基于水凝胶的细菌传感检测

苏喜; 葛闯; 陈李; 徐溢

doi:10.7536/PC200303

化学进展 ›› 2020, Vol. 32 ›› Issue (12) :1908-1916 DOI: 10.7536/PC200303

综述

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基于水凝胶的细菌传感检测

苏喜 ¹^,²^,⁴ ,
葛闯 ⁵ ,
陈李 ¹^,³^,⁴ ,
徐溢 ¹^,²^,³^,⁴^,^**

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Hydrogel-Based Sensing Detection of Bacteria

Xi Su ¹^,²^,⁴ ,
Chuang Ge ⁵ ,
Li Chen ¹^,³^,⁴ ,
Yi Xu ¹^,²^,³^,⁴^,^**

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摘要

水凝胶具有含水量高、柔韧性好、黏弹性高、生物相容性高以及独特的刺激响应特性,这使得水凝胶材料在细菌传感检测方面备受关注。基于水凝胶的细菌传感器及传感芯片的研究,对细菌的基础科学研究具有重要意义,更对细菌的快速高效检测、特定环境中的细菌污染防控和疾病传播控制等具有重要应用价值。本文针对近年来水凝胶在细菌传感检测方面的研究工作进行综述。简要介绍了水凝胶的种类,水凝胶与细菌之间相互作用的影响因素。重点综述了基于温敏型水凝胶、pH敏感型水凝胶、酶敏感型水凝胶以及特异性标识物功能化修饰的水凝胶构建的传感器和传感检测方法,并综述了基于水凝胶的新型柔性传感器和微流控传感芯片的研究进展。基于水凝胶的细菌传感器在检测效率、信号采集和稳定性等方面仍需进一步提升和拓展。随着新型水凝胶材料的出现,智能细菌传感器、柔性细菌传感器和集成微流控细菌传感芯片是目前发展的方向,在细菌检测方面显示出良好的发掘潜力和应用前景。

Abstract

Hydrogels have the features of high water content, good flexibility, high viscoelasticity, high biocompatibility, and unique stimulus response characteristic, which makes hydrogel materials attract much attention in the detection of bacteria. The research of hydrogel-based bacterial sensors and sensor chips is of great significance to the basic scientific research of bacteria, and it also has important application value for rapid and efficient detection of bacteria, prevention and control of bacterial pollution in specific environments, and control of disease transmission. The latest research works of hydrogel-based bacterial sensing detection are reviewed in this article. The types of hydrogel and the influence factors of the interaction between hydrogel and bacteria are briefly introduced. The sensors and sensing detection methods based on temperature-sensitive hydrogel, pH-sensitive hydrogel, enzyme-sensitive hydrogel and functionalized hydrogels with specific markers are reviewed and discussed in detail. The research progress of new type hydrogel-based flexible sensors and hydrogel-based microfluidic sensor chips are highlighted. The detection efficiency, signal acquisition, and stability of the hydrogel-based bacterial sensors still need to be further improved and expanded. With the emergence of new hydrogel materials, much more attention have been paid to developments of smart bacterial sensors, flexible sensors, and integrated microfluidic sensor chips which are shown good exploration potential and application prospects in terms of bacterial detection.

Contents

1 Introduction

2 Research on hydrogel and its interaction with bacteria

2.1 Functional polymer hydrogel material

2.2 The interaction between hydrogels and bacteria

3 Hydrogel-based bacterial sensing detection

3.1 Bacterial sensing detection based on temperature-sensitive hydrogel

3.2 Bacterial sensing detection based on pH-sensitive hydrogel

3.3 Bacterial sensing detection based on enzyme-sensitive hydrogel

3.4 Bacterial sensor detection based on specific marker functional hydrogel

4 Hydrogel-based flexible bacteria sensor

5 Microfluidic bacterial sensor chip integrated with hydrogel

6 Conclusion and outlook

Graphical abstract

关键词

水凝胶 / 智能水凝胶 / 细菌 / 传感检测 / 柔性传感器

Key words

hydrogel / smart hydrogel / bacteria / sensing detection / flexible sensor

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苏喜, 葛闯, 陈李, 徐溢. 基于水凝胶的细菌传感检测[J]. 化学进展, 2020, 32(12): 1908-1916 DOI:10.7536/PC200303

Xi Su, Chuang Ge, Li Chen, Yi Xu. Hydrogel-Based Sensing Detection of Bacteria[J]. Progress in Chemistry, 2020, 32(12): 1908-1916 DOI:10.7536/PC200303

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1 引言

细菌污染严重威胁人体健康,很多呼吸道传染病、肠道疾病和皮肤感染等都是由环境细菌引起的。然而环境中细菌含量极低,一般的检测方法很难实现对环境细菌的快速检测。传统的培养法,虽准确度高,但存在耗时较长和特殊的细菌在普通的培养皿上无法生长的问题。随后发展起来的分子生物技术、生物质谱^[1]、电化学技术和光谱技术等^[2],依旧存在样本预处理复杂、需用大型设备、检测效率有局限等问题。因而,将细菌的分离富集技术与高灵敏检测技术等联合起来,发展高效的细菌检测新技术和新方法,实现对低浓度细菌的高效快速鉴别及检测,成为人们关注的热点^[3]。本课题组长期开展基于传感技术和微流控传感芯片的细菌细胞测试研究^{[4 ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓~11]},我们认为,在基于微流控传感芯片分析技术平台的细菌、真菌和细胞检测中传感检测具有突出的优势和发展潜力。

一般来讲,传感器的核心部件是生物敏感元件和转换器,当待测物与生物敏感层发生相互作用后,产生的物理化学信号变化可通过信号转换器转换而输出电、光、声或热等响应信号,解析这些信号与待测物之间的关联性,从而达到分析检测待测物的目的^[13]。生化传感检测采用的传感器,依据生化靶标物与敏感界面之间的作用类型和模式,以及产生的响应信号特征,可以采用电化学、压电、光学、声学和热传感器等多种不同类型的传感器^[14]。

在细菌的传感检测过程中,细菌与传感界面之间的相互作用,导致传感界面的物理化学性质发生变化,产生传感信号。恰当的界面材料设计可以达到事半功倍的效果,实现细菌的高效检测,因此传感界面的材料选择是关键问题。目前用于细菌传感检测中传感界面构建的材料种类繁多,包括金属材料^[15]、石墨烯类材料^[16]、聚合物材料^[17]和水凝胶^[18]等。我们前期采用聚乙二醇水凝胶作为磁泳分离的介质,建立了大肠杆菌的快速富集及定量检测方法^[19],研究中发现,聚乙二醇水凝胶在生物兼容性和分离富集功效上展示出独特的优势,值得关注和探索。调研发现水凝胶因含水量高、柔韧性好、黏弹性高和生物相容性高等特性使得水凝胶近年来在细菌传感检测方面备受关注。部分水凝胶由于可以感受外界环境产生的细微改变,产生一定的物理化学变化,甚至产生宏观可见的形状改变,这使得水凝胶在细菌传感检测方面具有很大优势,细菌传感检测正逐步成为细菌分析测试发展的新热点和新趋势^[20]。

本文将针对水凝胶与细菌之间相互作用的影响因素进行简要综述,并重点对水凝胶在细菌传感检测方面的研究进行综述,涉及基于温度敏感型水凝胶、pH敏感型水凝胶、酶敏型水凝胶以及特异性标识物修饰的水凝胶构建的细菌传感器,细菌传感检测方法的现状和发展趋势。介绍了基于水凝胶的柔性细菌传感器件和集成水凝胶的微流控细菌传感芯片的研究现状,对水凝胶在细菌传感检测中面临的挑战及其发展趋势进行了讨论。

2 水凝胶及其与细菌的相互作用研究进展

2.1 功能高分子水凝胶材料

水凝胶(Hydrogel)是一类具有三维网络结构的新型功能高分子材料,由亲水性高分子通过共价键、氢键、范德华力等作用交联形成,在水中能够充分溶胀而不溶解。它的主、侧链上有很多的亲水基团(如—OH、—COOH、等),能够吸引水分子扩散到水凝胶内部,然后与亲水基团形成氢键,从而使水凝胶网络结构中保持大量水分^[22]。水凝胶具有网状结构,孔径在50~1500 Å(5~150 nm)范围内,对水及其水溶性小分子具有良好的透过性,小分子和离子可以在水凝胶内部自由扩散,形成均相分散状态;而大颗粒物质、细菌、细胞等则会被阻碍在凝胶表面,不能在水凝胶内自由穿梭^[23]。

水凝胶种类多样,功能各异。根据合成材料的不同,水凝胶可分为天然高分子水凝胶和合成高分子水凝胶。根据水凝胶网络键合机理的不同,可分为物理凝胶和化学凝胶。根据水凝胶对外界刺激的响应情况,可分为传统水凝胶和环境敏感性水凝胶。环境敏感型水凝胶本身含有相转变、电荷或其他功能型基团能够感知外界环境的微小变化或刺激,会相应产生体积或者形状的改变,并且这种改变是可逆的,当外界刺激消失时,水凝胶可以恢复初始的状态,这类水凝胶也被称为智能水凝胶。常见的智能水凝胶有温敏型、pH敏感型、压力敏感型以及生物酶敏感型^[22]。

在细菌检测领域,水凝胶传感器还处于初期研究阶段。水凝胶一般是通过间接地方式应用到细菌传感检测当中,细菌影响传感器测量的中间量,如酸碱度,然后再通过酸碱度来影响传感器系统的输出^[24]。在细菌的传感检测中,了解细菌与水凝胶之间的相互作用影响因素,提高细菌的黏附效率是影响细菌传感检测的重点研究内容之一。

2.2 水凝胶与细菌相互作用

目标细菌与传感界面之间的相互作用模式、机制和效果是细菌传感检测中的核心问题。本课题组采用甘露糖和金纳米颗粒修饰金电极构建了电化学阻抗细菌传感器^[9],测试并计算了鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌 JM109和大肠杆菌 DH5 α三种细菌与甘露糖之间的亲合力常数,并实现了鼠伤寒沙门氏菌的特异性检测。与此同时,我们也发现凝胶介质/界面对细菌有很好的吸附作用,了解凝胶与细菌之间的相互作用,对构建针对细菌的新型传感膜和传感器具有重要意义。

影响细菌在水凝胶传感界面上黏附的影响因素很多。细菌表面参与黏附作用的部分黏附素(Adhesin),如菌毛、肽聚糖、脂壁酸、细胞外黏质(Extracellar Slime Substance,ESS)、有黏附功能的荚膜等,细菌表面带负电荷特性等在细菌黏附于水凝胶表面时有很大影响。因此,水凝胶的表面的化学组成、亲水/疏水性、电荷特性等对细菌黏附有较大影响。此外研究表明,水凝胶的含水量、厚度以及形貌对细菌的黏附也有很大影响。

Fletcher等^[25]通过研究发现在带有正电荷或中性电荷官能团的水凝胶可黏附大量海洋假单胞菌,而在带有负电荷官能团的水凝胶几乎未黏附海洋假单胞菌。Cook等^[26]合成聚(羟乙基甲基丙烯酸酯)基水凝胶,考察含水量30%~70%的水凝胶对铜绿假单胞菌黏附的情况,发现含水量越少的水凝胶对铜绿假单胞菌的黏附量越大。Kalaji等^[27]同样证明在疏水表面,大量铜绿假单胞菌产生黏附。Kolewe等^[29]采用聚乙二醇凝胶进行实验,通过调节水凝胶制备过程中溶液PEG含量和PEG溶液的用量,来控制PEG水凝胶的硬度和厚度。通过测试大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在水凝胶表面成膜情况,计算细菌的黏附效率,研究结果表明水凝胶越薄,硬度越大(含水量越低),细菌的黏附越多(图1)。

细菌与水凝胶相互作用的方式主要有静电作用、疏水-疏水和氢键作用等,这些相互作用引起细菌在水凝胶上的黏附,但并不具有靶向性和特异性。通过在凝胶基质中引入酶、抗体、适配体和多糖等具有选择性和特异性的组分,可进一步提升细菌与水凝胶之间有选择性的吸附。从水凝胶和细菌之间的相互作用研究中发现,疏水表面、非电负性、低水含量的水凝胶薄层,会增加细菌的黏附,这一发现为水凝胶传感膜的构建奠定了理论基础,促进了水凝胶在细菌传感检测中的应用研究。

3 基于水凝胶的细菌传感检测

细菌与水凝胶之间的构效关系和传感机制,是构建细菌传感检测的重要依据。目前,在基于水凝胶的细菌传感检测体系构建过程中,应用到的水凝胶材料种类繁多,且多为复合凝胶。应用较多的凝胶基质主要包括:聚丙烯酸、聚异丙基丙烯酰胺、壳聚糖和海藻酸盐等,加以其他交联试剂和功能试剂,通过化学交联或物理作用合成水凝胶敏感层。以水凝胶作为敏感介质材料主要具有以下优势:①水凝胶种类繁多、化学性质丰富,可根据细菌的特征选择不同的凝胶种类,以实现水凝胶和细菌之间更好的相互作用;②水凝胶具有3D多孔纳米结构,大表面积可增加传感界面和被测物的相互作用范围;③保障生物识别分子(酶、抗体、抗原、适配体、蛋白等)的生物活性和稳定性;④水凝胶的化学兼容性好,可与荧光材料、导电材料等有效结合,制备多功能水凝胶,构建相应的细菌传感器。

3.1 基于温敏型水凝胶的细菌传感检测

温敏型水凝胶在某一温度时会向溶胀或收缩状态转变,若在低于此温度时发生溶胀,则称此温度为最低临界共溶温度(Lower critical solution temperature, LCST),若在高于此温度时发生溶胀,则称为最高临界共溶温度(Upper Critical Solution Temperature, UCST)。简言之,温度刺激使构成水凝胶的聚合物在亲疏水状态之间变化。温敏水凝胶中研究最广泛的是聚 N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)水凝胶,已被用于细菌传感检测的研究,该材料的LCST 为32 ℃,高于LCST时,PNIPAAm凝胶处于收缩疏水状态,水分含量较低,对细菌有很好的吸附作用;在温度低于LCST时,凝胶转变成亲水状态,吸水膨胀,将细菌推离凝胶表面,表现出自清洁特性^[31]。

Khan等^[32]采用聚( N -异丙基丙烯酰胺)-石墨烯片(PNIPAm-GR)复合水凝胶修饰滤纸作为基底,再将金电极蒸镀沉积到PNIPAm-GR表面,构建对电刺激和热刺激响应的传感芯片(Electrically-Receptive Thermally-Responsive Sensor Chip, ER-TR sensor chip)(图2)。可实现革兰氏阳性菌(变形链球菌和枯草芽孢杆菌)和革兰氏阴性菌(大肠杆菌)的捕获与释放,细菌的黏附带来电阻信号的变化,可检测的最低细菌浓度为10 cells/mL。

有研究在温敏型水凝胶中存储灭活剂(银纳米颗粒、季铵盐),将其用作防污涂层,实现细菌的吸附、灭活及清除^[33]。通过控制温度,温敏型水凝胶还可在疏水状态和亲水状态之间可逆切换,实现细菌的富集和释放,这使得温敏型水凝胶在细菌传感检测的应用方面显示出很大优势。但是,值得注意的是温敏型水凝胶受温度影响较大,使用环境受到一定限制。目前,通过在温敏型水凝胶中包埋功能试剂,实现细菌原位标记、富集、信号放大及原位定量检测等均受到研究者的关注。

3.2 基于pH敏感型水凝胶的细菌传感检测

pH敏感型水凝胶,可通过物理溶胀或消溶胀感应外界pH环境的变化。因含有大量易水解的基团,如羧酸、磺酸、伯胺、仲胺和季铵盐等,具有对环境中氢离子结合或者解离的能力,根据质子化-去质子化的程度会携带不同的电荷影响水凝胶的渗透压,发生收缩-溶胀现象。常见的pH敏感型水凝胶包括聚丙烯酸(PAA)、聚丙烯酸衍生物、壳聚糖(CS)等^[35],已被用于细菌的传感检测。

PAA水凝胶,在碱性电解质中脱质子,使得凝胶层中正负电荷离子密度增加,引起水凝胶的溶胀;相反酸性电解质会抑制水凝胶的脱质子,降低凝胶中正负电荷离子密度,导致水凝胶收缩。在电极表面由于电荷密度的变化以及水凝胶溶胀收缩带来的电极双层电容的变化,最终会体现在电位的变化。据此原理, Shaibani等^[36]采用聚丙烯酸(PAA)/聚乙烯醇(PVA)水凝胶修饰硅半导体工作电极,在水凝胶界面修饰D-甘露糖,构建基于PAA/PVA水凝胶的光寻址传感器(Nanofiber-Light Addressable Potentiometric Sensor, NF-LAPS),用于大肠杆菌的特异性检测(图3A)。大肠杆菌在水凝胶界面代谢,60 min内引起水凝胶pH变化,影响电位输出,通过比较pH和电位之间的关系,可间接检测大肠杆菌,最低可检测浓度为10² cfu/mL。

Wang等^[37]采用二氢硫辛酸(DHLA)修饰荧光银纳米簇(Ag NCs),将其掺杂到琼脂糖水凝胶中,构建一种基于琼脂糖水凝胶的荧光传感器,对pH值在8.0~4.0范围内的物质有响应。pH值为8.0时,DHLA-Ag NCs均匀地分散在琼脂糖凝胶中,具有很强的荧光特性;随着pH值降至4.0,DHLA发生质子化,从Ag NCs表面脱落,水凝胶脱水收缩,裸露的Ag NCs团聚,荧光逐渐猝灭。黏附到复合水凝胶表面的大肠杆菌,孵育生长12 h,代谢产生酸性物质,使得复合水凝胶的荧光猝灭,可据此用作细菌有无的判断依据(图3B)。

pH敏感型水凝胶具有含水量高和生物相容性好的特性,可为细菌的生长提供适宜的环境,其在细菌富集、原位定量检测以及环境中有无细菌的判定上具有很大优势,但其也存在对细菌鉴别耗时较长的不足。

3.3 基于酶敏感型水凝胶的细菌传感检测

现有研究中酶敏感型水凝胶多为复合功能型水凝胶,主要分为两类,一类是对外源性酶具有响应的水凝胶,形成水凝胶网格的单体之间的化学键,在外来催化酶的作用下发生断裂,水凝胶溶解坍塌;另一类是内源性酶导致水凝胶的物理化学变化,通过在水凝胶中掺杂特异性催化酶,催化目标物质发生反应,反应产物带来水凝胶的变化。这两种类型的酶敏感型水凝胶均在细菌检测中得到应用。

Schöherr等^{[38 ⇓~40]}用荧光报告基团(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖醛酸,XGlcA)功能化修饰壳聚糖,构建基于复合壳聚糖水凝胶的荧光传感器。大肠杆菌代谢产生的α-葡萄糖苷酶,可特异性分解XGlcA生成深蓝色的二聚吲哚,即实现大肠杆菌的鉴别。通过调控荧光报告基团的种类,特异性识别不同的酶,可实现细菌的鉴别(图4A)。Jelinek等^[41]将碳点掺杂到葡萄糖前驱体中,制得具有荧光特性的水凝胶,构建基于葡萄糖水凝胶的荧光传感器,用于细菌的检测及鉴别。细菌代谢分泌的酯酶和脂肪酶使水凝胶之间的酯键断裂,水凝胶发生流化,碳点发生聚集,荧光随之猝灭,实验证实该材料可用于芽孢杆菌、葡萄球菌属的检测(图4B)。以上研究都是通过细菌代谢分泌得到不同类型的酶,催化水凝胶中特定的键发生断裂,产生颜色或荧光的变化,实现细菌的检测。但细菌代谢产生足量的酶,耗时较长;其次细菌代谢过程影响因素较多,很难建立酶和细菌含量之间的关系,因此目前该方法的研究仅停留在细菌有无的定性判断,以及少量细菌的鉴别方面。

为了提高酶敏感型水凝胶在细菌鉴别应用中的效率,加拿大约克大学Mitra等^[42]将溶菌酶(B-PER)、酶底物(Red-Gal)和琼脂糖混合,在柱塞管底部固化形成酶敏感型复合水凝胶,构建集成细菌预浓缩和检测的比色传感器,用于特异性地检测水样中的大肠杆菌。当大肠杆菌被浓缩至柱塞管底部,与复合水凝胶基底接触,溶菌酶快速裂解大肠杆菌,释放出Gal酶,特异性催化Red-Gal底物发生颜色变化/产生荧光,在5 min内可对≥4×10⁵ cfu/mL的大肠杆菌实现检测;在60 min内可对4×10⁴ cfu/mL~ 400 cfu/mL的大肠杆菌实现准确检测。

酶敏感型水凝胶同样具有含水量高和生物相容性好的特性,可在适于细菌生长的环境下,通过对其中细菌代谢产物的检测,来实现对细菌鉴别。这种方法准确度高,但耗时较长。将高灵敏荧光/显色试剂、生物活性酶和水凝胶结合,通过共聚等途径,研制新型复合水凝胶正成为研发热点,其将促进酶敏型水凝胶在细菌传感检测及鉴别方面的更好应用。

3.4 基于特异性标识物功能化水凝胶的细菌传感检测

水凝胶生物相容性好,含水量高,易于改性和修饰,为生物活性物质提供了很好的存储平台,因而在传感器敏感膜构建中广为应用。采用抗体、适配体、凝集素等生物活性物质对水凝胶进行功能化修饰,得到特异性水凝胶,其可识别样本中的特定细菌,通过依托的传感检测平台,得到相应的信号响应,最终实现对特定细菌的定量检测。采用特异性水凝胶构建的传感器,主要有电化学传感器、光学传感器以及光电传感器。

Wan等^[43]将石墨烯和壳聚糖(CS)修饰到电极表面,通过戊二醛交联将抗体修饰到凝胶表面,构建基于CS水凝胶的免疫阻抗传感器,用于检测硫酸盐还原菌(SRB)。通过建立电荷转移电阻和SRB浓度之间的关系,最低可检测18 cfu/mL的SRB。Kraatz等^[44]采用CS和金纳米颗粒(AuNPs)共同修饰玻碳电极(GCE),在水凝胶表面固定一级抗体(Ab1),构建免疫电流传感器,用于沙门氏菌的特异性检测。在测试体系中加入二级抗体(Ab2)修饰的辣根酶(HRP),在电极界面形成三明治结构(图5A),实现电流信号的放大,灵敏度低至5 cfu/mL。

Massad-Ivanir等^[45]在多孔硅基表面修饰聚丙烯酰胺水凝胶(PAAm),通过在水凝胶表面修饰单克隆抗体,构建基于PAAm水凝胶的免疫光学传感器,利用水凝胶表面固定细菌时,会影响薄膜干涉光谱的强度,实现特异性检测大肠杆菌,最低检测浓度为10³ cfu/mL。Cai等^[46]在刀豆凝集素A(ConA)水凝胶底部嵌入二维光子晶体(2D PC,聚苯乙烯微球),构建基于Con A水凝胶的传感器,利用白色念珠菌可同时结合多个Con A分子,引起水凝胶收缩,2D PC间距减小,导致光子晶体的衍射光波长蓝移的原理,可实现白色念珠菌的特异检测,最低检测浓度为32 cfu/mL(图5B)。

Hao等^[47]采用溴化银纳米颗粒(AgBr NPs)和三维氮掺杂石墨烯(3DNGH)制备多孔复合纳米材料,将其和鲁米诺掺杂到壳聚糖(CS)水凝胶中修饰玻碳电极,在水凝胶表面修饰抗体,构建基于CS水凝胶的电化学发光传感器(ECL),用于大肠杆菌的特异性检测。当大肠杆菌黏附在电极表面时,产生的空间位阻抑制石墨烯半导体材料表面的电子和质量转移,降低ECL信号,可实现0.5~500 cfu/mL内大肠杆菌的定量检测。Hua等^[48]将负载碳量子点的三维石墨烯水凝胶(C-dots/3DGH)和氮化碳(g-C₃N₄)分别修饰到氧化铟锡膜的两个相邻区域,在C-dots/3DGH表面修饰大肠杆菌适配体,构建基于C-dots/3DGH水凝胶的光电传感器,用于特异性检测大肠杆菌。在一定的光照强度下,通过施加1.5 V和-0.4 V不同的偏置电压,大肠杆菌与适体结合后导致空间位阻大大增加,阴极电流显著降低,阳极电流不变,因此,建立阴极电流与阳极电流的比值与大肠杆菌浓度的线性关系,最低可实现2.9 cfu/mL大肠杆菌的检测。

可以看到,基于特异性标识物修饰的水凝胶可极大提升其与细菌之间的靶向作用,构建对细菌的高灵敏传感检测的新途径和新方法。目前,相关研究尚在起步中,进一步研发新型水凝胶并对其进行不同功能化修饰,将促进其对细菌高效传感检测的深入研发。

4 基于水凝胶的柔性传感器及其对细菌的检测

水凝胶良好的黏弹性和柔韧性等,使其在柔性传感器方面具有很大的发展空间。柔性传感器不仅环保,还具有极佳的生物相容性和可生物降解性。因此,其可应用于可穿戴电子设备、植入式设备等领域。柔性传感器也成为在细菌传感检测方面的发展趋势之一。

Tian等^[49]采用细菌纤维素修饰滤纸制得柔性水凝胶膜,通过过滤将纳米金棒修饰到水凝胶膜上,构建基于细菌纤维素水凝胶的SERS传感器,因其良好的柔韧性也可作为弹性拭子(Hydrogel Elastic Swab,图6A)。弹性拭子可用于采集树叶表面的大肠杆菌,通过SERS实现了大肠杆菌的原位检测和鉴别。

Yu等^[50]采用甲基丙烯酸二甲胺乙酯(DMAEMA)功能化修饰4,4-二氟-4-硼-3a,4a-二氮杂茚满(BODIPY),得到表面带正电的荧光聚合物(PDB),利用正负电荷相互吸附原理,将PDB和聚丙烯酸(PAA),通过层层自组装的方法吸附到聚乙烯醇-聚乙烯(PVA-co-PE)水凝胶膜表面,构建具有荧光性能的柔性水凝胶传感器(FNFM)。中性条件下细菌表面呈电负性,与FNFM接触时,使FNFM表面的PDB解离,荧光逐渐降低,5 min后荧光消失,而细菌表面因包裹PDB具有荧光,由此实现1×10¹~1×10⁵ cfu/mL范围内金黄色葡萄球菌ATCC 6538 或大肠杆菌ACTT 8099的定量检测(图6B)。

目前的研究表明构建基于水凝胶的柔性传感器可实现细菌的检测,并且展现出很大价值。一方面良好的弯曲性能可实现不规则表面细菌的采集,并实现快速检测及鉴别;另一方面用于可穿戴材料,可快速响应周围环境中的细菌,提出预警信息。目前柔性细菌传感器的研发处于初期,新型功能高分子水凝胶的研发,必将是柔性细菌传感器的重要研究方向。

5 集成水凝胶的微流控传感芯片及其对细菌的检测

实际情况下的生化样本中,细菌的含量较低,普通的大型仪器无法满足低含量细菌的快速检测需求。微流控芯片分析技术能在微米尺度对流体进行操控,可将化学和生物学领域所涉及的样品制备、反应、分离、检测等基本单元集成或基本集成到几平方厘米大小的芯片上;具有体积小、耗量低、传质快、检测手段丰富、集成度高、易于便携和自动化等特点;可同时获取大量的信号信息,具有高效集成化满足细菌快速检测要求的潜力^[51]。

本课题组长期开展基于微流控芯片的细菌传感检测研究,研制了多种不同类型的集成微流控细菌传感芯片^[10],在针对猪肉、鸡蛋壳、自来水等样本中沙门氏菌和大肠杆菌的检测方法建立中,我们发现,如何实现目标细菌片上在线富集和分离以及原位检测,是实现有效检测的核心技术,而利用凝胶介质/界面的特性,将水凝胶与微流控芯片结合搭建用于细菌检测的传感器,必将为细菌的快速检测提供更大优势。

早在2005年洛桑瑞士联邦理工学院Johann等^[52]就在微流控芯片上,通过控制压力调控微流控通道中海藻酸钠溶液、氯化钙溶液和EDTA溶液三者的层流类型和离子浓度,在溶液界面上形成/分解海藻酸钙水凝胶,利用海藻酸钙水凝胶实现了酵母菌的捕获释放(图7A)。Lee等^[53]在微流控芯片通道中集成含有微孔的光敏型3D硅水凝胶网络,将抗体固定至水凝胶中,通过光照激发,实现金黄色葡萄球菌的特异性捕获和释放(图7B)。

Liu等^[54]制备了一种基于琼脂糖水凝胶的微流控芯片,其包含玻璃底片和琼脂糖水凝胶盖片,琼脂糖水凝胶盖片上有二叉树结构的微通道,盖片末端采用滤纸提供动力实现进样,基于微通道的毛细作用和琼脂糖水凝胶的强透水性,可将生物流体从微升体积浓缩到皮升体积,由此细菌可以被富集浓缩至微通道的末端(图7C)。结合免疫荧光检测法,可实现临床上尿液和血浆样本中金黄色葡萄球菌在该芯片上浓缩和检测。

可见微流控芯片包含样本预处理区、待测物分离富集区和检测区等多种功能分区,可根据不同分析体系,在芯片上灵活组合和集成各种功能区,集成水凝胶材料,形成一个整体多元微操作平台,可实现细菌的快速富集及检测。结合微流控芯片分析技术,研制集成多功能水凝胶的芯片及系统对细菌的传感检测具有重要的研究价值。

6 结论及展望

细菌传感检测方法的研究和应用对环境细菌的快速检测具有重要意义。其中敏感膜材料的设计和效能,很大程度上决定了细菌传感检测的优劣,研制生物相容性好、选择性高和稳定性好的敏感膜是细菌传感检测的一个重要研究方向。近年来水凝胶材料因优异的生物相容性、潜在的传感特性为敏感膜的构建提供了新途径,在智能细菌传感器、柔性传感器、微型传感器等方面显示出良好的发掘潜力和应用前景。但如何实现细菌在水凝胶敏感膜上的有效黏附,如何解析水凝胶敏感膜与细菌之间的构效关系;如何据前两者建立高效的水凝胶传感界面,如何解析传感界面的传感机制,并确定可靠的信号采集方式,如何搭建稳定性好、寿命长和可实现细菌传感检测的分析系统,都是亟待深入研究的问题。相关研究的进展,有望实现细菌的高效传感检测,在细菌的基础科学研究、特定环境的细菌污染防控和疾病传播控制等领域显示出巨大的应用前景。

参考文献

原文顺序 | 出版日期 | 本文引用

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