共价有机框架材料在固定化酶及模拟酶领域的应用

侯晨; 陈文强; 付琳慧; 张素风; 梁辰

doi:10.7536/PC191226

化学进展 ›› 2020, Vol. 32 ›› Issue (7) :895-905 DOI: 10.7536/PC191226

综述

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共价有机框架材料在固定化酶及模拟酶领域的应用

侯晨 ¹^,^** ,
陈文强 ¹ ,
付琳慧 ¹ ,
张素风 ¹ ,
梁辰 ²

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Covalent Organic Frameworks(COFs) Materials in Enzyme Immobilization and Mimic Enzymes

Chen Hou ¹^,^** ,
Wenqiang Chen ¹ ,
Linhui Fu ¹ ,
Sufeng Zhang ¹ ,
Chen Liang ²

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摘要

共价有机框架(Covalent Organic Frameworks, COFs)是一类由轻质元素通过可逆共价键连接而成的晶型多孔有机材料。因具有高比表面积、低密度、规则的孔隙和易于功能化等独特的性能和结构,COFs在气体吸附、化学传感和非均相催化等领域有着广泛的应用前景。近年来,COFs逐渐显现出在固定化酶和模拟酶领域的应用潜力,由于可以轻松定制COF上的官能团以保持COF与酶之间的特定相互作用,因此COF成为有吸引力的酶固定基质。此外,COF的连续且封闭的开放通道为渗透酶提供了良好的微环境。同时,探索了COF模拟酶的特征,通过“从下到上”的方法或后修饰策略设计了COF模拟酶。这不仅扩展了固定化酶载体材料的研究和应用范围,还为模拟酶仿生催化提供了新的研究思路。本文综述了COFs固定化酶和作为纳米材料模拟酶(纳米酶)在生物催化领域的研究进展,详细讨论了COFs载体的合成和功能化策略、固定化酶方式,以及COFs纳米酶的设计理念、催化活性和选择性等内容。最后总结了目前COFs在酶催化领域所面临的挑战和未来发展的机遇。

Abstract

Covalent organic frameworks(COFs) are a class of crystalline porous organic material, constructed with light elements by reversible covalent bonds. Due to their high surface area, low density, regular channel structure and facile functionalization, COFs have attracted much attention and shown high perspectives in gas adsorption, chemical sensing, heterogeneous catalysis, etc. Recently, COFs have shown potential applications in enzyme immobilization and mimic enzymes. COFs present an attractive category of enzyme immobilization matrix, because the functional groups on COFs can be readily tailored to hold specific interactions between COFs and enzymes. Moreover, the continuous and confined open channels of COFs provide a favorable micro-environment for infiltrating enzymes. Meanwhile, the mimic enzyme features of COFs are explored, COF mimic enzymes are designed either by “from bottom to top” method or post modification strategy. As a result, not only the carrier materials for enzyme immobilization are expanded, but also it provides new ideas for biomimetic catalysis of mimic enzymes. This review focuses on recent advances of COFs immobilized enzyme and COFs mimic enzymes(nanozyme) applied in biocatalysis. Special emphasis is placed on the deliberation of synthetic and functional strategies, immobilization methods of COFs carrier, as well as the design concept, catalytic activity and selectivity of COFs mimic enzymes. Finally, the remaining challenges of COFs in enzyme catalysis and prospects in this field are summarized.

Contents

1 Introduction

2 Application of COFs materials in enzyme catalysis

2.1 COFs as immobilized enzyme carriers

2.2 COFs as mimic enzymes

3 Conclusion and outlook

Graphical abstract

关键词

共价有机框架 / 复合材料 / 固定化酶 / 模拟酶 / 非均相催化

Key words

covalent organic framework(COFs) / composite material / enzyme immobilization / mimic enzyme / heterogeneous catalysis

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侯晨, 陈文强, 付琳慧, 张素风, 梁辰. 共价有机框架材料在固定化酶及模拟酶领域的应用[J]. 化学进展, 2020, 32(7): 895-905 DOI:10.7536/PC191226

Chen Hou, Wenqiang Chen, Linhui Fu, Sufeng Zhang, Chen Liang. Covalent Organic Frameworks(COFs) Materials in Enzyme Immobilization and Mimic Enzymes[J]. Progress in Chemistry, 2020, 32(7): 895-905 DOI:10.7536/PC191226

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1 引言

多孔材料是指一类具有贯通或封闭孔洞的骨架结构材料,具有比表面积大、孔道结构和尺寸可调控等特点^[1],在催化、能源、环境、光电材料和生物医药等领域得到广泛应用。随着人们对多孔材料性能要求的日益提高,科研人员不断开发出新型多孔材料,从最早的天然无机多孔材料(如沸石^[2])到有机-无机杂化多孔材料(如Metal-Organic Frameworks, MOFs^[3]),再到共价有机多孔材料^[4]。目前已被报道的共价有机多孔材料主要包括:超交联聚合物(Amorphous Hyper-Crosslinked Polymers, HCPs)^[5]、固有微孔聚合物(Polymers of Intrinsic Microporosity, PIMs)^[6]、共轭微孔聚合物(Conjugated Microporous Polymers, CMPs)^[7]、多孔芳香骨架聚合物(Porous Aromatic Frameworks,PAFs)^[8]、嗪基多孔聚合物(Covalent Triazine-based Frameworks,CTFs)^[9]、共价有机框架(Covalent Organic Frameworks, COFs)^[10]材料。其中COFs是由H、B、C、O、N等轻原子构成,通过可逆共价键连接的结晶性多孔聚合物^{[11, 12]}。2005年,Yaghi等^[13]首次在Science上报道了由对苯二硼酸自聚而成的COF-1和由对苯二硼酸与1,2,4,5-四羟基苯共聚得到的COF-5。自此,不同结构的COFs材料相继被报道,如硼基COFs^[14]、亚胺基COFs^[15]和三嗪基COFs^[16]等。2007年,他们^[17]又报道了多种具有三维结构的COF-102、COF-103、COF-105和COF-108材料。COFs材料因具有高比表面积、低密度、高度有序的周期性结构、孔隙率高和易于功能化等特点而受到国内外学者的广泛关注,COFs因其结构特点也被形象地称为有机沸石^[13],应用于催化^[18]、气体吸附^[19]和化学传感^[20]等领域,而近年作为固定化酶载体和模拟酶的应用潜力也逐渐凸显。

酶是一类性能优异的生物催化剂,广泛应用于精细化工、食品、医药、能源和环境等领域^{[21, 22]}。大多数天然酶都是由蛋白质构成,其结构复杂不稳定,对催化条件要求苛刻,存储要求高,制备过程复杂且成本高,这些缺陷限制了天然酶的应用领域^{[23, 24]}。固定化酶技术通过物理或化学的方法将天然酶限制在一定区域内,实现酶的非均相催化。这不仅提高了酶在极端条件下的稳定性,实现酶的重复回用,还简化了整个反应的设计和控制。作为固定化酶载体,多孔材料因其特殊的孔结构,可以使酶分子在其孔道内充分分散,且良好的孔环境能有效减少外界条件对天然酶的影响,提高酶的稳定性。这些优势使其在固定化领域备受青睐^[25,26,27]。金属-有机框架材料(Metal-Organic Frameworks, MOFs)已被广泛用于固定化酶的研究,但MOFs载体的水/化学稳定性仍有待改善,且存在毒性金属离子浸出的可能。与MOFs相比,COFs材料为以可逆共价键连接而成的结晶型多孔材料,具有更优的稳定性和生物相容性。COFs具有较强的设计性和结构可调性,骨架上的功能基团能够更好地使COFs与特定酶分子相互作用,有利于获得高保留活力的固定化酶。此外,COFs具有纳米级规则的孔结构,能够为酶分子提供适宜的孔道和界面环境,不仅有利于底物的传质,还可阻止酶分子之间的聚集,保持其三维空间结构^{[28, 29]}。

同时,由于天然酶稳定性差,促使人们试图利用人工合成的方式来实现某些天然酶的催化效应。早期的模拟酶主要通过一些仿生化学的方法合成,例如卟啉、环糊精和金属配合物等。2007年,闫锡蕴等^[30]首次报道了磁性Fe₃O₄纳米粒子具有本征过氧化物模拟酶的性质。经过不断的探索,其他纳米材料如Au纳米粒子^{[31, 32]}、碳纳米材料^[33]以及MOFs材料^[34]等都被先后报道具有模拟酶的催化活性。随着对COFs材料探究的不断深入,COFs作为模拟酶的应用潜力被逐渐发掘。COFs除了作为固定化酶载体应用于非均相催化外,还可通过调控构筑单元或者后修饰的方式,将铁卟啉、Cu²⁺和Fe³⁺等活性官能团或金属离子结合在COFs上,使其具有类似于天然酶的催化活性。甚至部分COFs因骨架结构含有丰富的碳和氮元素,自身就形成了高密度的仿生活性位点而显现出优异的类酶活性^[35]。

2 COFs材料在酶催化领域的应用

2.1 COFs作为固定化酶载体

COFs作为一种新型的结晶性多孔材料,基于其自身所具备的纳米级多孔结构和稳定性好等性质,可作为固定化酶的优良载体^[29]。COFs多孔材料可调节的孔隙结构不仅为酶分子提供了大量的结合位点,还为固定化酶提供了良好的微环境,既使酶易于与小分子底物接触,又对酶起到保护作用,提高酶在极端环境下的催化效率和稳定性。以下将根据酶在COFs上的固定化机理,对COFs固定化酶的研究进展进行总结和讨论。

2.1.1 表面吸附法

吸附法制备COFs固定化酶主要通过物理作用和静电相互作用将酶结合在COFs表面。表面吸附对COFs的孔径大小和所带官能团没有特定要求,因而适用于多种COFs。由于该固定化方法的反应条件温和,且COFs比表面积高,所得固定化酶具有较高的载酶量和保留活力。但是酶和COFs之间的结合力较弱,容易导致酶的脱落,稳定性较低。2015年,Kandambeth等^[36]通过2,5-二羟基对苯二甲醛(Dha)和1,3,5-三(4-氨基苯基)苯(Tab)发生席夫碱反应,以自模板方法合成了介孔中空球形COF(DhaTab),制备过程中无需模板,避免了消除模板时对孔道污染的可能。所得DhaTab存在分子内氢键,表现出优异的化学稳定性,且比表面积高达1500 m²·g^-1。他们通过吸附法将胰蛋白酶固定化在DhaTab孔道内,研究了介孔DhaTab对胰蛋白酶的吸附性能。研究结果表明,DhaTab对胰蛋白酶的最大负载量为15.5 μmol·g^-1,其固定化后的胰蛋白酶保留了游离酶60%的催化活性。中空结构DhaTab的内部空腔有利于为底物提供更多的接触位点,提升了固定化酶的催化活性。

2019年,马胜前等^[37]以4,4',4″,4‴-(乙烯-1,1,2,2-四基)四苯胺(ETTA)和4,4'-(乙炔-1,2-二基)二苯甲醛(EDDA)为原料,通过席夫碱反应制备兼具三角形微孔(13.9 Å)和六边形介孔(38.5 Å)的双孔径COFs材料(COF-ETTA-EDDA)(图1)。随后他们分别以具有双孔径的COF-ETTA-EDDA和具有单一均质孔径的COF-PY-EDDA为载体,采用吸附法固定化脂肪酶,通过对比固定化酶活性和分析动力学参数,证实COFs的双孔结构能有效提升传质效率和固定化酶活性。通过SEM和BET等表征证实脂肪酶被固定化在COF-ETTA-EDDA的介孔内,其微孔仍保持原有孔径大小,能为底物提供畅通的传递通道。相比于孔结构单一的均质COF-PY-EDDA,COF-ETTA-EDDA独特的双孔结构不仅能增强酶与底物的接触能力,还有望增强酶对有害副产物和变性剂的抵抗力。为了研究该固定化酶抗变性能力,以三酰基甘油酯与脂肪酸乙酯的酯交换反应为验证实验,旨在解决制备生物柴油时产生副产物甘油导致固定化酶堵塞,抑制催化效率的问题。结果表明,双孔径COF-ETTA-EDDA相比单孔径COF-PY-EDDA固定化脂肪酶能更加高效地催化三酰基甘油酯转化,反应过程中只捕获少量甘油,且经5次循环使用仍保留初始90%的催化活性,为投入实际应用提供可能性。

2018年,宋永贵等^[38]首次利用COF-LZU1作为开放电位生物传感器(OCPS)的基质,用于体内检测神经化学物质。他们采用原位合成法,将碳纤维(CFs)浸渍在COFs前驱体溶液中,生成COF-LZU1/CFs复合材料,进一步制备得到碳纤维微电极(COF-LZU1/CFMEs)。随后通过吸附法将电子介体1,1'-二甲基二茂铁和葡萄糖氧化酶固定化在COF-LZU1/CFMEs上,以此为工作电极检测溶液中的葡萄糖含量。不仅有效改善了传统三电极系统对检测物选择性差,精确度低的弊端,还避免了酶生物传感器对氧含量过度依赖的问题。相比于含中心金属离子的MOFs,COF-LZU1体现出更好生物相容性。经活体实验证明,COF-LZU1为基质的OCPS能在体内对葡萄糖进行有效的连续性监测,表现出良好的线性关系、高选择性、稳定性和重现性,且减少对机体的伤害。

2018年,孙宝国等^[39]采用反相微乳液法和表面印迹技术制备了一种用于检测蛋白质的COFs-量子点复合材料。首先将席夫碱基COFs(TpPa)转变为稳定性较强的烯醇-酮式互变异构结构;然后采用反相微乳液法制备核壳结构量子点(QDs),利用3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)对QDs氨基功能化;最终与TpPa发生席夫碱反应,得到QDs-TpPa复合材料。TpPa作为载体,使QDs具备良好的化学和热稳定性;经修饰的QDs作为接收器,以其表面丰富的—NH₂作为识别位点,赋予QDs-TpPa较高的灵敏性和对蛋白质的特异性识别。他们在QDs-TpPa的吸附和选择性研究中发现,QDs-TpPa具有许多对牛血红蛋白(BHb)的特异性识别位点,使其与BHb有良好的空间匹配效果,通过分子印迹作用能快速选择性吸附BHb,并且QDs-TpPa的荧光强度与吸附BHb浓度呈现良好的线性关系,可用于荧光检测BHb。

随着对COFs材料在固定化酶领域研究的不断发展,研究人员始终致力于提高COFs的比表面积和负载量,并将目光聚焦于开发单层或者少层低维的共价有机纳米片(Covalent Organic Nanosheets, CONs)。通过溶剂辅助剥离、自剥离和机械剥离等方法,减少二维COFs材料在Z维度上的排列层数,得到大量的低维CONs^[40]。低维CONs不仅有助于增加COFs材料的比表面积,还保留了如低细胞毒性、易分散、低维强度和易跨细胞膜迁移等低维态物质所具有的优异性质^{[41, 42]},因此在新型2D材料中引起广泛关注。2018年,汪长春等^[41]利用简单环保的水相剥离法,将COFs分解成层数更少甚至单层的CONs。以1,3,5-三甲基间苯三酚(Tp)和联苯胺(BD)或者酰肼(HA)为配体,制备两种席夫碱型COFs(TpBD或TpHA)。所得COFs粉末加入FeCl₃溶液中超声分散,使Fe³⁺与COFs的三(N-亚水杨基苯胺)单元发生络合作用。Fe³⁺的配位作用使COFs层厚度和层间距离增加,并有效减少了层间的相互作用能,弱化其层间的作用力。利用超声分散和透析作用得到粒径均一的水溶性CONs(图2)。以二维TpBD纳米片为例,通过静电作用将罗丹明荧光素(FITC)标记的牛血清蛋白(BSA)吸附在TpBD纳米片上,通过检测其发出的荧光信号,进一步探究细胞内化机制和TpBD纳米片基共轭物在细胞内的运输途径和方式,证明了CONs作为酶蛋白载体,在跨细胞膜迁移转运中的优越性。

2.1.2 共价连接法

酶分子表面带有氨基、羧基和环氧基等反应性基团,可以通过共价键与COFs带有的官能团发生偶联。共价结合法相较于其他固定化方法,所得固定化酶具有更好的稳定性和重复使用性。但是共价连接法通常需要对载体功能化,合成固定化酶的反应条件相对复杂且容易引起酶活力的下降。2017年,申烨华等^[43]制备了一种磁性石墨烯共价有机框架(MG@TpPA-1)复合材料,利用1,3,5-三甲基间苯三酚(Tp)和1,4-二氨基苯(Pa)为前驱体,通过席夫碱反应在磁性石墨烯复合材料表面组装TpPA-1。将该复合材料作为载体,以戊二醛为连接剂共价固定化胰蛋白酶(MG@TpPA-1-trypsin)。由于该载体结合了COFs的高比表面积和石墨烯丰富的结合位点等优势,且MG@TpPA-1高度有序的二维结构降低了固定化酶的空间位阻,该载体对胰蛋白酶的负载能力相较于MG、MG@PDA^[44]、Fe₃O₄@MOF^[45]和Fe₃O₄@fTi

O 2 [46]

等载体均有显著提升,负载量高达268 μg·mg^-1。通过调节MG@TpPA-1固定化胰蛋白酶的浓度可以进一步控制蛋白的水解时间,能有效解决目前质谱检测过程中水解蛋白质耗时长和成本高等问题。此外,MG@TpPA-1-trypsin成功应用于促进牛血清蛋白和杏仁核蛋白的消化水解,表现出优于传统方法水解蛋白质的能力。

2018年,马胜前等^[47]以1,3,5-三-(4-氨基苯基)三嗪(TAPT)和1,2,4,5-苯四酸酐(PMDA)为前驱体,依次利用酸酐与氨基之间自发的开环反应和脱水缩合反应制备得到COF 1(图3a)。以1-乙基-3(3-二甲胺丙基)碳二酰亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)作为活化剂,将手性生物分子共价固定化在COF 1上,从而得到手性COF 1。该COF 1兼具生物分子的手性和反应活性,同时为生物分子提供保护作用(图3b)。将该手性COF 1应用于色谱分析中的生物基手性固定相,可实现对手性物质的高效分离。通过研究溶菌酶、肽段和赖氨酸等一系列手性生物分子的分离效果,成功将手性COF 1作为手性固定相应用于高效液相色谱仪中的正相和反相多种分离模式,均能有效分离多种手性底物,且手性分离色谱柱具有良好的重复利用性和重现性。此外,共价法固定化使COF 1与目标分子之间存在较强的相互作用,以溶菌酶为例,COF 1固定化溶菌酶保留了游离溶菌酶90%的催化活性,且在5次循环使用后,仍保留初始90%的催化活性。

季一兵等^[48]也报道了利用席夫碱基COFs(SNW-1)改善手性分离效果的相关研究。他们首先采用溶剂热法,通过三聚氰胺和对酚酞之间的席夫碱反应生成SNW-1(图4a)。SNW-1表现出的较高的比表面积、共轭结构和丰富的氨基等优势,使其成为毛细管电色谱(CEC)固定相的优选材料之一。SNW-1不仅改善了柱效,还同时增加了待测底物与固定相之间的相互作用,从而提升了CEC的分离效果。由于SNW-1自身纳米级尺寸和不规则的形状,使其在填充柱领域的应用受到限制,因此进一步将SNW-1与二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA)、甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)通过热引发自由基聚合获得poly(GMA-EDMA-SNW-1)整体柱。然后在碱性条件下诱导环氧环开环,以戊二醛为连接剂共价固定化纤维素酶(cellulase),制备得到cellulase@poly(GMA-EDMA-SNW-1)(图4b)。在实际测试中,所得的固定化纤维素酶整体柱对8种不同的手性药物均表现出优异的分离效果和重复使用性。

2.1.3 孔道扩散法

COFs的孔结构具有可设计性和调节性,可以通过酶分子的扩散作用将其固定化在孔道中。该法要求酶分子的尺寸必须小于COFs的孔径尺寸,否则酶分子可能仅吸附在COFs表面。孔道扩散法固定化酶的反应条件温和,特定的孔尺寸有利于维持酶分子的三维立体结构,减少自身团聚;孔道内部特有的微环境(如亲\疏水性)可增强对酶分子的亲合力,所得固定化酶的稳定性更强。该法对COFs载体的孔结构有较强的专一性,载体的普适性有待改善。2018年,马胜前等^[29]以两种构造相似的疏水性COF-OMe和COF-V材料作为参比,通过孔道扩散法固定化脂肪酶(lipase PS),与其他亲水性COFs材料、MOFs材料以及多孔有机聚合物(Porous Organic Polymer,POP)材料等多孔材料进行对比试验,表明疏水、孔结构均一的介孔COFs材料对脂肪酶具有更好的亲合力(表1)。通过测定1-苯基乙醇的转化率,对比lipase@COF-OMe、lipase@COF-V与游离lipase PS的催化活性,证明两类COFs材料因稳定均一的孔结构和疏水的微环境,有利于脂肪酶在载体孔道内的正确取向,增加与底物的反应效率,提高酶对溶剂的耐受性。利用lipase@COF-OMe对比游离酶的热稳定性和重复回用次数,证实COFs材料对lipase PS具有优异的保护能力,是一种良好的酶载体材料。

2019年,宋永海等^[49]报道了溶剂热法制备二维层状CONs。以4,4',4″,4‴-(乙烯-1,1,2,2-四基)-四苯胺(ETTA)和对苯二甲醛(TPAL)为原料,制备同时具备两种孔径尺寸(3.06 nm和0.87 nm)的双孔径席夫碱型ETTA-TPAL。并以其作为固定化酶载体,通过自组装法固定化与ETTA-TPAL大小孔径尺寸吻合的葡萄糖氧化酶(GOD)和微过氧化物酶-11(MP-11)(图5)。COFETTA-TPAL中丰富的N原子可与MP-11和GOD所含羧基产生大量氢键,显著增强载体和酶的相互作用。片状ETTA-TPAL具有高结晶性、柔韧性、有序共轭结构、高比表面积和良好的生物相容性,所得GOD-MP-11/ETTA-TPAL作为性能优异的生物传感材料,在比率电化学葡萄糖生物检测中表现出良好的选择性、稳定性和重复使用性。

2.2 COFs作为模拟酶

模拟酶的出现在一定程度上解决了天然酶稳定性差和应用成本高等不足。随着对COFs材料研究的深入,人们不断尝试将具有特殊内在功能的各种有机或无机结构单元结合到不同类型的COFs中,以赋予COFs材料特异的功能性和模拟酶催化活性^[50]。作为模拟酶催化剂,COFs可分为本征型和负载型两类。本征型COFs模拟酶的设计方法是基于“自下而上”的合成策略将模拟酶活性中心嵌入构建单元;负载型模拟酶的设计方法是以COFs为载体,通过后合成的方式负载具有模拟酶活性的材料来构建COFs模拟酶。本征型COFs模拟酶从分子水平引入类酶活性中心,所得材料具有活性位点分散均匀、数量可控的特点;负载型COFs模拟酶通过后修饰的方法引入类酶活性中心,所得材料稳定性好,比表面积高,有利于底物的传质。

2.2.1 本征型

2014年,马胜前等^[51]首次报道了将COFs用作非均相仿生催化剂。他们以铁卟啉氯化物(Fe(tbpp)Cl)为前驱体,通过偶联反应合成二维层状纳米多孔共价血红素框架(CHF-1),其中亚铁血红素以二维石墨烯排列形态掺杂在共价骨架中,有效防止血红素聚集成无催化活性的二聚体,同时血红素暴露出的铁卟啉活性中心,提供了高密度的活性位点,使CHF-1呈现出优异的仿生催化活性、稳定性和高比表面积(1620 m²·g^-1)等特性。他们进一步通过酶动力学理论与催化2,2'-连氮二(3-乙基苯并噻唑啉)-6-磺酸盐(ABTS)实验测定CHF-1过氧化物模拟酶活性(图6),证明CHF-1对底物的亲合力和催化效率接近天然血红素酶(表2)。且在经过循环使用5次后,仍保留约80%的催化活性。

共价三嗪骨架(CTFs)属于COFs的子类,通过芳族氰化合物的环化三聚反应合成,具有高比表面积和更好的热稳定性,并且含氮量很高,常用于气体储存、气体分离和催化等领域^{[54, 55]}。2017年,侯贤灯等^[35]以对苯二甲腈(DCB)为原料、氯化锌(ZnCl₂)为模板剂,通过微波辅助离子热聚合法制得同时具备过氧化物酶和氧化酶活性的CTF-1(图7)。CTF-1骨架中含有大量的C、N元素,无需通过金属离子的修饰便可提供高密度的活性位点,催化H₂O₂或溶解氧分解产生羟基自由基(·OH)或超氧根离子(

O 2 -

和¹O₂),表现出接近天然过氧化物酶和氧化酶的催化活性。并且CTF-1模拟酶成本低、易制备、稳定性好,在循环使用3次后,仍保留原90%的催化活性。此外,研究表明生物硫醇对CTF-1的反应活性有明显的抑制作用,进一步构建了一种无需H₂O₂等氧化剂的比色检测生物硫醇的传感器,所建立的TMB-CTF-1体系中,其吸光度与谷胱甘肽(GSH)、胱氨酸(Cys)和同型半胱氨酸(Hcy)三种生物硫醇浓度均呈现良好的线性关系。检测范围分别为5~40 μM、5~40 μM和5~140 μM,检测限分别为0.65 μM、0.62 μM和0.68 μM。

2.2.2 负载型

2018年,戴志晖等^[24]以硫酸亚铁和COF-366为基材,通过后修饰法制得具有优异过氧化物模拟酶活性的铁卟啉共价有机骨架(Fe-COFs)。Fe-COFs的过氧化物模拟酶活性源于铁卟啉活性单元催化H₂O₂产生羟基自由基(·OH),且其规整均一的孔道结构促进底物的快速扩散,提升催化效率和稳定性。通过对比催化3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)的显色反应,证实Fe-COFs对底物的亲合力优于辣根过氧化物酶(HRP)(表3)。Fe-COFs对H₂O₂显现出优异的催化活性,用于检测H₂O₂,其检测范围为7~500 μM,检出限为1.1 μM。进一步将Fe-COFs与葡萄糖氧化酶(GOx)结合,设计了一步法比色检测葡萄糖(图8),对葡萄糖表现出良好的灵敏度与选择性,检测范围为5~350 μM,检出限为1.0 μM,且成功应用于检测人血清中葡萄糖浓度。

2019年,严秀平等^[59]在溶剂热条件下,以1,3,5-三-(4-甲酰基-苯基)三嗪(PT)和4,4'-偶氮二苯胺(Azo)原料,通过席夫碱反应合成稳定晶型多孔COF-PTAzo,由于其较大的比表面积(221 m²·g^-1)和预先设计的孔径(43 Å),提供了丰富的金属结合位点,因此以COF-PTAzo作为基底,通过柠檬酸盐还原法在其孔隙内原位负载Au纳米颗粒(图9)。所得PTAZo-Au有效改善了Au纳米颗粒的团聚现象,表现出良好的稳定性,在Hg²⁺存在的情况下PTAZo-Au表现出优异的过氧化物酶活性。他们基于这一特性进一步开发PTAZo-Au用于水体中Hg²⁺比色检测(其对Hg²⁺检测性能对比如表4所示),显示PTAZo-Au对Hg²⁺具有高选择性,且在5~300 nM浓度范围内表现出良好的线性关系,检出限为0.75 nM。

2017年,叶芳贵等^[64]报道了一种具有过氧化物模拟酶活性的铜修饰共价三嗪框架(CCTF),将CTF浸渍在CuCl₂溶液中,通过CTF中N原子与Cu²⁺配位,得到CCTF(图10)。高孔隙率的CTF使最终所得CCTF具有高比表面积,可提供有效的扩散通道,促进底物分子的扩散;CCTF中分散的Cu不仅提供丰富的活性位点,还促进了电子转移效率。基于CCTF优异的过氧化物模拟酶性质,开发定量检测H₂O₂和催化降解亚甲基蓝(MB)的策略,在H₂O₂浓度为2.5~140 μM范围内,表现出良好的线性关系,反应10 min MB降解率可达到80%。同年,他们^[65]基于先前CCTF所表现出优异的过氧化物模拟酶性质,分析Cu²⁺作为金属活性中心,而CTF作为过氧化物模拟酶骨架,所表现出的过氧化物模拟酶活性。Cu²⁺促进物质之间的电子转移,增加CTF接受电子的能力,因此Cu²⁺-CTF所表现出的过氧化物模拟酶活性与Cu²⁺的浓度密切相关。由此开发了一种基于CTF选择性比色检测Cu²⁺的方法,检测范围为15.75 nM~1.26 mM,检测限为1.25 nM(表5),并成功应用于茄子和荸荠中Cu²⁺的测定。

近年来,二维层状共价纳米(CONs)片除了在固定化酶领域有所发展,在模拟酶领域也备受关注。COFs模拟酶的发展也逐渐聚焦至开发单层或者少层低维的共价有机纳米片,制得具有高酶样活性且低细胞毒性的模拟酶。2018年,Su等^[42]报道了一种在水相中可均匀分散且稳定的Fe³⁺修饰二维共价三嗪骨架(2D Fe-CTF)。以对苯二甲酸作为荧光探针,证明了2D Fe-CTF具有优异的过氧化物模拟酶活性,其中二维CTF纳米薄片作为模拟酶骨架,Fe³⁺为催化中心与底物结合,能有效降低反应所需的活化能,提高反应速率。且相较于Cu-CTF,2D Fe-CTF具有更低的细胞毒性。基于2D Fe-CTF优异的过氧化物模拟酶活性分别构建了检测肌氨酸、赭曲毒素A和氟离子的比色传感器,检测范围分别为10~100 μM、0.2~0.8 μM和50~700 nM。

2018年,Ma等^[71]受碳纳米管纵向切割思路的启发,将CTF剥离成保留三嗪基本单元的均质单层二维片状结构,再与CuCl₂溶液混合,通过Cu-N配位作用使Cu²⁺固定在CTF框架上,制备得到Cu²⁺修饰的2D共价三嗪骨架(UnZ-CCTF)。UnZ-CCTF不仅保留了CCTF优异的过氧化物模拟酶活性,还具有良好的分散性,有效改善了三维非均质CCTF不利于电子转移的问题。基于以上优势,构建了一种以UnZ-CCTF/GCE为工作电极、鲁米诺/H₂O₂为探针的电化学发光超灵敏定量检测磺胺喹口恶啉抗生素(SQX)的检测体系,对SQX的检测范围为1.0~20 pM,检出限为0.76 pM。通过对牛奶样品中SQX含量的多次检测,证实其实用性和准确性,改善了目前磺胺类物质检测耗时长和操作过程复杂等弊端,可用于快速测定日常牛奶中SQX含量。

2019年,邱建丁等^[72]通过溶剂热法制备含联吡啶的共价有机框架Tp-Bpy。经机械剥离作用制得2D Tp-Bpy 纳米薄片(Tp-Bpy NSs),以其孔隙内丰富的含氮官能团作为金属结合位点,通过配位作用原位生成Au纳米颗粒(Au NPs),所得AuNPs@Tp-Bpy表现出良好的分散性、稳定性和过氧化物酶活性(图11)。基于金汞齐效应,AuNPs@Tp-Bpy成功应用于多种环境样品中Hg²⁺含量检测,表现出优异的选择性和灵敏度,其检出限为0.33 nM。

3 结论与展望

共价有机框架材料作为一种新型的有机多孔材料,经过十多年的发展,近些年逐渐开展在固定化酶和模拟酶领域应用的研究。在固定化酶领域,COFs因其比表面积高、孔结构规整有序和易于功能化修饰等优点,作为载体材料有利于酶的充分分散,进而获得高负载量的固定化酶;其规则的孔结构能够为酶分子提供有利的微环境,提高固定化酶的稳定性,有利于底物传质。在模拟酶领域,通过合成前改造构建单元的“自下而上”法,或者合成后的后修饰法引入模拟酶活性位点这两种方式设计制备COFs模拟酶。COFs因其大的比表面积,有利于类酶活性的催化位点分散,增强底物和催化位点的结合;COFs以小分子为构建单元,模拟酶的功能和性质便于调控;COFs作为模拟酶稳定性好,易于存储,相较于天然酶有更好的实际应用能力。

基于COFs材料自身的优异性能,在上述领域的应用中取得了一定进展,但仍然面临着一些挑战。为了获得少酶活力损失、稳定性好、可重复回用的固定化酶催化剂,COFs作为载体在酶催化领域的研究重点还需放在改善COFs化学稳定性和加强COFs功能化上。目前应用于模拟酶的COFs种类较为单一,多采用铁卟啉-COFs或者CTFs作为基质,因此还应致力于设计具有模拟酶性质的新COFs材料。另外,模拟酶和天然酶相比专一性较差,很难催化一种特定底物。因此,为实现COFs模拟酶特异性催化,还要深入探究COFs模拟酶的催化机理,提高其选择性。

总之,COFs材料在智能、多功能人工酶系统的设计、开发上有着巨大的应用潜力,但是在实际工业化应用上还存在一定距离。今后,COFs在固定化酶和模拟酶领域的发展目标是设计合成具有高稳定性、专一、高效和低成本的功能性材料,为应用于酶催化、生物检测和色谱分析等领域奠定基础。

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