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基于树状大分子的SPECT成像造影剂的构建及其应用

赵平平 ,  杨军星 ,  施健辉 ,  朱静怡

化学进展 ›› 2021, Vol. 33 ›› Issue (3) :394-405

PDF (5877KB)
化学进展 ›› 2021, Vol. 33 ›› Issue (3) :394-405 DOI: 10.7536/PC200571
综述
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基于树状大分子的SPECT成像造影剂的构建及其应用

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Construction and Application of Dendrimer-Based SPECT Imaging Agent

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摘要

树状大分子具有精准的化学结构,包括小分子内核、多分枝形成的内部空腔以及表面大量的官能团,可用于负载多种纳米颗粒及进行功能化修饰。此外,基于树状大分子的优异性能,具有良好的生物相容性及稳定性,经过功能化修饰后,其可在体内实现较长时间的血液循环和较高的组织特异性。因此,近年来常将树状大分子作为构建SPECT成像造影剂的理想载体使用。通过不同功能基团修饰树状大分子,降低纳米载体的细胞毒性,提高肿瘤部位的富集等,以实现精准高效的SPECT成像。SPECT成像主要通过监测放射性核素的体内分布、流动及代谢情况以在分子层面上监测病灶部位的生理、病理学变化。相比于小分子的放射性核素,以树状大分子为载体构建的SPECT成像造影剂体内循环时间更长,且经过功能化修饰后可实现体内特异性分布。本文围绕各类放射性核素标记的功能化树状大分子进行了详细阐述,并总结归纳其制备方法及生物医学应用。最后,对这类基于树状大分子的SPECT成像造影剂在肿瘤早期诊断中的应用前景进行了展望。

Abstract

Dendrimer owns a precise chemical structure, including a small molecular core, an internal space induced by multiple branches, and large numbers of functional groups on the surface, which can be used to load a variety of nanoparticles and perform functional modification. In addition, based on the excellent properties of dendrimer, it demonstrates good biocompatibility and stability. After functional modification, it could achieve long blood circulation and high tissue specificity in vivo. Therefore, dendrimer has often been used as an ideal carrier for constructing SPECT imaging agents in recent years. Through multifunctional modification with various functional groups, the cytotoxicity of the generated nanocarrier is decreased and its accumulation at tumor site is improved, which faciliates accurate and efficient SPECT imaging. SPECT imaging monitors the physiological and pathological changes of lesions at the molecular level via monitoring the distribution, flow and metabolism of radionuclides in vivo. Compared with small molecular radionuclides, dendrimer-based SPECT imaging agents demonstrate longer circulation time and could achieve specific distribution after functional modification in vivo. In this review, various radionuclides labeled functional dendrimers are described in detail, their preparation methods and biomedical applications are summarized. Finally, the applications of these dendrimer-based SPECT imaging agents in the early diagnosis of tumor are prospected.

Graphical abstract

关键词

分子影像学 / 纳米造影剂 / 树状大分子 / SPECT成像 / 生物医学应用

Key words

molecular imaging / nanoparticle-based contrast agents / dendrimer / SPECT imaging / biomedical application

引用本文

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赵平平, 杨军星, 施健辉, 朱静怡. 基于树状大分子的SPECT成像造影剂的构建及其应用[J]. 化学进展, 2021, 33(3): 394-405 DOI:10.7536/PC200571
Pingping Zhao, Junxing Yang, Jianhui Shi, Jingyi Zhu. Construction and Application of Dendrimer-Based SPECT Imaging Agent[J]. Progress in Chemistry, 2021, 33(3): 394-405 DOI:10.7536/PC200571

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Contents

1 Introduction

2 Dendrimer-based SPECT imaging agents with 99mTc labelling

3 Dendrimer-based SPECT imaging agents with 111In labelling

4 Dendrimer-based SPECT imaging agents with 125I labelling

5 Dendrimer-based SPECT imaging agents with 131I labelling

6 Conclusion and outlook

1 引言

癌症即恶性肿瘤,由细胞增殖机制失控而引起的疾病。基于癌症的局部浸润性及远端转移特性,及早发现及早治疗是治愈癌症最为有效的方法[1⇓⇓⇓~5]。针对癌症的早期诊断,分子影像学技术(Molecular Imaging,MI)是目前临床诊断最为有效的方法之一。其通过影像学方法对活体状态下的生物在细胞和分子水平进行定性和定量研究,利用现有的医学影像技术在不干扰机体生理条件下对机体内部生理或病理过程在分子水平上进行无损伤实时成像,是21世纪影像学研究和癌症治疗的热点[6⇓⇓⇓~10]。

目前分子影像学技术包含两类,即结构成像和功能成像。结构成像主要由超声成像(Ultrasonic Imaging,US)、磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging,MR)、X-射线断层扫描(X-ray Computed Tomography Imaging,CT)和生物发光断层成像(Bioluminescence Tomography,BLT)等组成,可提供肿瘤的解剖学信息[11⇓~13]。功能成像主要包括核医学成像中的正电子发射计算机断层成像(Position Emission Tomography,PET)和单光子发射断层成像(Single Photon Emission Computed Tomography,SPECT),其灵敏度较高,可区别肿瘤和正常组织的代谢差异[14⇓~16]。在众多成像技术中,作为功能成像的SPECT成像技术方法简单、诊断准确率高、灵敏度高、无穿透深度限制、能在分子层面上发现并监测病变组织[17,18]。作为SPECT成像所必须的组成部分,放射性核素起到至关重要的作用。SPECT成像通过监测放射性核素在体内的分布、流动及代谢情况以在分子层面上监测病灶部位的生理、病理学变化[19]。但由于小分子放射性核素在体内循环时间相对较短,很容易代谢出体外,且其无组织特异性,极易吸附或残留在正常组织脏器中,对正常组织具有放射性辐射损伤[20,21]。为了弥补小分子放射性核素的缺点,目前常将放射性核素与纳米载体相结合构建SPECT成像造影剂,通过功能化修饰从而延长其在体内的循环时间并实现其在体内的特异性分布。作为SPECT成像的基本要素,常见的放射性核素包括:锝-99(99mTc)、铟-111(111In)、镓-67(67Ga)、铊-201(201Tl)、碘-125(125I)及碘-131(131I)等,其中99mTc具有较短的半衰期(6 h)和γ发射能量(140 keV)等物理特性。基于其较高的SPECT成像分辨率,可用于短时体内SPECT监测。且基于99mTc潜在的化学性质,可标记多种化学药物以监测放射性治疗进程[22]。111In的半衰期为2.83天(2.83 d),γ发射能量分别为173 keV(89%)和247 keV(95%)。目前临床上已用111In标记多种载体,如单克隆抗体(MAb)和淋巴细胞等,并作为特异性肿瘤或淋巴感染的SPECT成像造影剂使用[23]。67Ga的半衰期为78.3 h,常用于肿瘤和炎症的定位及鉴别。其介导的病灶部位SPECT成像可区分与其重叠的正常组织以减少影像重叠带来的误差,增加了检测的灵敏度[23,24]。201Tl具有相对较长的放射性半衰期(74 h),能够进行长效SPECT成像。且201Tl标记的SPECT成像造影剂可量化胶质瘤的恶性程度,将放射性坏死区域和肿瘤复发区域区分开来[23,24]。125I和131I作为放射性碘的同位素,均具有较长的放射性半衰期。其中125I半衰期为60 d,γ发射能量为28 keV。131I的半衰期为8.01 d,其可同时发射出γ射线(364 keV,81.7%)用于SPECT成像和β射线(0.606 MeV,89.9%)用于放射性治疗[23,24](表1)。

为了构建基于纳米材料的SPECT成像造影剂,目前已有多种纳米载体被选用,如脂质体、介孔硅、树状大分子、胶团、铁蛋白、白蛋白、氧化铁、金纳米粒、超顺磁稀土离子和量子点等[25⇓⇓~28]。在众多纳米载体中,树状大分子具有精准的结构和优良的理化性质可弥补小分子放射性核素在体内作用时的固有缺陷,提高其稳定性、特异性,且延长其在体内的循环时间以实现高效SPECT成像。树状大分子具有精准的分子结构,其由小分子内核、多分枝形成的内部空腔和外围功能基团三部分组成,结构如图1所示。其外围基团能够实现功能分子的修饰、组装使其生物功能化;内部由多分枝结构形成的空腔,可用于多种纳米颗粒及小分子药物的负载[29⇓⇓~32]。此外,基于树状大分子优良的理化性质、良好的水溶性、较强的生物相容性和稳定性,可在体内实现较长时间的血液循环和较高的组织特异性。因此,目前常将树状大分子作为构建SPECT成像造影剂的理想载体使用。

如今,已有多种基于树状大分子的SPECT成像造影剂被开发利用,其能实现肿瘤的精准、高效SPECT成像,且能有效地监测癌症的发生发展及进行预后评估。基于树状大分子的SPECT成像造影剂类型涵盖99mTc标记的树状大分子SPECT成像造影剂、111In标记的树状大分子SPECT成像造影剂、125I标记的树状大分子SPECT成像造影剂和131I标记的树状大分子SPECT成像造影剂,其分别具有不同的功能成像效果。因此,本综述对近年来放射性核素标记的基于树状大分子的SPECT成像造影剂的构建及生物医学应用进行了归纳总结,为开发新型、智能化SPECT成像造影剂用于肿瘤早期诊断提供参考。

2 99mTc标记的树状大分子SPECT成像造影剂

99mTc作为SPECT成像中最常用的γ放射性核素,具有相对较短的半衰期(6 h),较低的注射量及较低的生产成本来源(钼-99(99Mo)/99mTc)。其在功能化树状大分子表面的标记效率较高,并在体内外具有良好的放射性稳定性,小分子99mTc不易从标记物中脱落,其可用于监测药物的药理学及药动学行为及其体内的代谢分布情况[33]。

为了得到一种结构稳定的99mTc 标记的树状大分子用于SPECT成像,Parrott等[22]以对甲苯磺酰乙酯(TSe)为内核,合成了第1代到第8代(G1~G8)脂肪族聚酯树状大分子。随后,通过去除保护剂TSe,得到以羧基(COOH)为核心,表面分别平均修饰32、64、128个苄基二氧化物(O2Bn)基团的G5、G6、G7代脂肪族聚酯树状大分子(COOH-G5-(O2Bn)32、COOH-G6-(O2Bn)64和COOH-G7-(O2Bn)128)。进一步脱去苄基,再利用酰胺化反应,将三齿双(吡啶基)胺(BisPy)配体引入到聚酯树状大分子的羧基内核中,最后通过配体螯合放射性核素99mTc,得到经BisPy基团和32/64/128个羟基功能化,且标记99mTc的G5/G6/G7代功能化聚酯树状大分子([TcBisPy-G5-(OH)32]+、[TcBisPy-G6-(OH)64]+ 和[TcBisPy-G7-(OH)128]+)。研究表明,99mTc标记的G5~G7代聚酯树状大分子可在体内进行实时无损伤的SPECT成像。通过研究其在体内的生物分布情况,可知99mTc标记的G5~G7代聚酯树状大分子可经肾脏迅速有效地从血液中清除,在15 min内几乎完全清除并通过膀胱排出体外,且其与正常组织、脏器不存在特异性结合。这三种聚酯树状大分子的快速清除可能是由于G5、G6、G7代树状大分子的分子量(4.1、7.8、15.2 kDa)远低于肾过滤截留分子量(40~60 kDa),且其水动力学尺寸(<3 nm)低于肾孔半径(5 nm)。此方法构建的99mTc标记的G5/G6/G7代聚酯树状大分子,主要以BisPy配体酰胺化形成的核心作为螯合99mTc的单一高亲合力结合位点,克服了树状大分子与放射性核素多位点结合的缺陷,得到99mTc稳定标记的聚酯树状大分子,提高了其在SPECT成像和临床应用中的实用价值。

Wen等[34]构建了两种多功能的99mTc标记的树状大分子包裹金纳米颗粒(Au NPs)复合物(99mTc-Au DENPs)。依次使用环二亚乙烯三胺五乙酸酐(cDTPAA)和甲氧基聚乙二醇(mPEG)对第5代聚酰胺胺树状大分子(G5.NH2)进行修饰,并以此作为模板络合氯金酸,通过硼氢化钠(NaBH4)还原法合成树状大分子包裹的金纳米颗粒,再将树状大分子表面剩余的末端氨基进行乙酰化或者缩水甘油化。最后以 cDTPAA配体标记99mTc得到乙酰化的99mTc-Au DENPs(99mTc-Au-Ac DENPs)和缩水甘油化的99mTc-Au DENPs(99mTc-Au-Gly DENPs,图2)。在一定浓度范围内([Au] = 0~80 μmol/L), 99mTc-Au DENPs具有良好的胶体稳定性、放射稳定性和生物相容性。

基于G5.NH2独特的化学结构,内部空腔包裹Au NPs,外围通过螯合剂cDTPAA标记99mTc,使得构建的99mTc-Au DENPs具有SPECT/CT双模态成像功能。体内SPECT成像表明,注射0.5 h后,99mTc-Au-Ac DENPs主要存在于肺部,而99mTc-Au-Gly DENPs在心脏、肝脏、肾脏和后腔静脉均检测到SPECT信号,且99mTc-Au-Gly DENPs主要聚集在血液中。随着时间的推移,两种99mTc-Au DENPs最终通过泌尿系统排出体外。其体内分布差异的原因可能是99mTc-Au-Ac DENPs(95.6 ± 5.8 nm)和 99mTc-Au-Gly DENPs(50.4 ± 3.2 nm)的水动力学半径以及表面修饰的官能团不同所造成。由于淋巴系统是大部分癌症转移的共有路径,前哨淋巴结(SLN)成像对于癌症病患的临床治疗具有重要的指导意义。因此,为了探究两种 99mTc-Au DENPs在淋巴结进行SPECT/CT双模态成像的可能性,在家兔左右足分别注射两种99mTc-Au DENPs,SPECT成像结果显示注射1 h后99mTc-Au DENPs主要聚集在腘淋巴结。随着时间的延长,SLN区域逐渐变得清晰明亮,且易于检测,这表明两种99mTc-Au DENPs从注射区域向SLN区域的有效扩散。CT成像结果也表明随着时间的推移,SLN区域逐渐变得清晰,在注射后2 h可以精确地描绘出SLN边界,即使在注射4 h后也可以很容易检测到SLN区域。与传统的蓝色染料和氧化钽纳米颗粒相比,构建的99mTc-Au DENPs同时具有较高的成像分辨率和灵敏度,可实现不同脏器的SPECT/CT双模态成像及癌症转移监测。

Li等[35]以第2代(G2)聚酰胺胺树状大分子(PAMAM)为模板,通过酰胺键将cDTPAA修饰在G2表面,随后修饰功能分子聚乙二醇化的叶酸(PEG-FA),并以此为模板包裹Au NPs,最后利用cDTPAA配体标记放射性核素99mTc。得到的FA靶向的多功能树状大分子包裹纳米金颗粒({(Au0)6-G2-DTPA(99mTc)-PEG-FA} DENPs),可实现体内外靶向高叶酸受体表达(FAR)肿瘤的SPECT/CT成像。研究表明得到的纳米颗粒粒径为1.6 nm,其具有良好的水分散性和胶体稳定性,且在0~4000 nmol/L浓度范围内,细胞相容性良好。基于FA的靶向特异性,构建的{(Au0)6-G2-DTPA(99mTc)-PEG-FA} DENPs能与高叶酸受体表达的癌细胞及肿瘤特异性结合,以实现其在体内外的靶向SPECT/CT成像。体内SPECT成像表明,在注射后相同时间点下,相比于未修饰靶向分子FA的多功能树状大分子包裹的纳米金颗粒{(Au0)6-G2-DTPA(99mTc)-mPEG } DENPs,构建的{(Au0)6-G2-DTPA(99mTc)-PEG-FA} DENPs在肿瘤处的SPECT图像更加明亮且信号强度和肿瘤/肌肉信号比明显更高。注射90 min后,其SPECT信号强度和肿瘤/肌肉信号比分别是非靶向{(Au0)6-G2-DTPA(99mTc)-mPEG} DENPs造影剂的 1.2倍和1.6倍(图3)。因此,基于FA的功能化修饰,{(Au0)6-G2-DTPA(99mTc)-PEG-FA} DENPs可作为靶向纳米探针,实现卵巢癌、肺癌、胶质瘤等高叶酸受体表达肿瘤的SPECT/CT双模态成像。

Xing等[36]将 1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)、聚乙二醇化的耐久霉素(PEG-duraycin)、甲氧基-聚乙二醇-羧基(mPEG-COOH)及异硫氰酸荧光素(FI)等基团依次修饰在第5代(G5)PAMAM表面形成多功能化的树状大分子。随后,以此为模板包裹Au NPs,再将树状大分子表面剩余氨基乙酰化,最后通过DOTA螯合剂标记99mTc,得到99mTc标记的耐久霉素功能化树状大分子包裹纳米金颗粒(99mTc-duramycin-Au DENPs)。研究表明,在一定浓度范围内([Au] = 20~100 μmol/L),构建的 99mTc-duramycin-Au DENPs具有良好的放射稳定性、胶体稳定性及细胞相容性。最重要的是,这种多功能纳米探针能够对体外凋亡的癌细胞以及经阿霉素(DOX)治疗后的肿瘤凋亡进行靶向SPECT/CT成像。通过在体内建立皮下移植瘤模型,观察DOX治疗后肿瘤细胞的凋亡情况,从而评价99mTc-duramycin-Au DENPs对体内肿瘤细胞凋亡后的SPECT/CT成像能力。研究发现DOX治疗前,荷瘤鼠肿瘤部位并未发现99mTc-duramycin-Au DENPs或99mTc标记的未经耐久霉素修饰的树状大分子包裹纳米金颗粒(99mTc-Au DENPs),表明耐久霉素对正常肿瘤细胞没有特异性。然而,经DOX治疗3 d后,观察注射99mTc-duramycin-Au DENPs和99mTc-Au DENPs的小鼠体内SPECT成像图可知,注射2 h后,每个时间点下的99mTc-duramycin-Au DENPs肿瘤SPECT信号强度均明显高于99mTc-Au DENPs,并在注射后8 h达到峰值,12 h仍能获得较清晰的SPECT图像。对分别注射99mTc-Au DENPs和99mTc-duramycin-Au DENPs的荷瘤鼠在8 h后进行组织分布研究,发现功能化树状大分子主要聚集在肝脏和脾脏中,而肺部、心脏、肾脏、肠、胃和软组织的积累量相对较低。相比于99mTc-Au DENPs,99mTc-duramycin-Au DENPs具有更高的肿瘤富集量,进一步证明修饰有耐久霉素的树状大分子具有特异性靶向作用(图4)。体内CT成像结果也证实99mTc-duramycin-Au DENPs可作为靶向纳米探针用于监测肿瘤早期化疗。综上所述,构建的99mTc-duramycin-Au DENPs可作为监测早期化疗反应的纳米探针用于肿瘤细胞凋亡后的SPECT/CT成像。

99mTc是目前在核医学成像中最常用的放射性核素,因其具有较高的灵敏度能够进行有效成像,并且对患者的辐射危害低,已有超过80%的放射性药物中含99mTc。根据上述总结归纳的99mTc标记的树状大分子SPECT成像造影剂可知,其存在构建方法上的共同点。首先,其均是利用树状大分子作为纳米模板,以有效调控成像造影剂的尺寸便于从体内有效代谢。其次,通过修饰多种功能分子(如:O2Bn、mPEG、乙酰基、缩水甘油基、叶酸等)可有效调控其在体内的生物医学分布,进而实现SPECT成像造影剂在体内的功能成像。最后,为将放射性核素99mTc标记于功能化树状大分子上,常使用配体螯合剂(如:BisPy、cDTPAA、DOTA)以实现放射性核素99mTc的高效、稳定标记。目前已经构建的99mTc标记的树状大分子SPECT成像造影剂,通过在树状大分子表面修饰靶向分子等功能基团,能够有效地提高放射性标记物在肿瘤部位的富集,以便进行即时灵敏的肿瘤SPECT成像监测。与此同时,也减少了对正常组织器官的辐射伤害。在众多放射性核素中,99mTc是目前最常用于SPECT成像的放射性核素,这基于其潜在的化学性质及独特的物理性质,如较短的半衰期(6 h)和低能的γ射线(140 keV),其更有利于在体内进行短时、有效的SPECT成像且具有良好的辐射安全性,能较快地衰减完毕。但由于99mTc标记的复合物放射性半衰期较短,导致其在体内只能进行短时的SPECT成像,难以实现长期监测及治疗后的预后评估。因此如何实现更好的长效成像效果,提高基于树状大分子的SPECT成像造影剂的血液循环时间仍然需要进一步研究。

3 111In标记的树状大分子SPECT成像造影剂

111In是临床上应用于SPECT成像的放射性同位素,半衰期为2.83 d。因为具有与钇(90Y)相似的配位化学性质,111In标记的放射性示踪剂常被用作成像替代物,测定相应的90Y类似物的生物分布和剂量。111In标记的载体,如博来霉素、淋巴细胞和单克隆抗体(MAb)等,已经作为靶向肿瘤或针对淋巴细胞感染的显像剂进行相关研究[23]。

Biricova等[37]将第1代(G1)和第4代(G4)的PAMAM与10-[(4-羧基-1-氧化吡啶基)甲基] -1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三乙酸(H4do3a-pyNO-C)通过吡啶-4-羧酸基团进行共价键合,并标记放射性核素111In制备得到了表面修饰H4do3a-pyNO-C基团并标记111In的G1-PAMAM和G4-PAMAM(G1-[111In(do3a-pyNO-C)]和G4-[111In(do3a-pyNO-C)])。为了优化放射性标记的条件,探究了缓冲液类型、pH值和反应温度对放射性产物G1-[111In(do3a-pyNO-C)]、G4-[111In(do3a-pyNO-C)]的产率和纯度的影响。研究发现,在30 ℃反应条件下,pH=5.0的乙酸缓冲液(0.2 mol/L)中,G1-[111In(do3a-pyNO-C)]和G4-[111In(do3a-pyNO-C)]的放射性化学纯度高于95%。且其放射性化合物的动力学稳定性研究表明,G1-[111In(do3a-pyNO-C)]和G4-[111In(do3a-pyNO-C)]在制备后48 h内稳定,即使在竞争性配体乙二胺四乙酸(EDTA)或二乙烯三胺五乙酸(DTPA)存在的情况下,48 h内两种放射性化合物的化学纯度仅降低约4%~7%,结果表明,G1-[111In(do3a-pyNO-C)]和G4-[111In(do3a-pyNO-C)]均具有较高的放射性化学纯度和放射性稳定性。且通过评价这两种药物在大鼠体内的药代动力学和生物分布情况可知, G1-[111In(do3a-pyNO-C)] 给药后,在最短时间间隔内(5 min)主要富集在肾脏,并表现出相对较快的血液清除率。在注射后2 h,血液中仅存0.51%±0.07%的放射剂量。而G4-[111In(do3a-pyNO-C)]在肝脏和肾脏中存在长期显著的放射性摄取,在注射后48 h,仍有20.56%±2.59%和5.85%±0.58%的放射剂量存在于肝脏和肾脏中(图5)。研究发现,G1-[111In(do3a-pyNO-C)]主要通过尿液从体内迅速清除,而G4-[111In(do3a-pyNO-C)]在注射48 h后仅有一小部分经过尿液排出体外,仍有大部分放射性药物残留在体内。相比之下,G1-[111In(do3a-pyNO-C)]具有更好的生物分布和代谢特性,而G4-[111In(do3a-pyNO-C)]在肝脏和肾脏中的放射性积累,限制了其在核医学成像中的应用。

Kobayashi等[38]使用2-(对异硫氰酸苯甲酰基)-6-甲基二乙烯三胺五乙酸(1B4M)与G2-PAMAM结合,得到表面平均有14.3个1B4M修饰的树状大分子PAMAM-1B4M,并将其与过量的磺基丁二酰亚胺基6-[3-(2-吡啶二硫基)丙酰胺]己酸盐(磺基-LCSPDP)及固体二硫苏糖醇反应,过滤纯化得到含巯基的PAMAM-1B4M。与此同时,将磺基琥珀酰亚胺酰4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸盐(磺基SMCC)与人源化抗体HuTac反应得到磺基SMCC修饰的HuTac(SMCC-HuTac)。随后将含巯基的PAMAM-1B4M与SMCC-HuTac偶联,采用高效液相色谱法(HPLC)及尺寸排阻色谱法(SEC)分离纯化得到人源化抗体和1B4M修饰的树状大分子(HuTac-PAMAM-1B4M)。最终使用放射性核素111In和钇-88(88Y)标记PAMAM-1B4M或HuTac-PAMAM-1B4M得到每个树状大分子含有不到一个放射性核素(111In/88Y)标记的不饱和制剂。随后利用冷铟和氯化钇以同样的方法制备了111In/88Y标记的饱和PAMAM-1B4M和HuTac-PAMAM-1B4M,放射性标记率高于85%。研究表明,饱和制剂和不饱和制剂在荷瘤鼠体内的生物分布有所差别。以111In-HuTac-1B4M 作为对照,对注射111In 标记的饱和/不饱和HuTac-PAMAM-1B4M化合物的正常小鼠、A431荷瘤鼠和ATAC4荷瘤鼠进行了研究。发现111In标记的不饱和PAMAM-1B4M大多数时间点的蓄积量明显高于饱和制剂在肝脏、肾脏、脾脏及骨中的蓄积量。111In标记的HuTac-PAMAM-1B4M饱和制剂的肝脏摄取量(27%±2% ID/g)低于不饱和制剂(32% ± 2% ID/g),但高于111In-HuTac-1B4M对照组(10% ± 0% ID/g)。且 111In标记的饱和/不饱和HuTac-PAMAM-1B4M的血液清除率均高于111In标记的HuTac-1B4M。HuTac-PAMAM-1B4M在荷瘤鼠与正常小鼠体内的生物分布相似,但在特异性肿瘤ATAC4中的积累量明显高于非特异性肿瘤A431。放射性标记的PAMAM-1B4M及HuTac-PAMAM-1B4M在肝脏、肾脏及脾脏中的累积会随着螯合物被稳定元素饱和而降低,表明PAMAM自身的性质会导致生物分布的差异。

目前构建的111In标记功能化树状大分子常作为SPECT成像示踪剂所使用,基于其较高的放射性标记效率及放射性稳定性,可实现在体内的生物医学应用。111In标记的树状大分子SPECT成像造影剂的构建方法大同小异。基于树状大分子纳米平台,将各功能分子及标记载体修饰在其表面,随后标记放射性核素111In得到对应的SPECT成像造影剂。基于不同代数树状大分子之间在体内生物分布及代谢方面的差异,可获得功能各异的SPECT成像造影剂。特异性抗体(如HuTac)的修饰可使功能化树状大分子高效富集于特异性肿瘤(如ATAC4)中。总体而言,引入树状大分子作为纳米平台标记放射性核素111In不仅使其具有较高的放射性标记效率及稳定性,还能调控其在体内的分布及代谢情况,赋予其功能化。由于放射性核素111In自身半衰期为2.83 d,长短较为适中,为实现其在体内SPECT成像效果最大化,在设计111In标记的树状大分子SPECT成像造影剂时常匹配选择在体内具有适中血液半衰期的纳米载体(如:不同代数的树状大分子),减少PEG的修饰以避免其在体内的长时间滞留,以有效进行SPECT成像及其在体内的生物医学监控。尽管通过功能化修饰及不同代数树状大分子的选择可优化其SPECT成像效果,但也存在诸多缺陷,如其代谢后不能迅速从体内排出,导致成像质量下降。此外,不同功能化树状大分子自身结构及物理特性的差异会造成111In标记的功能化树状大分子在体内各脏器的生物分布有所差异,进而影响SPECT成像效果。因此,如何提高111In标记的树状大分子SPECT成像造影剂在体内特定组织的特异性分布,减少非特异性脏器的积累及摄取进而提高目标组织的SPECT成像效率极为重要。目前,在构建新型功能化树状大分子标记载体方面仍需要深入研究,为日后构建精准高效的SPECT成像造影剂奠定基础。

4 125I标记的树状大分子SPECT成像造影剂

相较于其他放射性核素,125I具有极长的半衰期(60 d)和较低的γ发射能量(27.4~35.4 keV),常作为动物放射性免疫分析或临床前体内实验的标记物所使用。与其他基于碘的放射性同位素(如123I、124I)相似,125I的应用范围广泛,基于其自身低能内转换电子,可进行放射自显影,可用于甲状腺肿瘤活组织检查[23,24]。

Malik等[39]运用几类常见的树状大分子,包括PAMAM、以1,4-丁二胺(DAB)或乙二胺(DAE)为核心的聚丙烯亚胺树状大分子、碳硅烷接枝的环氧乙烷树状大分子(CSi-PEO)(图6),通过标记放射性125I从而系统地研究树状大分子的代数及表面功能基团对其体外生物性能的影响。研究结果表明,通常带有氨基末端的PAMAM树状大分子表现出浓度和代数依赖性溶血,即使在低浓度(10 μg/mL)条件下,1 h后也能观察到红细胞形态的改变。在浓度低于1 mg/mL时,CSi-PEO树状大分子和带有羧基(COOH)末端的树状大分子既没有溶血,也没有细胞毒性。总得来说,表面具有氨基的PAMAM阳离子型树状大分子在孵化72 h时具有细胞毒性,其半致死量(IC 50)约为50~300 μg/mL,IC 50值的大小取决于树状大分子的类型、代数及选用的细胞类型。静脉注射125I标记的第3代、第4代表面修饰有氨基的阳离子型PAMAM(10 μg/mL)至大鼠体内,观察发现注射1 h后血液中的剂量小于2%,表明其可从血液循环中快速清除。

而第2.5代、3.5代、5.5代表面修饰有羧基的阴离子型PAMAM树状大分子体内循环时间较长,注射1 h后血液中的剂量达到20%~40%,且阴离子型PAMAM的血液清除率与树状大分子的代数相关,越低的代数具有越长的血液循环时间。阴、阳离子型树状大分子在注射1 h后,其血液中的含量与大鼠的肝脏摄取量(约30%~90%)有关。因此,在需要靶向其他病灶部位(如肿瘤)时减少肝脏的摄取,需要精心设计树状大分子的结构从而优化其在体内的分布。

Wiwattanapatapee等[40]利用大鼠肠囊外翻系统,研究了125I标记的阳离子型和阴离子型PAMAM树状大分子的尺寸、电荷和浓度对大鼠体外小肠吸收和转运的影响。首先,使用波顿-亨特试剂羟苯基丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯对第3代、第4代表面修饰氨基的阳离子型PAMAM(G3、G4)和第2.5代、第3.5代、第5.5代表面修饰羧基的阴离子型PAMAM(G2.5、G3.5、G5.5)进行放射性125I标记,得到放射性核素125I标记的各类PAMAM。随后,在体外将这些125I标记的树状大分子(10~100 μg/mL)与成年大鼠体外肠囊外翻系统一起孵育2 h,随着时间的推移,放射性转移到组织和浆膜液中。研究结果表明,所有代数的阴离子型PAMAM的浆膜转移率都非常高,其每小时每毫克蛋白转移含树状大分子的培养基体积为3.4~4.4 μL(EI = 3.4~4.4 μL/mg protein/h)。当树状大分子浓度在10~100 μg/mL时,浆膜转移率与其浓度呈线性关系。但相比于 125I标记的阴离子型G2.5和G3.5(EI = 0.6~0.7 μL/mg protein/h), 125I标记的阴离子型G5.5(EI = 2.48 ± 0.51 μL/mg protein/h)的组织摄取率更高。 125I标记的阳离子型PAMAM(含G3和G4)的组织摄取率(EI = 3.3~4.8 μL/mg protein/h)高于浆膜转移率(EI = 2.3~2.7 μL/mg protein/h),这可能是由于组织黏膜表面对阳离子型PAMAM的非特异性吸附所导致。由于 125I标记的阴离子型PAMAM在大鼠肠囊外翻系统中的浆膜转移率高于其他合成大分子,因此阴离子型PAMAM具有巨大的潜力可发展为口服给药系统。

目前构建的125I标记的树状大分子SPECT成像造影剂主要用于分析研究其在体内的生物医学性能及其分布情况,具有良好的成像指导及示踪作用。目前已知的125I标记的树状大分子SPECT成像造影剂常对比不同代数及表面基团对其生物性能的影响,评估其在体内的血液循环时间及其脏器分布、吸收情况。在造影剂的构建方面,常使用酪氨酸及其类似物(如羟苯基丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯)作为螯合剂进行125I标记,标记产物具有较高的放射性标记效率及良好的放射性稳定性。基于125I较长的放射性半衰期(60 d),其可支持体内长时间的放射性成像示踪。因此,为了有效监测125I标记的功能化树状大分子在体内的分布情况,常通过不同表面基团的修饰及选取不同种类及代数的树状大分子进而提高其在体内的生物相容性,并调控其在体内的血液循环时间以尽可能地延长其在体内的SPECT监测时间。通过此种设计策略构建的125I标记树状大分子SPECT成像造影剂可在体内进行长期监测及治疗后的预后评估。但也存在缺陷,125I价格昂贵,是131I的3~4倍;其长达60 d的半衰期在体内应用中对各组织脏器具有长期的放射性辐射作用,完全衰减完所需时间更长。因此,为减少125I的辐射损伤及优化其在体内的生物分布以实现特异性成像监测作用,在构建新型125I标记的树状大分子SPECT成像造影剂以改善其在体内的生物分布方面、降低辐射损伤方面仍需进一步研究。

5 131I标记的树状大分子SPECT成像造影剂

基于放射性131I可同时发射出γ射线及β射线分别用于SPECT成像和放射性治疗,其在进行放射性治疗的同时进行SPECT成像示踪作为指导。但小分子放射性131I由于自身的性质仅对甲状腺具有较强的亲合性,但对其他组织及病灶部位无组织特异性。因此,其常用于监测及治疗甲状腺癌,这极大地限制了放射性核素131I的应用范围。树状大分子作为优良的纳米平台,具有良好的生物相容性及可功能修饰性等特点,可赋予131I一定的组织特异性并提高其放射性稳定性,进而在体内实现不同类型肿瘤的SPECT成像和放射性治疗,以拓宽其生物医学应用范围。

Zhu等[41]以G5.NH2为载体,在其表面修饰3-(4-羟基苯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(HPAO)和聚乙二醇化的叶酸(PEG-FA),并乙酰化树状大分子表面剩余的氨基,最后将131I通过HPAO标记在功能化树状大分子表面,制备得到了放射性131I标记的功能化树状大分子131I-G5.NHAc-HPAO-PEG-FA(图7)。研究表明,每个功能化树状大分子表面平均修饰了9.4个HPAO。得到的功能化树状大分子具有良好的生物相容性,在浓度高达20 μmol/L时仍无细胞毒性,且能与高叶酸受体表达的癌细胞特异性结合。基于HPAO的苯酚结构,放射性 131I可有效地标记在酚羟基的邻位,从而间接地标记在功能化树状大分子的表面。得到的131I-G5.NHAc-HPAO-PEG-FA具有较高的放射性稳定性和放射性化学纯度,且具有良好的靶向高叶酸受体表达肿瘤的SPECT成像及放射性治疗的功效。这种利用树状大分子纳米技术与放射性核素相结合的策略,为开发应用于不同类型癌症的SPECT成像和放射性治疗的纳米平台提供了新方向。

Cheng等[42]将G5.NH2和甲氧基-聚乙二醇-羧基(mPEG-COOH)通过EDC偶联反应制备得到G5.NH2-mPEG,随后在G5.NH2表面修饰马来酰亚胺-聚乙二醇-琥珀酰亚胺戊酸酯(MAL-PEG-SVA)、东亚钳蝎氯毒素(BmK CT-SH)以及HPAO得到功能化树状大分子G5.NH2-HPAO-(PEG-BmK CT)-(mPEG)。之后将树状大分子表面剩余氨基乙酰化,最后用三水合氯胺(ch-T)法标记放射性核素131I,得到产物131I-G5.NHAc-HPAO-(PEG-BmK CT)-(mPEG)。通过瞬时薄层色谱法(ITLC)表征发现,得到的131I-G5.NHAc-HPAO-(PEG-BmK CT)-(mPEG)放射性化学纯度达到99.5%±0.7%。即使将其溶解于磷酸盐缓冲液(PBS)或胎牛血清(FBS)中长达24 h,其放射性化学纯度也高于91%。结果表明131I-G5.NHAc-HPAO-(PEG-BmK CT)-(mPEG)具有良好的放射性化学纯度和放射稳定性。构建的功能化树状大分子G5.NHAc-HPAO-(PEG-BmK CT)-(mPEG)对大鼠肺上皮Ⅱ型细胞系(RLE-6TN)和C6胶质瘤细胞在一定浓度范围内(0.1~50 μmol/L)无细胞毒性,RLE-6TN和C6细胞活性均超过90%。基于BmK CT能与神经胶质瘤细胞表面的基质金属蛋白酶-2(MMP-2)受体特异性结合[43⇓~45],因此131I-G5.NHAc-HPAO-(PEG-BmK CT)-(mPEG)在体内外对神经胶质瘤细胞均表现出良好的靶向特异性。尤其是体内SPECT成像结果表明,注射15 h后,构建的131I-G5.NHAc-HPAO-(PEG-BmK CT)-(mPEG)在肿瘤部位的富集量达到峰值,比非BmK CT修饰的功能化树状大分子131I-G5.NHAc-HPAO-(PEG-MAL)-(mPEG)在肿瘤部位表现出明显更强的SPECT信号。且在注射后各时间点下,131I-G5.NHAc-HPAO-(PEG-BmK CT)-(mPEG)在肿瘤部位的SPECT信号值均高于非BmK CT靶向的131I-G5.NHAc-HPAO-(PEG-MAL)-(mPEG)在肿瘤部位的SPECT信号值(图8)。131I除了具有SPECT成像作用,也具有放射性治疗的功能。通过评价肿瘤增长速率发现经131I-G5.NHAc-HPAO-(PEG-BmK CT)-(mPEG)治疗后的C6荷瘤鼠肿瘤的生长速率明显低于其他试剂(Na131I、131I-G5.NHAc-HPAO-(PEG-MAL)-(mPEG))处理的C6荷瘤鼠肿瘤生长速率(图9),体现了BmK CT的修饰极大增强了131I-G5.NHAc-HPAO-(PEG-BmK CT)-(mPEG)在肿瘤部位的特异性富集,从而提升其抗肿瘤效果。构建的131I-G5.NHAc-HPAO-(PEG-BmK CT)-(mPEG)不仅能实现其靶向神经胶质瘤SPECT成像的作用,还具有靶向放射性治疗的功效。

Zhao等[46]同样以G5.NH2树状大分子为纳米平台,以mPEG-COOH和MAL-PEG-SVA修饰的功能化树状大分子G5.NH2-(PEG-MAL)-(mPEG)为模板,将靶向试剂氯毒素(CTX)通过MAL-PEG-SVA中的马来酰亚胺基团(MAL)间接连接在功能化树状大分子表面,再进一步修饰HPAO,最终标记放射性131I得到CTX靶向的放射性诊疗试剂131I-G5.NHAc-HPAO-(PEG-CTX)-(mPEG)。研究表明,每个功能化树状大分子表面平均负载约7.7个CTX和21.1个HPAO,且其在一定浓度范围内(0~20 μmol/L)具有良好的细胞相容性。基于CTX的表面修饰,得到的 131I-G5.NHAc-HPAO-(PEG-CTX)-(mPEG)能够与MMP2过表达的癌细胞特异性结合,从而实现靶向神经胶质瘤SPECT成像和放射性治疗。

目前构建的131I标记的树状大分子SPECT成像造影剂在一定程度上拓宽了其核医学应用范围,可针对不同类型肿瘤实现良好的SPECT成像及放射性治疗效果。其构建方法和思路与125I标记的树状大分子SPECT成像造影剂相似,在经过功能化修饰后的树状大分子表面共价键合酪氨酸类似物HPAO以有效、稳定标记131I于HPAO的苯酚结构上。基于树状大分子的纳米模板,常将生物相容性分子(如PEG)及靶向试剂(如:FA、BmK CT、CTX等)修饰于其表面以提高其在体内的生物相容性及赋予其肿瘤靶向特异性。利用树状大分子这样的纳米中介,可将131I有效、稳定地带入病灶部位进行SPECT成像及放射性治疗。目前,基于131I 自身的理化性质,相对较长的放射性半衰期(8.01 d)及可同时发射出γ射线及β射线分别用于SPECT成像和放射性治疗的特性,以G5.NH2树状大分子为纳米平台,常用功能化PEG及靶向试剂(如:FA、BmK CT、CTX等)进行修饰以延长纳米载体在体内的血液循环时间并提高病灶部位的富集度,从而延长体内SPECT成像时间及提高放射性治疗效率。且使用分子量越大的PEG,功能化树状大分子在体内的滞留时间越长。通过该种功能化修饰手段可设计构建出有效契合131I应用需求的SPECT成像造影剂。基于树状大分子的纳米技术可实现其在体内的长时间循环,有利于提升其在肿瘤部位的富集。但也存在未完善之处,大部分的纳米颗粒仍然逃脱不了网状内皮系统(如肝脏、脾脏等)的摄取,仍然会在正常组织脏器中有所富集,这就减少了其在肿瘤部位的滞留,从而影响SPECT成像及放射性治疗的效率。因此,如何减少网状内皮系统的摄取从而进一步提升SPECT成像精确度及放射性治疗效率仍需深入研究,这也为后续构建新颖智能化SPECT成像造影剂提供思路。

6 结论与展望

本文总结了基于树状大分子的SPECT成像造影剂的构建及其生物医学应用,详细阐述了99mTc、111In、125I及131I标记的树状大分子SPECT成像造影剂的开发及其体内外独特的核医学性质。通过对这些放射性核素进行比较可知,其分别具有不同的放射性半衰期及发射能量,根据放射性半衰期的差异从而选取合适的功能化树状大分子纳米载体以调控其在体内的SPECT成像时间。如99mTc是目前最常用于SPECT成像的放射性核素,其放射性半衰期(6 h)较短且发射出的γ射线能量(140 keV)较低。这也导致其在体内只能进行短时的SPECT成像,无法进行体内长期SPECT监测及治疗后的预后评估。但其体内短时的核医学衰变也保证了其在体内辐射的安全性。111In虽然具有适中的放射性半衰期(2.83 d),但其在国内基础研究及临床应用较少,究其原因在于制备成本较高,从国内获取困难,国外进口价格昂贵,远不如99mTc应用广泛。其次,111In发射能量较高,体内辐射安全不如99mTc。125I与131I虽均为放射性碘的同位素,但其物理化学性质差别较大,125I的放射性半衰期(60 d)远大于131I的放射性半衰期(8.01 d),这就意味着125I更适合用于长期的体内成像监测及预后,但其对生物体的辐射损伤时间也较长,有利有弊。其次,125I具有优于131I的SPECT成像分辨率,成像效果相对较好。131I基于其可同时具有SPECT成像功能和放射性治疗效用,常在进行放射性治疗的同时以SPECT成像作为示踪指导,边治疗边监测,使用方便。但131I的SPECT成像分辨率较低,难以进行精准成像。虽然各类放射性核素具有独特的物理化学性质及其应用范围,但若想达到最优的体内SPECT成像效果,也要结合负载该核素的功能化树状大分子纳米平台,匹配核素的放射性半衰期及功能化树状大分子的体内血液半衰期,在完成体内最优SPECT成像后代谢出体外。

通过总结归纳各类放射性核素标记的树状大分子SPECT成像造影剂的功能特性可知,基于树状大分子纳米技术及其优良的理化性质,可作为纳米平台高效的标记各类放射性核素,通过功能化修饰可提升放射性核素标记物的放射性稳定性、生物相容性及其在病灶部位的富集量。与此同时,根据各类SPECT成像造影剂的需要适当调整其在体内的循环时间及其组织分布,从而提升SPECT成像效率。目前已开发的各类放射性核素标记的树状大分子SPECT成像造影剂已明显改善小分子核素在体内生物医学应用中的种种缺陷。但仍然存在不足之处,尽管SPECT成像灵敏度较高,但相较于其他成像模式其空间分辨率仍然较低,需要与其他成像模式辅助配合,通过构建多模态成像以弥补其成像分辨率方面的不足。因此,构建更为精准且灵敏度较高的基于树状大分子的多模态成像造影剂以弥补SPECT成像模式的缺陷成为今后的研究重点,将为实现精准高效诊断奠定基础。

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基金资助

国家自然科学基金项目(21807059)

江苏省自然科学基金项目(BK20180711)

江苏省高等学校自然科学研究面上项目(17KJB350005)

江苏省研究生科研与实践创新计划项目(KYCX20_1122)

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