酸进行绝对定量分析。滑动芯片主要由两块紧密接触的分别加工有微结构的上下两片玻璃平板组成,通过上下平板之间的滑动完成PCR反应液的引入与间隔,可形成1280个独立的2.6 nL的液滴,如图14a所示。该系统被应用于定量检测金黄葡萄球菌基因组DNA样品。此外,基于滑动芯片还发展了多体积数字PCR系统[49],显著地提高了动态检测范围(图14b)。

将该多体积数字PCR方法用于对人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus, HIV)和丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)的病毒载量进行定量分析,可实现1.8×103~1.2×107 copies/mL的浓度检测范围,其结果与常规方法检测得到的结果一致[50]。

数字PCR技术提出至今,由于其独特的技术优势和应用前景,使其系统的产业化得到了快速的发展。目前,基于微流控技术发展的商品化数字PCR仪器主要有基于微反应腔室的ClarityTM、Quant studioTM 3D、Constellation数字PCR系统,基于集成化微流控芯片的BioMarkTM HD高通量基因分析系统和基于液滴的QX200TM、RaindropTM 、NaicaTM数字PCR系统。表1从样品分配方式、耗样体积、反应单元数、运行通量及运行时间等方面对这些仪器的性能作了对比。

4 数字PCR技术的应用

与qPCR技术相比,数字PCR技术具有极高的灵敏度、特异性和准确度,不依赖CT值进行定量,有较好的重复性,特别适合用于检测稀有基因突变、细微的拷贝数变异和核酸绝对定量分析等。目前,这项技术已被广泛应用于单细胞基因分析、肿瘤研究、产前诊断、病毒微生物分析、食品安全和环境检测、测序结果验证及基因编辑等领域[51]。

4.1 单细胞基因分析

细胞间存在异质性,其主要体现在基因组的各种突变、细胞间基因表达水平不同以及基因转录的随机性。特定的单个细胞的基因突变及表达水平在许多关键生命过程中起着重要作用,为了更深入地探究生命活动的本质,研究单个细胞的基因突变及表达是非常必要的。Farago等[52]使用商品化高密度微孔数字PCR系统(OpenArray微孔板数字PCR仪),在利用膜片钳技术提取单个细胞内物质后定量分析单个神经元中mRNA或miRNA的表达。与qPCR方法相比,数字PCR方法能更精确地确定电生理学表型细胞的基因表达谱的分布或变异性。White等[22]将高通量数字PCR分析方法应用于单细胞分析,对GAPDH、BCR-ABL以及miR-16在单个K562细胞中的表达量进行了定量分析,还进一步利用单细胞数字PCR方法的特异性和灵敏度对单细胞中RNA剪切情况进行了研究。

4.2 肿瘤研究

研究肿瘤有效遗传特性和表观遗传的改变主要通过对拷贝数变异、等位基因失衡、杂合性缺失等基因变异或者是体液中微量的肿瘤标志物进行检测[53]。然而,传统的检测技术在灵敏度和特异性上均无法满足对这些微小差异进行准确定量的要求。而数字PCR作为一种单分子检测技术,可以准确地检测基因的变异、缺失或甲基化水平,对肿瘤的早期筛查和术后疗效的监控起着重要的作用。Cui等[54]基于数字PCR技术的MethyLight检测方法,对23个临床样本中与乳腺癌相关的四个超甲基化等位基因(RARβ2, BRCA1, GSTP1和RASSF1A)进行检测。研究结果表明,数字PCR方法可提高癌症的检出率,为癌症活检诊断和疾病监测提供了工具。Wiencke等[55]采用数字PCR技术对原发性胶质瘤的DNA甲基化进行检测,并将其结果与常规流式细胞术和qPCR方法相对比,显示了数字PCR对DNA甲基化评估的优势。Sartore-Bianchi等[56]通过对结直肠癌DNA甲基化的数字PCR检测,可预测结直肠癌患者对烷化剂的反应,有助于临床疗效的评估。Huber等[57]用数字PCR方法检测肺癌患者痰液中的基因突变,30%~50%的EGFR突变患者可以在痰液中检测出EGFR突变,这与血液中检出率相似,这一研究表明数字PCR方法对痰液的检测可替代某些患者的血液检测。Beaver等[58]利用液滴数字PCR系统对乳腺癌患者癌组织/血浆样品中PIK3CA基因的突变进行定量分析,通过ddPCR分析证实了这些突变并鉴定了另外五种突变。研究表明数字PCR技术可对肿瘤组织中的基因突变进行精确地分析,并且通过对血浆中的循环肿瘤DNA进行检测,可实现对术后疗效的有效监控。Oxnard等[59]采用液滴数字PCR系统检测了晚期肺癌、黑色素细胞瘤患者的血浆游离肿瘤DNA(EGFR、KRAS、BRAF),对血浆游离肿瘤DNA进行了基因分型。并且在肺癌患者接受药物治疗后对疗效进行评估,对可能产生的耐药性基因进行检测,如T790 M。该研究表明利用数字PCR系统对肿瘤DNA进行检测对于治疗疗效评估、提前确认肿瘤恶化、耐药突变检测及肿瘤个体化治疗均具有重要意义。

microRNA(miRNA)是一类内源性的具有调控功能的非编码RNA,其参与调节细胞功能,并稳定地存在于外周循环中,大量研究表明miRNA的异常表达与肿瘤的发生和发展有直接的联系,因此miRNA可发展为肿瘤早期检测的生物标志物。Hindson等[11]使用液滴数字PCR系统对血清miR-141的丰度进行定量分析,并与qPCR方法作对比。结果显示数字PCR方法的重复性提高了7倍,其结果更为可信(P=0.0036 vs P =0.1199)。Mangolini等[60]利用液滴数字PCR系统对循环miRNA进行绝对定量分析,在两组独立的乳腺癌患者和无疾病对照组的血清样品中检测了五种miRNA。在两组乳腺癌患者血清中miR-148b-3p和miR-652-3p水平显著低于对照组,也观察到较高水平的血清miR-10b-5p与不良预后的临床生物学标志物相关。

4.3 产前诊断

产前诊断是指在出生前检测及诊断胚胎或胎儿的发育状态和是否患有疾病等。目前,医学上还主要是利用遗传学和影像学检测技术,胎儿样品的采集通常使用羊膜腔穿刺术和绒毛取材术等创伤性方法从母体内获得,然后进行基因分析。但这种侵入式采样方法对胎儿造成创伤的风险较大,孕妇接受程度较低。Lo等[61]采用常规的PCR扩增方法检测到了胎儿游离DNA的存在,为通过游离胎儿DNA来进行无创产前诊断奠定了基础。随后,Lo等[62]基于数字PCR技术,发展了数字RNA SNP(Single-nucleotide polymorphism, SNP)的方法和数字RCD(Relative chromosome dosage, RCD)的方法,并将其分别用于对21号染色体上PLAC4 mRNA的SNP等位基因以及21号染色体拷贝数与1号染色体拷贝数比率进行分析,可对21三体综合征进行诊断。Tusi等[63]提出了一种基于数字PCR技术无创产前诊断方法,对7例携带血友病基因杂合性突变孕妇的12份血浆进行检测,结果表明利用数字PCR可以准确鉴定胎儿F8和F9基因的突变情况,验证了数字PCR技术可用于遗传病无创诊断的可行性。

4.4 病毒和微生物分析

数字PCR技术因其极高的检测灵敏度、特异性和精确性,在病毒和微生物分析领域中也受到了关注。Strain等[64]利用液滴数字PCR系统对血液中HIV DNA中pol基因和LTR进行定量分析。Ottesen等[19]采用具有PDMS微阀结构的数字PCR芯片进行单细胞基因表达分析实验,研究了自然环境中的微生物群落。

4.5 食品安全和环境监测

数字PCR技术在食品安全和环境监测领域中也发挥了重要作用。Corbisier等[65]用数字PCR方法对玉米种子的外源检测基因和hmg基因进行检测,其结果与标准物的qPCR结果一致,说明数字PCR技术可以用来检测转基因相关DNA的拷贝数。Kim等[66]分别利用数字PCR和qPCR系统对土壤中的特定细菌cupriavidus sp. MBT14和sphingopyxis sp. MD2进行检测,结果表明数字PCR系统对微生物检测有较高的灵敏度,较qPCR系统提高了10倍。

4.6 测序结果验证及基因编辑

数字PCR技术可对测序结果进行验证或应用于基因编辑。Boettger等[67]利用数字PCR技术,可以高通量、快速地验证二代测序(Next-generation sequencing, NGS)系统所发现的基因组结构变异位点。首先使用二代测序技术对人17号染色体的17q21.31区域进行深入的研究,显示有较多的基因组结构在上述区域发生变异,如拷贝数变异等。然后通过数字PCR系统验证相应的变异位点。结果显示,数字PCR的验证结果与二代测序的结果一致。Mock等[68]基于数字PCR的原理,利用GEF-数字PCR方法评估TALE敲除效率,采用双荧光标记区分未编辑位点和突变位点,实现基因编辑效率(Gene-editing frequency, GEF)的定量分析。实验结果表明,GEF-数字PCR方法对CCR5基因编辑效率和CCR2的脱靶效率测定的灵敏度可达0.2%,且与NGS得到的数据结果有很好的一致性。

5 结论与展望

近年来,随着微流控技术的成熟,基于微流控技术的数字PCR技术得到了快速的发展。将微流控技术与数字PCR技术相结合,能够避免繁琐的样品分散操作,在短时间内自动化、高通量地形成大规模的独立反应单元,可简化操作,缩短实验周期,并显著地提高定量分析结果的准确性和灵敏度。微流控技术已逐渐成为数字PCR分析系统的主要技术平台。

与传统的qPCR技术相比,数字PCR技术具有极高的灵敏度、精确度和特异性,特别适用于检测稀有基因的突变、细微的拷贝数变异和核酸绝对定量等,作为一种全新的技术手段已经在精准医疗、微生物检测和食品安全等多个领域获得较为广泛的应用。目前,市场上已有多款商业化的数字PCR仪器出现,对进一步拓展和深化数字PCR技术的应用具有积极的促进作用。但目前文献报道的数字PCR系统和现有的商品化数字PCR仪器还不同程度地存在成本高、自动化和集成度水平低、分析通量低、兼容性差等不足,这是需要在后续发展中不断予以解决的。

参考文献

原文顺序 | 出版日期 | 本文引用
[1]

Saiki R K, Scharf S, Faloona F, Mullis K B, Horn G T, Erlich H A, Arnheim N. Science, 1985,230(4732):1350.

[2]

Saiki R K, Gelfand D H, Stoffel S, Scharf S J, Higuchi R, Horn G T, Mullis K B, Erlich H A. Science, 1988,239(4839):487.

[3]

Mullis K B. Sci. Am., 1990,262(4):56.

[4]

Higuchi R, Fockler C, Dollinger G, Watson R. Bio-Technology, 1993,11(9):1026.
[5]

Sykes P J, Neoh S H, Brisco M J, Hughes E, Condon J, Morley A A. Biotechiques, 1992,13(3):444.
[6]

Vogelstein B, Kinzler K W. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A., 1999,96(16):9236.

[7]

Pohl G, Shih L M. Expert Rev. Mol. Diagn., 2004,4(1):41.

[8]

Baker M. Nat. Methods, 2012,9(6):541.

[9]

刘雯雯(Liu W W). 浙江大学博士论文( Doctoral Dissertation of Zhejiang University of Science and Technology), 2017.
[10]

林彩琴(Lin C Q), 姚波(Yao B). 化学进展 (Progress in Chemistry), 2012, ( 12):2415.

[11]

Whale A S, Huggett J F, Cowen S, Speirs V, Shaw J, Ellison S, Foy C A, Scott D J. Nucleic Acids Res., 2012,40(11):e82.

[12]

Hindson C M, Chevillet J R, Briggs H A, Gallichotte E N, Ruf I K, Hindson B J, Vessella R L, Tewari M. Nat. Methods, 2013,10(10):1003.

[13]

Stephens J C, Rogers J, Ruano G. Am. J. Hum. Genet., 1990,46(6):1149.
[14]

Morrison T, Hurley J, Garcia J, Yoder K, Katz A, Roberts D, Cho J, Kanigan T, Ilyin S E, Horowitz D, Dixon J M, Brenan C J H. Nucleic Acids Res., 2006,34(18):e123.

[15]

Kinz E, Leiherer A, Lang A H, Drexel H, Muendlein A. Int. J. Lab. Hematol., 2015,37(2):217.

[16]

Low H Y, Chan S J, Soo G H, Ling B, Tan E L. Anal. Bioanal. Chem., 2017,409(7):1869.

[17]

Rutsaert S, Bosman K, Trypsteen W, Nijhuis M, Vandekerckhove L. Retrovirology, 2018,15(1):16.

[18]

Unger M A, Chou H P, Thorsen T, Scherer A, Quake S R. Science, 2000,288(5463):113.

[19]

Ottesen E A, Hong J W, Quake S R, Leadbetter J R. Science, 2006,314(5804):1464.

[20]

Men Y F, Fu Y S, Chen Z T, Sims P A, Greenleaf W J, Huang Y Y. Anal. Chem., 2012,84(10):4262.

[21]

Heyries K A, Tropini C, Vaninsberghe M, Doolin C, Petriv O I, Singhal A, Leung K, Hughesman C B, Hansen C L. Nat. Methods, 2011,8(8):649.

[22]

White A K, Heyries K A, Doolin C, VanInsberghe M, Hansen C L. Anal. Chem., 2013,85(15):7182.

[23]

Thompson A M, Gansen A, Paguirigan A L, Kreutz J E, Radich J P, Chiu D T. Anal. Chem., 2014,86(24):12308.

[24]

Zhu QY, Qiu L, Yu B W, Xu Y N, Gao Y B, Pan T T, Tian Q C, Song Q, Jin W, Jin Q H, Mu Y. Lab Chip, 2014,14(6):1176.

[25]

Sundberg S O, Wittwer C T, Gao C, Gale B K. Anal. Chem., 2010,82(4):1546.

[26]

Margulies M, Egholm M, Altman W E, Attiyal S, Baderl J S, Bemben L A, Berka J, Braverman M S, Chen Y J, Chen Z T, Dewell S B, Du L, Fierro J M, Gomes X V, Godwin B C, He W, Helgesen S, Ho C H, Irzyk G P, Jando S C, Alenquer M LI, Jarvie T P, Jirage K B, Kim J B, Knight J R, Lanza J R, Leamon J H, Lefkowitz S M, Lei M, Li J, Lohman K L, Lu H, Makhijani V B, McDade K E, McKenna M P, Myers E W, Nickerson E, Nobile J R, Plant R, Puc B P, Ronan M T, Roth G T, Sarkis G J, Simons J F, Simpson J W, Srinivasan M, Tartaro K R, Tomasz A, Vogt K A, Volkmer G A, Wang S H, Wang Y, Weiner M P, Yu P, Begley R F, Rothberg J M. Nature, 2005,437:376.

[27]

Tawfik D S, Griffiths A D. Nat. Biotechnol., 1998,16:652.

[28]

Dressman D, Yan H, Traverso G, Kinzler K W, Vogelstein B. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2003,100(15):8817.

[29]

Huang H, Qi Z T, Deng L L, Zhou G H, Kajiyama T, Kambara H. Chem. Commun., 2009,27(27):4094.
[30]

Beer N R, Hindson B J, Wheeler E K, Hall S B, Rose K A, Kennedy I M, Colston B W. Anal. Chem., 2007,79(22):8471.

[31]

Beer N R, Wheeler E K, Lee-Houghton L, Watkins N, Nasarabadi S, Hebert N, Leung P, Arnold D W, Bailey C G, Colston B W. Anal. Chem., 2008,80(6):1854.

[32]

Hindson B J, Ness K D, Masquelier D A, Belgrader P, Heredia N J, Makarewicz A J, Bright I J, Lucero M Y, Hiddessen A L, Legler T C, Kitano T K, Hodel M R, Petersen J F, Wyatt P W, Steenblock E R, Shah P H, Bousse L J, Troup C B, Mellen J C, Wittmann D K, ErndtN G, Cauley T H, Koehler R T, So A P, Dube S, Rose K A, Montesclaros L, Wang S L, Stumbo D P, Hodges S P, Romine S, Milanovich F P, White H E, Regan J F, Karlin-Neumann G A, Hindson C M, Saxonov S, Colston B W. Anal. Chem., 2011,83(22):8604.

[33]

Mazutis L, Araghi A F, Miller O J, Baret J C, Frenz Lucas, Janoshazi A, Taly V, Miller B J, Hutchison J B, Link D, Griffiths A D, Ryckelynck M. Anal. Chem., 2009,81(12):4813.

[34]

Pekin D, Skhiri Y, Baret J C, Le Corre D, Mazutis L, Ben S C, Millot F, El Harrak A, Hutchison J B, Larson J W, Link D R, Laurent-Puig P, Griffiths A D, Taly V. Lab Chip, 2011,11(13):2156.

[35]

Zhong Q, Bhattacharya S, Kotsopoulos S, Olson J, Taly V, Griffiths A D, Link D R, Larson J W. Lab Chip, 2011,11(13):2167.

[36]

Hatch A C, Fisher J S, Tovar A R, Hsieh A T, Lin R, Pentoney S L, Yang D L, Lee A P. Lab Chip, 2011,11(22):3838.

[37]

Dangla R, Kayi S C, Baroud C N. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2013,110(3):853.

[38]

Schuler F, Trotter M, Geltman M, Schwemmer F, Wadle S, Dominguez-Garrido E, Lopez M, Cervera-Acedo C, Santibanez P, Von Stetten F, Zengerle R, Paust N. Lab Chip, 2016,16(1):208.

[39]

Xu P, Zheng X, Tao Y, Du W B. Anal. Chem., 2016,88(6):3171.

[40]

Chen Z T, Liao P Y, Zhang F L, Jiang M C, Zhu Y S, Huang Y Y. Lab Chip, 2017,17(2):235.

[41]

Novak R, Zeng Y, Shuga J, Venugopalan G, Fletcher D A, Smith M T, Mathies R A. Angew. Chem. Int. Edit., 2011,123(2):410.
[42]

Leng X F, Zhang W H, Wang C M, Cui L A, Yang C J. Lab Chip, 2010,10(21):2841.

[43]

Chen J Y, Luo Z F, Li L, He J L, Li L Q, Zhu J W, Wu P, He L Q. Lab Chip, 2018,18(3):412.

[44]

Zhang W F, Li N, Koga D, Zhang Y, Zeng H L, Nakajima H, Lin J M, Uchiyama K. Anal. Chem., 2018,90(8):5329.

[45]

Liu W W, Zhu Y, Feng Y M, Fang J, Fang Q. Anal. Chem., 2016,89(1):822.

[46]

Li X R, Zhang D F, Zhang H M, Guan Z C, Song Y L, Liu R C, Zhu Z, Yang C Y. Anal. Chem., 2018,90(4):2570.

[47]

Shen F, Du W B, Kreutz J E, Fok A, Ismagilov R F. Lab Chip, 2010,10(20):2666.

[48]

Shen F, Davydova E K, Du W B, Kreutz J E, Piepenburg O, Ismagilov R F. Anal. Chem., 2011,83(9):3533.

[49]

Kreutz J E, Munson T, Huynh T, Shen F, Du W B, Ismagilov R F. Anal. Chem., 2011,83(21):8158.

[50]

Shen F, Sun B, Kreutz J E, Davydova E K, Du W B, Reddy P L, Joseph L J, Ismagilov R F. J. Am. Chem. Soc., 2011,133(44):17705.

[51]

彭年才(PengN C), 数字PCR——原理、技术及应用 (Digital PCR-Principles, Technologies and Applications). 北京: 科学出版社( Beijing: Science Press), 2017. 204.
[52]

Farago N, Kocsis A K, Lovas S, Molnar G, Boldog E, Rozsa M, Szemenyei V, Vamos E, Nagy L I, Tamas G, Puskas L G. Biotechniques, 2013,54(6):327.
[53]

Jim F H, Simon C, Carole A F. Clin. Chem., 2015,61(1):79.

[54]

Cui X Y, Cao L, Huang Y L, Bai D, Huang S, Lin M, Yang Q Z, Lu T J, Xu F, Li F. Analyst, 2018,143:3011.
[55]

Wiencke J K, Bracci P M, Hsuang G, Zheng S, Hansen H, Wrensch M R, Rice T, Eliot M, Kelsey K T. Epigenetics, 2014,9(10):1360.

[56]

Sartore-Bianchi A, Pietrantonio F, Amatu A, Milione M, Cassingena A, Ghezzi S, Caporale M, Berenato R, Falcomatà C, Pellegrinelli A, Bardelli A, Nichelatti M, Tosi F, De Braud F, Di Nicolantonio F, Barault L, Siena S. Eur. J. Cancer, 2017,71:43.

[57]

Hubers A J, Heideman D A M, Yatabe Y, Wood M D, Tull J, Taron M, Molina M A, Mayo C, Bertran-Alamillo J, Herder G J M, Koning R, Sie D, Ylstra B, Meijer G A, Snijders P J F, Witte B I, Postmus PE, Smith E F, Thunnissen E. Lung Cancer, 2013,82(1):38.

[58]

Beaver J A, Jelovac D, Balukrishna S, Cochran R L, Croessmann S, Zabransky D J, Wong H Y, Valda Toro P, Cidado J, Blair B G, Chu D, Burns T, Higgins M J, Stearns V, Jacobs L, Habibi M, Lange J, Hurley P J, Lauring J, Van Den Berg D A, Kessler J, Jeter S, Samuels M L, Maar D, Cope L, Cimino-Mathews A, Argani P, Wolff A C, Park B H. Clin. Cancer Res., 2014,20(10):2643.

[59]

Oxnard G R, Paweletz C P, Kuang Y, Mach S L, O’Connell A, Messineo M M, Luke J J, Butaney M, Kirschmeier P, Jackman D M, Janne P A. Clin. Cancer Res., 2014,20(6):1698.

[60]

Mangolini A, Ferracin M, Zanzi M V, Saccenti E, Ebnaof S O, Poma V V, Sanz J M, Passaro A, Pedriali M, Frassoldati A, Querzoli P, Sabbioni S, Carcoforo P, Hollingsworth A, Negrini M. Biomark Res., 2015,3(1):12.

[61]

Lo Y M D, Corbetta N, Chamberlain P F, Rai V, Sargent I L, Redman CWG, Wainscoat J S. Lancet, 1997,350(9076):485.

[62]

Lo Y M D, Lun F M F, Chan K C A, Lun F M F, Chan K C A, Tsui N B Y, Chong Ka C, Lau T K, Leung T Y, Zee B C Y, Cantor C R, Chiu R W K. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2007,104(32):13116.

[63]

Tsui N B Y, Kadir R A, Chan K C A, Chi C, Mellars G, Tuddenham E G, Leung T Y, Lau T K, Chiu R W K, Lo Y M D. Blood, 2011,117(13):3684.

[64]

Strain M C, Lada S M, Luong T, Rought S E, Gianella S, Terry V H, Spina C A, Woelk CH, Richman D D. PloS One, 2013,8(4):e55943.

[65]

Corbisier P, Bhat S, Partis L, Xie V R D, Emslie K R. Anal. Bioanal. Chem., 2010,396(6):2143.

[66]

Kim T G, Jeong S, Cho K. Appl. Microbiol. Biot., 2014,98(13):6105.

[67]

Boettger L M, Handsaker R E, Zody M C, McCarroll S A. Nat. Genet., 2012,44(8):881.

[68]

Mock U, Hauber I, Fehse B. Nat. Protoc., 2016,11(3):598.

[1]
Saiki R K, Scharf S, Faloona F, Mullis K B, Horn G T, Erlich H A, Arnheim N. Science, 1985,230(4732):1350. https://www.sciencemag.org/lookup/doi/10.1126/science.2999980
[2]
Saiki R K, Gelfand D H, Stoffel S, Scharf S J, Higuchi R, Horn G T, Mullis K B, Erlich H A. Science, 1988,239(4839):487. https://www.sciencemag.org/lookup/doi/10.1126/science.239.4839.487
[3]
Mullis K B. Sci. Am., 1990,262(4):56. http://www.nature.com/doifinder/10.1038/scientificamerican0490-56
[4]
Higuchi R, Fockler C, Dollinger G, Watson R. Bio-Technology, 1993,11(9):1026.
[5]
Sykes P J, Neoh S H, Brisco M J, Hughes E, Condon J, Morley A A. Biotechiques, 1992,13(3):444.
[6]
Vogelstein B, Kinzler K W. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A., 1999,96(16):9236. http://www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.96.16.9236
[7]
Pohl G, Shih L M. Expert Rev. Mol. Diagn., 2004,4(1):41. http://www.tandfonline.com/doi/full/10.1586/14737159.4.1.41
[8]
Baker M. Nat. Methods, 2012,9(6):541. http://dx.doi.org/10.1038/nmeth.2027
[9]
刘雯雯(Liu W W). 浙江大学博士论文( Doctoral Dissertation of Zhejiang University of Science and Technology), 2017.
[10]
林彩琴(Lin C Q), 姚波(Yao B). 化学进展 (Progress in Chemistry), 2012, ( 12):2415. http://www.progchem.ac.cn//CN/abstract/abstract10997.shtml
[11]
Whale A S, Huggett J F, Cowen S, Speirs V, Shaw J, Ellison S, Foy C A, Scott D J. Nucleic Acids Res., 2012,40(11):e82. https://academic.oup.com/nar/article/40/11/e82/2409772
[12]
Hindson C M, Chevillet J R, Briggs H A, Gallichotte E N, Ruf I K, Hindson B J, Vessella R L, Tewari M. Nat. Methods, 2013,10(10):1003. http://dx.doi.org/10.1038/nmeth.2633
[13]
Stephens J C, Rogers J, Ruano G. Am. J. Hum. Genet., 1990,46(6):1149.
[14]
Morrison T, Hurley J, Garcia J, Yoder K, Katz A, Roberts D, Cho J, Kanigan T, Ilyin S E, Horowitz D, Dixon J M, Brenan C J H. Nucleic Acids Res., 2006,34(18):e123. https://academic.oup.com/nar/article-lookup/doi/10.1093/nar/gkl639
[15]
Kinz E, Leiherer A, Lang A H, Drexel H, Muendlein A. Int. J. Lab. Hematol., 2015,37(2):217. http://doi.wiley.com/10.1111/ijlh.2015.37.issue-2
[16]
Low H Y, Chan S J, Soo G H, Ling B, Tan E L. Anal. Bioanal. Chem., 2017,409(7):1869. http://link.springer.com/10.1007/s00216-016-0131-7
[17]
Rutsaert S, Bosman K, Trypsteen W, Nijhuis M, Vandekerckhove L. Retrovirology, 2018,15(1):16. https://doi.org/10.1186/s12977-018-0399-0
[18]
Unger M A, Chou H P, Thorsen T, Scherer A, Quake S R. Science, 2000,288(5463):113. https://www.sciencemag.org/lookup/doi/10.1126/science.288.5463.113
[19]
Ottesen E A, Hong J W, Quake S R, Leadbetter J R. Science, 2006,314(5804):1464. https://www.sciencemag.org/lookup/doi/10.1126/science.1131370
[20]
Men Y F, Fu Y S, Chen Z T, Sims P A, Greenleaf W J, Huang Y Y. Anal. Chem., 2012,84(10):4262. https://pubs.acs.org/doi/10.1021/ac300761n
[21]
Heyries K A, Tropini C, Vaninsberghe M, Doolin C, Petriv O I, Singhal A, Leung K, Hughesman C B, Hansen C L. Nat. Methods, 2011,8(8):649. https://doi.org/10.1038/nmeth.1640
[22]
White A K, Heyries K A, Doolin C, VanInsberghe M, Hansen C L. Anal. Chem., 2013,85(15):7182. https://pubs.acs.org/doi/10.1021/ac400896j
[23]
Thompson A M, Gansen A, Paguirigan A L, Kreutz J E, Radich J P, Chiu D T. Anal. Chem., 2014,86(24):12308. https://pubs.acs.org/doi/10.1021/ac5035924
[24]
Zhu QY, Qiu L, Yu B W, Xu Y N, Gao Y B, Pan T T, Tian Q C, Song Q, Jin W, Jin Q H, Mu Y. Lab Chip, 2014,14(6):1176. http://dx.doi.org/10.1039/c3lc51327k
[25]
Sundberg S O, Wittwer C T, Gao C, Gale B K. Anal. Chem., 2010,82(4):1546. https://pubs.acs.org/doi/10.1021/ac902398c
[26]
Margulies M, Egholm M, Altman W E, Attiyal S, Baderl J S, Bemben L A, Berka J, Braverman M S, Chen Y J, Chen Z T, Dewell S B, Du L, Fierro J M, Gomes X V, Godwin B C, He W, Helgesen S, Ho C H, Irzyk G P, Jando S C, Alenquer M LI, Jarvie T P, Jirage K B, Kim J B, Knight J R, Lanza J R, Leamon J H, Lefkowitz S M, Lei M, Li J, Lohman K L, Lu H, Makhijani V B, McDade K E, McKenna M P, Myers E W, Nickerson E, Nobile J R, Plant R, Puc B P, Ronan M T, Roth G T, Sarkis G J, Simons J F, Simpson J W, Srinivasan M, Tartaro K R, Tomasz A, Vogt K A, Volkmer G A, Wang S H, Wang Y, Weiner M P, Yu P, Begley R F, Rothberg J M. Nature, 2005,437:376. https://doi.org/10.1038/nature03959
[27]
Tawfik D S, Griffiths A D. Nat. Biotechnol., 1998,16:652. https://doi.org/10.1038/nbt0798-652
[28]
Dressman D, Yan H, Traverso G, Kinzler K W, Vogelstein B. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2003,100(15):8817. http://www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1133470100
[29]
Huang H, Qi Z T, Deng L L, Zhou G H, Kajiyama T, Kambara H. Chem. Commun., 2009,27(27):4094.
[30]
Beer N R, Hindson B J, Wheeler E K, Hall S B, Rose K A, Kennedy I M, Colston B W. Anal. Chem., 2007,79(22):8471. https://pubs.acs.org/doi/10.1021/ac701809w
[31]
Beer N R, Wheeler E K, Lee-Houghton L, Watkins N, Nasarabadi S, Hebert N, Leung P, Arnold D W, Bailey C G, Colston B W. Anal. Chem., 2008,80(6):1854. https://pubs.acs.org/doi/10.1021/ac800048k
[32]
Hindson B J, Ness K D, Masquelier D A, Belgrader P, Heredia N J, Makarewicz A J, Bright I J, Lucero M Y, Hiddessen A L, Legler T C, Kitano T K, Hodel M R, Petersen J F, Wyatt P W, Steenblock E R, Shah P H, Bousse L J, Troup C B, Mellen J C, Wittmann D K, ErndtN G, Cauley T H, Koehler R T, So A P, Dube S, Rose K A, Montesclaros L, Wang S L, Stumbo D P, Hodges S P, Romine S, Milanovich F P, White H E, Regan J F, Karlin-Neumann G A, Hindson C M, Saxonov S, Colston B W. Anal. Chem., 2011,83(22):8604. https://pubs.acs.org/doi/10.1021/ac202028g
[33]
Mazutis L, Araghi A F, Miller O J, Baret J C, Frenz Lucas, Janoshazi A, Taly V, Miller B J, Hutchison J B, Link D, Griffiths A D, Ryckelynck M. Anal. Chem., 2009,81(12):4813. https://pubs.acs.org/doi/10.1021/ac900403z
[34]
Pekin D, Skhiri Y, Baret J C, Le Corre D, Mazutis L, Ben S C, Millot F, El Harrak A, Hutchison J B, Larson J W, Link D R, Laurent-Puig P, Griffiths A D, Taly V. Lab Chip, 2011,11(13):2156. http://dx.doi.org/10.1039/c1lc20128j
[35]
Zhong Q, Bhattacharya S, Kotsopoulos S, Olson J, Taly V, Griffiths A D, Link D R, Larson J W. Lab Chip, 2011,11(13):2167. http://dx.doi.org/10.1039/c1lc20126c
[36]
Hatch A C, Fisher J S, Tovar A R, Hsieh A T, Lin R, Pentoney S L, Yang D L, Lee A P. Lab Chip, 2011,11(22):3838. http://dx.doi.org/10.1039/c1lc20561g
[37]
Dangla R, Kayi S C, Baroud C N. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2013,110(3):853. http://www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1209186110
[38]
Schuler F, Trotter M, Geltman M, Schwemmer F, Wadle S, Dominguez-Garrido E, Lopez M, Cervera-Acedo C, Santibanez P, Von Stetten F, Zengerle R, Paust N. Lab Chip, 2016,16(1):208. http://xlink.rsc.org/?DOI=C5LC01068C
[39]
Xu P, Zheng X, Tao Y, Du W B. Anal. Chem., 2016,88(6):3171. https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.5b04510
[40]
Chen Z T, Liao P Y, Zhang F L, Jiang M C, Zhu Y S, Huang Y Y. Lab Chip, 2017,17(2):235. http://xlink.rsc.org/?DOI=C6LC01305H
[41]
Novak R, Zeng Y, Shuga J, Venugopalan G, Fletcher D A, Smith M T, Mathies R A. Angew. Chem. Int. Edit., 2011,123(2):410.
[42]
Leng X F, Zhang W H, Wang C M, Cui L A, Yang C J. Lab Chip, 2010,10(21):2841. http://xlink.rsc.org/?DOI=c0lc00145g
[43]
Chen J Y, Luo Z F, Li L, He J L, Li L Q, Zhu J W, Wu P, He L Q. Lab Chip, 2018,18(3):412. http://xlink.rsc.org/?DOI=C7LC01160A
[44]
Zhang W F, Li N, Koga D, Zhang Y, Zeng H L, Nakajima H, Lin J M, Uchiyama K. Anal. Chem., 2018,90(8):5329. https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.8b00463
[45]
Liu W W, Zhu Y, Feng Y M, Fang J, Fang Q. Anal. Chem., 2016,89(1):822. https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.6b03687
[46]
Li X R, Zhang D F, Zhang H M, Guan Z C, Song Y L, Liu R C, Zhu Z, Yang C Y. Anal. Chem., 2018,90(4):2570. https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.7b04040
[47]
Shen F, Du W B, Kreutz J E, Fok A, Ismagilov R F. Lab Chip, 2010,10(20):2666. http://xlink.rsc.org/?DOI=c004521g
[48]
Shen F, Davydova E K, Du W B, Kreutz J E, Piepenburg O, Ismagilov R F. Anal. Chem., 2011,83(9):3533. https://pubs.acs.org/doi/10.1021/ac200247e
[49]
Kreutz J E, Munson T, Huynh T, Shen F, Du W B, Ismagilov R F. Anal. Chem., 2011,83(21):8158. https://pubs.acs.org/doi/10.1021/ac201658s
[50]
Shen F, Sun B, Kreutz J E, Davydova E K, Du W B, Reddy P L, Joseph L J, Ismagilov R F. J. Am. Chem. Soc., 2011,133(44):17705. http://dx.doi.org/10.1021/ja2060116
[51]
彭年才(PengN C), 数字PCR——原理、技术及应用 (Digital PCR-Principles, Technologies and Applications). 北京: 科学出版社( Beijing: Science Press), 2017. 204.
[52]
Farago N, Kocsis A K, Lovas S, Molnar G, Boldog E, Rozsa M, Szemenyei V, Vamos E, Nagy L I, Tamas G, Puskas L G. Biotechniques, 2013,54(6):327.
[53]
Jim F H, Simon C, Carole A F. Clin. Chem., 2015,61(1):79. https://academic.oup.com/clinchem/article/61/1/79/5611450
[54]
Cui X Y, Cao L, Huang Y L, Bai D, Huang S, Lin M, Yang Q Z, Lu T J, Xu F, Li F. Analyst, 2018,143:3011.
[55]
Wiencke J K, Bracci P M, Hsuang G, Zheng S, Hansen H, Wrensch M R, Rice T, Eliot M, Kelsey K T. Epigenetics, 2014,9(10):1360. http://dx.doi.org/10.4161/15592294.2014.967589
[56]
Sartore-Bianchi A, Pietrantonio F, Amatu A, Milione M, Cassingena A, Ghezzi S, Caporale M, Berenato R, Falcomatà C, Pellegrinelli A, Bardelli A, Nichelatti M, Tosi F, De Braud F, Di Nicolantonio F, Barault L, Siena S. Eur. J. Cancer, 2017,71:43. https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0959804916325394
[57]
Hubers A J, Heideman D A M, Yatabe Y, Wood M D, Tull J, Taron M, Molina M A, Mayo C, Bertran-Alamillo J, Herder G J M, Koning R, Sie D, Ylstra B, Meijer G A, Snijders P J F, Witte B I, Postmus PE, Smith E F, Thunnissen E. Lung Cancer, 2013,82(1):38. https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0169500213003206
[58]
Beaver J A, Jelovac D, Balukrishna S, Cochran R L, Croessmann S, Zabransky D J, Wong H Y, Valda Toro P, Cidado J, Blair B G, Chu D, Burns T, Higgins M J, Stearns V, Jacobs L, Habibi M, Lange J, Hurley P J, Lauring J, Van Den Berg D A, Kessler J, Jeter S, Samuels M L, Maar D, Cope L, Cimino-Mathews A, Argani P, Wolff A C, Park B H. Clin. Cancer Res., 2014,20(10):2643. http://clincancerres.aacrjournals.org/cgi/doi/10.1158/1078-0432.CCR-13-2933
[59]
Oxnard G R, Paweletz C P, Kuang Y, Mach S L, O’Connell A, Messineo M M, Luke J J, Butaney M, Kirschmeier P, Jackman D M, Janne P A. Clin. Cancer Res., 2014,20(6):1698. http://clincancerres.aacrjournals.org/cgi/doi/10.1158/1078-0432.CCR-13-2482
[60]
Mangolini A, Ferracin M, Zanzi M V, Saccenti E, Ebnaof S O, Poma V V, Sanz J M, Passaro A, Pedriali M, Frassoldati A, Querzoli P, Sabbioni S, Carcoforo P, Hollingsworth A, Negrini M. Biomark Res., 2015,3(1):12. http://biomarkerres.biomedcentral.com/articles/10.1186/s40364-015-0037-0
[61]
Lo Y M D, Corbetta N, Chamberlain P F, Rai V, Sargent I L, Redman CWG, Wainscoat J S. Lancet, 1997,350(9076):485. https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0140673697021740
[62]
Lo Y M D, Lun F M F, Chan K C A, Lun F M F, Chan K C A, Tsui N B Y, Chong Ka C, Lau T K, Leung T Y, Zee B C Y, Cantor C R, Chiu R W K. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2007,104(32):13116. http://www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.0705765104
[63]
Tsui N B Y, Kadir R A, Chan K C A, Chi C, Mellars G, Tuddenham E G, Leung T Y, Lau T K, Chiu R W K, Lo Y M D. Blood, 2011,117(13):3684. http://dx.doi.org/10.1182/blood-2010-10-310789
[64]
Strain M C, Lada S M, Luong T, Rought S E, Gianella S, Terry V H, Spina C A, Woelk CH, Richman D D. PloS One, 2013,8(4):e55943. https://dx.plos.org/10.1371/journal.pone.0055943
[65]
Corbisier P, Bhat S, Partis L, Xie V R D, Emslie K R. Anal. Bioanal. Chem., 2010,396(6):2143. http://link.springer.com/10.1007/s00216-009-3200-3
[66]
Kim T G, Jeong S, Cho K. Appl. Microbiol. Biot., 2014,98(13):6105. http://link.springer.com/10.1007/s00253-014-5794-4
[67]
Boettger L M, Handsaker R E, Zody M C, McCarroll S A. Nat. Genet., 2012,44(8):881. https://doi.org/10.1038/ng.2334
[68]
Mock U, Hauber I, Fehse B. Nat. Protoc., 2016,11(3):598. https://doi.org/10.1038/nprot.2016.027

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