化学衍生用于代谢物异构体质谱分析

王子璇; 厉欣; 再帕尔·阿不力孜

doi:10.7536/PC200555

化学进展 ›› 2021, Vol. 33 ›› Issue (3) :406-416 DOI: 10.7536/PC200555

综述

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化学衍生用于代谢物异构体质谱分析

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Chemical Derivatization for Mass Spectrometric Analysis of Metabolite Isomers

Zixuan Wang ¹ ,
Xin Li ¹^,^* ,
Zeper Abliz ¹^,²

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摘要

内源性代谢物是机体生命活动的中间体和终产物,对其进行定性和定量分析在生命科学研究中具有重要意义。质谱能够同时提供化合物的定性和定量信息,已经成为一种通用的内源性代谢物分析技术。由于质谱是通过检测离子质荷比获取化合物组成信息,区分生物体内复杂多样代谢物同分异构体仍然是质谱分析亟待解决的难题之一。化学衍生通过放大同分异构体理化性质差异,能够增强质谱检测的灵敏度和特异性。本文介绍了化学衍生用于代谢物异构体质谱检测的研究进展,对用于脂质、糖类和手性氨基酸等精细结构异构体的化学衍生质谱分析方法及应用进行了综述。特别强调了微液滴化学反应加速在衍生化质谱分析中的发展,其有望成为代谢物实时原位衍生化检测的新方法。此外,将生物组织原位衍生化与质谱成像分析技术相结合,对于研究低丰度、非极性和异构体代谢物的空间分布及其功能具有重要价值。

Abstract

Being the intermediates and final products of life metabolic activities, endogenous metabolites precisely mirror metabolic changes in vivo, providing clues for the study of diseases and other life processes. Mass spectrometry has become a universal technique for qualitative and quantitative analysis of endogenous metabolites, with high sensitivity, high specificity and wide dynamic range. However, it remains a limitation on the detection and differentiation of subtle structural differences of metabolite isomers in heterogeneous biological tissue using mass spectrometry. Therefore, how to improve sensitivity and specificity of mass spectrometry needs to be solved in the study of metabolite isomers’ analysis. Chemical derivatization takes advantage of bringing high proton affinity groups, hydrophobicity or chiral selectors to desired analytes, which is expected to broaden the applications of mass spectrometry for analysis of metabolite isomers. In this review, advances in chemical derivatization-based mass spectrometric analysis of metabolic isomers are summarized, including(1) reaction approaches and(2) methods and applications of lipids, carbohydrates and chiral amino acids. Special emphasis is placed on on-line derivatization microdroplet accelerate reaction by mass spectrometry, in which chemical derivatization of analytes occurring simultaneously with spray ionization, providing a promising way for instant and in-situ metabolite derivatization. The emerging study of on-tissue derivatization mass spectrometry imaging is of great value for providing spatial distribution of low abundance, non-polar and isomer metabolites. In the second part, different approach of detailed structural characterization of various compound classes are discussed, with a focus on lipids, carbohydrates and chiral amino acids.

Contents

1 Introduction

2 Chemical derivatization for mass spectrometric analysis of metabolites

2.1 Online chemical derivatization of metabolites

2.2 Offline chemical derivatization of metabolites

2.3 Chemical derivatization for mass spectrometry imaging of metabolites

3 Chemical derivatization for mass spectrometric analysis of metabolite isomers

3.1 Chemical derivatization for mass spectrometric analysis of lipids

3.2 Chemical derivatization for mass spectrometric analysis of glycans

3.3 Chemical derivatization for mass spectrometric analysis of chiral amino acids

4 Conclusion and outlook

Graphical abstract

关键词

质谱分析 / 化学衍生 / 异构体 / 代谢物分析 / 反应质谱

Key words

mass spectrometry analysis / chemical derivatization / isomer / metabolite analysis / reactive mass spectrometry

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王子璇, 厉欣, 再帕尔·阿不力孜. 化学衍生用于代谢物异构体质谱分析[J]. 化学进展, 2021, 33(3): 406-416 DOI:10.7536/PC200555

Zixuan Wang, Xin Li, Zeper Abliz. Chemical Derivatization for Mass Spectrometric Analysis of Metabolite Isomers[J]. Progress in Chemistry, 2021, 33(3): 406-416 DOI:10.7536/PC200555

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1 引言

内源性代谢物是机体与外界环境共同作用下生命代谢活动的中间体和终产物,其种类和含量变化能够反映机体在各种生命活动中的代谢状态,为疾病等生命过程研究提供重要线索。生物体内代谢物种类繁多、异构体形式多样、含量范围跨越9个数量级,这对分析技术的灵敏度和选择性提出了巨大挑战。

质谱技术分析速度快、通量高、动态范围宽,能够同时提供化合物定性和定量信息,已经成为一种通用的内源性代谢物分析技术。近年来,色谱-质谱联用技术^[1,2]、敞开式离子化技术^[3⇓~5]、质谱成像技术(Mass spectrometry imaging, MSI)^[6,7]在内源性代谢物分析和应用方面取得了一系列研究成果。然而,质谱检测要求待测化合物具有易于电离的基团,这在一定程度上限制了质谱分析的应用范围。另一方面,虽然一级质谱分析能够提供待测物离子的质荷比信息,但无法区分同分异构体。尽管串联质谱分析在一定程度上能够反映待测物结构信息,但对于具有相同裂解途径的异构体而言,即使采用高分辨质量分析器,也很难通过单独的质谱分析将其鉴别。因此,如何提高质谱对代谢物异构体分析的适用范围是亟需解决的技术瓶颈。

在质谱分析中引入化学衍生反应,将待测物转化为更适合质谱检测的产物,是提高质谱分析适用范围的有效手段。通过衍生反应将特定种类的化合物标记,增强其在质谱检测时的离子化效率,可以有效地提高检测灵敏度。此外,化学衍生还可以提高串联质谱分析的特异性,即通过衍生反应放大同分异构体之间理化性质的差异,并在碰撞诱导裂解(CID)过程中将其转化为相应产物离子的丰度差异,从而实现异构体的区分。通过选择合适的衍生化试剂进行标记,可以实现对生物体内脂质、糖类和氨基酸等化合物多类型异构体的精准区分。本文将重点关注内源性代谢物异构体分析,从代谢物化学衍生质谱分析方法和对不同类别内源性代谢物的化学衍生质谱分析应用两方面进行综述,着重介绍以在线化学衍生质谱分析方法为代表的基于独立质谱分析技术的代谢物衍生化方法及化学衍生用于脂质、糖和手性氨基酸异构体质谱分析的研究方法和进展。

2 代谢物化学衍生质谱分析方法

随着质谱技术在生物分析领域的广泛应用,国内外研究人员开始在基于色谱-质谱联用技术^[8,9]、敞开式离子化技术^[10]以及质谱成像技术^[11,12]的分析方法中引入化学衍生反应。早期的化学衍生-色谱-质谱联用技术着重于改善样品的挥发性、热不稳定性及色谱保留行为,以提高色谱分离能力。针对质谱检测的化学衍生研究则以开发高质子亲合性的衍生反应质谱标记试剂为主。这些标记试剂多在溶液条件下与待测物发生反应,将转化产物纯化后用于质谱分析,能够显著提高待测物的离子化效率。随着美国普渡大学化学系Cooks等报道了在微液滴等限域条件下化学反应速度加快的现象等一系列研究,在此基础上将化学衍生反应用于在线质谱分析的方法得到了发展和应用^[13,14],为化学衍生质谱技术提供了新的选择。

根据衍生反应的发生是否与质谱检测联机同时进行,可将化学衍生质谱分析分为在线化学衍生和离线化学衍生两种。离线化学衍生质谱分析通常在溶液体系中进行衍生反应,在样品待测物中引入亲质子基团将其衍生化,其检测效率与衍生反应机制密切相关。而在线化学衍生质谱分析则在离子化过程中或质量分析器(如离子阱)中引入反应试剂,将待测物的化学衍生和产物检测联机同时进行,能够对待测物进行快速和高灵敏检测。

2.1 代谢物在线化学衍生质谱分析

由于质谱扫描速度快,将化学衍生同质谱分析联机进行时,衍生反应的耗时是在线质谱分析的制约条件。基于自由基的气相离子-分子反应由于反应速度较快,常被用于在线化学衍生质谱分析。臭氧诱导解离(Ozone-induced dissociation, OzID)技术^[15]在离子阱质量分析器中引入氧自由基离子,同不饱和脂质离子骨架结构上的C

C双键进行反应并发生诱导解离,产生相关碎片离子的丰度比值可用于指认前体离子结构中不饱和双键的位置。聂宗秀等^[16]开发了半导体辅助激光解吸/电离质谱(SA-LDI MS) 平台,用于在线监测光催化反应,可进行超快速反应筛选。在大气压离子化过程中,同样可以引入自由基反应进行在线衍生质谱分析。Cooks等^[17]发现在常压环境下氮气中的氮原子经电场作用下,能够通过氮插入反应活化饱和烷烃的C—C/C—H键。在此基础上,发展出场辅助氮插入反应的常压离子化技术,通过整合原位衍生化和解吸离子化的过程,建立了利用氮插入反应功能化饱和烷烃的方法,解决了饱和烷烃在常压环境下难电离的问题^[18]。尽管基于自由基反应的化学衍生具有反应速度快的优点,但仍面临可选反应类型较少的限制。

能够在溶液体系下进行的化学衍生反应类型较为丰富^[19],如何加快其衍生反应速度是在线质谱分析研究的新方向。研究表明^[20],在异相反应界面(如凝聚相、液气界面、微溶剂化环境)形成的限域条件下,化学反应过程会加快。Cooks等在2011年报道了喷雾离子化过程中化学反应速率加快的现象,并提出了微液滴体系内发生的化学反应适用于限域条件下化学反应加速理论的观点^[21],即利用喷雾产生反应物液滴,液滴不断脱溶剂形成体积为几微升的微小液滴,为化学反应提供了有限的和高表面积的场所,在气液交界面上加速了衍生反应过程。这项研究结果为在线化学衍生质谱分析研究提供了新的理论依据。他们系统研究了微液滴条件下的反应加速现象,发现Hantzsch反应在微液滴条件下的反应速率比溶液体系快10⁵倍,所需时间缩短到毫秒级^[22]。在多种喷雾电离方式如电喷雾电离(ESI)、电喷雾萃取电离(EESI)、解吸电喷雾电离(DESI)、纸喷雾电离(PS)中都发现具有类似的加速反应现象(图1)。其中,反应解吸电喷雾离子化(reactive-DESI,rDESI)采用含有反应试剂的液滴束流萃取固态样品表面的待测物并发生反应,所形成的二次微滴在去溶剂化过程中能够在毫秒时间内快速生成反应产物。这种基于电喷雾等方式的加速化学反应质谱分析方法已用于以下三方面研究^[23]:(1) 在线反应监测用于溶液反应的原理和机制探索;(2) 制备质谱法,收集液相微滴离子反应生成的产物;(3) 喷雾电离的同时对待测物进行衍生反应,产生易于质谱检测的产物。

反应解吸电喷雾离子化质谱技术已在生物样品代谢物检测中取得广泛应用。欧阳证等^[24]将rDESI和串联质谱技术相结合,实现了全尿中合成代谢类固醇的快速筛选。将羟胺作为衍生化试剂加入到喷雾溶液中,在电离过程中与甾体的羰基发生微液滴加速化学反应,能够观察到反应产物及其脱水形成的肟。用这种方法检测到了包括糖类固醇在内的7种类固醇。该方法也用于人血浆中丙酮的检测,检测到的类固醇和丙酮的线性响应范围约为2个数量级,检测限低于1 ng,分析时间只需要几秒钟。Ifa等^[25]用反应解吸电喷雾质谱成像(rDESI-MSI)的方法将正离子衍生化候选物DC9用于组织中脂质的衍生化,在正离子模式下对大鼠脑组织和斑马鱼中磷脂酰乙醇胺(PE)和小分子脂类同时检测。结果显示,相比常规DESI-MSI检测,DC9衍生化产物响应强度有显著提高,而且节约了数据采集时间和样品消耗量。多羟基化合物中,空间位置接近的顺式二醇可以与苯硼酸发生环硼化反应生成一个带负电荷的环状硼酸盐,该反应可用于在线质谱检测生物体内的糖以及区分顺式和反式雌三醇^[26,27]。最近的研究表明,微液滴加速反应还适用于单个生物细胞内代谢物的衍生化^[28],且在线反应过程中衍生溶剂逐步蒸发形成的衍生化试剂浓度梯度类似于物质在细胞中转运时的梯度浓缩过程。因此,该方法还有望成为一种简单、可控的细胞内反应模拟方法,有助于更深入地理解细胞内生化反应过程^[29,30]。

微液滴体系下化学反应加速具有较高适用性,对碳碳、碳氮键形成,环化,氧化还原和多组分多步反应均实现了明显加速^[31]。以此为基础建立的在线化学衍生质谱分析技术可以实现待测物的瞬时衍生化和产物在线检测,已经在醛、酮、醇、酯、硫醇、烷烃类等代谢物检测中得到应用^[23],该方法应用于代谢物及代谢物异构体的检测将具有广泛的应用前景。

2.2 代谢物离线化学衍生质谱分析

离线化学衍生质谱分析是指先在常规反应体系中将待测物进行衍生标记后,再对产物进行质谱检测。在溶液体系中的离线化学衍生反应已有较多报道^[32,33],其适用的离子化方式不限于ESI,也有适用于基质辅助激光解吸电离(MALDI)的衍生化方法^[19],如烷基化和引入亲质子基团等。研究人员针对含有不同官能团的代谢物开发了一系列用于离线化学衍生的内源性代谢物质谱分析方法:氨基酸在pH>8时由伯胺引发亲核反应,可以被酰氯、丹磺酰氯、酸酐、N-羟基丁二酰亚胺等试剂衍生化;对羟基的化学衍生质谱分析通常使用含碱性基团的衍生试剂,如对多羟基物质进行甲基化,或使用卤代甲烷捕获羟基转化为酯等。离线化学衍生还可以用于同位素标记,使用多种同位素同时标记不同待测物,可以实现多通路分析,提高了质谱检测的通量^[32]。如冯钰锜等^[9]开发了对含有羧基、羰基、氨基和硫醇4类官能团代谢物的平行同位素衍生反应方法,在大鼠粪便样品中鉴定出了1400多个代谢物。

2.3 代谢物化学衍生质谱成像分析

近年来,质谱成像技术迅速发展,已经成为质谱领域研究的热点之一。质谱成像技术具备广谱、灵敏度高和特异性好等突出优势,能够获得代谢物在生物组织内时空分布动态变化信息。此外,对代谢物的结构异构体进行质谱成像分析,表征其空间分布,有利于对其生物学意义进行挖掘和探索。但是,与液相色谱质谱联用(LC-MS)方法相比,质谱成像分析样品未经分级降维,难以获得类似LC-MS的高灵敏检测结果。因此,开发针对低丰度、低离子响应代谢物和异构体的质谱成像分析方法是亟需解决的难题。

目前有少量研究报道了代谢物原位化学衍生质谱成像分析方法,包括离线化学衍生方法,如衍生化试剂喷涂法、自动化点样法、切片预处理法等以及在线化学衍生方法,如在线臭氧诱导解离反应质谱成像法等。采用新兴的化学衍生质谱成像技术能够对生物组织复杂体系中低丰度、低离子响应代谢物及结构异构体进行可视化表征。例如,郭寅龙等^[11]报道了使用自主研发的电喷雾喷涂装置将N,N-二甲基哌嗪碘化物(DMPI)作为衍生化试剂喷涂于甲状腺癌组织切片,与组织中游离脂肪酸羧基发生衍生化反应。在正离子模式下同时对脂肪酸衍生产物和组织中磷脂进行MALDI-MSI分析,结果表明在甲状腺癌组织中饱和游离脂肪酸(如FFA C16∶0, FFA C18∶0)与磷脂的表达呈正相关。该方法有效提高了体内低丰度脂肪酸的检测灵敏度,增加了质谱成像方法检测到脂肪酸的数目。目前,尽管在化学衍生质谱成像方法研究方面取得了一些进展,但仍存在操作复杂、重复性差和反应类型有限等问题。

各类衍生化反应已越来越广泛地应用于代谢物质谱分析,为各种生物学过程的探索提供了线索和依据。离线化学衍生质谱分析对多种衍生反应具有普遍适用性,有效提高了低丰度和难电离代谢物的质谱响应。在线化学衍生质谱分析操作简便、高效,在质谱快速分析中具有广泛应用前景。表1列举了在线和离线化学衍生在代谢物质谱分析中的方法和应用,表明现有的衍生反应质谱分析方法已成功应用于生物组织、体液及单细胞中脂质、糖和氨基酸等多种化合物的检测。

3 代谢物异构体的化学衍生质谱分析

代谢物异构体间的结构和理化性质差异微小,仅使用高分辨质谱不足以将其区分,目前已经有越来越多的化学衍生质谱分析方法成功地应用于不同种类化合物异构体的检测。脂质、糖和氨基酸是生物体内重要的代谢物,也是常见的具有多种异构体的化合物。以下将分别对用于脂质、糖和氨基酸异构体分析的化学衍生质谱方法和应用进行介绍。

3.1 用于脂质的化学衍生质谱分析方法

脂质是细胞膜的重要组成成分,在化学结构、内源性丰度和理化性质方面具有多样性,在多种生理和病理过程中发挥着重要的功能。不同脂质的功能与其种类和结构密切相关,因此,鉴定脂质的精细结构对研究其生物学功能具有重要意义。

脂质分子结构多样,存在头基类型、酰基链长度、连接位置、不饱和度和立体化学等多种异构体,这对鉴定脂质结构提出了巨大挑战。对脂质各类同分异构体进行精准鉴定将成为未来脂质组质谱分析的重点。对脂质的鉴定可以分为5个层次:(1) 脂质头基和类别归属;(2) 酰基链总碳数和双键数目;(3) 每个酰基链含碳数和双键数目;(4)酰基链在脂质骨架上的连接位置(如sn位置);(5)双键的位置及其立体化学构象。使用碰撞诱导解离(CID)质谱技术能够实现前3个层次的鉴别,但常规串联质谱分析对于sn位置异构体及双键位置、顺反异构体等精细结构的解析仍存在着分析灵敏度低和结构解析能力不足等局限。因此,一些基于化学衍生的串联质谱分析方法被开发出来用于鉴别脂类精细结构异构体,如光化学激活Paternò-Büchi反应、臭氧诱导解离和紫外光解离等。

3.1.1 Paternò-Büchi(P-B)反应

Paternò-Büchi反应是一类羰基-烯[2+2]光化学环加成生成氧杂环丁烷的反应。瑕瑜等^[37]在ESI电离时在线引入含酮或醛羰基的衍生化试剂溶液,其在254 nm紫外光催化下产生双自由基中间体,与脂质双键反应生成含有氧烷环的产物,经串联质谱分析能够鉴定与双键位置相关的特异性碎片。该方法高效、快速、操作简便,对多种脂质普遍适用。欧阳证与瑕瑜等合作改良了P-B反应,通过2-乙酰吡啶在线光化学P-B反应-nanoESI-MS/MS分析建立了一种大批量、种类完备的脂质深度结构解析方法。该研究还发现未经光化学反应的MS³分析可直接用于区分sn异构体:未衍生化的磷酸胆碱在MS/MS分析时会丢失头基基团(-183 Da),在与脂酰基链结合处生成二氧戊烷环,sn-2脂肪酰基链通过新形成的C

C与二氧戊烷环结合。进一步的CID裂解中,二氧戊烷环断裂,产生表征sn位置的特征子离子。使用2-乙酰吡啶作为衍生化试剂,有助于产生高丰度的C

C位置和sn位置的特征子离子,获得较高的P-B反应产率。将这一方法用于脂质组学研究,提高了脂质分子分析的结构解析度,实现了脂质中磷脂类型、双键位置及脂肪酸链sn位置异构体的同时解析及定量分析。P-B反应还可以离线方式进行,如Dreisewerd等^[46]采用苯甲醛作为衍生化试剂对组织切片进行离线P-B反应,将反应后的切片进行MALDI-2-MSI 和MALDI-2-MS/MS分析,发现了磷脂酰胆碱和磷脂酰丝氨酸双键位置异构体在小鼠小脑白质区和灰质区有不同的分布趋势(图2)。

3.1.2 臭氧诱导解离技术

臭氧化反应是一种重要的衍生化脂质结构鉴定方法。烯烃与臭氧反应可以生成初级臭氧化产物,进一步转化为两个羰基类化合物。两个羰基类化合物分别与烯烃C

C双键两侧的骨架对应,因此,可由产物推测原烯烃结构和双键位置^[15]。最初的研究中,Murphy等先将干燥的磷脂薄膜暴露在臭氧下离线进行臭氧化反应后,再将产物进行ESI-MS /MS分析,通过产生的特征子离子确定双键位置^[58]。这种方法能够达到较高臭氧化物产率,但在质谱分析前需要额外的样品准备步骤,难与在线分析方法(如鸟枪法脂质组学分析)兼容。Thomas等^[59]开发了臭氧电喷雾质谱(Ozone electrospray mass spectrometry, OzESI-MS),该技术使用氧气作为喷雾电离时的雾化气,增加毛细管电压至电晕放电产生臭氧,在线将待测物脂质臭氧化并将产物进行串联质谱分析以解析其结构。这种方法操作简单,可以直接在商品化质谱仪上进行,用于单一脂质或简单脂质混合物的鉴定。但对于复杂脂质混合物,其峰归属和谱图解析存在较大挑战。

臭氧诱导解离技术是基于臭氧化作用开发的一种在线脂质衍生化质谱分析方法,它解决了OzESI-MS对复杂混合物中脂质结构鉴定的限制。OzID技术在质谱离子阱检测器处安装臭氧发生器,在缓冲气中注入低浓度(~1%)臭氧,先将目标脂质离子通过离子阱选择出来,选择出的离子与臭氧发生反应,通过其产物碎片离子鉴定目标脂质结构。OzID技术的局限性在于需要对仪器进行改造,并严格遵守对高反应活性臭氧的安全性要求。尽管如此,OzID技术能够实现复杂混合物中脂质结构鉴定,产生易于辨认的特征性离子,已报道对双键位置、sn位置等多种脂质异构体具有鉴别能力。Blanksby等^[60]将OzID方法与数据非依赖鸟枪脂质组学方法结合,对血浆中不饱和脂质异构体进行了全面的分析,发现大多数不饱和脂质以异构体混合物的形式存在。Ellis等^[35]将MALDI-MSI与OzID-离子阱质谱仪相结合,对大鼠脑组织中多种类型脂质异构体的特异性分布进行了表征。如图3所示,PC(36∶1) 的各种异构体在鼠脑灰质和白质的表达有明显差异。OzID技术可与多种脂质组学方法兼容,能够全面提供生物组织复杂基质中脂质的结构信息,具有广泛应用前景。

3.1.3 其他在线化学衍生质谱分析方法

P-B反应和OzID技术是常用的在线脂质衍生质谱分析方法。此外,不饱和脂质碱金属加合物的多级质谱信息也可用于双键位置鉴定^[61]。紫外光解反应通过193 nm紫外光照射,使酰基链上与双键相连的碳碳键断裂,所产生特征性相差24 Da的离子对可用于指认对应脂质的双键位置。由于紫外光被脂质吸收并使后者被激活所用时间极短,因此特别适用于在线MSI和LC-MS/MS分析。低温等离子体(LTP)原位电离质谱技术也被用于脂质双键位置的快速鉴定^[62]。LTP探针在离子化过程中产生的氧自由基将不饱和脂质氧化,氧化产物可以用于确定双键的位置。

3.2 用于糖的化学衍生质谱分析方法

糖类化合物在生物体内以单糖及其衍生物、寡糖、多糖、复合多糖和糖苷类等多种形式存在。糖种类、糖链和异常结构的多样性使得糖异构体的结构区分成为难题。完全阐明糖的结构,需要以下几方面的信息:(1)分子量及组成单糖的种类与摩尔比;(2)各糖环的构象与异头碳的构型;(3)各糖残基间的连接方式;(4)糖残基的连接顺序;(5)二级结构及空间构象等。质谱分析需要样品量小、分析速度快、灵敏度高,已成为表征糖基结构不可或缺的研究工具。目前基于质谱鉴别糖异构体的方法主要有两种:化学衍生质谱法和离子淌度质谱法(Ion mobility mass spectrometry, IMS)。

3.2.1 化学衍生质谱法

大多数聚糖的亲水性强、质子亲合力低,质谱检测时不易发生离子化。通过对其衍生化,可以实现:(1)提高离子化效率,增强其质谱检测灵敏度;(2)稳定糖分子结构,防止发生重排;(3)保护不稳定聚糖残基;(4)区分异构体。Charles等^[42]报道了引入丝氨酸、Cu²⁺的质谱动力学方法区分单糖异构体。对聚糖的衍生化过程通常相对复杂,多在离线条件下完成。常见的衍生化方法包括针对聚糖还原末端进行的还原氨化反应、肼化反应、结合羧基反应以及糖类通用的全甲基化、甲胺化反应等。潘远江等^[47]将肼类衍生化试剂3-肼基苯甲酸(3HBA)和喹啉-3-碳酰肼(Q3CH)与MALDI MS常用基质2,5-二羟基苯甲酸(DHB)组合使用提出了靶板并行衍生化策略(POTDS),在提高N-聚糖电离效率的同时将其作为MS和MS²的质量校正内标,实现了同时在正负离子模式下的精确校正和鉴定。针对有特定生物学意义的聚糖异构体还可以开发特异性的化学衍生方法,如酯化和酰胺化反应可用于区分酸性N-聚糖同分异构体。α-(2, 3)和 α-(2, 6)唾液酸是常见的两种N-聚糖连接方式异构体,其中α-(2, 6)唾液酸被认为是多种癌症的生物标志物。Carlstedt等^[63]首先报道了使用4-(4,6-二甲氧基-1,3,5,-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMT-MM)作为衍生化试剂,实现了对α-(2, 3)和 α-(2, 6)唾液酸的鉴别。α-(2, 6)唾液酸经甲酯化后分子量增加14 Da,而α-(2, 3)唾液酸反应后生成内酯,其分子量减少18 Da,因此,二者在质谱图上会产生相差32 Da的特征离子峰而实现区分。Wuhrer 等^[53]发现利用1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)卡二亚胺(EDC)活化衍生反应可以实现α-(2, 3)和 α-(2, 6)唾液酸的区分。在EDC作用下,α-(2,6)连接唾液酸会生成乙酯,而α-(2, 3)连接的唾液酸形成内酯。这种衍生化方法步骤简单,不需要纯化过程,提高了唾液酸异构体的特异性。为了进一步简化分析流程,稳定唾液酸结构,Cipollo等^[64]将该方法用于亲水相互作用液相色谱-固相萃取-MALDI-TOF MS分析,能够直接检测聚糖混合物样品。

3.2.2 离子淌度质谱法

离子淌度谱是基于不同气相离子在电场中迁移速率的差异而对化学物质进行分离的一种分析方法。离子在迁移管中的迁移速率受到离子质量、大小、碰撞截面积(CCS)以及偶极矩等因素的影响。离子淌度谱可分为多种类型:漂移时间离子迁移谱(Drift tube ion mobility spectrometry, DTIMS)、行波离子迁移谱(Travelling-wave ion mobility spectrometry, TWIMS)、场不对称波形离子迁移谱(Field asymmetric waveform ion mobility spectrometry, FAIMS)和捕集离子淌度质谱(Trapped ion mobility spectrometry, TIMS)等,其主要差别在于推动离子进入迁移管所施加的电压方式不同。离子淌度谱分析速度快,可以在几十毫秒内实现待测物的分离,特别适合与质谱联用进行在线检测。离子淌度质谱是离子淌度谱与质谱联用的一种新型分析技术。通常在质谱离子源和质量分析器之间增加离子迁移管,待测离子通过离子迁移管按照淌度预分离后进一步被质谱检测,可获得迁移时间、质荷比和响应强度的三维数据,拓展了质谱的分离性能和应用范围。

离子淌度质谱已成功用于异构体分析,但这种方法对于大分子聚糖的鉴别仍有一定的局限性。IMS对糖同分异构体的研究始于20世纪90年代末,Clemmer等^[65]使用自制的DTIMS对一系列低聚糖进行分析,首次证明了同分异构体具有不同的漂移时间。2003年,Froese等^[66]使用FAIMS首次对寡糖异构体混合物进行了分离。近期的研究发现,通过引入金属离子衍生形成非共价加合物离子,可以放大糖异构体构象的差异而便于IMS将其分离。其中大多数研究基于碱金属离子进行,如Pagel等^[39]报道了使用DTIM-MS检测高甘露糖N-聚糖异构体[M + Na]⁺、[M + K]⁺、[M + H]⁺、[M + Cl]^-,[M + H₂PO₄]^- 离子的CCS值;Dodds等^[67]研究了气相离子-离子电子转移反应,发现虽然糖异构体的二价加合离子[C+M]ⁿ⁺(C:糖,M:金属)的CCSs谱图可能相同,但不同异构体加合离子的电子转移产物[C+M]⁽^N^-1)+·能够经IMS实现分离,因此该方法可用于糖异构体鉴别。也有研究通过引入外源性离子,如Leary等^[43]发现Mn²⁺、Co²⁺、Fe²⁺、Ni²⁺等过渡金属能够诱导肝素低聚糖异构体加合离子构象变化,进而采用IMS将其分离。

3.3 用于氨基酸的化学衍生质谱分析方法

氨基酸是生物体内重要的有机分子,在蛋白质合成、维持机体生理功能和各种代谢活动中发挥着重要作用。氨基酸还是一类重要的手性分子,绝大多数氨基酸都是手性化合物。手性氨基酸在体内与其受体、酶等生物大分子的相互作用密切相关,不同手性对映体表现出独特的生物学功能。L-氨基酸是哺乳动物体内主要的活性形式,但越来越多的报道显示D-氨基酸在疾病等生理病理过程中发挥着重要作用,如D-Ser作为N-甲基-天冬氨酸(NMDA)受体的激动剂,与脑卒中、阿尔茨海默症和精神分裂症等疾病密切相关。常用的手性分析方法,如高效液相色谱法、电泳法、旋光光谱法等可以得到较好的手性区分结果,但存在操作复杂、需要样品量大和适用范围窄等缺点。近年来,多种基于质谱技术的分析方法成功应用于手性物质的识别与分析研究,主要包括以下两种方式:(1)手性拆分技术与质谱联用法,将质谱与手性分离技术,如高效液相色谱、毛细管电色谱和离子淌度谱等联用。这种方法增强了分析的灵敏度和准确性,但存在联用方法与质谱不相容的问题。(2)手性识别质谱法,将待测手性化合物经化学衍生为非对映异构体后,利用质谱检测手性非对映体在反应过程中动力学和热动力学的微小差异进行手性识别。

3.3.1 手性识别质谱法

根据手性识别机制的不同,手性识别质谱法又可以分为以下三种类型:(1)主体-客体结合法;(2)客体交换离子分子反应法;(3)非对映异构体解离法。其中,非对映异构体解离法能够得到衍生化非对映异构体特异性MS/MS裂解图谱,是目前应用最为广泛的质谱手性分析方法之一。例如,质谱动力学方法借助串联质谱技术将对映体之间微小的自由能差异转化为所形成非对映体配合物裂解方式的巨大差异,而实现手性区分。Cooks等^[68]通过引入过渡态二价金属阳离子(M²⁺)与手性分析物对映体(A_RorS)及手性参比物(ref^*)反应形成非对映体三聚体配合物[M²⁺(A_RorS)(ref^*)₂-H]⁺,配合物作为前体离子经CID竞争性失去参比物或分析物而解离为二聚体离子[M²⁺(A_RorS)(ref^*)-H]⁺或[M²⁺(ref^*)₂-H]⁺。非对映体解离所需要的活化能大小不同,故其在二级质谱裂解所产生的产物离子丰度不同,进而实现手性识别(图4)。通过将产物二聚体间丰度比变化值的自然对数与其中一种对映体的摩尔分数构建标准曲线,还可以进行对映体定量测定^[36]。质谱动力学方法广泛用于手性氨基酸分析,手性氨基酸也常用作手性参比物引入。Cooks等^[36]使用Cu²⁺和Trp分别作为配体离子和手性参比剂,对选择性N-烷基化反应产物进行手性识别,并实现了产物ee值的在线监测。曾苏等^[69]在这方面报道了一系列研究,如建立了双电荷三聚体配合物[Ni^II(PPIs)(tadalafil)₂]²⁺的质谱动力学方法对4种他达拉菲对映体及3种质子泵抑制剂进行了手性识别和定量分析。此外,潘远江等^[70]开发了N-苯磺酰基-2-吡咯酰氯手性探针,实现了在有机溶剂体系和动物血浆中同时对氨基酸对映体过量值的测定。他们近期还报道了一种新型溴代手性醛探针(D-BPBr),其对D-氨基酸有较好的识别效果和检测灵敏度,结合反相C18色谱柱HPLC-MS/MS分析,能够实现痕量手性氨基酸和含氨基代谢物的标记、分离和检测。利用溴同位素2 Da的特征离子和1∶1的峰强度比有效地排除了假阳性结果,在尿液和血浆样品中快速检测到119个氨基类代谢物^[54],该方法具有潜在用于复杂生物样品中D-氨基酸类生物标志物筛选的能力。

手性识别质谱法灵敏度高,分析速度快,且不受溶剂及杂质的干扰,因此有望在高通量手性分析中发挥重要作用。

3.3.2 离子淌度质谱手性分析方法

离子淌度质谱在手性氨基酸化学衍生分析中也取得了较大进展。但由于手性对映体的CCS值完全相同,因此无法直接通过离子淌度质谱将其分离,需要先用手性衍生将其转化为非对映异构体后再进行分析。用于离子淌度质谱的手性衍生试剂主要分为以下几种:(1) 在缓冲气中加入的气相手性改良剂;(2) 含金属离子的手性选择剂;(3) 不含金属离子的手性选择剂;(4) 其他化学衍生试剂。姚仲平等^[44]发现,动力学方法中使用Cu²⁺形成的四配体[(Cu²⁺)₂XY₂-4H+Na]⁺离子结合TWIMS分析可以得到更好的手性区分结果。在质谱动力学方法中使用多配体离子虽然能取得较好的手性区分效果,但需要针对每个手性氨基酸作优化选择出最佳的金属离子和手性参比剂,通用性较差。最近,Dominguez-Vega等^[55]使用(+)-1-(9-芴基)氯甲酸乙酯(FLEC)对21种氨基酸进行衍生化,结合TIMS-TOF MS实现了对其中17种的手性拆分。

离子淌度质谱的分辨率高、分离速度快,在手性分析中有较大前景。但截至目前,基于化学衍生的质谱分析方法仍然难以实现对生物组织等复杂混合物中手性对映体的区分。

4 结论与展望

化学衍生质谱分析方法通过引入衍生反应将待测物转化为易于质谱检测的产物离子,提高了质谱分析的检测灵敏度和选择性,扩大了其在代谢物分析中的适用范围,也使得质谱技术对于多种异构体具有准确区分和定量分析的能力。衍生化反应与高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)、气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术结合已较为成熟,在代谢物异构体分离与检测方面得到了广泛的应用。但化学衍生用于代谢物质谱分析仍具有挑战性:(1)代谢物精细结构解析往往需要进行MS/MS甚至MSⁿ 分析,缺乏高通量的分析方法;(2)现有方法可以对代谢物标准品进行准确区分,但对于复杂的生物组织样品还需进一步提高检测灵敏度;(3)通过未进行预分离的质谱成像技术对异构体空间分布进行表征;(4)生物样品中代谢物异构体的定量分析。

以自由基反应及电喷雾电离过程中发生的微液滴加速化学反应为基础的在线化学衍生质谱分析方法具有操作简便、省时的优点,有望开启质谱快速分析应用的新篇章^[30,31]。新兴的化学衍生质谱成像技术可以对生物组织复杂体系中低丰度、低离子响应代谢物以及精细结构异构体进行可视化表征,因此,对化学衍生质谱成像方法的探索将成为质谱成像技术的发展前沿之一。进一步开发适合于内源性代谢物异构体质谱分析的化学衍生方法,将有助于发现更多的代谢标志物,更好地理解各种生命过程的机制,为疾病早期诊断和潜在药物靶点的发现提供新的依据。

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基金资助

国家自然科学基金项目(21927808)

中国医学科学院医学与健康科技创新工程协同创新团队项目(2017-I2M-3-010)

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Received	Published	Revised
2020-05-22	2021-03-20	2020-08-01
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2020-09-30

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