新型冠状病毒(COVID-19)的检测和诊断

黄炎; 刘国东; 张学记

doi:10.7536/PC200522

化学进展 ›› 2020, Vol. 32 ›› Issue (9) :1241-1251 DOI: 10.7536/PC200522

综述

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新型冠状病毒(COVID-19)的检测和诊断

黄炎 ¹ ,
刘国东 ²^,^** ,
张学记 ³^,^**

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Detection and Diagnosis of COVID-19

Yan Huang ¹ ,
Guodong Liu ²^,^** ,
Xueji Zhang ³^,^**

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摘要

2019年12月以来席卷全球的新型冠状病毒(COVID-19)肺炎是一种高传染性疾病,给全球社会、经济和生活带来了巨大的负面影响,严重威胁人类的生命安全。由于尚无用于COVID-19的特定药物或疫苗,快速及时的检测和诊断对于控制疫情至关重要。本文介绍了目前检测COVID-19的方法,主要比较了CT检测、核酸检测和抗体检测在检测COVID-19中各自发挥的作用,总结了各种方法的优势和不足之处,综述了各种方法的最新研究进展。病毒分离是检测病毒感染的黄金标准,但是要求严格的条件,这些条件多数实验室和医院无法满足。CT检查可以直接看到症状,但是存在特异性低的局限;核酸检测能提供直接的证据,是当前检测新型冠状病毒的主要方法,但是存在假阳性;抗体检测能提供非直接的证据,适于进行筛查工作,但是其无法用于感染的早期诊断且可能得到假阳性或假阴性结果。本文提出了联合使用和综合判读可以从技术和时间差上互补,并对未来的发展趋势和研究重点进行了展望。

Abstract

The novel coronavirus disease(COVID-19) is a highly contagious pneumonia that has swept the world since December 2019. It has a huge negative impact on the global society, economy and life, which also seriously threatens people’s lives. Since there are no specific drugs or vaccines against COVID-19, rapid and timely detection and diagnosis are essential for controlling the epidemic. This article reviews the current detection methods for COVID-19. It mainly compares the function of computed tomography-based, nucleic acid-based and antibody-based methods for the detection of COVID-19, summarizes the advantages and weaknesses, and reviews recent research progress. Virus isolation is the gold standard for detecting viral infections but requires strict conditions that most laboratories and hospitals cannot reach; CT examination allow us directly see the symptoms but with a limitation of low specificity; nucleic acid testing provides direct evidence and is currently the main method for COVID-19 but have a false-negative rate; antibody testing is indirect evidence and adapt to carry out screening work, but it cannot be used in the early stage of infection and may get false-positive and false-negative results. Joint use and comprehensive interpretation are proposed to be complementary in terms of technology and time difference, which will play an important role in identifying patients, monitoring disease progress and investigating epidemiology. The future development, research priorities and challenges are addressed.

Contents

1 Introduction

2 Virus isolation and sequencing

3 Computed tomography

4 Nucleic acid detection

5 Antibody detection

6 Conclusion and outlook

Graphical abstract

关键词

新型冠状病毒 / 病毒分离测序 / CT检测 / 核酸检测 / 抗体检测

Key words

novel coronavirus disease(COVID-19) / virus isolation and sequencing / computed tomography examination / nucleic acid detection / antibody detection

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黄炎, 刘国东, 张学记. 新型冠状病毒(COVID-19)的检测和诊断[J]. 化学进展, 2020, 32(9): 1241-1251 DOI:10.7536/PC200522

Yan Huang, Guodong Liu, Xueji Zhang. Detection and Diagnosis of COVID-19[J]. Progress in Chemistry, 2020, 32(9): 1241-1251 DOI:10.7536/PC200522

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1 引言

2019年12月开始席卷全球的新型冠状病毒(COVID-19)传染病是一种由严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(SARS-CoV-2或2019-nCoV)引起的,其传播度和致病性高^[1~3]。截至2020年9月14日,该病已蔓延到200多个国家,国内累计确诊病例90 696人,国外累计确诊病例29 098 163人,并导致全球至少920 000人死亡。但这些数字是被低估的,因为并非所有患者都接受了检查,尤其是那些无症状或仅有轻度症状且无并发症的患者^[4,5]。SARS-CoV-2属于β属冠状病毒,为可感染人类的冠状病毒的第七个成员,其颗粒具有多形性,略呈球形,直径为80~220 nm,具有囊膜和12~24 nm的棒状刺突(图1),刺突顶端膨大呈球状,排列呈皇冠状,故而称“冠状”病毒。病毒外表面上的棒状刺突——糖蛋白刺突,使病毒可以附着和进入宿主细胞^[6,7]。

冠状病毒的天然宿主和载体是蝙蝠,但其已经越过物种壁垒感染人类和许多其他种类的动物,包括禽类、啮齿动物和手翅类动物^[8,9],有一种假设是第一次传播是在蝙蝠和尚未确定的中间宿主动物之间发生^[10]。SARS-CoV-2可以在人与人之间传播,但病毒溯源问题仍有待研究和确认^[11~13]。

SARS-CoV-2的传播速率高于SARS-CoV,其原因可能是SARS-CoV-2的RBD区S蛋白发生基因重组增强了其传播能力^[14,15]。据估计,SARS-CoV-2感染者将感染大约三个新人(平均繁殖数达到3.28)^[16]。不同患者的症状不同,有些患者保持无症状,而另一些患者则出现发烧、咳嗽、疲劳和许多其他症状,症状更严重的患者出现严重的急性呼吸综合症,产生急性肺损伤(ALI)和急性呼吸窘迫综合症(ARDS),导致肺衰竭并最终死亡^[6]。SARS-CoV-2最可能的传播方式被认为是直接接触和液滴传播^[17,18]。一项有关SARS-CoV-2的气溶胶和表面稳定性的最新研究表明,该病毒可存在于气溶胶中(<5 μm)至少3 h,并且在塑料和不锈钢上比在铜和纸板上更稳定^[19]。

COVID-19的传播蔓延和触目惊心的感染死亡数据使全世界开始寻求有效的防控和治疗方法^[20]。目前尚无用于COVID-19的商业疫苗^[21],因此防控在面对COVID-19显得尤为重要,防控的前提是有效的检测诊断方法,快速准确地诊断COVID-19对于预防其传播和暴发非常重要。在这篇综述中,我们将综述COVID-19目前的检测和诊断方法。

2 病毒分离测序

COVID-19患者表达的症状是非特异性的,不能用于准确的诊断。据报道,来自中国的1 099名COVID-19患者中有44%入院时发烧,89%在住院时发烧,68%出现咳嗽,38%表现出疲劳,34%有痰液和19%出现呼吸急促。其中许多症状可能与其他呼吸道感染有关^[23]。

根据世界卫生组织(WHO)与中国的联合报告,从2019年12月底至2020年2月中旬,研究者已分离了104株SARS-CoV-2病毒,并使用了Illumina和Oxford Nanopore测序^[24,25]。Illumina测序是一种使用固相桥扩增的逐个序列合成方法,而Nanopore纳米测序涉及将DNA分子穿过蛋白质孔移位并测量随后的电压变化以确定DNA序列^[26]。其中SARS-CoV-2的第一个基因组序列是使用宏基因组RNA测序进行的,这是对多个基因组进行测序的无偏和高通量方法^[27,28]。SARS-CoV-2的蛋白质组组成也已确定,但宿主对病毒的反应仍在研究中^[29]。基因组数据对于研究人员设计引物并探测聚合酶链反应(PCR)和其他核酸测试的序列非常重要,蛋白组数据是开发基于免疫反应的抗体检测传感器的基础。

病毒分离是检测病毒感染的“金标准”,将毒株从含有病毒的样本中分离,然后在实验室条件下培养出来,一般有组织细胞培养法、动物接种和鸡胚接种三种方式,其中组织培养是最常用的病毒分离培养方法^[30,31]。但是,病毒分离需要有资质、高洁净度、无污染的实验室和高度专业的研究技术人员^[32,33]。培养新型冠状病毒的资质至少要有三级生物安全实验室,除了很少数拥有多年病毒分离经历的研究院,绝大多数实验室和医院是做不到的。因此,虽然病毒分离是COVID-19确诊的检测手段,但是病原微生物对实验室人员威胁大,分离时间长、条件难、要求高,不适用于医院或其他体检中心的大规模检测。

3 CT检测

确认COVID-19的参考标准依赖于微生物检测,例如病毒分离、实时聚合酶链反应(RT-PCR)或测序^[34],但这些测试在紧急情况下可能不适用;且当病毒载量不足时,RT-PCR可能会出现假阴性,而胸部计算机断层扫描(CT)会发现异常^[35,36]。基于1014名患者的研究报告表明,胸部CT诊断COVID-19的灵敏性为97%,而初始RT-PCR阴性与阳性之间的平均时间间隔约为5 d^[36]。因此,CT可以在COVID-19肺炎的早期发现和治疗中发挥关键作用,例如对症状超过3 d的患者^[37]。但是,56%患者在症状发作后的前两天内的影像学检查具有正常的CT表现^[38]。心血管计算机断层扫描协会(SCCT)对COVID-19流行中CT使用提供了指南,以期降低技术人员、成像人员和研究人员在COVID-19疫情中被传播的风险^[39]。

由于缺少试剂盒和RT-PCR的假阴性率,而CT检查能直接看到发病症状,湖北曾将CT扫描用作COVID-19的临床诊断方法^[40]。胸部CT扫描是非侵入性的,需要在不同角度进行多次X射线测量来产生病人胸部的横断面图像^[41,42]。放射科医生进行图像分析,寻找可能的异常特征得到诊断结果^[41]。COVID-19肺炎的主要CT特征是通常在肺周边和胸膜下存在毛玻璃样混浊(GGO)^[43]。其特征会随着时间而变化,根据肺部感染的阶段和严重程度会出现不同的表现^[44]。Pan等^[45]从COVID-19中恢复的患者中按时间调查肺部变化的研究表明,肺部受累增加到症状发作后约10 d后逐渐降低。Bernheim等^[38]在疾病的早期阶段(0~2 d)发现CT正常的频率高(56%),最大的肺部感染在症状发作后约10 d达到峰值^[45]。Pan等也发现在症状发作后0~4 d,毛玻璃片混浊最为明显。随着COVID-19的发展,除了毛玻璃不透明之外,还出现了疯狂的铺路图案(即不规则形状的铺路石图案),随后是肺部合并增加^{[38, 45]}。Wang等^[43]评估了纵向变化,并确认单独的磨砂玻璃样混浊在症状发作后最常见,而磨砂玻璃样混浊与不规则线性不透明样混浊的混合模式在患病第6~11 d达到峰值。Salehi等^[46]对不同CT异常的发生频率作了统计,观察到GGO的患者为88.0%,GGO合并为31.8%,肺部双侧受累为87.5%,GGO周围分布为76.0%。Sun等^[47]对98例确诊的四个年龄段(<18岁、18~44岁、45~59岁、≥60岁)的COVID-19感染患者的高分辨CT进行了比较,45~59岁且≥60岁的患者比18岁以下的患者有更多的双侧肺、肺叶和肺野受累,并且病变数目更大。与年龄小于18岁和18~44岁的患者相比,年龄在45~59岁且≥60岁的患者中,伴有小叶间隔增厚或疯狂铺路、巩固和气管支气管征的GGO更为常见。说明COVID-19患者的胸部高分辨率CT表现与患者年龄有关,年轻患者的HRCT体征可能较轻。一些基于影像学的研究表明,与RT-PCR相比,CT扫描具有更高的灵敏性(88%~98%)和更低的假阴性率^{[35,36, 48]}。

使用CT进行COVID-19的主要局限性是特异性低(25%),将COVID-19与其他肺炎区分开来困难,尽管有报道称COVID-19肺炎的CT异常多表现为周围占优势,而胸膜积液和淋巴结病的发生率较低,但其成像特征与其他病毒性肺炎重叠^{[36, 49]}。Hong等^[50]最新报道的130名疑似患者中,阳性患者中双侧肺病变和GGO的组合特征、胸膜分布病变和GGO的组合特征等组合影像学特征的平均特异性约为90%,可用于COVID-19的鉴别诊断,区分其他传染性肺部疾病,提醒临床医生隔离患者以进行迅速治疗,并重复RT-PCR测试(图2)。

4 核酸检测

目前唯一能够在症状发作后的最初几个小时内检测感染的方法是基于分子生物学的核酸扩增技术。具体来说,人体在感染病毒后第3~5 d开始对数增加,可达到10⁴~10⁶ copies·μL^-1。核酸扩增技术的检测阈值为1~10 copies·μL^-1,因此在此期间可以发现病毒存在,从而能更早地在临床样本中发现病毒^[51]。核酸扩增技术检测方法通常包括聚合酶链反应(PCR)^[52]、逆转录PCR(RT-PCR)^{[34, 53]}、DNA微阵列检测^[54,55]和二代测序^[56,57]等,这些技术通常具有较高的灵敏度和特异性。

核酸检测是目前诊断COVID-19的主要方法^{[3, 24]},可为诊断提供直接证据^{[6, 29]}。SARS-CoV-2为正链单股RNA病毒,基因组约为30 kb,两端为非编码区,中间为非结构蛋白编码区和结构蛋白编码区^{[10, 58]},与严重急性呼吸道综合症病毒(SARS-CoV),中东呼吸综合症病毒(MERS-CoV)和蝙蝠的基因组有~80%,~50%和~96%的相似性^{[10, 25]}。SARS-CoV-2核酸检测主要针对两个基因位点,其中一个是针对开放阅读框的ORF1ab区的RdRP基因,另一个是结构蛋白编码区的N基因,而E基因用得比较少^[58]。最近一项研究报道了SARS-CoV-2有感染性的cDNA的反向遗传克隆策略^[59],另一项研究报道了基于酵母的合成基因组学平台可以直接使用酵母快速生产出大量有活性的SARS-CoV-2^[60],都突破了病毒来源的限制,能够快速(一周)、批量的生产或重组活性病毒用于疾病诊断的研究。

SARS-CoV-2病原体的传染途径和致病力尚未完全明确,在核酸检测过程中存在感染风险,再加上SARS-CoV-2基因结构与一般RNA差别较大,中华医学会检验医学分会中提出了SARS-CoV-2核酸检测的检验流程、检验质量和生物安全的指南^[61]。RT-PCR是使用呼吸道样本诊断COVID-19的最主要方法,中国国家药品监督管理局(NMPA)批准了15种基于核酸的检测试剂盒来检测SARS-CoV-2^{[62, 63]}。设计过程通常包括两个主要步骤:1)序列比对和引物设计;2)分析优化和测试。Corman等^[64]比对并分析了许多SARS相关病毒基因组序列,设计了一组引物和探针,该设计为双靶系统,其中一个引物可通用检测包括SARS-CoV-2在内的多种冠状病毒,而第二个引物组仅可检测SARS-CoV-2。测定条件包括试剂条件、孵育时间和温度,在PCR测试前需要优化。逆转录PCR分为一步法和两步法。一步法中,反转录和PCR扩增被整合为一个反应,可以快速、可重复、高通量的分析结果。挑战在于逆转录和扩增步骤同时发生,难以优化,导致靶标扩增子生成量降低。在两步法中,反应是在单独的试管中顺序进行的^[65],比起一步法需要优化其他参数,检测更耗时,但灵敏度更高^[65,66]。

标本采集优选顺序为鼻咽拭子、口咽拭子、痰液,为提高阳性率,可同时采集1份鼻咽拭子和1份口咽拭子于同一标本采集管中;为观察疗效和控制传染源,可对确诊患者的粪便和血液进行检测。此外,标本样本还包括肺泡灌洗液痰^[61]。

中国科学家在2020年3月份总结出来的规律显示,鼻咽拭子采样核酸量比喉咽拭子更多,稳定性更好^[67]。调查研究表明(图3),眼泪、粪便之间都可能检测到SARS-CoV-2,痰液或下呼吸道分泌物最不易漏检,准确率(97.9%)最高,鼻咽拭子为88.6%,喉咽拭子为60%^[68]。

标本采集后应尽快送检,采集后应尽可能在2~4 h内送到实验室。在2~8 ℃下转运,运送时间应不超过72 h。核酸检测须检测含SARS-CoV-2基因的两个位点(开放读码框1a/b、核壳蛋白N或E结构蛋白),可选用引物不同的试剂盒便于对结果复核。流程可简单的概括为,使用核酸提取试剂如基于磁珠吸附的自动化核酸提取方法提取标本中的核酸,将提取的核酸加至PCR扩增反应体系中进行核酸扩增,由扩增产物中ORF1ab和N基因的结果进行判断。判读为"检出"的任一条件为:(1)ORF1ab和N基因同时阳性;(2)第一次检测仅ORF1ab或N基因其中之一检测结果阳性,重新提取原标本复查结果显示ORF1ab或N基因仍为阳性。当两个位点扩增结果无反应,可报告"未检出",核酸检测为阴性^[61]。此情况可能是病毒载量低于检出限。检测的时间点很重要,可检测的病毒载量取决于疾病发作后的天数。例如,在发病后的第14 d,最能可靠地在痰中检出SARS-CoV-2, 而在症状发作后的八天内,咽拭子是不可靠的^[69,70]。考虑到病毒载量的可变性、采样技术不当、采样区域的病毒载量低或病毒基因组突变,呼吸道样本的阴性测试结果不能排除SARS-CoV-2^{[36, 71]}。Winichakoon等^[71]对于流行病学相关的患者,即使鼻咽拭子和/或口咽拭子检测结果为阴性,也建议使用多种证据。据报道,50%以上的COVID-19确诊患者的一次检测核酸的结果为阴性^[72]。

美国疾病控制与预防中心(CDC)使用一步实时RT-PCR(rRT-PCR)法,通过病毒载量的定量信息检测SARS-CoV-2^[73]。提取病毒RNA并将其添加到预混液后装入PCR热循环仪进行测定,预混液包括无核酸酶的水、正向和反向引物、荧光团猝灭探针和反应混合物(由逆转录酶、聚合酶、镁、核苷酸和添加剂组成)^[74]。在rRT-PCR期间,荧光团-猝灭剂探针裂解,产生荧光信号。荧光信号由热循环仪检测,并实时记录扩增过程。Guan等^[23]使用的探针序列是Black Hole Quencher-1(BHQ1,猝灭剂)和荧光素酰胺(FAM,荧光团)。该反应需要约45 min,并且可以在96孔板中进行,每个孔中包含不同的样品或对照。运行rRT-PCR时,必须同时存在阳性和阴性对照,才能正确解释最终结果。对于SARS-CoV-2,CDC提供了一个称为nCoVPC的阳性控制序列^[73]。

由于RT-PCR在方法学上存在着易污染造成假阳性结果,需要有硬件条件的实验室和专业培训的实验人员,不适合开发快速实时现场检测。等温扩增技术是一种新型简易核酸扩增技术,其反应过程始终维持在恒定的温度下,通过添加不同温度下具有活性的酶和特异性引物来达到快速核酸扩增的目的。与PCR相比,等温扩增对仪器的要求大大简化甚至不需要仪器,反应时间也大大缩短,能更好满足快速简便检测的需求。目前,等温扩增比较常用的技术有环介导等温扩增(LAMP)和重组酶聚合酶扩增(RPA)。环介导等温扩增通常在60~65 ℃进行,反应时间为40 min左右,结果通过浊度指数或SYBR Green荧光来判定^[75]。Sun等^[76]开发了基于微流控芯片和手机的检测系统用于马鼻拭子样本中呼吸道传染病病原体的检测,表示该系统能应用于COVID-19的检测。五种特定核酸序列在微流控芯片上通过LAMP扩增,约30 min内通过智能手机进行了检测。另一种重组酶聚合酶扩增(RPA)一般在37~42 ℃进行扩增,测定耗时短(3~15 min)、灵敏度高,体系组分稳定易保存,读取结果多样化,可以在便携式设备上进行操作^[77,78]。最近,逆转录重组酶聚合酶等温扩增技术(RT-RPA)已用于鉴定核酸靶标^[79],它既不需要高温,也不需要周期控制,因此RPA等温扩增也是PCR很好的替代方法。这种不使用热循环仪、15 min内完成DNA/RNA扩增的方法适合于开发家用和实时现场检测的SARS-CoV-2产品。等温扩增拥有着与PCR媲美的灵敏度和反应时间,但等温扩增在较低温度下进行扩增反应,引物非特异性结合的可能性会增加,容易造成假阳性。因此,等温扩增的引物设计要求更高。

有研究者结合等离子体光热效应(PPT)和局部表面等离子体共振(LSPR)传感转导的双功能等离子体生物传感器来检测SARS-CoV-2的选定序列。互补DNA功能化的二维金纳米岛(AuNIs)可以通过核酸杂交对严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(SARS-CoV-2)中的选定序列进行灵敏检测。为了获得更好的识别性能,当以其等离子共振频率照射时,等离子热在同一AuNIs芯片上产生。PPT的局部热量能够提高原位杂交温度,有助于准确区分两个相似的基因序列。这种双功能LSPR生物传感器对选定的SARS-CoV-2序列检测很灵敏,检测限低至0.22 pM,并且可精确检测多基因混合物中的特定目标(图4)^[80]。

5 抗体检测

2020年3月3日,国家卫生健康委发布的SARS-CoV-2检测指南中,首次加入抗体检测内容^[81]。SARS-CoV-2病毒蛋白抗原和响应感染而产生的抗体可用于诊断COVID-19。SARS-CoV-2基因组编码27种蛋白质,包括RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)和4种结构蛋白^[82]。SARS-CoV-2主要结构蛋白包括刺突糖蛋白(S蛋白)、膜糖蛋白(M蛋白)、囊膜蛋白(E蛋白)和核衣壳^[83],其中的S蛋白和N蛋白被用于血清蛋白检测最多。S蛋白可被酶分解为S1和S2两个亚单位。S1用来促进病毒结合到细胞受体,通过宿主受体互作区(RBD区)与宿主上皮细胞受体(血管紧张素转换酶2(ACE2))结合而感染细胞,进而导致肺炎^{[15, 84]}。N蛋白以串珠形式与RNA基因组结合,形成螺旋对称的核衣壳^[58]。在感染过程中病毒载量的变化可能使病毒蛋白难以检测。例如,Lung等^[85]报道症状发作后的第一周唾液病毒载量较高,然后随时间逐渐下降。相反,对病毒蛋白产生的抗体为间接检测SARS-CoV-2提供了更大的时间窗口。

当COVID-19病毒入侵人体后,人体会产生相应的特异性抗体进行防御,其中特异性抗体IgM在5~7 d后首先产生并进行早期防御,持续保持2~3周;然后IgG抗体在10~15 d时产生,能较长或长期存在于人体中,并且相比IgM,IgG有较高的亲和力和较多的样本含量^[86]。血清SARS-CoV-2抗体检测用途包括:弥补核酸检测的不足,辅助确诊患者;可对因采样等原因致核酸假阴性而漏检问题起补充作用,或与核酸检测联合用于疑似患者的确诊;联合核酸检测,监测患者病程进展;相比于核酸检测,抗体检测的血液样本更易获取,标本质量好,操作简单快捷^[72]。抗体检测一般进行IgM和IgG的同时检测,结果会给研究者或医护人员很多信息。例如,抗体结果为IgM(+)/IgG(+),解读为可能处于感染中早期,或感染活跃期;IgM(+)/IgG(弱+)/、IgG(-),解读为可能处于感染早期;抗体结果为IgM(-)/IgG(+),解读为可能处于感染中晚期;抗体结果为IgM(-)/IgG(-),解读为正常人群或者处于感染"窗囗期"。若进一步结合核酸或者CT检测结果,将会得到更准确的结果^[72]。

发展精确的血清学测试的潜在挑战包括:由于SARS-CoV-2基因组与SARS等冠状病毒的基因组有相似性,SARS-CoV-2抗体与针对其他冠状病毒的抗体之间存在不可避免的潜在免疫交叉反应,可能出现“假阳性”;由于患者自身因素如带有类风湿因子、血清中嗜异性抗体、补体及其他自身抗体等,可能出现“假阳性”;正常的血清中大量的非特异性IgG和免疫刺激后产生的特异性SARS-CoV-2 IgG对于二抗存在的竞争关系,可能导致测不到而出现“假阴性”;病毒感染人体后尚未产生抗体或者抗体产生量较少的“窗口期”无法检测到抗体,可能出现“假阴性”。Mok等^[87]测试了15名COVID-19患者的血浆样品中SARS-CoV-2和SARS-CoV的S蛋白的水平,发现交叉反应的频率很高。

SARS-CoV-2抗体检测技术包括胶体金免疫层析技术、化学发光免疫分析技术、酶联免疫吸附试验和荧光免疫层析技术^[72]。对COVID-19康复患者的早期研究检测到了三种SARS-CoV-2特异性抗体,德国生物医药公司欧蒙(EUROIMMUN)发明了一种可以检测SARS-CoV-2特异性免疫球蛋白G和免疫球蛋白A的实验室测试^[88]。在美国和澳大利亚,这些检测被用于诊断疑似COVID-19、但是标准PCR检测呈阴性的人^[88]。但是,一些商业抗体检测在感染早期的特异性只有40%^[88],因此基于抗体的检测方法可以用来诊断COVID-19的感染,但不能作为确认感染的唯一依据,结果的解读需要谨慎。

考虑到COVID-19流行的严峻形势,胶体金免疫层析技术由于拥有检测快速、廉价,适用于即时现场检测等特点,中国国家药品监督管理局(NMPA)批准了8种基于抗体的检测试剂盒^[62,63],美国的Premier Biotech也开发了即时检测试剂盒,让医疗专业人士用来检测个体是否感染过病毒,管理住院患者,追踪接触者^[86]。丹麦的一项研究评估了9种基于血清学检测的市售产品的灵敏性和特异性。统计结果显示,三种实验室ELISA检测的灵敏性为67%~93%,特异性为93%~100%;六种POC试剂盒产品有五种的检测灵敏性在80%~93%,特异性为80%~100%,但他们的检测对象不超过30人^[89]。所有检测的灵敏性都会随时间增加,并在症状首次出现的两周后达到最高。与实验室检测相比,即时检测存在的难点在于它们的血液样本量更小——通常是一丁点儿手指血,而且是在可控性不如实验室的环境。因此,世卫组织建议即时检测只用于科研目的,但是可靠的抗体检测一旦出现,如有类似乙肝抗原抗体检测试剂用于新冠病毒抗原抗体检测,对于新冠病毒感染的预防、诊断、治疗、预后判断以及新冠病毒感染的流行病学调查将具有重大意义。

目前,研究者们针对特定抗体开发了多种COVID-19血清学检测方法^[90,91](图5)。Zhang等^[90]使用酶联免疫吸附法(ELISA)在COVID-19患者的人血清中检测了免疫球蛋白G和M(IgG和IgM)。他们使用的是SARS-CoV-2的Rp3核衣壳蛋白,这种蛋白与其他SARS相关病毒具有90%的氨基酸序列同源性。重组蛋白吸附到96孔板的表面,多余的蛋白被洗掉。加入稀释的人血清1 h,然后再次洗涤板。添加用辣根过氧化物酶功能化的抗人IgG,并使其与靶标结合。洗涤板,然后加入底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)。过氧化物酶与底物反应,引起颜色变化,该颜色变化可以通过酶标仪检测。如果存在抗SARS-CoV-2 IgG,它将被夹在吸附的核蛋白和抗人IgG探针之间,从而产生阳性信号。Zhang等^[90]的IgM测试具有相似的结构,但吸附在板上的是抗人IgM并使用了抗Rp3核衣壳探针。他们测试了16份SARS-CoV-2阳性患者样品(通过RT-PCR确认),发现这些抗体的水平在症状发作后的前5 d内有所增加。在第0 d,分别有50%和81%的患者IgM和IgG阳性,但在第5 d增加到81%和100%。Xiang等^[92]在可疑病例中的呼吸道、血液或粪便样本中也检测SARS-CoV-2 IgG和IgM抗体。根据最近的研究,可能还有其他蛋白质或细胞标记物可用于检测。Guan等^[23]的结果表明,感染患者的C反应蛋白和D-二聚体水平升高,淋巴细胞、白细胞和血小板水平降低。使用这些生物标志物的挑战在于它们在其他疾病中也是异常的。抗体和小分子标记物的多重测试可以提高特异性。有研究人员开发了一种基于石墨烯的场效应晶体管生物传感器,可以在不到1 min的时间内检测到COVID-19患者鼻咽拭子中的SARS-CoV-2病毒。传感器通过抗SARS-CoV-2尖峰蛋白的特异性抗体包被场效应晶体管(FET)的石墨烯片制成,使用抗原蛋白、培养的病毒和来自COVID-19患者的鼻咽拭子标本测试了传感器的性能。当传感器中加入纯化的尖峰蛋白或培养的SARS-CoV-2病毒时,与抗体的结合会引起电位的变化。这种基于FET的传感器对SARS-CoV-2峰值蛋白在PBS中的检测限(LOD)为1 fg·mL^-1,在临床转运介质中的LOD为100 fg·mL^-1。此外,FET传感器成功检测出了培养基(LOD:1.6 × 10¹ pfu·mL^-1)和临床样品(LOD:2.42 × 10² copies·mL^-1)中的SARS-CoV-2。在没有任何样品准备的情况下,该传感器可以区分来自疾病患者和健康人的样品^[93]。

6 结论与展望

在这篇文章中,我们主要综述了COVID-19的四种检测和诊断方法,包括病毒分离测序、CT检测、基于核酸的方法和基于抗体的方法。病毒分离是检测病毒感染的金标准,测序确认病毒的身份,得到的基因组数据和蛋白组数据是核酸检测和蛋白检测的基础和前提,但病毒分离时间长、条件难、要求高,不适用于医院或其他体检中心的大规模检测。CT检查能直接看到发病症状,对于发病超过3 d的患者检测灵敏性高,但其特异性低,不易区分COVID-19和其他传染性肺部疾病,可以在COVID-19早期发现中发挥关键作用。核酸检测病毒的RNA,是病毒存在的直接证据,能够检测到处于窗口期的患者,及时发现感染者,但由于采样或者其他的原因导致50%以上患者的核酸检测为阴性,单纯检测核酸会漏诊。血清学检测的是病原体刺激后产生的抗体,是间接证据,样本、标本易获取,操作简单快捷、医护人员被感染风险小,易于基层实验室开展筛查工作。CT检测、核酸检测和抗体检测三种方法在COVID-19的检测和防控中发挥着重要的作用,三者各有应用所在,各有优势,各有局限,三者的联合使用和综合判读可以从技术上和时间差上互补,在确诊患者、监测病程进展、调查流行病学中发挥作用。

核酸检测一次需要花费几十到一百多元,抗体检测不超过50元,胸部CT检测相比较贵,需要400元。我国COVID-19的流行率低(约为0.006%),由于在流行率低的人群进行抗体检测产生的假阳性结果会带来大量不必要的隔离和混乱,因此我国大规模人群新冠病毒检测适于用核酸检测。采样极其关键,需要专业训练的医护检测人员。提取和检测过程中,完整的自动化将有助于结果的可靠稳定。对于新型冠状病毒核酸检测阴性疑似病例,通过动态检测IgM和IgG进行COVID-19辅助诊断,也可以通过CT检测直接观看发病症状来辅助诊断。

COVID-19宿主对病毒的反应仍在研究中,抗体产生规律的研究需要大量数据的积累,即时检测手段如类似乙肝抗原抗体检测的试剂亟待开发,还有待于广大科研人员和医务工作者共同努力。

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