循环肿瘤细胞体内检测技术及其应用研究

郭珊; 周翔

doi:10.7536/PC200423

化学进展 ›› 2021, Vol. 33 ›› Issue (1) :1-12 DOI: 10.7536/PC200423

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循环肿瘤细胞体内检测技术及其应用研究

郭珊 ¹^,²^,^* ,
周翔 ²

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Detection of Circulating Tumor Cell in Vivo:Technology and Application

Shan Guo ¹^,²^,^* ,
Xiang Zhou ²

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摘要

从实体瘤脱落进入血液循环系统的肿瘤细胞即循环肿瘤细胞(CTCs)与肿瘤转移密切相关,因此CTCs检测对癌症患者的诊断、治疗监测、病情评估以及肿瘤转移机制研究具有重要意义。由于CTCs在体内含量极少、异质性、分布不均一,通过体外采血发展的CTCs检测技术虽然已取得很大进展,但仍然面临肿瘤细胞损失、失活、失真以及灵敏度低等问题,因此亟需发展基于体内快速流动血液的肿瘤细胞检测技术,在真实生理状态下实时监测CTCs动态变化。在此,我们总结了CTCs体内检测技术及其相关应用的研究进展,分析了这些技术的优势和不足。最后,讨论并展望了CTCs体内检测技术的未来发展趋势。

Abstract

Cancer cells that shed from solid tumor and circulate into bloodstream, namely circulating tumor cells(CTCs), are closely related to tumor metastasis. Therefore, CTCs detection is of great significance for cancer diagnosis, treatment monitoring, disease assessment and understanding of the mechanisms underlying tumor metastasis. However, CTCs are extraordinarily rare, heterogeneous, nonuniform in blood. Even if strategies for detection of CTCs in static blood collected from patients have made significant progress, they still face the tumor cell loss, cell death, low fidelity, and low sensitivity. It is essential to develop approaches available for detection of tumor cells in fast-flowing blood, allowing real-time monitoring of CTC dynamic changes under physiological conditions. In this review, we summarize techniques developed for CTC detection in vivo and their related applications. Furthermore, the advantages and disadvantages of these techniques are analyzed. Finally, future techniques for detection of CTCs in vivo are discussed and predicted.

Contents

1 Introduction

2 Detection of circulating tumor cells(CTCs)in vivo

2.1 Optical imaging-based CTC detection in vivo

2.2 In vivo flow cytometry-based CTC enumeration

2.3 Scaffold implant-based CTC recruiting in vivo

2.4 Intravenous indwelling device-based CTC capture in vivo

2.5 Microfluidic chip-based CTC detection in vivo

3 Conclusion and outlook

Graphical abstract

关键词

癌症 / 循环肿瘤细胞 / 体内检测

Key words

cancer / circulating tumor cells / in vivo detection

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郭珊, 周翔. 循环肿瘤细胞体内检测技术及其应用研究[J]. 化学进展, 2021, 33(1): 1-12 DOI:10.7536/PC200423

Shan Guo, Xiang Zhou. Detection of Circulating Tumor Cell in Vivo:Technology and Application[J]. Progress in Chemistry, 2021, 33(1): 1-12 DOI:10.7536/PC200423

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1 引言

癌症相关死亡的主要原因是肿瘤的复发和转移。早在1869年,澳大利亚籍医生Ashworth^[1]在1例癌症患者血液中发现类似于尸检的肿瘤细胞,首次提出循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)的概念。CTCs是指从实体瘤脱落、侵袭并进入血液循环系统的肿瘤细胞。1889年,Paget提出了“种子与土壤假说”,指出器官微环境可以影响特定肿瘤细胞的种植、侵袭、存活和生长。游离于血液中的肿瘤细胞在进入其他器官之后,可以如同“种子”遇到“土壤”一样,发展成新病灶即转移灶^[2]。1997年,Dick等从白血病患者血液中分离出一些类似于干细胞的罕见细胞,提出并首次验证了肿瘤干细胞理论^[3]。目前,肿瘤转移机制的许多方面已得以阐明, 具体表现有:预转移肿瘤细胞(prometastatic tumor cells)在上皮病变组织发生上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT),引起上皮性标志物如EpCAM、CK和E-钙黏蛋白(E-cadherin)的表达降低,而间充质标志物如N-钙黏附蛋(N-cadherin)、波形蛋白(vimentin)和纤连蛋白(fibronectin)的表达上升;而后从实体瘤部位脱落,破坏并穿过基底膜,进入血管或者淋巴管;在循环系统中,CTCs通过结合血小板等方式逃避免疫系统攻击;最后,CTCs黏附于新的位点,溢出血管,经过间质上皮转化(mesenchymal-epithelial transition,MET),在新的位点增殖,形成转移病灶^{[4⇓⇓⇓⇓⇓~10]}。由此可见,CTCs与肿瘤转移密切相关。CTCs检测对于癌症的诊断、治疗以及肿瘤转移分子机制研究具有重要意义。

血液是由血浆和血细胞(包括红细胞、白细胞、血小板)构成。对于成年人而言,流经全身的血液总量约5 L,每毫升血液中红细胞的数目为10⁹数量级,白细胞的数目为10⁶数量级,血小板的数目为10⁸数量级。然而,每毫升血液中CTCs数目在10³以下,含量低,且CTCs半衰期较短(几小时以内)^{[10⇓⇓⇓~14]}。此外,不同个体、不同种类癌症和同一个体的CTCs具有高度异质性。因此,从大量的背景血细胞中高特异性、高灵敏和高通量地分离出CTCs,如同大海捞针,具有极大挑战。为此,研究者利用化学、物理、生物、材料、医学以及交叉学科领域的优势,发展了各种各样的技术用于CTCs捕获、释放、表征和分析。截至2019年12月,以“circulating tumor cells”为关键词,可以在PubMed数据库检索出23 000多篇论文,其中,综述类超过3600篇。自2000年起,每年CTCs相关的论文均超过100篇,且近5年超过了300篇/年,可见CTCs相关的研究发展速度很快,也取得了很多研究成果。

综观CTCs检测技术,可以分为CTCs体内和体外检测两大类。CTCs体外检测技术主要有三大步骤:(1)抽取血样,富集分离肿瘤细胞;(2)经免疫荧光染色或者荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)等鉴定CTCs;(3)于荧光显微镜下观察并计数CTCs。与借助穿刺等手术操作的组织活检相比,基于采集的血液检测CTCs,具有取样简便、易操作和非侵入性的优点,可以反复取样,动态监测患者体内CTCs数目和表型等的变化。根据CTCs和血细胞物理学性质(如尺寸、密度、电荷、变形性)和生物学性质(主要是细胞表面蛋白标志物)差异,研究者们发展了基于滤膜^[15⇓~17]、介电泳^[18⇓~20]、微纳米颗粒或者基底^{[21⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓~30]}、微流控技术^{[31⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓~45]}等方法实现CTCs高效分离,灵敏度达到1~10个CTCs/mL。

然而,体内CTCs含量存在时空分布差异^[11]。在时间上,CTCs可以出现在肿瘤发展的任意阶段。在肿瘤发展的早期阶段,CTCs在血液中的含量较少,而随着肿瘤恶化的持续发展,血液中CTCs数目增多。在空间上,由于CTCs尺寸较大以及CTCs与血管间的受体-配体作用,CTCs可能滞留于血管某处,导致从不同部位所采血样中CTCs含量不同。因此,在某一时间点从机体特定部位采集血液进行CTCs检测具有一定的局限性。另外,当体内血液中CTCs数量小于5000个(即每毫升血液中分布的CTCs小于1个),即使CTCs均匀分布,且体外检测技术的捕获效率高达100%,也难以从1 mL血液中捕获到CTCs^[46]。CTCs体外检测技术的捕获效率通常是捕获到的肿瘤细胞数目除以掺入固定体积(通常1~10 mL)血液中的肿瘤细胞数目。再者,从有限的血液中富集分离到的CTCs数目较少,且血液采集后的运送、保存、离心以及体外CTCs富集分离过程可能会产生细胞污染、丢失、失活和失真问题^[47]。

CTCs体内检测技术是基于生理状态下血管内快速流动肿瘤细胞发展的一种分析方法,其捕获效率通常是捕获到的肿瘤细胞数目除以被注射入体内循环流经全身血液(~5 L)的肿瘤细胞数目。因此,即使CTCs体内检测技术捕获效率低至0.02%,也有可能从体内检测到1个CTCs,灵敏度较高。此外,还具有以下优势:(1)能够在真实的生理条件下实时动态监测患者体内CTCs变化;(2)有效避免了临床样本采集、预处理、存取以及CTCs分离过程对细胞质量的影响;(3)体内循环流动的血液可以多次接触CTCs分选装置,增强细胞与功能化修饰部位的接触频率,利于提高检测的灵敏度和获得较多CTCs进行下游分析;(4)有望从机体的不同部位以及不同体液得到不同来源CTCs,进一步结合后续的分子水平分析可以全面、准确揭示肿瘤演变历程和机制。因此,发展高效且可靠的CTCs体内检测技术,实时监测CTCs随疾病发展、手术或者药物治疗等的动态变化必要且意义重大。

为此,本文系统地综述了CTCs体内检测技术及其应用的研究进展,并根据检测原理的不同将现已发展的技术分为五类,即基于光学成像技术的CTCs体内检测、基于活体流式细胞仪的CTCs计数分析、基于支架植入体的CTCs体内募集、基于静脉留置针装置的CTCs体内捕获和基于微流控芯片的CTCs检测。最后,总结并展望了这些技术应用于患者体内CTCs检测的发展趋势。

2 CTCs体内检测

2.1 基于光学成像技术的CTCs体内检测

临床上,常用的影像学技术有X射线断层成像(computed tomography,CT)、磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)、正电子发射计算机断层显像(positron emission tomography,PET)、光声层析成像(photoacoustic tomography,PAT)、光学相干层析成像(optical coherence tomography,OCT)等。其中,PAT和OCT等光学成像技术的分辨率(μm量级)高于CT、MRI、PET的分辨率(mm量级),且速度较快^{[48⇓⇓⇓⇓~53]},有望用于血管内快速流动细胞包括肿瘤细胞的实时成像。

在基于光学显微镜的CTCs体内成像方面,Chen等^[54]采用近红外光激发的多光子激光扫描显微镜(multiphoton laser scanning microscopy)实时监测了靠近老鼠耳垂部实体瘤血管中CTCs数量、流动速度以及轨迹的变化。为了区别于其他正常细胞,该工作将稳定表达红色和绿色荧光蛋白(RFP,GFP)的人胰腺癌细胞BxPC3注射入裸鼠(5周龄BALC/cx雄鼠)耳垂部,并在此形成实体瘤。另外,还将化学分子染料伊文思蓝(Evans blue)和异硫氰酸荧光素(FITC)标记的葡聚糖注射入老鼠尾静脉用作血管荧光造影剂。He和Wei等^[55]通过共聚焦显微镜线性扫描定量分析了GFP标记人肝细胞癌细胞HCCLM3和前列腺癌细胞PC-3注射入老鼠体内后以及随着肿瘤生长的数量变化。其中,GFP标记的HCCLM3通过尾静脉注射入BALC/c雄鼠(25 g)体内;GFP标记的PC3经皮下植入BALC/c雄鼠体内;亲脂性膜染料DiI经尾静脉注射用于血管染色。研究结果显示,在肿瘤发展的早期(皮下移植肿瘤后的第5天),通过共聚焦显微镜可以在老鼠耳部动脉血管(直径~40 μm)检测到CTCs,而且,依据检测到的靶细胞荧光信号轮廓可以区分单个CTC和CTC簇。

PAT结合了组织的光学吸收特性和超声波在软组织中的低散射性,突破了纯光学成像技术的成像深度限制,实现几个厘米深的高分辨成像。Wang等^[56,57]利用PAT成像和黑色素光吸收强的优势检测了注射入大鼠(12~13周龄RH-Foxn1^rnu∕Foxn1⁺雄性裸鼠)体内的黑色素瘤CTC簇,并应用于黑色素瘤患者体内CTCs检测。OCT是一种基于弱相干光干涉原理获得不同深度组织结构信息的光学成像技术。该技术测量的是样品的背向散射光,具有免标记、无创的特点。De la Zerda等^[58]利用可调制散斑噪音的OCT(speckle-modulating OCT,SM-OCT)成功地在裸鼠(6~8周龄Foxn 1^nu-/nu-雌鼠)耳部血管纵向横截面(平行于血流方向)检测到游离的RPMI-8226骨髓瘤细胞(图1)。该工作选用金纳米棒(~100×30 nm)作为造影剂,标记肿瘤细胞,增强靶细胞的对比度(contrast),首次将OCT技术应用于动物模型血液循环系统的单细胞检测。由此可见,高分辨率的光学成像技术可以拍摄到血管内纳米颗粒或者荧光分子标记的肿瘤细胞以及免标记的黑色素瘤细胞,但是这些技术的成像速度较慢(<100帧/s)^[59],难以准确地定量分析快速流动血液中CTCs动态变化。

2.2 活体流式细胞仪(in vivo flow cytometry,IVFC)

传统的体外流式细胞仪能够高效地分析、计数以单细胞液体流形式穿过激光束的单色或者多色荧光标记细胞(流动速度达到几个毫米每秒)^[60]。当每一个细胞流经激光束时,其携带的荧光标记物会被激光激活发射出荧光,而后通过检测器如光电倍增管(photomultiplier tube,PMT)将光学信号转变成放大的电信号,再经过模数转换器(A/D)将电信号转变为可以被计算机识别的0和1数字信号。最后,通过数据处理和分析,识别荧光标记细胞。与体外流式细胞仪不同之处是,IVFC直接以天然的血液循环系统为液体流动系统(血管和淋巴管为“鞘液管”),实时定量分析快速流动靶细胞的变化。根据靶细胞和其他细胞在光照射下产生的不同信号即对比度,如荧光、光热效应、光声信号、光散射强度等,IVFC分为活体荧光流式细胞仪、活体光热流式细胞仪、活体光声流式细胞仪等。目前,在CTCs检测应用最为广泛的是活体荧光流式细胞仪(fluorescence IVFC,IVFFC)和活体光声流式细胞仪(photoacoustic IVFC,IVPAFC)。

2.2.1 活体荧光流式细胞仪

2004年,Lin等首次开发了IVFFC用于体内循环游离细胞包括CTCs检测^[61,62]。在检测时,首先借助电荷耦合器件(charge coupled device,CCD)图像信息选定尺寸合适的血管,而后将通过显微镜物镜聚焦成一定宽度的激光狭缝垂直照射于选定血管一段时间,记录靶细胞穿过激光狭缝靶细胞产生的荧光信号。激光狭缝的长度需要与血管的直径匹配,保证所有流经选定血管的细胞都能被检测到。所得荧光信号峰的个数即代表细胞数量,而荧光信号峰的宽度代表荧光标记细胞流经激光狭缝的时间,因此,可以通过该时间宽度估算血流速和流量,即流速=(激光狭缝宽度+细胞直径)/荧光信号峰时间宽度;血流量=血管横截面面积×流速。

在实验中,Lin等^[62]设计将He-Ne连续激光通过显微镜聚焦成宽度约5 μm狭缝,垂直照射于老鼠耳部小动脉血管(直径约40 μm,离体表距离70~100 μm),测试了人雄激素依赖性前列腺癌细胞LNCaP和大鼠前列腺细胞MLL(GFP标记)通过尾静脉注射入老鼠体内血液循环系统中的消逝动力学。实验所用的老鼠是4~6周龄雄性SCID小鼠和6~8周龄哥本哈根雄性大鼠。研究发现,当注射荧光标记细胞量大于10³个,该方法能够稳定地从老鼠耳部检测到CTCs;从鼠尾静脉注射细胞后2~4 h,超过80%的细胞即消逝。另外,转移性较强的鼠源MLL细胞数量减少的速度明显快于人的LnCap细胞。基于该技术,Wei和Mosig等^[63]同样发现从尾静脉注射入老鼠体内的转移性较强PC-3细胞和HCCLM3细胞消逝速度较LNCap和HepG2(DiD标记)快。本工作所用老鼠是6~8周龄雄性BALB/cASlac裸鼠。进一步地,Wei等^[64]研究发现,巨噬细胞会加速注射入BALC/c裸鼠体内PC-3细胞的消逝。因此,CTCs消逝动力学与细胞本身的转移能力以及微环境如巨噬细胞有一定的关系。

与静脉注射肿瘤模型和皮下移植瘤模型相比,原位肿瘤模型(orthotopic tumor model)为肿瘤生长提供了适宜的局部微环境,能较好地模拟体内肿瘤发生、发展、侵袭和自发性转移全过程。基于此,Wei和Zhou等^[65]利用IVFFC监测了原位肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)动物模型中GFP标记HCCLM3在血液循环系统中的动态变化。研究结果显示,原位肿瘤模型中CTCs数量变化和肿瘤的大小呈正相关,而皮下肿瘤模型中CTCs数量变化和肿瘤大小无相关性,因此,与皮下肿瘤模型相比,原位肿瘤模型更能真实反映血行转移状况。另外,肝切除手术能够抑制肿瘤细胞血行转移,CTCs数目明显减少。在药物治疗方面,Zhou和Wei等^[66]基于IVFFC和原位肝细胞癌动物模型发现了CTCs数量和疾病的发展、多激酶抑制剂索拉非尼(sorafenib)药物治疗疗效密切相关;Gu和Wei等^[67]基于IVFFC和原位前列腺癌动物模型发现经雄激素阻断治疗(androgen deprivation therapy,ADT)后,CTCs数量明显减少。高强度聚焦超声(high-intensity focused ultrasound,HIFU)治疗是一种将高能超声聚焦于病变组织,利用其产生的热效应杀伤组织的无创肿瘤治疗技术。同样地,Jiang和Wei等^[68]基于IVFFC研究了胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)经HIFU治疗后体内CTCs变化。结果显示,HIFU消融局部病变组织在很大程度上限制了PDAC的血行转移。

CTCs在循环系统以单个细胞和细胞簇形式存在。研究表明,CTC簇的转移能力比单个CTC高23~50倍^[69]。Maheswara和Haber等^[69]使用IVFFC分析了通过尾静脉注射的DiD标记单个CTC和CTC簇在免疫缺陷老鼠循环系统的清除速率(clearance rate)。结果显示,CTC簇的半衰期是6~10 min,单个CTC的半衰期是25~30 min。由于CTC簇的尺寸较大,所以CTC簇流经小尺寸毛细血管时易被困住,在循环系统的半衰期较短^[70,71]。进一步地,Wei等^[72]基于IVFFC发现,在肿瘤转移发展过程中,单个CTC和CTC簇的含量均增加,而且,CTC簇所占比例也随之升高,高达30%,而基于体外微流控芯片和免疫磁性技术分离CTCs所得CTC簇所占比例小于9%^[69,73]。

从实体瘤部位脱落进入循环系统的大部分肿瘤细胞很快死亡,仅有不足0.00004%的CTCs引起肿瘤转移^[74]。研究发现,凋亡的CTCs和预后也有一定的相关性,体外采集外周血中凋亡CTCs数量越多,预后越好^[75]。Lin等^[76]采用Alexa Fluor 647标记的Annexin V特异性结合早期凋亡细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸,实现了血液循环系统中凋亡肿瘤细胞实时监测。进一步地,Nolan等^[77]采用双色荧光IVFC同时监测活的和早期凋亡乳腺癌细胞MDA-MB 231。该工作采用橙色藻红蛋白(R-Phycoerythrin,RPE)结合的Annexin V特异性标记早期凋亡细胞,以区别于GFP标记的活细胞。

综上可见,IVFFC已广泛用于实时监测肿瘤动物模型血液循环系统荧光标记CTCs包括单个CTC、CTC簇和凋亡CTCs动态变化。使用的肿瘤模型有:尾静脉注射肿瘤模型、皮下移植肿瘤模型和原位移植肿瘤模型。IVFFC的检测部位主要集中于老鼠耳部离体表30~100 μm的静脉和微动脉血管(直径为30~50 μm),血流速度3~7 mm/s^[60],检测的血量较少(0.1~1 μL/min)即通量低。当血液中CTCs含量低于1000个/mL,仪器需要采集很长时间,才能够检测到靶细胞^[47]。为此,Niedre等^[78]将荧光宏观成像系统和自动化的计算机视觉算法结合,发展了一种计算机视觉IVFC(computer vision IVFC,CV-IVFC)用于Vybrant-DiD标记多发性骨髓瘤细胞的检测,灵敏度达到20个CTCs/mL。CV-IVFC在老鼠耳部的成像面积约5×5 mm²,检测通量达到10 μL/min。另外,他们还发展了一种漫射荧光IVFC(diffuse fluorescence IVFC),检测通量高达几百微升/min^{[79⇓⇓~82]}。

由于生物组织的密度分布不均,因此生物组织是光高散射介质。当光照射生物组织时,大部分会产生散射,一部分会被吸收,可以穿透的深度非常有限。在近红外区域(700~1100 nm),大多数生物组织的光吸收相对较低,近红外光可以较好地穿透组织^[83]。Shi和Wei等^[84]将IVFFC扩展到近红外区域用于循环游离细胞的检测。目前,IVFFC已能够检测从可见光到近红外波段的荧光团,且拥有体外流式细胞仪所具有的所有通道^[59]。基于多色IVFFC可以同时检测不同荧光标记的单个细胞或者细胞簇如血小板-CTCs复合体^[85]。另外,Wei等^[86]使用光学清除剂ESOCA(PEG-400、果糖和硫脲的混合物)降低光散射,改善光在组织中的穿透深度,增强IVFFC的光学成像深度。与常用的甘油浸泡液相比,ESOCA处理后IVFFC的检测深度提高了32%。

2.2.2 活体光声流式细胞仪

美国Arkansas大学Zharov等^[46,60,87]最早发展了IVPAFC,并论证了该技术在单颗粒、病原体、循环细胞等检测领域的可行性和可靠性。与IVFFC检测CTCs相比,IVPAFC采用高频脉冲激光照射选定血管某处,通过放置于组织表面的超声探测器检测靶细胞流经此处产生的瞬时超声波信号,检测深度较深。当激光照射时,靶细胞会吸收光能转换为热能,引起局部温度升高,造成组织热致弹性改变,产生超声波即光声信号。为使快速流动的CTCs产生光声信号,脉冲激光的频率f≥V_F/d(V_F是血流速度,d是激光斑的宽度),脉冲宽度t≤2R/c_s(R是靶细胞半径,c_s是声速度)^[60]。人静脉血管(1~2 mm)的血流速度是5~15 cm/s,因此,使用50~100 μm光斑照射血管获取流动细胞的超声信号则脉冲频率f≥0.5~3 kHz。

生物组织中,光的吸收主要源于血红蛋白、胆红素和黑色素等发色团^[83]。在近红外区域,黑色素瘤细胞的内在对比剂黑色素在激光照射下产生明显强于血液背景的光声信号,因此,IVPAFC检测黑色素瘤CTCs具有明显优势,无需额外标记。2009年,Zharov等^[88]采用高重复率脉冲二极管激光(905 nm,10 kHz)集成的IVPAFC实现了对体内黑色素瘤CTCs检测。其中,黑色素瘤细胞B16F10通过尾静脉注射入老鼠体内。同年,Zharov等^[89]采用配体功能化修饰的Fe₂O₃磁性纳米颗粒和金碳纳米管(gold-plated carbon nanotube)特异性标记乳腺癌细胞MDA-MB-231,使其在不同波长脉冲激光照射下产生区别于背景的特征光声信号,实现对靶细胞的特异性检测。采用不同的配体修饰纳米颗粒,可以实现对不同种类靶细胞的检测。Galanzha等^[90]基于同样策略,实现了对表达CD44乳腺癌干细胞的检测。

在肿瘤转移的最初阶段,从实体瘤脱落的肿瘤细胞除了进入血管,还有可能先扩散至淋巴管内,而后流入血液循环系统。和血管相比,淋巴管的结构较小,且其内流动的淋巴(液)无色透明,需要使用对比剂增强淋巴系统,显示淋巴管;另外,每次采集的淋巴液只有几微升,需要长时间的插管收集,因此基于体外检测方法分析淋巴中CTCs有很大局限性^[60]。然而,使用IVPAFC检测CTCs时,无色淋巴产生PA信号背景较低,具有明显优势。Galanzha等^[91]基于IVPAFC在老鼠耳部黑色素瘤模型的淋巴管和淋巴结中检测到CTCs(伊文思蓝染料作为对比剂,显示淋巴管和淋巴结)。另外,该工作还用叶酸修饰的金碳纳米管特异性结合MDA-MB-231细胞(FITC标记),并将其直接注射入淋巴结中,结合荧光显微镜成像结果,验证了基于IVPAFC检测无内在对比剂CTCs转移的可行性。进一步地,Galanzha等使用IVPAFC检测了乳腺癌细胞转移至脑脊液^[92]和骨组织中的CTCs^[93]。

此外,Zharov等^[94] 将IVFFC和IVPAFC联合使用,研究了触诊、组织活检、激光手术等医疗操作是否会引起肿瘤细胞从实体瘤部位脱落进入血液循环系统。结果显示,压力、触诊、活检、激光处理能够在短时间内增强CTCs释放,血液中CTCs数量明显增多,而完全手术切除,血液中CTCs数量明显减少。以上研究均是基于肿瘤动物模型的CTCs检测,近期,Zharov等^[95]将一种cytophone设备应用于黑色素瘤患者CTCs检测(图2a)。该设备采用波长1060 nm的脉冲激光穿过人手皮肤1~1.5 mm(深度)照射直径1.1~2.8 mm静脉血管,能够从黑色素患者1 L血液中检测出1个CTC,灵敏度远高于CellSearch 系统(1个CTC/7.5 mL)和其他CTCs体外检测方法(1~10个CTCs/mL)。此外,该设备还可以区分单个CTC、CTC簇、血凝块(circulating blood clots,CBC)和 CTC-CBC 栓子(emboli)产生的特征光声信号,即单个CTC:高于基线的单峰,峰宽0.5~1.5 ms;CTC簇:高于基线的多峰,峰宽3~5 ms;CBC:低于基线单峰,峰宽20~50 ms;CTC-CBC:组合峰(高于和低于基线峰并存),其中,检测区域内红细胞血红蛋白吸收光产生的光声信号作为基线(图2b)。当将激光能量调高至240 μJ安全能量水平照射患者胳膊肘静脉1 h,CTCs数目明显减少。之前的研究表明,在高能量的激光持续照射下,黑色素瘤细胞内的黑色素聚集体过量吸收光能,会导致局部过热,产生纳米气泡破坏CTCs^[96]。因此,IVPAFC不仅可以实时、在体检测黑色素瘤CTCs,还能杀死黑色素瘤细胞,具备治疗作用。

2.3 基于支架植入体(scaffold implants)的CTCs体内募集

基于植入体的CTCs体内捕获技术主要是采用生物材料支架模拟肿瘤细胞转移至目标器官的微环境或调控局部微环境,诱导肿瘤细胞迁移至支架内。2007年,Rsenblatt等^[97]构建了一种负载骨形成蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)和人骨髓基质细胞(human bone marrow stromal cells,BMSCs)的丝素蛋白支架材料,发现其可以作为SUM1315乳腺癌细胞于老鼠体内转移的靶位点。2012年,Parekkadan等^[98]制备了一种多孔的I型胶原功能化聚丙烯酰胺水凝胶支架,发现该支架负载BMSCs同样能够募集造血干细胞和白血病细胞。2015年,Shea等^[99]将微孔聚丙交酯乙交酯共聚物(polylactide-co-glycolide, PLG)支架(直径5 mm,高度2 mm)植入老鼠体内,发现PLG支架自身能够调控局部免疫微环境,募集、捕获转移的肿瘤细胞,降低实体器官的肿瘤负荷(tumor burden)。这些工作所使用的生物材料均具有良好的生物相容性,可以制作为组织工程支架和药物缓释载体等,广泛应用于生物医学领域。其中,PLG是一种FDA批准的生物材料。对于有复发风险的患者而言,初级治疗后植入以上支架有可能在早期发现肿瘤转移,有望在疾病负担较低的情况下开始治疗干预。

2.4 基于静脉留置针装置的CTCs体内捕获

静脉留置针在临床上广泛应用,可以减轻患者因反复静脉穿刺带来的痛苦,其核心组成部件包括可以留置在血管内的柔软导管和不锈钢材质的穿刺引导针芯。因此,可以将枕芯尖端的表面功能化修饰特异性识别CTCs亲和性配体如抗体、适配体,或者将枕芯替换为其他生物相容好的线型材料等通过置留在血管内的导管插入血管,捕获CTCs。

2012年,德国Lücke等^[100]报道了一种结构化、FDA批准的(510k)不锈钢医用导丝(Seldinger guidewire,直径0.5 mm,长16 cm)用于体内分离乳腺癌和非小细胞肺癌CTCs(图3a)。导丝功能化修饰的步骤是:(1)将导丝的前端(2 cm)电镀2 $\mu m$m厚金层;(2)在金表面修饰一层线型聚羧酸盐水凝胶;(3)采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化水凝胶中的羧基,通过羧基和氨基反应,共价连接抗体。随后,将功能化的导丝经留置针(20G)的导管缓慢推入肘部静脉血管(血流量约20 mL/min),停留30 min,捕获CTCs。最后,取出导丝,经洗涤、固定、封闭、免疫染色后,于显微镜下观察并计数CTCs(采用呈蓝色荧光的4',6-二脒基-2-苯基吲哚即DAPI染料染细胞核鉴定细胞)。细胞呈现EpCAM 或者角蛋白(cytokeratin,CK)4、5、8、9、18阳性,且尺寸在10~50 μm之间,具有高细胞核质比的细胞认定为CTCs,而呈现CD45阳性的细胞则为白细胞。同年,该技术即GILUPI CellCollector®获得CE(European Conformity)认证,是第一个也唯一在售的体内捕获CTCs技术,已应用于肺癌^{[100⇓⇓~103]}、前列腺癌^[104⇓~106]、神经内分泌肿瘤^[102]、乳腺癌^[107]、结直肠癌^[108]的CTCs检测包括计数、基因突变、基因表达分析等,取得了大量的临床研究数据。

2014年,Liu和Zhang等^[109]采用anti-EpCAM抗体修饰的尼龙丝(长10 cm)介入装置用于裸鼠肿瘤模型CTCs体内捕获。抗体修饰尼龙线与血液接触的工作长度~10 mm。该工作仅表明了该装置的CTCs捕获潜力,但尚未准确定量CTCs捕获效率。此外,该装置在捕获CTCs之前,首先要解剖小鼠的后腔,具有创伤性。进一步地,Tang等^[110]发展了一种基于输液型静脉留置针的CTCs体内捕获技术(图3b)。在该工作中,他们将留置针的表面涂覆聚二甲基硅氧烷(PDMS),而后通过非特异性吸附作用修饰anti-EpCAM抗体。如此,改进的留置针可以实现在对患者输液的同时捕获CTCs,避免了额外穿刺带来的伤痛,也易于被患者接受。在实验中,抗体修饰的留置针在兔子耳朵静脉血管和老鼠尾静脉血管停留3 h(实验前,将DAPI染色的MCF-7乳腺癌细胞注射入兔子耳部静脉和老鼠尾静脉),与血液接触的工作长度~1.7 cm。最后,将捕获的细胞从留置针上洗脱下来,经免疫染色鉴定CTCs,计算捕获效率。该体系从兔子耳部静脉捕获CTCs效率是1.9%~11%;从野生型小鼠尾静脉捕获CTCs是0.9%~15%;从免疫缺陷裸鼠尾静脉捕获CTCs效率是9.3%~33%。另外,该体系能够在皮下接种鼠乳腺癌细胞4T1的第七天即检测到CTCs,而原位实体瘤的尺寸小于2 cm且未见转移。随着肿瘤的发展,捕获CTCs数量增多。这些结果表明该体系能够在肿瘤发展的早期阶段检测CTCs,有望用于肿瘤早期诊断。

在此基础上,Zhang和Wang等^[111]采用anti-EpCAM和anti-EGFR两种抗体修饰的留置针以及多色荧光标记的适配体捕获并鉴定乳腺癌和肝细胞癌CTCs。多种抗体的联合使用,有效地提高了CTCs捕获效率。肝细胞癌CTCs捕获效率从3.17%提高至26.67%;乳腺癌CTCs捕获效率从27%提高至29.84%。最近,Huang和Xie等^[112]将anti-EpCAM修饰的三维多孔PDMS支架(微孔的大小为40~250 μm)嵌入留置针管内用于大鼠CTCs体内捕获(图3c)。鉴于贯通的多孔支架具有较大比表面积,可以负载较多的抗体,且能够有效增强细胞和支架的接触频率,因此PDMS支架嵌入的留置针细胞捕获性能较好,优于GILUPI CellCollector。另外,用胰酶将捕获的细胞从支架上释放下来,收集并提取其DNA,通过PCR可以分析、鉴定出肿瘤细胞H1975细胞EGFR基因EGFR的T790M和L858R突变。

此外,Gambhir等^[113]制备了一种由60个圆柱形钕磁铁组成的磁线(长6 cm,直径0.75 mm),并通过静脉导管将其插入血管内捕获、富集超顺磁性氧化铁颗粒(直径1 μm)标记的肿瘤细胞。Anti-EpCAM抗体修饰的颗粒被提前注射入血管内,标记靶细胞。富集细胞后,将磁线取出,去除磁铁后可将捕获的细胞释放,进行后续的分子分析等。将磁线置入猪耳朵附近静脉(血流量约20 mL/min)捕获磁性颗粒标记的非小细胞肺癌细胞H1650,捕获效率达到1%~8%,捕获CTCs数量是体外检测方法(采血量5 mL)的10~80倍,是GILUPI CellCollector(0.0016±0.0003%)的500~5000倍。

总体来说,基于静脉留置针装置的CTCs体内捕获技术直接接触静脉血管中流动的血液捕获CTCs,通量较高。不过,这些方法依赖于抗体,会造成不表达抗体对应抗原CTCs漏检。另外,捕获于不锈钢丝或者留置针上的CTCs,不便直接在显微镜下观察细胞的形貌等,需要洗脱下来,这一操作可能会损伤细胞,甚至丢失细胞。

2.5 基于微流控芯片的CTCs体内检测

2019年,Hamza等^[114]发展了一种光流系统(optofluic system)检测小鼠体内荧光标记的CTCs。该系统主要由分选CTCs的PDMS微流控芯片、荧光检测器和计算机控制的气动阀组成。在实验中,通过蠕动泵抽取来自植入小鼠左颈动脉导管中的血(30 μL/min),而后流入CTC分选芯片。当荧光标记的细胞流经激光照射的2个位点,则产生荧光脉冲,被PMT检测到。然后,根据产生两个脉冲的时间差,程序会计算细胞的流动速度,并操作气动阀将荧光标记CTCs引流入收集管,用于后续的分析。最后,去除CTCs后的血液经另外一根植入的导管流回小鼠的右颈静脉。同样基于体外循环,Zhang等^[115]用泵将小鼠体内血液引流经抗EpCAM抗体修饰磁性纳米颗粒集成的微流控芯片,特异性富集分离CTCs(图4)。由此可见,通过蠕动泵将体内血液引流至现已发展的CTCs体外富集方法如微流控芯片可以实现CTCs检测。不过,在动静脉置入导管具有一定的创伤性,且必须考虑使用材料的生物毒性、保持CTCs分选装置无菌等。

3 结论与展望

CTCs作为肿瘤转移的“前体种子”,有望成为标志物用于肿瘤的诊断和治疗监测。为实现此目的,发展实时、准确监测体内CTCs动态变化的分析技术至关重要。CTCs体内检测技术立足于体内循环系统快速流动的血液,甚至是淋巴、脑脊液等体液,可以在真实的生理状态下于机体的不同部位实时记录CTCs数目的动态变化、募集以及捕获肿瘤细胞。目前,CTCs体内检测技术主要用的动物模型是老鼠肿瘤模型包括静脉注射肿瘤、皮下移植瘤、原位肿瘤。体内CTCs定量分析方法主要有两种,一种是基于光学的IVFCs自动记录靶标细胞产生的荧光信号、光声信号等对CTCs计数。另一种是先捕获CTCs,而后经染色标记肿瘤细胞,于显微镜下观察、并计算细胞数目。其中,商业化的CellCollector最具代表性。为了提升CTCs捕获的灵敏度,可以增大基质的比表面积如使用三维支架,增多抗体等亲和性配体修饰的负载量。由于体内血管尺寸有限,因此还可以将体内血液引流至体外,结合高效的体外富集方法捕获CTCs。

不过,CTCs检测除了关注CTCs数目随肿瘤发展的动态变化,还期望从CTCs获取肿瘤相关表型、基因组、转录组、蛋白组、代谢组等生物学信息。因此,要求发展的技术能够分离到完整、活力高、纯度高的高质量CTCs。为此,发展的CTCs体外检测技术已附加温和、特异性释放捕获的CTCs的功能;也可以构建特异性富集、去除正常血细胞的负选方法获取CTCs;和/或集成可以直接将富集的CTCs进行原位培养、分析的模块等。现已发展的CTCs体内捕获技术,虽然有效保证了捕获前和捕获过程中CTCs质量,但离体后对其进行下游分析同样面临细胞失活、失真等问题,需要整合新的功能于捕获装置,便于CTCs从体内捕获基质表面释放下来,进而满足后续CTCs培养和分子分析等的要求。此外,还可以发展诊疗一体化的CTCs检测系统,实现在体内捕获并杀死肿瘤细胞,或者募集转移的肿瘤细胞,降低肿瘤负荷,益于治疗干预,如基于支架植入体的CTCs体内募集技术。

由于CTCs体内检测技术直接应用于活体,因此置于体内的肿瘤细胞检测元件、用于靶细胞标记的外源性对比剂(如荧光染料、纳米颗粒、抗体探针)等必须安全、无菌、无毒、生物相容性很好,不会对机体产生危害。另外,发展的测试装置应快速、操作简单、多功能,适宜临床转化应用。我们相信随着多学科研究人员的不懈努力以及更多技术的发展、交叉融合,CTCs体内检测技术能够取得新的突破,并和CTCs体外检测技术相辅相成,共同促进我们对肿瘤转移机制的深入认识,进而战胜癌症。

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