基于纳米颗粒的化学发光技术在炎症及肿瘤诊疗中的应用

丁静静; 黄利利; 谢海燕

doi:10.7536/PC200209

化学进展 ›› 2020, Vol. 32 ›› Issue (9) :1252-1263 DOI: 10.7536/PC200209

综述

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基于纳米颗粒的化学发光技术在炎症及肿瘤诊疗中的应用

丁静静 ¹ ,
黄利利 ¹ ,
谢海燕 ¹^,^**

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Application of Nanoparticles-Based Chemiluminescence in Diagnosis and Treatment of Inflammation and Tumor

Ding Jingjing ¹ ,
Lili Huang ¹ ,
Haiyan Xie ¹^,^**

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摘要

光学技术在生物医药领域具有至关重要的作用,它不仅使生物活体的检测变得可视化,还可以提高疾病治疗的特异性和灵敏性。但是普通的光学技术具有组织穿透深度低、信噪比低和组织自发光等问题。针对这些问题,研究者开始关注并研究自发光技术,包括化学发光、生物发光、切伦科夫发光。其中,化学发光(Chemiluminescence,CL)是化学物质在进行化学反应过程中产生的一种光辐射现象,具有灵敏度高、无需外部光源激发、打破组织穿透深度限制、提高信噪比的优势,为光学成像与治疗技术的进一步发展提供了新思路。但是由于化学发光物质的疏水性等问题限制了其在生物医药领域的应用。针对这些问题,研究者开始将纳米技术与化学发光技术进行结合,不仅拓展了化学发光的应用范围,还进一步促进了疾病的诊断与治疗。在此基础上,该文首先分析了化学发光的分子机理,其次总结归纳了化学发光在炎症及肿瘤诊疗中的应用,并探讨了在实际应用中遇到的问题以及未来的发展方向。

Abstract

Optical technology plays a vital role in the field of biomedicine. It not only enables visualization of physiological or pathological processes at the cellular and subcellular dimensions in living subjects, but also improves the specificity and sensitivity of disease treatment. However, ordinary optical technology faces many challenges, including relatively low tissue penetration depth, low signal-to-noise ratio, and autofluorescence of the tissue. To overcome these problems, many researchers have gradually begun to focus on self-luminous technologies, including chemiluminescence, bioluminescence, and Cherenkov luminescence. Among them, chemiluminescence(CL) is a kind of light radiation phenomenon, which is produced by chemical substances in the process of chemical reactions. It has many advantages, including high sensitivity, no need for external light source excitation, breaking through the limit of tissue penetration depth, and improving the signal-to-noise ratio. These characteristics provide new ideas for the further development of optical imaging and treatment technology. However, due to the hydrophobicity of the chemiluminescent substance and other problems, its application in the field of biomedicine has been limited. To solve these problems, researchers have begun to combine nanotechnology with chemiluminescence technology, which not only expands the application range of chemiluminescence, but also further promotes the diagnosis and treatment of diseases. On this basis, the article first analyzes the molecular mechanism of chemiluminescence, secondly summarizes the application of chemiluminescence in the diagnosis and treatment of inflammation and tumor, and discusses the problems encountered in practical applications and the future development direction.

Contents

1 Introduction

2 The molecular mechanisms of chemiluminescence

2.1 Direct chemiluminescence

2.2 Indirect chemiluminescence

3 Application of nanoparticles-based chemiluminescence in inflammation and tumor diagnosis

3.1 Nanoparticles-based luminol chemiluminescence imaging

3.2 Nanoparticles-based oxalate peroxide chemiluminescence imaging

4 Application of nanoparticles-based chemiluminescence in tumor treatment

4.1 Nanoparticles-based luminol luminescence-induced tumor treatment

4.2 Nanoparticles-based oxalate peroxide luminescence-induced tumor treatment

4.3 Combination of chemiluminescence-induced photodynamic therapy and other tumor therapies

5 Conclusion and outlook

Graphical abstract

关键词

化学发光 / 鲁米诺 / 过氧化草酸酯 / 过氧化氢 / 纳米颗粒 / 成像 / 治疗

Key words

chemiluminescence / luminol / oxalate peroxide / hydrogen peroxide / nanoparticles / imaging / therapy

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丁静静, 黄利利, 谢海燕. 基于纳米颗粒的化学发光技术在炎症及肿瘤诊疗中的应用[J]. 化学进展, 2020, 32(9): 1252-1263 DOI:10.7536/PC200209

Ding Jingjing, Lili Huang, Haiyan Xie. Application of Nanoparticles-Based Chemiluminescence in Diagnosis and Treatment of Inflammation and Tumor[J]. Progress in Chemistry, 2020, 32(9): 1252-1263 DOI:10.7536/PC200209

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1 引言

化学发光(Chemiluminescence,CL)是指在没有外部光源或能量的作用下,反应体系中的反应物或生成物吸收了反应释放的化学能之后,电子由基态跃迁至激发态,当其由激发态返回基态的过程中产生的一种光辐射现象^[1]。它具有量子产率高、反应速度快、灵敏度高和颜色可调节等优点^[2]。但是,由于化学发光底物普遍具有水溶性差的缺点,严重限制了其在生物医学领域中的应用^[3]。近年来随着纳米科学的发展,纳米颗粒已经被广泛用于生物医药领域,为疾病的诊断与治疗提供了新的解决方法^[4]。纳米颗粒作为一种微尺度的物质构成单元,其具有特殊的Kubo效应、小尺寸效应、表面效应及量子性质,得到研究者的广泛关注^[5]。纳米颗粒凭借特殊的物理化学性质使其在肿瘤检测与治疗领域中具有广泛的应用前景。纳米颗粒可以通过实体瘤的高渗透性和滞留效应(Enhanced Permeability and Retention Effect,EPR)被动靶向肿瘤,实现肿瘤部位的特异性富集^[6];除了可以通过EPR被动靶向肿瘤,也可以对纳米颗粒进行表面修饰抗体或细胞膜仿生等手段在帮助其逃避内皮网状细胞的清除、延长体内循环时间的同时,还可以赋予纳米颗粒主动靶向的能力,进一步提高其肿瘤部位的特异性富集量^[7];除了人工合成的纳米颗粒以外,一些天然衍生的纳米颗粒,比如外泌体也可以利用其归巢能力来实现其病变部位的特异性靶向^[8]。因此以纳米颗粒作为物质递送的载体,不但可以增加物质的溶解度,而且可以赋予其肿瘤靶向性,以提高其生物利用度和降低毒副作用^[9]。因此,利用纳米颗粒装载化学发光底物的技术策略在疾病的诊断与治疗中具有广阔的应用前景。此外,纳米颗粒还可以直接或者间接参与化学发光,作为化学发光反应的催化剂^[10]、还原剂^[11]、发光体^[12]或能量接收体^[13],进一步拓展化学发光的应用范畴^[14]。

2 化学发光的分子机理

化学发光是一种无需外部光源激发的光辐射现象。按照发光的原理,可分为直接化学发光和间接化学发光^[15]。

2.1 直接化学发光

直接化学发光是指化学分子本身不具有发光的性质,只有被氧化才能进行化学发光。其中最具代表性的是鲁米诺化学发光体系。该体系中常见的氧化剂有过氧化氢(H₂O₂)、次氯酸盐、碘等^[16]。目前,研究者广泛认可的机理是^[17]:在非质子溶液中,鲁米诺在强碱的作用下生成二价阴离子鲁米诺,之后与分子氧进一步反应;在水溶液中,鲁米诺在H₂O₂或超氧自由基和酶的作用下,经过一系列的氧化过程,最终生成一种包含O—O和N

N键的过氧化物,该过氧化物(被猜测为环状内式过氧化物)很不稳定,立即分解出氮气并形成环形过氧化物。在相对低热能环境下,过氧化物环被打开,就形成了激发态的鲁米诺。激发态的鲁米诺由激发态变成基态的过程中,会发射425 nm左右的荧光^[18~22](图1)。

2.2 间接化学发光

间接化学发光体系由过氧化草酸酯、H₂O₂和荧光基团^[23]组成。目前广泛应用的过氧化草酸酯是^[24]:双(2,4,5-三氯水杨酸正戊酯)草酸酯(CPPO)、双(2,4,6-三氯苯基)草酸酯(TCPO)。该体系发光的过程可以分成两个步骤:首先,过氧化草酸酯被H₂O₂亲核进攻,生成不稳定的高能量的双氧基环状中间体——二氧杂环丁二酮(图2a),简称为能量中间体(HEI);然后,HEI激发荧光基团由基态变成激发态,处于激发态的分子重新回到基态的过程中,能量以荧光的形式释放^[25]。早期研究表明,荧光分子的化学发光发射光谱和荧光光谱是一致的。而且,当反应体系中没有荧光分子时,发光信号无法出现。这些现象都表明,HEI本身不能发光^[26],必须和荧光分子以某种方式相互作用才能发光。HEI与荧光基团之间相互作用的机理被称为CIEEL(Chemically Initiated Electron Exchange Luminescence),主要包括五个步骤:①当HEI与荧光分子在同一溶剂中时,会促进O—O键的延伸,形成一种电子转移复合物;②荧光分子将一部分电子传递给过氧化物,促进O—O键断裂;③进一步促使C—C键发生断裂并释放二氧化碳;④电子反向传递给荧光分子并释放二氧化碳;⑤荧光分子通过发光从激发态重新回到基态(图2b)^[27,28]。

3 基于纳米颗粒的化学发光技术在炎症及肿瘤诊断方面的应用

疾病是在一定诱因作用下,引发自体一系列代谢、功能和结构异常的过程。其中,肿瘤、心脑血管疾病和神经退行性疾病等重大疾病严重威胁着人类的健康与生存。当前,对疾病的准确判断,通常是疾病治疗和预后评估最可靠的依据。在疾病诊断方面,光学成像作为一种非电离辐射的诊断方式,同时拥有空间分辨率高、灵敏度高和无侵入性等优点,在疾病的诊断中有着至关重要的作用^[29-31],但是也面临着组织穿透性低、组织自发光和信噪比低等问题^[32]。为此研究者开始利用无需外部光源激发的自发光来解决外部光源组织穿透能力的限制。自发光分为化学发光^[33]、生物发光^[34]、切伦科夫发光^[35],其中化学发光不仅排除了组织自发光以及穿透深度的限制,提高了信噪比,而且还具有量子产率高和发射波长可调节等优点,可以提高疾病诊断的准确性与灵敏度,为疾病的早期发现和及时治疗提供可能。按照发光机理的不同,基于纳米颗粒的化学发光在炎症及肿瘤诊断方面的应用主要分为鲁米诺化学发光成像和过氧化草酸酯化学发光成像。

3.1 基于纳米颗粒的鲁米诺化学发光成像

鲁米诺发光体系主要有两个方面需要改进:①发光体系的化学反应效率较低,导致其成像灵敏度不够;②发光体系的最适荧光发射波长是425 nm,对组织穿透能力极差,只能用于浅层炎性病灶的检测,无法进行广泛的临床应用。因此,对于鲁米诺发光体系的研究大致可以分为两个方面。

第一,促进鲁米诺的氧化,增强化学发光的强度并提高反应速度。许多研究者发现纳米金^[36]、纳米银^[37]、纳米铂^[38]等可以催化鲁米诺的发光,提高鲁米诺发光强度。此外,与炎症相关的酶,如髓过氧化物酶(MPO)和辣根过氧化物酶(HRP)等^[39]都可以催化鲁米诺与H₂O₂的反应进行发光,对炎症疾病进行成像。Lu等^[40]构建了一种由HRP形成的纳米颗粒(nHRP)。如图3所示,通过化学键的修饰,将金纳米颗粒(GNP)连接到nHRP的表面,形成复合纳米颗粒(BPN),以增强鲁米诺的发光强度,这为鲁米诺发光体系在疾病诊断中的应用提供了思路和方法。

第二,提高鲁米诺的发射波长,以便增强其组织穿透能力,实现其在深层组织检测中的应用。利用化学发光能量共振转移(Chemiluminescence Resonance Energy transfer,CRET),将鲁米诺发射的425 nm光转换为组织穿透能力较强的近红外光,是实现肿瘤及相关炎性疾病深层成像的有效方法。Ansaldi等^[41]构建了一种由量子点与鲁米诺组成的纳米颗粒(Luminol-R),当其在MPO作用下,鲁米诺被氧化并发出425 nm蓝光,之后通过CRET激发量子点发出800 nm左右的荧光(图4A)。因此,当将Luminol-R通过尾静脉注射到肿瘤细胞转移的小鼠体内时,可利用化学发光成像,实现肿瘤转移灶的检测(图4B中a~e)。而且,检测结果与利用成熟荧光素酶生物成像(图4B中a)和CT成像(图4B中b~d)具有很好的共定位(图4B j),表明构建的化学成像体系对肿瘤转移灶的检测具有很好的准确性与特异性。尽管量子点可以作为化学发光能量共振转移的能量受体,实现鲁米诺的近红外发光,但是大多数量子点含有剧毒金属,会引起人们对其长期生物安全性的担忧。针对这一问题,Dai等^[42]设计了一种由荧光探针DiI-DiD组成的纳米泡。如图4C所示,该纳米泡可以取代量子点作为鲁米诺发光的能量受体,当鲁米诺被氧化后,发出的荧光可以激发DiI,被激发的DiI发射的荧光又可以激发DiD,最终实现该体系670 nm左右的荧光发射,当将该纳米颗粒通过尾静脉注射到小鼠体内时,从图4D中可以发现,只能在肿瘤部位检测到化学发光信号,表明该纳米颗粒可以对深层炎症及肿瘤进行特异性的检测。

3.2 基于纳米颗粒的过氧化草酸酯化学发光成像

生物体内的各种物质都保持着一种稳定的动态平衡,某种物质的表达量异常往往预示着某种疾病的发生。例如,H₂O₂是生物体内一种重要的细胞信号传递分子,它的过量表达预示着炎症等相关疾病的发生^[43]。但是,H₂O₂在生物体内活性和浓度都比较低(10^-7 M)^[44],因此对检测试剂的灵敏度要求极高,也使得H₂O₂的活体检测变得十分困难。针对这些问题,Lee等^[45]通过构建了一种包含过氧化草酸酯和荧光染料的纳米颗粒,首次实现了H₂O₂分子的活体检测。该纳米颗粒由一个包含有过氧化草酸酯结构的疏水性聚合物与荧光分子(Pentacene)通过疏水性相互作用自组装形成,将纳米颗粒与不同浓度的H₂O₂共混之后,原位注射到小鼠体内,可以在小鼠体内清楚地观察到化学发光信号,而且进一步的实验结果又表明H₂O₂的浓度越高,荧光信号越强。在此基础上,Kim等^[46]以嵌段共聚物F127和聚乳酸-羟基乙酸共聚(Poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA)为基质,将CPPO与近红外发射的染料Cy5包裹起来,形成一种以过氧化草酸酯为基础的化学发光纳米胶束体系,通过原位注射的方式对脂多糖(LPS)诱导的关节炎进行了活体成像,成像结果如图5a所示,可以观察到在关节炎的部位具有较强的化学发光信号。该体系不仅提高了化学发光体系对H₂O₂检测的灵敏度,而且增强了其组织检测深度。但是,像Cy5这样的有机荧光探针会发生聚集猝灭,会影响所构建体系的发光强度。为了避免这个问题,他们^[47]利用9,10-二炔基蒽衍生物(BLSA)的聚集荧光增强特性,以F127为载体,将CPPO与BLSA通过疏水相互作用自组装形成一种可有效提高成像灵敏度的纳米胶束(图5b)。但是BLSA发射荧光为绿光,该波段的光穿透深度比较低,为了进一步提高该纳米体系的检测深度,他们又将近红外发射的荧光分子同时装载到纳米颗粒中,进而利用BLSA发射的荧光对近红外的荧光分子进行激发(FRET)。通过不断的摸索与改进,他们所构建的纳米体系不仅实现了该纳米胶束发射光颜色可调节(绿光和红光都可以),还进一步提高了其在活体水平的H₂O₂检测深度。

随着研究的深入,研究人员发现,机体内H₂O₂浓度的变化,有时候也可能是由于某些外部因素导致的机体损伤^[48]。比如,过量的解热镇痛药对乙酰氨基酚(APAP) 可诱导肝脏产生过量的H₂O₂,继而引发急性肝损伤,而利用常规的组织切片检测方法进行检测时,通常需要约180 min才能实现肝损伤检测。针对这一问题,Rao等^[49]构建了一种可以对药物诱导的急性肝损伤进行实时快速检测的纳米颗粒,该体系以PS-g-PEG-Gal聚合物为基质,利用CPPO与近红外荧光半导体聚合物(PFODBT和IR775S)组装成化学发光纳米颗粒,在该体系中,当CPPO与H₂O₂反应,生成的HEI可以激发体系中的荧光分子在680 nm/820 nm处发射荧光。当利用该纳米颗粒对药物APAP诱导的急性肝损伤进行检测时,将纳米颗粒通过尾静脉注射到小鼠体内18 min后,即可通过化学发光强度变化来判断肝脏部位H₂O₂的浓度变化,从而指示肝损伤情况,即APAP的注射量越多,化学发光信号越强,肝损伤越明显。由此可见,该体系不仅实现了活体急性肝损伤的可视化检测,而且还进一步提高了器官损伤的检测效率。

进一步的研究表明,CPPO与H₂O₂反应生成的HEI对于发射绿光的荧光分子的激发效率更高^[50],但是该波段的光对组织穿透性差,无法直接在活体上进行检测。在此基础上,Kim等^[51]构建了一种包含CPPO,发射绿光的荧光分子BODIPY以及近红外发射的荧光分子DPA-CN-PPV的纳米颗粒,在该体系中,CPPO在H₂O₂存在的条件下形成的HEI激发BODIPY,被激发的BODIPY利用荧光能量共振转移(FRET)激发近红外荧光分子DPA-CN-PPV。基于上述发光机理的纳米颗粒由于波长的红移而提高了化学发光的检测深度,与此同时通过原位注射该纳米颗粒也成功地对关节炎以及腹膜炎进行了成像。进一步的研究表明只有当荧光分子占据的最高分子轨道(HOMO) 与HEI的最低未占分子轨道(LUMO) 能级接近时才会使化学发光体系有更好的发光强度和量子产率。为了更好地利用HEI激发荧光分子,Pu等^[52]研究了五种不同的半导体聚合物荧光分子,如图6所示,通过发光强度筛选出了HEI最适激发半导体聚合物——PFPV;在活体检测方面,他们构建了一个包含有TCPO,荧光半导体聚合物PFPV和NIR775的纳米颗粒,并实现了其在近红外条件下,通过原位注射所构建的纳米颗粒对神经性炎症与腹膜炎进行成像,成像结果显示,只有病变部位具有较强的化学发光信号。该研究结果不仅为间接化学发光体系中荧光分子如何选择提供了参考,而且还进一步拓展了化学发光在炎症性疾病检测的应用范围。

另外,利用葡萄糖在葡萄糖氧化酶作用下,生成H₂O₂与葡萄糖酸的机理,Wei等^[53]以介孔二氧化硅为载体,将CPPO与荧光分子罗丹明B(Rh B)装载在二氧化硅内部,然后利用静电吸附作用,将葡萄糖氧化酶吸附于介孔二氧化硅表面(图7a),然后通过荧光强度与H₂O₂浓度之间的关系,间接反映细胞内葡萄糖浓度的变化,利用该纳米颗粒可以成功检测细胞对葡萄糖浓度发生变化的反应(图7b)。此外,装载完成的介孔二氧化硅不仅可以通过静电作用吸附葡萄糖氧化酶,还可以进行乳酸氧化酶、尿素氧化酶等的吸附,进而间接反映活体中多项生物标志物的表达。

综上所述,基于纳米颗粒的化学发光体系,已被成功应用于炎症及肿瘤检测方面,推进了自发光成像技术在生物医学领域的发展。在鲁米诺化学发光体系中,研究者对如何增强鲁米诺的发光强度进行了探索,即筛选合适的催化剂;在过氧化草酸酯化学发光体系中,研究者探索了能量中间体与荧光基团之间的能级关系,为荧光分子的选择提供了理论支持。另外,通过FRET和CRET的方式提高化学发光体系的发射波长,增强检测深度,增加荧光分子的激发效率,进而提高检测的灵敏度。

4 基于纳米颗粒的化学发光技术在肿瘤治疗方面的应用

由于肿瘤的复杂性、多样性以及异质性^[54],使得肿瘤的治疗遇到许多困难。目前肿瘤治疗的方式^[55]主要分为:传统治疗方式(手术切除、化疗、放疗)以及新型治疗方式(基因治疗、免疫治疗、光热治疗以及光动力治疗^[56]等)。其中,光动力治疗(PDT)是通过光照射富集光敏剂的肿瘤组织,使光敏剂由基态变成激发态,然后将其激发态的能量传递给氧气,诱导产生单线态氧,进而引起细胞毒性从而选择性地杀死肿瘤^[57],是一种非侵入性的局部高特异性治疗方法,已经成功应用于皮肤癌、食道癌及口腔癌等浅层肿瘤的治疗。值得注意的是,激发光的组织穿透深度和光敏剂的特异性富集是影响PDT治疗效果的关键因素。PDT中常用的红光在活体组织中的穿透深度仅为1~3 mm^[58]。且大多数活体组织内具有发色团(血红蛋白、黑色素、脂肪等),对可见光有强烈的吸收作用。因此,随着组织深度的增加,激光的光能快速衰减,使得PDT很难对深层肿瘤进行治疗。此外,光敏剂普遍存在水溶性差、靶向性差等问题。因此,利用纳米材料作为光敏剂的载体,能有效改善光敏剂的亲水性,提高靶向性,增加纳米光敏剂在肿瘤内的滞留,降低光毒性^[59,60]。另外,化学发光不需要外部光源的激发,无组织穿透深度的限制,而且具有高度的特异性和灵敏度。因此将纳米颗粒与化学发光结合,有望实现PDT对深层肿瘤的治疗。

4.1 基于纳米颗粒的鲁米诺化学发光诱导的肿瘤治疗

通常,传统的光敏剂在紫外可见光的激发下才具有良好的单线态氧产生能力,然而,该波段的光对组织穿透能力极差。为了实现PDT对深层肿瘤进行治疗,一些研究者通过装载上转换材料^[61],将近红外光转换成紫外可见光,然后激发光敏剂。此外,还有一些研究者利用X射线^[62]激发光敏剂来实现PDT的深层肿瘤治疗。但是,上转换材料的体系构建复杂,X射线对周围正常组织的损伤大,因此越来越多的研究者开始利用自发光激发光敏剂,进行PDT^[63]。其中,鲁米诺常常被用作化学发光供体,在H₂O₂和HRP或者MPO存在的条件下,发射425 nm左右的光。研究者还发现,被氧化的鲁米诺发射的光信号与目前广泛应用的光敏剂二氢卟吩e6(Ce6)的吸收是重叠的,因此可以实现对光敏剂Ce6的深层激发。基于此,Zhang等^[64]合成了一个包含光敏剂Ce6,鲁米诺及聚乙二醇的聚合物,并自组装形成纳米颗粒——CLP。如图8a所示,鲁米诺在MPO的催化下与H₂O₂反应并发光,进而激发光敏剂Ce6产生单线态氧,引起细胞凋亡,并且研究结果还显示通过尾静脉注射CLP到荷瘤小鼠体内时,具有良好的肿瘤抑制效果(图8b)。

除此之外,为了提高肿瘤治疗效果,研究者进一步探索如何更好地利用鲁米诺所发射的光去激发光敏剂。基于此,研究者把鲁米诺、H₂O₂、HRP和光敏剂整合到一个纳米体系中来实现无需外部光源激发的自激发光动力治疗。如图9a所示,Wang等^[65]构建了一个基于纳米颗粒的鲁米诺自发光PDT治疗体系,并且将叶酸(FA)和HRP共轭修饰到半导体聚合物(Pdots)与光敏剂形成的纳米颗粒上,在实现PDT的同时也提高治疗体系的靶向性。其中,HRP是鲁米诺与H₂O₂反应的催化剂;鲁米诺的最大发射波长与光敏剂四(羟苯基)-二氢卟吩(m-THPC)(420 nm)的吸收峰可以很好的匹配(图9b)。

与此同时,Pdots可通过CRET将鲁米诺的发射波长转变在550~700 nm处,与此同时该发射光还可以通过FRET对m-THPC进行激发并产生ROS。因此,自发光PDT可以通过鲁米诺-H₂O₂-HRP化学反应的CRET实现对m-THPC的激发,或通过鲁米诺-H₂O₂-HRP的CRET发光先激发Pdots,然后被激发的Pdots通过FRET然后激发m-THPC,二者协同提高ROS产量(图9c);此外,FA对肿瘤细胞表面叶酸受体的靶向识别作用,使得该体系对肿瘤细胞具有更好的杀伤效果,而不损伤正常细胞,具有很好的生物安全性。

此外,Yang等^[66]将光敏剂Ce6利用EDC/NHS化学反应连接到碳量子点上(CDs),并用于小鼠实体瘤的治疗(图10a)。在这个体系中,鲁米诺可通过CRET的方式激发Ce6成功生成单线态氧;同时,鲁米诺可有效激发CDs,这是因为CDs与鲁米诺的发射光谱具有很好的重叠(图10b),被激发的CDs通过FRET的方式对Ce6进行激发,使其被充分激发而产生更多的单线态氧,当利用该体系对荷瘤小鼠进行治疗时,研究结果显示该体系具有良好的肿瘤治疗效果(图10c)。

4.2 基于纳米颗粒的过氧化草酸酯化学发光诱导的肿瘤治疗

过氧化草酸酯化学发光体系不仅具有量子产率高、寿命长等优点,还可以通过荧光分子的选择和调节,使发光强度、持续时间以及发射波长满足应用需求。荧光分子的选择决定了化学发光的效率及用途。当将光敏剂作为这种体系中的能量受体时,该体系不仅可以成像还可以进行深层肿瘤的光动力治疗。Liu等^[67]以F127为载体,与CPPO、TBD(AIE 聚集诱导发光材料)、Soybean oil(豆油)利用自组装的方式形成纳米颗粒——C-TBD NPs,该纳米颗粒在H₂O₂存在的条件下,光敏剂TBD被激发,并产生单线态氧,最终实现了化学能激发的PDT治疗。进一步的研究结果也表明,通过尾静脉方式注射的C-TBD NPs具有良好的肿瘤抑制效果。

光敏剂的HUMO与HEI的LUMO间的能隙差对光敏剂的激发效率至关重要,能隙差越小激发的效率越高,但是近红外发射的光敏剂与HEI之间的能隙差比较大,使得激发效率比较低,会在一定程度上影响治疗效果。针对该问题,Liu等^[68]在光敏剂与CPPO之间引入了HEI的受体,进而通过CRET和FRET将能量间接传递给光敏剂,从而实现对光敏剂TPP的高效激发,通过静脉注射的方式实现了肿瘤的高效、特异性成像与治疗(图11)。

除了光敏剂,化疗药喜树碱(CPT)也可以作为HEI的受体。Huang等^[69]以偶氮苯和环糊精聚合物为载体,装载化学发光的底物CPPO与荧光分子抗癌药CPT。如图12所示,当CPPO与H₂O₂反应之后激发CPT,CPT发光使环糊精与偶氮苯发生化学发光导致的光学异构进而释放小分子CPT。被释放的CPT不仅可以作为化疗药杀死肿瘤细胞,还可以促进H₂O₂的产生,进一步促进CPT的释放,提高肿瘤治疗效果。

4.3 化学发光诱导的光动力治疗与其他肿瘤治疗手段的联合

为了更有效的治疗肿瘤,目前的研究已经从单一治疗转变成联合治疗,根据两种或者多种治疗方式之间的相互增强作用,实现“1+1>2”的协同治疗效果。基于此,Wang等^[70]设计了一种新型的利用鲁米诺发光进行肿瘤治疗的体系(图13)。在该体系中,利用纳米沉淀法将MEH-PPV与PSMA组装成一个表面带羧基的纳米颗粒,之后利用EDC/NHS化学反应将血红蛋白(Hb)连接到纳米颗粒表面,形成纳米颗粒——Hb-NPs,最后利用电转的方法将其电转到脂质体中,形成纳米颗粒——Hb-NPs@Liposome。在该体系中,Hb不仅可以作为鲁米诺与H₂O₂反应的催化剂,同时还可以提供氧气。MEH-PPV通过CRET吸收鲁米诺的化学发光,然后敏化Hb提供的氧气来产生能杀死癌细胞的活性氧,而且还可以定点、可控释放ROS敏感的前药,实现抗癌药物的可控释放,实现PDT与化疗的联合(图13)。

此外,Tang等^[71]利用介孔二氧化硅的空腔装载CPPO与供氧化合物——全氟己烷(PFC),之后利用化学键将葡萄糖氧化酶与Ce6连接到二氧化硅颗粒表面,并在表面包裹细胞膜。如图14 所示,通过葡萄糖氧化酶对葡萄糖进行消耗不仅可以实现肿瘤的饥饿治疗,而且葡萄糖分解产生的H₂O₂还可以增强化学能激发的PDT。结果表明,该体系对于B-16肺转移模型小鼠具有优异的治疗效果。

综上所述,目前与化学发光技术相结合的纳米颗粒主要是聚合物胶束、量子点、介孔二氧化硅和脂质体等。这些材料已经在生物体的检测和治疗中得到了广泛的应用。研究者在如何提高化学发光诱导的光动力治疗效果方面进行了探索。首先,选择与能量中间体能级匹配的光敏剂,这样才能实现光敏剂的有效激发;其次,选取合适的荧光分子作为桥梁,利用CRET和FRET之间的相互作用来更好的激发光敏剂;最后,探索如何将其与其他肿瘤治疗方法有效结合,实现协同肿瘤治疗。此外,研究者们还从细胞毒性、血常规,大生化以及组织切片的角度对于应用了纳米材料的生物体进行分析考察,结果显示,这些材料对于细胞无明显毒性,在活体内对正常组织也无明显损伤,进而表明这些纳米材料具有良好的生物安全性,一般情况下不会对生物体造成损伤^{[55, 72]}。

5 结论与展望

纳米颗粒直接或者间接参与的化学发光,对于提高化学发光的效率以及促进化学发光在生物诊疗中的应用具有十分重要的作用。本文首先对两种不同的化学发光体系发光原理进行了分析,之后归纳总结了目前与纳米颗粒相结合的化学发光技术在生物标志物检测、炎症性疾病成像、肿瘤成像及深层肿瘤的光动力治疗中的应用。针对两种化学发光在炎症及肿瘤的诊断与治疗中的应用进行分析与总结,二者具有以下优点:①打破了光源穿透深度的限制;②提高了信噪比与H₂O₂的检测灵敏度;③实现了病变部位的特异性成像与治疗。同时,这两种方式也存在以下缺点:①两种化学发光方式只能激发部分的荧光基团或者光敏剂,主要是因为鲁米诺的发射波长在425 nm左右,因此只能有效的激发在425 nm附近有吸收的荧光基团;其次是过氧化草酸酯体系,该体系中激发荧光基团的是过氧化草酸酯与过氧化氢反应生成的能量中间体,该能量中间体只能有效的激发荧光基团的HOMO与其LUMO能隙差比较小的荧光分子;②反应速度过快,导致化学能衰减迅速进而对化学信号的捕捉带来困难,一般的化学发光基团容易发生聚集性猝灭,导致荧光基团无法被有效激发;③通过静脉注射方式进入体内的纳米颗粒,主要通过实体瘤的高渗透性和滞留(EPR)效应被动靶向肿瘤,实现肿瘤部位的特异性富集。然而,EPR效应在人体上是否存在,近年来争议突出,临床实验表明,EPR效应虽然在动物实验上效果良好,但在人体模型上效果并不显著^[73]。针对目前基于纳米颗粒的化学发光技术所存在的缺点,为了进一步推进化学发光技术在生物诊疗中的应用,体系的构建与设计可以从以下几个方面进行考虑:①充分研究能量中间体与荧光分子二者之间的能级关系,在提高组织穿透深度的同时,实现激发效率的最大化;②利用AIE这类聚集诱导发光的材料代替聚集诱导猝灭的荧光基团,或者是在对荧光基团进行装载的时候采用化学键将荧光基团或者光敏剂连接到固相载体的方式取代亲疏水自组装装载,以避免聚集诱导猝灭导致的荧光基团无法被有效激发;③针对能量衰减迅速、寿命短的问题,可以在构建纳米化学发光体系的过程中引入黏性的反应溶剂,比如豆油等,延缓能量的衰减;④特异性增强肿瘤部位的过氧化氢含量。可以利用纳米颗粒将M2型巨噬细胞极化成可以产生H₂O₂的M1型巨噬细胞或者是利用葡萄糖氧化酶催化葡萄糖产生H₂O₂,进而特异性的提高肿瘤部位的H₂O₂含量;⑤针对纳米颗粒载体的靶向性与生物安全性的问题,可以制备脂质体、细胞、外泌体等生物结构作为化学发光体系的载体以增强其生物安全性,并进一步通过偶联靶向抗体、多肽、核酸适配体等,提高纳米载体的靶向性。另外,应从生物相容性、免疫学相容性,以及纳米颗粒在体内的代谢、吸收与排泄行为,对化学发光体系的生物安全性进行系统的评估。

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