DNA中醛基嘧啶的化学检测

周倩; 李娜; 李坤; 余孝其

doi:10.7536/PC200606

化学进展 ›› 2020, Vol. 32 ›› Issue (11) :1634-1650 DOI: 10.7536/PC200606

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DNA中醛基嘧啶的化学检测

周倩 ¹^,² ,
李娜 ² ,
李坤 ² ,
余孝其 ¹^,²^,^**

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Detection of 5-Formylpyrimidines in DNA Based on Chemoselective Labeling

Qian Zhou ¹^,² ,
Na Li ² ,
Kun Li ² ,
Xiaoqi Yu ¹^,²^,^**

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摘要

基因组DNA除A、G、T、C四大经典碱基外,还存在上百种稀有碱基。其中,醛基嘧啶(5-醛基胞嘧啶和5-醛基尿嘧啶)是DNA中天然存在的嘧啶类修饰碱基,在哺乳动物细胞中广泛分布。5-醛基胞嘧啶除参与DNA主动去甲基化过程外,还具备独立的表观遗传功能;而5-醛基尿嘧啶通常被认为是一种基因毒性很高的DNA氧化损伤。根据醛基嘧啶的特征结构,有针对性地开发准确、灵敏和简便的检测方法,从全基因组范围内对他们进行定性、定量和区域定位,是进一步明确这类碱基修饰物调控机制的基础和前提。本文从选择性化学标记的角度总结了近年来醛基嘧啶检测方法的研究进展。

Abstract

In addition to the four canonical nucleobases of A, G, T and C, hundreds of chemical modifications have been identified in genome DNA. Among them, 5-formylpyrimidines, including 5-formylcytosine(5fC) and 5-formyluracil(5fU), are naturally occurring pyrimidine-covalent-modifications and are widely distributed in mammalian cells. Emerging evidence indicates that 5fC not only serves as a key intermediate in active DNA demethylation but also carry independent epigenetic significance; while 5fU was always considered to be an oxidative DNA lesion with high genotoxicity. In order to further understand their regulatory functions, it is necessary to develop accurate, sensitive and facile methods for qualitative, quantitative, and localized detection of 5-formylpyrimidines in the whole genome. In this review, we summarized the recent progress in detecting 5-formylpyrimidines from the perspective of selective chemical labeling.

Contents

1 Introduction

1.1 DNA methylation and demethylation

1.2 5-Formylcytosine and 5-formyluracil

1.3 Detection methods of 5-formylpyrimidines

2 Detection of 5-formyluracil based on chemoselective modification

2.1 Fluorescent labelling of 5-formyluracil

2.2 Enrichment and sequencing of 5-formyluracil

3 Detection of 5-formylcytosine based on chemoselective modification

3.1 Fluorescent labelling of 5-formylcytosine

3.2 Enrichment and sequencing of 5-formylcytosine

4 Conclusion and outlook

Graphical abstract

关键词

5-醛基胞嘧啶 / 5-醛基尿嘧啶 / 荧光探针 / DNA测序

Key words

5-formylcytosine(5fC) / 5-formyluracil(5fU) / fluorescent sensor / DNA sequencing

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周倩, 李娜, 李坤, 余孝其. DNA中醛基嘧啶的化学检测[J]. 化学进展, 2020, 32(11): 1634-1650 DOI:10.7536/PC200606

Qian Zhou, Na Li, Kun Li, Xiaoqi Yu. Detection of 5-Formylpyrimidines in DNA Based on Chemoselective Labeling[J]. Progress in Chemistry, 2020, 32(11): 1634-1650 DOI:10.7536/PC200606

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1 引言

表观遗传学(Epigenetics)作为经典遗传学的补充,意指DNA序列不发生改变的前提下,基因的表达水平与功能发生改变,并产生可遗传的表型,例如受精卵分化成不同的细胞类型,又如同卵双生儿在性格、体质和疾病易感性等诸多方面表现出差异,再如“橘生淮南则为橘,生于淮北则为枳,叶徒相似而味不同”。基因组依赖核苷酸序列编码遗传信息,而表观基因组则通过附着在基因组上的化学修饰记载表观遗传信息^{[1,2,3,4,5,6]}。其中,DNA甲基化是目前为止研究得最为广泛、最为透彻的一种表观遗传修饰^{[7, 8]}。甲基化修饰的动态平衡是保证机体正常生长发育所必需的,否则将导致多种疾病甚至癌症的发生,例如原癌基因的甲基化状态过度丢失或者抑癌基因的异常高甲基化均是肿瘤发生的标志性事件之一^[9,10,11],其他疾病,包括肥胖、糖尿病、阿尔茨海默症以及帕金森综合征等也与特定基因的异常甲基化密切相关^{[12,13,14,15]}。

1.1 DNA甲基化与去甲基化

DNA甲基化通常是指DNA甲基转移酶以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体在胞嘧啶5位碳上添加甲基形成5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine, 5mC)的过程,并且此过程是动态可逆的,即DNA去甲基化。DNA去甲基化可分为被动和主动两种不同的形式。前者是由于DNA甲基化维持机制受到抑制,例如DNMT1失活,DNA甲基化水平在DNA的连续半保留复制过程中被逐渐稀释;后者是指在TET等多种酶的参与下,5mC被持续氧化并经由一系列中间体和多种途径最终还原为胞嘧啶,具体过程见图1:首先5mC被TET蛋白逐步氧化为5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine, 5hmC)、5-醛基胞嘧啶(5-formylcytosine, 5fC)及5-羧基胞嘧啶(5-carboxylcytosine, 5caC);随后5fC和5caC被胸腺嘧啶糖基转移酶(thymine DNA glycosylase, TDG)特异性识别并切除,最后通过碱基清除修复(base excision repair, BER)将胞嘧啶重新补充在该位点;另一方面,5hmC可在活化诱导脱氨酶AID/APOBEC1的作用下脱去氨基形成5-羟甲基尿嘧啶(5-hydroxymethyluracil, 5hmU),再经由TDG、BER途径实现该位点胞嘧啶的恢复;此外,最新研究表明,5fC和5caC可直接通过去醛基或去羧基还原为胞嘧啶^[16,17,18];5-醛基尿嘧啶(5-formyluracil, 5fU)作为5fC脱氨产物与鸟嘌呤发生错配时能被TDG识别并清除^[19,20,21],暗示着5fU也可能是主动去甲基化的中间体,这些新发现为DNA主动去甲基化提供了潜在途径。

1.2 5-醛基胞嘧啶与5-醛基尿嘧啶

5fC和5fU作为DNA主动去甲基化过程的重要中间体或潜在中间体,对于维持DNA甲基化动态平衡至关重要。而最新的研究表明,醛基嘧啶的表观遗传学“身份”并不局限于脱甲基中间体^[22]。Balasubramanian及Carell等^{[23, 24]}已经证明大多数5fC在哺乳动物细胞中可稳定存在;5fC在内含子、外显子、启动子等功能重要的基因区域靶向富集,并能改变DNA双螺旋结构,增加DNA灵活性,影响RNA聚合酶Ⅱ延伸^{[25,26,27,28,29,30,31,32,33]};还能募集与基因转录、DNA修复及染色质调控相关的蛋白,并能通过Schiff-base反应共价结合到组蛋白的氨基酸残基上^{[34,35,36,37,38]}。这些事实表明,5fC极有可能是一种全新的表观遗传修饰,直接参与基因表达调控。而5fU曾经一度被认为是一种基因毒性很高的DNA氧化损伤^[39,40,41],由紫外线、电离辐射和Fenton试剂等活性氧刺激作用于胸腺嘧啶T产生。与C5位为甲基的胸腺嘧啶相比,C5位为醛基的5fU其N3位酸性明显增强,在DNA复制过程中易与G、C、T形成错配,造成基因突变^{[20, 42, 43]};此外,5fU的活泼醛基易与含氨基、巯基的化合物偶联引入新的碱基修饰损伤。最近的研究表明,与TET连续氧化5mC生成5fC类似,JBP、NgTET1及胸腺嘧啶-7羟化酶(Thymine-7-hydroxylase, T7H)似乎也能以T为底物并将其逐步氧化为 5fU^{[44,45,46,47]},而且它们与TET一样,同属α-酮戊二酸(α-KG)及Fe²⁺依赖的双加氧酶;组蛋白修饰与5fU位点的空间分布表明,5fU可能会抑制基因转录^[48],这与5fU干扰DNA与转录因子NFkB之间的序列特异性相互作用相符^[49];鉴于5fC能与组蛋白共价结合,理论上,反应活性更高的5fU同样可以与组蛋白的氨基酸残基发生Schiff-base反应生成DNA-蛋白质复合物^{[50, 51]},进而影响转录调控和染色质重组。

综上所述,有理由推测,醛基嘧啶广泛参与基因功能调控,并对细胞分化、胚胎发育、疾病发生发展等重要生命过程产生深远影响。因此,无论是对于基础表观遗传学研究,还是对于包括癌症在内的许多疾病的前期诊断、治疗评估、愈后观察乃至发病机理研究^{[52,53,54,55]},检测这些特殊碱基修饰物的含量与分布都具有极为重要的意义^{[22, 56~65]}。

1.3 醛基嘧啶的检测方法

液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)因灵敏度高、选择性好等特点在定性和定量检测核苷衍生物方面具有显著优势,同时也是发现新型碱基修饰物的强有力工具。在 LC-MS/MS 测定过程中,基因组DNA首先经过酶催化裂解为单核苷,液相色谱根据极性差异对核苷混合物进行分离,串联质谱则负责统计目标碱基的质量信号(即依据独一无二的质核比所得的提取离子色谱),最终将质量信号的积分与预先拟合的标准曲线方程比对即可计算出样品中该修饰碱基的含量。虽然LC-MS/MS技术已经被广泛应用于评估DNA/RNA修饰,但对于生物样品中丰度低且离子化效率低的5fC、5fU,仍具有一定的挑战性。选用结构相似、性质相近的化合物或稳定同位素为内标是提高检测准确度的有效方法,其中后者最为理想,被奉为行业内的“黄金标准”^[66]。其次,改进样品前处理过程尽量除去样品中的干扰成分,优化色谱分离条件避免干扰组分与待测组分同时进入离子源,或在流动相中适当掺入改性剂(有机酸碱等)以增强待测组分或抑制基质组分的质谱响应都是值得尝试的方向。此外,近年来,武汉大学的袁必锋等^{[67, 68]}利用化学反应将一些更为疏水的或易于离子化的结构共价修饰到5fC、5fU的骨架中,以此改善5fC、5fU在液相分离时与诸多干扰项的分离分辨率,同时提高其在质谱检测过程中的电离效率,收获了更为优异的检测灵敏度。虽然化学衍生辅助的LC-MS/MS技术有信心对实际样品中的5fC、5fU进行准确定性和定量,但总体来说,其操作步骤繁杂,且依赖专业技术人员和大型仪器设备,最重要的是,由于酶解步骤的引入使其丧失了给出序列相关信息的能力。

荧光传感技术历史悠久,伴随着设计理念的不断创新和成像技术的快速发展,“可视化”的荧光分析法已经能够对细胞乃至活体内的生物活性物质或靶标进行“无损伤”示踪,实现其分布和含量变化的实时监测。荧光探针是荧光传感技术的基石和灵魂。其中,有机小分子荧光探针具有选择性好、灵敏度高和易调控等特点,被认为具有广阔的应用前景。相比于上述化学衍生辅助的LC-MS/MS技术,同样基于特异性化学反应发展而来的“反应型”荧光探针技术优势明显。首先,DNA经荧光标记后可直接根据荧光强度读出目标分析物的含量,避免了过程冗杂的酶解处理,其中“Turn On”型荧光探针在修饰DNA后甚至可以省略纯化步骤;其次,通过对探针结构进行多功能调控,可以同时实现醛基嘧啶的选择性荧光标记、富集及测序分析等,真正做到“一举多得”;另外,荧光分光光度计成本低,体积小,易挪动;最后,荧光检测过程响应时间短、操作简便。

5fC、5fU分子结构中的特征醛基,可作为 “反应型”荧光探针的理想靶点。同时,醛基嘧啶在基因功能调控方面崭露头角,更激发了研究人员对其检测方法的探索热情。近年来,相继有报道基于Schiff-base反应、Aldol缩合、Friedländer反应、Wittig反应、醛基还原等机理设计小分子化学标签用于醛基嘧啶的荧光定量、富集与测序。

2 基于选择性化学标记的5fU检测方法

如前所述,5fU是一种与8-羟基脱氧鸟苷(8-oxodGuo)含量相当的DNA氧化损伤^{[40, 59]},由胸腺嘧啶T经多种氧化途径产生。虽然其在DNA去甲基化历程中的意义尚不明确,但5fU在改变DNA结构、诱导基因突变、增加基因不稳定性、干扰DNA-蛋白相互作用、被TDG识别并清除、共价偶联组蛋白等方面的表现已被证实。因此,开发高选择性和高灵敏度的检测技术辅助5fU的功能探索是极其必要且迫切的。目前,5fU的化学标记方法主要包括Schiff-base反应、Aldol缩合及Wittig反应。

2.1 5-醛基尿嘧啶的荧光标记与定量检测

2010年, Matsuda课题组^[69]报道了首例检测5fU的反应型小分子荧光探针1(图2)。该探针系两个甲氧基取代的邻氨基苯硫酚衍生物,此结构能选择性地与5fU反应生成苯并噻唑类荧光团,产率可达95%以上,检测限低至150 fM。虽然脱碱基位点(AP位点)也能与该探针反应(产率58%),但并不能在458 nm处产生荧光信号,也就是说不会干扰5fU的定量检测。另外,HPLC分析也排除了5fC参与反应的可能。遗憾的是,此标记反应生成的荧光团具有强烈的pH依赖性,即在酸性(100 mM HCl)和中性(10 mM磷酸盐缓冲液,pH=7.0)环境中荧光强度极低,荧光量子产率分别为0.160和0.074,仅在强碱性(100 mM NaOH)条件下才能发射强烈荧光(Φ=0.701)。鉴于标记反应是在弱酸性的醋酸盐缓冲液中进行的,且探针由于自身稳定性因素需由其二倍体在DTT催化下释放,所以,反应结束后,除了要通过乙酸乙酯萃取除去过量的探针及添加剂,还要将纯化所得的DNA重溶于100 mM NaOH溶液中,才能进行荧光扫描。最后,作者将此方法应用于检测γ射线辐射导致的ctDNA中 5fU的突变率,结果表明每单位剂量的γ射线大约能使10⁶个碱基产生8.9个5fU。

2013年,Guo等^[70]以DMF为溶剂、Sc(OTf)₃/H₂O₂ 为氧化剂,通过5fU与多种邻苯二胺衍生物的反应合成了一系列苯并咪唑类荧光团,产率均高于77%。随后,他们系统地考察了这类荧光团的光学性质,包括紫外吸收、荧光发射、pH敏感性、溶剂效应等(图3)。他们认为这类荧光团的发光机理为分子内电荷转移(Intramolecular Charge Transfer,ICT),其中,尿嘧啶部分充当电子受体,邻苯二胺部分充当电子供体,位于邻苯二胺苯环上的取代基供电能力越强对应荧光团的荧光量子产率就越高,但最高仅0.088。其次,这类荧光团也表现出明显的pH依赖性,即在中性及碱性条件下荧光强度相对较低,但当pH<7.0时,荧光强度随pH值的降低迅速增强。最后,他们以甲氧基取代的邻苯二胺(2)为例,考察了其在醋酸铵缓冲液中检测5fU的能力。实验证明,该试剂能以明显增强的荧光信号将5fU与常规碱基A、G、C、T区分开,阐述了邻苯二胺衍生物作为小分子荧光探针检测寡核苷酸甚至基因组DNA中5fU的潜力。

2017年,Liu等^[71]再次报道了一例基于邻苯二胺衍生物的小分子荧光探针Biotin-lys(3)(图4)。该探针以1,8-萘二甲酰亚胺为荧光团;富电子的邻苯二胺为5fU反应位点,

可通过“PET”机理猝灭1,8-萘二甲酰亚胺的荧光;乙二醇链的掺入一方面增加探针的亲水性,另一方面作为“linker”共价连接生物素分子用于5fU的富集。当Biotin-lys与5fU反应后,邻苯二胺的两个氨基与5fU的醛基生成苯并咪唑杂环,PET猝灭受到抑制,1,8-萘二甲酰亚胺的荧光得以恢复。作者通过RP-HPLC、变性PAGE、荧光光谱、MALDI-TOF等手段证实了探针对5fU的高度选择性,AP位点及5fC不对此产生干扰。与T和5fU不同,Biotin-lysU会充当“拦路虎”的角色阻断PCR过程中DNA聚合酶的引物延伸,利用此性质结合凝胶电泳可直接判断出DNA中5fU的具体位置。随后,作者对HeLa细胞施以1044 Gy的γ辐射,然后与10 μM的Biotin-lys在37 ℃下共培养4 h,细胞成像结果显示,相比于仅实施射线辐射或Biotin-lys孵育的对照组,实验组的细胞视野内展现出显著增强的绿色荧光,这是截至目前少有的能够对活细胞内5fU进行荧光成像的案例。至于富集效果,作者以对应的T取代产物为背景,分别考察了Biotin-lys对包含5fU的80 mer ssDNA(含两个5fU位点)和dsDNA(每条链各含两个5fU位点)的富集能力,前者可达101倍,后者可达73倍,探针对5fC的富集可忽略不计。

同年,Liu等^[72]以肼为反应位点开发了一例能同时通过比色法和荧光法高效检测5fU的简单小分子NBDH(4)(图5)。该检测反应条件温和,背景荧光弱,对5fU的转化率超过99%,检测限约为20 nM,同样不受5fC和AP位点的干扰。试验样品包括小分子核苷、人工合成的15 mer单链DNA、人工合成的76 mer双链DNA以及不同剂量γ射线预处理的ctDNA,检测过程不需要额外的纯化步骤,体现了荧光分析法快速、直接的特点。另外,以NBDH衍生后的DNA为模板进行PCR扩增,引物延伸被终止,表明修饰后的5fU能抑制DNA复制,结合凝胶电泳分析可识别目标DNA中5fU的序列信息。据文献报道,KRuO₄可特异性地将5hmU一步氧化为5fU。因此,理论上,针对5fU开发的检测方法同样适用于间接检测5hmU。作者利用此特点,对人工合成的单链DNA(含一个5hmU位点)进行KRuO₄预处理,随后与NBDH共孵,经HPLC、LC-MS、荧光光谱、MALDI-TOF、变性PAGE以及裸眼可察的颜色变化验证了NBDH对DNA中5hmU的定性定量能力。

同样以肼为反应位点,Wang等^[73]选择1,8-萘二甲酰亚胺为荧光团设计合成了具有富集潜力的多功能分子5(图6)。探针本身因为氨基的PET猝灭不发射荧光,当探针与5fU反应后,PET过程受到抑制荧光恢复。该检测机理除了适用于5fU的荧光光谱分析,还被作者独辟蹊径地应用于开发5fU的PAGE定量新技术。具体原理为:DNA中的5fU能选择性地被化合物5修饰并发射1,8-萘二甲酰亚胺的荧光,荧光强度与5fU浓度成正相关;含5fU的寡核苷酸经化合物5修饰后因分子量增大电泳迁移速率下降,从而与不含5fU的寡核苷酸区别开;凝胶成像系统以1,8-萘二甲酰亚胺(λ_ex=488 nm)的激发波长对凝胶进行成像,含5fU的寡核苷酸将显色,依据条带的灰度值对5fU进行定量,检测限为20 pM。但是作者在文中仅排除了5fC的干扰,未对AP位点作任何介绍。探针结构中的叠氮基团可通过经典的“点击化学”反应按需引入其他功能基,实现功能拓展。

众多能与醛基反应的氨基衍生物中,羟胺的反应活性最高。而探针分子的活性越高,往往也就意味着其选择性会变差。2018年,Liu等^[74]以羟胺为反应位点和荧光“开关”设计合成了化合物6,其中,吡咯基团可改善探针分子的水溶性。化合物6并非单一地对5fU响应,5fC和AP位点也能产生同样的信号变化,所以,化合物6检测的是DNA中醛基修饰物的总和(图7)。因为AP位点较之5fC和5fU来说,稳定性较差,故作者以包含AP位点的寡核苷酸为例进行反应条件优化,包括反应溶剂、反应温度和反应时间,最终确立了如图例所示的能使三种醛基修饰物近乎完全转化的反应条件。作者在文中使用的定量分析方法主要为变性PAGE,对荧光标记后的ODN-5fU、ODN-5fC及ODN-AP分别绘制了灰度-浓度标准曲线,检测限约为10 pM。我们已经知道,KRuO₄能选择性氧化5hmC、5hmU为对应的5fC、5fU。为检验KRuO₄导致的氧化损伤,作者将ctDNA作KRuO₄氧化处理,简单纯化后用探针6作荧光标记,随后进行变性PAGE分析,结果显示氧化剂处理过的实验组灰度值约为对照组(未作KRuO₄处理)的2倍,进一步体现了该方法的灵敏度。

2016年,德国科学家Höbartner等^[75]首次公开了2,3,3-三甲基吲哚衍生物基于Aldol反应检测DNA/RNA中醛基嘧啶的示例。在如图8所示的反应条件下,化合物7能够以80%的产率标记DNA中的5fU,但与此同时,亦能以24%的产率标记DNA中的5fC。幸运的是,即使探针同时完成了二者的标记,鉴于胞嘧啶和尿嘧啶碱基本质上相互区别的电子性质,对应生成的半花菁类似物拥有不同的荧光发射波长,以此可实现5fU和5fC的特异性鉴别。值得注意的是,即使两种荧光碱基的最大发射波长有接近100 nm的差异,但荧光光谱仍有一定重叠,这并不利于二者的精确定量。

由化合物7衍生5fU所得的核苷加合物对环境敏感,其荧光强度随体系pH增加而增强,而在脱盐的纯水溶液中几乎无荧光;除此之外,寡核苷酸序列中邻近碱基的种类也对其有影响,即当两侧为T时,荧光强度最高,A、C次之,当两侧为G时,荧光强度最低,这与G本身常常扮演“荧光猝灭剂”一角一致。随后,为调控荧光碱基的光谱性质,作者还合成了化合物8和9,以及对应的核苷加合物。跟预期的一样,扩大的共轭体系确实使荧光团的发射波长红移了约20 nm,令人意外的是,亲水性磺酸基团的取代模式严重影响着荧光团的亮度,即磺酸基团在苯环上时的荧光强度约为在N端的6倍,作者对此给出的解释是磺酸基团的位置影响了荧光团与邻近碱基的堆叠相互作用。随后,作者以化合物7为例,对荧光标记的DNA(含5fU的寡核苷酸)绘制了荧光强度-浓度曲线,由此计算出该方法的检测限为25 nM,相当于DNA中5fU至少占比0.02%,显然这与生物样品中5fU的实际含量相差甚远。另外,该方法在完成化学衍生后,还需要醇沉等额外纯化步骤,增加了操作负担与时间成本。

2018 年,四川大学余孝其课题组^[76]首次基于Wittig反应报道了首例比率型荧光Wittig试剂用于5fU的选择性荧光标记(图9)。将三苯基膦与3-乙酰基-7-(二乙氨基)香豆素共轭相连,得益于香豆素内酯及其3位羰基的强吸电子能力,探针YU(10)在水溶液及空气中稳定性良好。YU本身发射498 nm左右的绿色荧光,与5fU发生Wittig反应后,碳碳双键连接的嘧啶环使得荧光团的共轭体系进一步扩大,转而发射波长为555 nm的黄色荧光。5fC作为5fU的类似物,因醛基反应性低,并不会干扰5fU的定量检测。通过荧光光谱和凝胶电泳成像,YU能快速鉴定DNA中的5fU。最后,作者利用探针YU实现了HeLa细胞中由γ射线辐射及芬顿试剂刺激产生的内源性5fU的荧光成像。

2.2 5-醛基尿嘧啶的富集与测序

如前所述,富集策略的实施不仅能够实现检测信号的放大,还能对选择性富集的核酸片段进行高通量测序从而获得目标碱基的序列信息。富集反应的特异性主要取决于生物素化的探针“捕获”靶碱基的特异性。针对这个关键问题,2015年,Balasubramanian课题组^[77]以生物素修饰的羟胺、酰肼及邻苯二胺衍生物为例,通过增减催化剂、调节体系酸碱度、控制反应时间等手段系统筛选了仅适用于富集5fU的反应条件,具体见图10中表格的第4、7、8例。此表对后续5fU反应型小分子探针的结构设计和反应条件设置提供了重要参考。定量PCR实验表明,在最优条件下,三种试剂对5fU-DNA的富集效率是5fC-DNA或G/C/A/T-DNA的150倍左右,表明三种探针对5fC-DNA的捕获量基本处于背景水平。这种高度特异性的富集策略,尤其适用于5fU与5fC含量相当的哺乳动物基因组中5fU碎片的选择性富集,有利于更精确地绘制其全基因组图谱,进而推动相关领域的发展。另外,本方法也可以通过KRuO₄的辅助实现对5hmU的富集,5hmC和5fC亦不会对此产生干扰。

尽管Balasubramanian等发展了5fU的高度特异性富集方法,但富集实验仅仅止步于人工合成的寡核苷酸,并未涉及实际生物样品。2018年,Wang等^[48]采用一种名为“fU-Seq”的新方法首次报道了小鼠海马组织及人甲状腺癌组织中5fU的全基因组分布特征(图11)。该方法首先利用化合物azi-BIAN标记碎片化DNA中的5fU,随后,生物素修饰的环辛炔衍生物(DBCO-S-S-PEG3-Biotin)通过无铜催化的“点击化学”反应捕获叠氮“尾巴”,再借助链霉亲和素包被的磁珠完成5fU-DNA的富集,二硫苏糖醇(DTT)可有效剪切二硫键从而将富集碎片从磁珠表面尽数释放,随后对浓缩的5fU-DNA进行二代测序并将测序读段映射到参考基因组便可获悉5fU的序列相关信息。在此之前,作者首先考察了化合物azi-BIAN对5fU的选择性,通过一系列实验验证了在当前反应条件下,5fC和AP位点不会参与反应;随后还排除了标记过程及纯化步骤对样品DNA造成氧化损伤的可能;接着以80 bp的双链DNA(每条链含两个5fC或5fU或正常的C)为模型,证实了该富集方法对5fU-DNA的高度特异性。应用“fU-Seq”策略,作者发现大多数5fU更“青睐”基因间区及内含子;此外,组蛋白修饰和5fU位点的空间关系暗示着5fU可能在基因转录中起抑制作用;另外,研究发现,在人甲状腺癌组织中,5fU的分布与POLR2A蛋白的结合位点呈正相关,这表明5fU可能分布在POLR2A结合位点附近。尽管此方法分辨率有限,也不能完全排除非特异性富集,但对增进我们对5fU修饰在基因组学中的作用理解意义颇深。

与此同时,Balasubramanian课题组^[78]基于5fU的错配性质开发了5hmU的单碱基分辨率测序技术,鉴于该方法涉及KRuO₄的氧化辅助,所以其本质还是在定位5fU(图12)。众所周知,C5位的醛基是5fU区别于其他胸腺嘧啶衍生物的独特结构,然而环外醛基的存在却使得嘧啶环上3位NH的酸性增强(pK_a=8.1),例如5hmU中3位NH的pK_a为9.3。换句话说,5fU相对于T、5hmU等胸腺嘧啶衍生物更容易以离子化形式存在。原本作为氢键供体的N3在该离子化形式中已经转变为氢键受体,导致5fU的碱基配对模式发生改变,即由5fU:A转变为5fU:G,测序读数随之表现出T→C的转变。作者对人工合成的寡核苷酸(含两个5hmU位点)实施KRuO₄氧化处理,扩增后测序并统计5hmU氧化位点的C突变率。结果显示,两个5fU位点(5hmU氧化所得)的C读取率分别为39%和30%,未经氧化处理的寡核苷酸中两个5hmU位点的C读取率分别为2.2%和2.7%,而T的C读取率仅为1.4%。作者利用5fU显著升高的错配特点,结合KRuO₄氧化对真核病原体布氏锥虫基因组中的5hmU进行了定位分析,也直接证实了该方法在单碱基分辨率分析5fU方面的可行性。

3 基于选择性化学标记的5fC检测方法

2011年, Carell等^[79]首次解析了5fC的单晶结构,并揭示其环外4-NH₂与5-CHO之间存在强烈的分子内氢键。因此,虽然 5fC与5fU同属醛基嘧啶,结构极为相似,但5fC的醛基反应活性低于5fU。理论上,可以通过合理调控探针活性或优化反应条件较为容易地实现5fU靶向,这也是目前大多数5fU荧光探针所采取的选择性优化策略。但反过来,能标记5fC的小分子在同等条件下一定也能标记5fU,所以,如何排除5fU的干扰并实现5fC的特异性识别一直是一个难题。早期开发的大多数5fC标记试剂并没有考察5fU的干扰,随着该领域的不断深入,越来越多的研究人员开始重视这个问题并提出了对应解决策略。对于荧光检测,主要有以下两个思路,其一是首先选用高活性的醛基化试剂在特定条件下屏蔽5fU,再以荧光探针标记5fC;其二是根据5fC区别于5fU独特的2-氨基芳基醛结构,将荧光“开关”从传统的醛基单位点改为醛基、氨基双位点,如此一来,5fU虽然不可避免地要与探针发生反应,但因缺乏4-氨基不能被“点亮”。对于选择性富集,目前还没有相应策略,所以基于醛基标记的磁珠分选测序法必然包含5fU的假阳性,上述“屏蔽法”或可一试;而对于单碱基分辨率测序,由于5fC和5fU完全不同的测序行为,结合对照组一般可排除5fU的干扰。

3.1 5-醛基胞嘧啶的荧光标记与定量检测

早在2013年,Hu等^[80]便率先基于席夫碱反应利用含氨基的荧光染料完成了DNA中5fC的选择性荧光标记(图13)。研究发现,直接与芳环共轭相连的伯胺因亲核性弱并不能与5fC反应,只有通过柔性碳链连接于荧光染料骨架上的烷基胺类化合物,才可以在温和条件下标记5fC。另外,得到的席夫碱类物质结构稳定,不易水解(反应不可逆),作者认为可能有两个方面的原因,其一是亚胺与胞嘧啶杂环共轭增加了稳定性,其二是碳氮双键上的氮原子与胞嘧啶的4位氨基可形成分子内氢键进一步增加了稳定性。虽然化合物15和16都能在不外加催化剂的情况下顺利完成寡核苷酸中5fC的荧光标记,但15水溶性差,标记反应需较大比例的DMSO助溶,标记效率也略显劣势(65%);相比之下,化合物16水溶性良好,

标记反应能在纯水或近中性的缓冲液中进行,标记效率接近100%,被认为更具应用前景。荧光标记后的核酸无需酶解便可直接通过荧光光谱和PAGE对其中的5fC进行定性定量分析。值得注意的是,本文中的化合物15和16均属于“标记”型探针,即游离的探针小分子在与5fC结合前后,荧光发射波长基本不变。通常情况下,为确保样品中的5fC被完全衍生,会加入大大过量的探针,这势必会对依赖单一波长处的荧光强度获得的定量结果带来严重干扰,所以必要的纯化措施不可避免,本文便通过醇沉和HPLC分离对标记后的寡核苷酸进行了两步纯化。另外,经试验,AP位点也能与上述氨基衍生物发生反应,这又对该方法的检测准确度提出了新的考验。在这种情况下,发展特异性更高的“Turn On”型小分子荧光探针势在必行。

同年,Guo等^[81]设计合成了三例羟胺类衍生物(17、18及19),并基于羟胺与醛生成肟的反应机理将其应用于5fC的荧光标记(图14)。其中,探针17和探针18以邻苯二甲酰亚胺保护态储存,使用时需通过肼解现制现用。以醋酸铵缓冲液(10 mM,pH=4.5)为溶剂,10 mM茴香胺为催化剂,5fC在室温条件下逐步被探针19转化为对应的肟衍生物,反应12 h,产率可达97%以上,其他胞嘧啶衍生物C、5mC、5hmC以及AP位点基本不干扰。但是这三个试剂仍然属于“标记”型探针,所以在衍生结束后荧光定量前,作者不得不依靠EA萃取去除体系中过量的探针及茴香胺,随后再将其重溶于二次蒸馏水中测定荧光强度并以此定量5fC浓度。作者曾尝试利用开发的方法测定小鼠胚胎干细胞基因组DNA中5fC的含量(提取核酸与探针19在37 ℃孵育24 h),但迫于方法本身灵敏度的限制未能如愿,对样品DNA进行浓缩、降低系统背景荧光或可解决这个困境。

同属羟胺衍生物的6已经在综述5fU的检测方法时予以详细介绍^[74]。如前所述,化合物6对5fU、5fC及AP位点没有选择性,是检测DNA中醛基修饰物总和的“Turn On”型荧光探针,相比于17、18及19这类纯标记型探针,其背景荧光明显降低。以PAGE定量为主,荧光定量为辅,作者在KRuO₄预处理的ctDNA中检测到了2倍于对照组的氧化损伤,当然这增加的一倍应有5fC的贡献。

随后,为了降低“标记”型荧光探针的背景干扰,Hong等^[84]报道了一种名为“CCP-FRET”的5fC检测新策略。如图15所示,该策略沿用羟胺衍生物17作为5fC标记试剂,标记反应完成后向体系加入阳离子共轭聚合物(CCP),带正电的CCP通过静电相互作用迅速与带负电的DNA结合,二者距离适中,且CCP的发射光谱与BODIPY的吸收光谱能有效重叠,可构成荧光共振能量转移(FRET)体系。当以CCP的最适激发波长380 nm激发体系时,CCP的发射光转而激发BODIPY,从而发射BODIPY的绿色荧光(518 nm)。该策略弥补了BODIPY本身斯托克位移小、易“串光”的缺点,检测信号也在一定程度上得以放大。但是,标记反应引入的过量小分子染料易在CCP附近聚集,并在CCP受到激发时产生干扰信号。对此,作者通过氯仿萃取对化学衍生后的体系进行了简单提纯,除去过量染料分子后,背景信号显著下降。最后,作者结合KRuO₄氧化,将此方法应用于检测小鼠胚胎干细胞、HeLa细胞及HEK 293T细胞中的5hmC,前二者检测结果与文献报道相当,唯独对HEK 293T细胞中5hmC的定量结果不甚理想,可能与其浓度太低有关。

2014年,Wang课题组^[85]报道了一例含吖啶结构的肼衍生物HMA(20),并基于肼与醛生成腙的反应机理将其应用于DNA中5fC的共价修饰,随即探究了该共价修饰对5fC下游相关功能的影响(图16)。实验证明,化合物20能在pH=7或6的缓冲液中高效标记寡核苷酸中的5fC,但pH=5的缓冲体系并不适合,作者给出的解释是较低的pH值会加速产物腙的水解。作者还在细胞裂解液中尝试了该标记反应,若反应时间延长至6 h,也能收获~100%产率。常规碱基A、G、C、T及胞嘧啶衍生物5mC、5hmC、5caC都不会产生干扰。TDG剪切5fC并通过BER途径还原胞嘧啶是DNA主动去甲基化历程的关键环节。体外实验表明,HMA修饰后的5fC,TDG再难剪切,与此同时,DNA polⅠ复制和RNA polⅡ转录均受到极大阻碍,可能的原因是共价连接在DNA上的吖啶通过柔性链嵌入DNA的碱基对中从而干扰了相应酶的活性。GFP基因中5'-UTR内的5fC位点若被HMA衍生,该基因也将不能在活细胞中顺利表达。总的来说,作者利用精心设计的化学小分子成功靶向并干预了5fC参与的相关生物学过程,为特殊碱基的功能调控提供了新思路。

随后,Wang课题组^[86]又报道了含芘结构的肼衍生物,基于两分子芘能形成激基缔合物(Excimer)并发射长波长荧光的特点实现了DNA中对称5fCpG与非对称5fCpG的区分(图17)。鉴于芘与DNA的连接模式会影响其光学性质,作者首先设计合成了21、22及23三个类似化合物,并根据他们对对称5fC与非对称5fC的响应行为进行了筛选。结果表明,化合物21始终只在短波范围内(360~420 nm)发光,对于以上二者仅表现出荧光强度上的差别;化合物22、23对非对称5fC同样只发射短波弱荧光(~390 nm),但对对称5fC却能在490 nm处产生明显的二聚体信号,相比之下,化合物23特异性更高,对二者的区分更明显,并且490 nm处的荧光强度与对称5fC的丰度呈现良好线性关系。据文献报道,CpG二核苷酸序列中的5mC多数以对称形式分布,TET也倾向于氧化对称5mCpG位点中的5mC,但对于TET的氧化途径及氧化胞嘧啶的分布模式尚无任何报道。为此,作者在体外模拟对称性5mCpG 的TET氧化过程,通过PAGE和紫外实时监测体系的整体5fC水平,随着氧化时间的延长,5fC呈现先增后减的趋势,并在8 min时到达峰值;与此同时,作者还通过荧光光谱对4 min、8 min及30 min时体系的对称性5fC进行了定量分析,令人意外的是,在4 min、8 min两个时间节点,体系中所有的5fC都是对称性5fC,而在30 min时,对称性5fC水平下降到80%。该实验证明了TET氧化对称性5mCpG时并不遵照如图17所示的“processive”路线(黄色底纹标记),而是按另外一种以对称性5fC为中间体的“distributive”路线(绿色框与蓝色框标注)进行的。众所周知,TDG识别并剪切5fC是DNA去甲基化过程的关键步骤,若对称性5fC双双被切除,将增加DNA断裂及引入突变的风险。

2018年,Wang等^[73]在1,8-萘二甲酰亚胺的荧光骨架上修饰了叠氮“尾巴”,并以肼为醛基反应位点和荧光“开关”设计合成了化合物5。化合物5已经在5fU的PAGE定量分析方面初露锋芒(见图6),若配合使用5fU屏蔽剂,化合物5还可应用于5fC的PAGE定量及斑点印记分析。基于前期研究基础^[70],作者选用4-硝基邻苯二胺为5fU屏蔽剂,该试剂能在醋酸钠缓冲液中(pH=5.0)选择性与5fU反应,并且生成的新型核苷几乎不发光,不会影响5fC的定量分析;待5fU充分沉默后,无需提纯操作,直接向体系投入化合物5,继续反应4 h,便能以~100%的产率完成5fC的荧光标记(图18)。类似地,化合物5修饰的5fC-DNA因分子量增大电泳迁移速率下降,从而与其他寡核苷酸区别开,当5fC-DNA浓度在20~200 pM之间时,其凝胶成像灰度呈线性增强,检测限约为20 pM。除此之外,作者还利用二苯基环辛炔修饰的生物素(DBCO-Biotin)通过经典的“点击化学”反应进一步将NAAH修饰的5fC位点生物素化,再通过辣根过氧化物酶标记的亲和素(avidin-HRP)进行杂交显色,实现5fC的斑点印迹(dot blotting)分析。

2016年,德国科学家Höbartner等^[75]报道的2,3,3-三甲基吲哚衍生物能基于Aldol反应标记DNA/RNA中的5fU和5fC,对应生成的半花菁类荧光产物虽结构相似但发光颜色不同。然而,以吗啉乙磺酸缓冲液(50 mM,pH=6.0)为溶剂,45 ℃下反应6 h, 化合物7能够以80%的产率标记DNA中的5fU,但对5fC的标记效率仅有24%(图19)。为此,作者尝试着将pH值升高到7.5,产率随之提升至65%,但继续升温至70 ℃却导致了副产物的产生。经质谱鉴定,该副产物为Aldol加成产物,因此,标记效率低应归咎于脱水障碍。如此一来,作者若想提高5fC的标记效率需要从两个方面入手,

其一是提高吲哚衍生物对5fC的Aldol加成效率,其二是使加成产物有效脱水生成目标烯烃。对于前者,作者对反应溶剂的pH值进行了全面筛查,并将吲哚衍生物用NaOH预处理为烯胺以增强探针分子的亲核性;对于后者,作者在加成反应结束后,通过向体系添加乙酸来帮助脱水。在最终的优化条件(pH=7.4,45 ℃,6 h;3%乙酸,15 min)下,5fC的标记效率可达~80%,标记产物相对于5fU,其发射波长蓝移且荧光强度降低,对环境的敏感性也有所改善。不仅如此,化合物7衍生后的5fC能阻断Klenow exo-DNA聚合酶的引物延伸,可用于指示DNA中5fC的特定位置。

2019年,四川大学余孝其课题组^[87]通过改变叶立德碳负离子α位的吸电子基团,设计合成了一系列稳定性和反应活性各异的Wittig试剂,并从中筛选出能高效衍生醛基嘧啶(5fC和5fU)的“明星分子”氰亚甲基三苯基膦YC-CN(24)(图20)。然而,和大多数5fC标记试剂一样,YC-CN能同时与5fU和5fC的醛基发生Wittig反应,产物以反式烯烃(trans-5fC-CN、trans-5fU-CN)为主,且均不发射荧光。通过对反应体系所得产物进行详细分析和结构鉴定,意外发现5fC能基于自身独特的2-氨基芳基醛结构与YC-CN反应生成发射蓝色荧光的新型核苷。遗憾的是,YC-CN参与的Wittig反应产物以反式烯烃为主,这直接导致以顺式烯烃为来源的荧光核苷产率极低,进而严重影响5fC的荧光定量灵敏度。

为此,作者创新性地采用光催化将反式异构体高效转化为顺式异构体以拉近—CN与嘧啶环4-NH₂的空间距离,便于二者之间的分子内亲核加成反应快速进行,从而以较高产率得到强荧光的5fC-CN-Close;在相同条件下,trans-5fU-CN也能实现光致异构化,但因缺乏关键的4-NH₂元素不能环化生成荧光核苷,这使得YC-CN能够基于荧光信号快速区分5fC和5fU。作者通过核磁共振氢谱监测了trans-5fC-CN向5fC-CN-Close逐步转化的过程,验证了光催化的可行性及有效性,并最终提出了一种集Wittig烯化、光致异构化(trans→cis)、分子内亲核加成为一体的三重多米诺反应策略,实现了5fC的高选择性、高灵敏度(LOD=35.7 nM)荧光检测,并成功应用于定量分析γ射线导致的5fC突变。值得一提的是,经过条件优化,YC-CN与5fC之间的三重多米诺反应总产率>99%,用时可控制在2.5 h以内,是当前5fC标记领域耗时最短的。但YC-CN对水敏感,标记反应不得不在有机溶剂中进行,这或许会限制其进一步生物应用。

3.2 5-醛基胞嘧啶的富集与测序

以上介绍的检测方法只能用于评估样本中的整体5fC水平。虽然衍生后的5fC大多能中断DNA聚合酶延伸,但据此通过凝胶电泳实现实际样品中5fC的定位分析仍有相当大的难度,且暂无相关报道。目前,绘制5fC的全基因组分布谱图主要依靠快速发展的高通量测序技术。然而,5fC的碱基配对性质与胞嘧啶并无区别,因此,测序时与胞嘧啶一样被读为C。长久以来,如何使5fC的测序信号与C、5mC、5hmC、5caC区别开来从而实现其单碱基分辨率分析受到了极大关注。2015年,启发于Friedländer喹啉合成反应(特指邻氨基芳基醛或酮与另一分子含α-亚甲基的酮反应得到喹啉的反应),北京大学伊成器等^[88]通过精心设计与结构筛选,利用叠氮修饰的1,3-茚满二酮衍生物(25)选择性化学标记5fC,建立了一种新颖的单碱基分辨率的5fC全基因组测序技术(cyclization-enabled C-to-T transition of 5fC,fC-CET)。如图21所示,1,3-茚满二酮与5fC发生成环反应后将屏蔽5fC的C4位氨基,该氨基氢的缺失将直接导致与鸟嘌呤配对失败,继而在PCR过程中被读为T^[89]。DBCO-S-S-Biotin可在标记反应完成后对5fC碎片进行富集,从而大幅度降低后续测序成本。最后,作者应用此方法成功绘制了mESCs中5fC的全基因组分布谱图。值得一提的是,若能将其他胞嘧啶衍生物选择性转化为5fC,fC-CET在单碱基分辨率测序方面或有更广阔的发展空间。遗憾的是,化合物25水溶性欠佳,可能会限制其进一步临床应用。

随后不久,该课题组与汤富酬课题组^[90]合作于2017年报道了国际上首例单细胞、单碱基分辨率的5fC全基因组测序技术(chemical-labeling-enabled C-to-T conversion sequencing,CLEVER-seq)(图22)。这项技术的核心在于使用丙二腈(26)标记5fC将其转换为5fC-M,该标记反应有如下优势:1)丙二腈水溶性极好,在pH=5~8的各种盐溶液、缓冲液中其溶解度可高达摩尔级别,因此,即使标记反应在微量溶剂中进行依然方便有效;2)反应条件温和,不会造成DNA降解,这对于在化学处理过程中保持单细胞基因组DNA的完整性意义重大;3)生物相容性好,即使PCR体系中存在大量丙二腈(>100 mM),DNA聚合酶的活性也不会受到明显抑制,这使得标记反应和PCR扩增可在同一个样品管中连续进行,无需在中途引入纯化步骤;4)5fC与丙二腈反应后,其C4位氨基已经不再是一个质子供体,无法与鸟嘌呤形成标准碱基对,故而在后续PCR及测序环节被读为T,并且该C→T的信号变化不受5fC密度及邻近序列的影响^[89]。应用CLEVER-seq,作者首次在单细胞、单碱基分辨率水平上绘制了小鼠着床前胚胎及多能干细胞中5fC在基因组的分布图谱。研究发现,在小鼠早期胚胎发育过程中,5fC保持高度动态变化并在基因表达调控区域富集;5fC在不同的胚胎发育阶段及多能干细胞中具有高度异质性;同时,启动子区域5fC的产生先于相应基因的表达,说明在哺乳动物早期胚胎发育过程中主动去甲基化可能参与了关键基因的表达调控。

同年,武汉大学周翔课题组^[91]设计合成了小分子化合物CBAN(27)(图23)。该小分子可看作5-氯苯并[d]噻唑取代的丙二腈,其与5fC的反应机理也模仿了丙二腈:活泼亚甲基先与醛基缩合生成碳碳双键,随后氰基与嘧啶环上的氨基发生分子内加成形成荧光杂环。不同于单纯靶向醛基的氨基衍生物(包括烷基伯胺、羟胺、肼)和吲哚衍生物,CBAN 瞄准的是2-氨基芳基醛类物质。放眼目前发现的修饰碱基,仅有5fC具备上述结构特点。虽然5fU和AP位点能与CBAN发生Aldol缩合,但因缺乏邻位氨基终不能被CBAN“点亮”。这种“双位点靶向”的思想使得CBAN成为首例能够选择性检测5fC却不受5fU和AP位点干扰的小分子荧光探针。单链DNA和双链DNA中的5fC都能被CBAN顺利标记。作者选择γ射线辐射的ctDNA(⁶⁰Co,0~240 Gy,1.84 Gy/min)为实际样品考察CBAN的定量能力,测得每单位剂量的γ射线约产生1.3个5fC/10⁶个碱基,该结果与LC-MS/MS的定量结果(1.27个5fC/10⁶个碱基)高度一致。此外,分子内环化反应屏蔽了5fC结构中曾经担任质子供体的C4位氨基,生成的新型碱基CBC在聚合酶延伸时转而与腺嘌呤A配对,由此产生C→T的信号转换,可在单碱基分辨率层面上实现DNA中5fC的定位分析。作者选用KF exo-DNA聚合酶进行引物延伸并通过Sanger测序和Illumina测序验证了这一猜想。

紧接着,该课题组^[92]在CBAN的骨架上修饰叠氮基合成了多功能小分子azi-BP(28)(图24)。该小分子几乎拥有CBAN的全部结构特点,因此能继承CBAN优异的5fC选择性及定量、定位分析5fC的能力。更重要的是,DNA中的5fC被azi-BP标记后,可进一步通过无铜催化的Click反应将DBCO-Biotin与azi-BP的叠氮端基相连,该偶联产物“体积庞大”,使得原本可以轻松经过5fC位点的DNA聚合酶“望而却步”,引物延伸受到极大阻碍,基于此特点可通过qPCR对DNA局部区域的5fC含量进行测定。作者以80 bp双链DNA(每条链含两个5fC)为例,依次完成azi-BP、DBCO-PEG4-Biotin(二者合称为DBCO-azi-BP)衍生之后,考察了“体积障碍”对Taq DNA聚合酶扩增效率的影响。qPCR实验表明,化学标记后的DNA模板,其C_t值(23.03)相对于未标记的DNA模板(18.58)增加了4.45,C_t值的增量(ΔC_t)可作为评估Taq聚合酶被抑制效率的指标,同时还与DNA模板中5fC的含量成线性正相关。作者对mESCs中含5fC的三个基因片段(chr5, 122444170-122444305, Cux2;chr14, 68371367-68371573, Dock5;chr18, 20748569-20748711, Dsg2)分别实施了DBCO-azi-BP辅助的qPCR分析,其ΔC_t分别为1.28、1.16、1.3,证实了5fC位点的存在,更突出了该方法的灵敏性。此外,对扩增产物进行Sanger测序,也在对应区域找到了“C→T”信号,所在位点符合文献报道。生物素化的5fC还可通过链霉亲和素包被的磁珠进行富集,其富集倍数约为其他胞嘧啶衍生物(C、5mC、5hmC)的50~70倍,富集5fC碎片不仅可以放大定量信号,在进行全基因组测序时更是事半功倍。

近年来,5fC测序技术迅猛发展,这断然离不开化学选择性标记所做的贡献。其实,世界上第一张小鼠胚胎干细胞全基因组5fC分布图也是借助于化学探针完成的。2012年,英国剑桥大学Balasubramanian课题组突破传统思维,从抗体免疫沉淀转战化学特异性标记,率先使用商业化的醛基捕获剂11将生物素共价修饰到基因组DNA的5fC上(图25),随后利用链霉亲和素包被的磁珠对生物素化的5fC-DNA进行富集,最后对富集的DNA片段进行深度测序,可获得分辨率在100个碱基左右的5fC分布图^[33]。值得一提的是,化合物11曾用于选择性富集DNA中的5fU(见图10),鉴于5fU比5fC活泼,可以调控反应条件避免对5fC的非特异性富集,但富集5fC时却无法排除5fU的干扰。

虽然化合物11的醛基捕获能力强,AP位点干扰小,对5fC-DNA可实现高达1000的浓缩,但富集后的DNA片段中其5fC位点始终以分子量较大的生物素偶联产物存在,这不利于后续的引物延伸,在高通量测序时可能导致部分5fC位点的漏读。针对这个缺陷,Balasubramanian课题组于2014年对化合物11的结构进行了优化,得到如图25所示的化合物29^[93]。叠氮作为氨基掩蔽剂可通过三(2-羧乙基)膦(TCEP)催化的Staudinger反应还原,氨基暴露后的中间体不稳定将进一步发生自分解,从而顺利完成探针主体的剪切。该剪切步骤的实施不仅清除了PCR障碍,还可应用于磁珠表面5fC-DNA的高效脱附,避免了使用剧烈变性条件破坏生物素-链霉亲和素相互作用的方式回收DNA,富集效率也提高了近30倍。2016年,该课题组使用可剪切探针29首次描绘了5fC在野生型和Tdg缺陷型E11.5天小鼠胚胎的后脑、心脏、肝脏等组织中的基因组分布概况^[30]。在此之前,5fC的基因组测序一直停留在基于细胞培养的系统,而其体内分布特征未见报道。

2013年,芝加哥大学何川课题组与埃默里大学金鹏课题组^[26]合作,使用NaBH₄还原5fC为5hmC,将一种已经发展成熟的5hmC检测方法直接用于5fC的富集测序,即fC-Seal(5fC-selective chemical labeling)(图26)。为了屏蔽DNA中原有5hmC的干扰,作者首先采用β-GT以未修饰的UDP-Glu为糖基来源将5hmC转化为5gmC,待NaBH₄还原完成后,再以UDP-6-N₃-Glu为糖基供体将新产生的5hmC转化为N₃-5gmC,接下来的生物素标记与磁珠富集步骤与前文描述类似。fC-Seal相比于羟胺类醛基捕获剂,非特异性富集显著降低,但分辨率依然有限。为此,作者用羟胺(NH₂OH)保护5fC并结合重亚硫酸盐测序开发了国际上第一例5fC单碱基分辨率测序技术,即fCAB-seq(chemically assisted bisulfite sequencing)。NH₂OH保护的5fC能抵抗亚硫酸氢盐的脱氨作用,测序时与5mC、5hmC一样被读为C,而未保护的5fC与C、5caC一样被读为T,二者对比,可获得5fC的精确定位信息。2014年,Balasubramanian课题组再次利用NaBH₄可选择性还原5fC为5hmC的特点发展了另外一例亚硫酸氢盐测序方法(redBS-Seq,reduced bisulfite sequencing)^[94]用于5fC的单碱基分辨率分析(图27)。然而,与fCAB-seq的羟胺保护相比,NaBH₄还原赋予5fC抵抗亚硫酸氢盐去氨化的能力稍逊一筹。

4 结论与展望

深入了解醛基嘧啶的生理功能,需要从细胞、组织层面上对其进行定量分析,以探讨含量变化与细胞分化、个体生长及肿瘤发病等生命进程之间的联系。已经有研究发现,癌组织与癌旁组织中的醛基嘧啶含量不同,提示基因组DNA中的醛基嘧啶可能与肿瘤发展相关。因此,有理由推测醛基嘧啶可以作为某些疾病早期诊断和愈后评估的潜在生物标记。另一方面,探究醛基嘧啶的基因调控功能需要从全基因组范围内对其进行测序定位。近年来,醛基嘧啶的测序分析已从人工合成的模型寡核苷酸扩展到基因组DNA,从低分辨率扩展到单碱基分辨率,从多细胞扩展到单个细胞,从重亚硫酸氢盐测序扩展到“Bisulfite-free”测序。这些重大突破很大程度上归功于新颖的化学标记技术,这些技术为理解表观遗传修饰相关的生物学过程做出了突出贡献。

然而,现有的标记方法在标记效率、标记条件、选择性、活细胞乃至体内原位标记等方面仍面临一定的挑战;其次,虽然荧光检测法便捷灵敏,但其检测限还需进一步降低以实现实际生物样品中醛基嘧啶的丰度测定;另外,集定量、选择性识别、富集、测序等一体的多功能分子探针或标记方法亟需开发;最后,相对于5fC来说,5fU的单碱基分辨率测序技术相对欠缺,其体内形成机制尚不明确,相关的功能研究也较为滞后。

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