多肽基金属离子传感器

于帅兵; 王召璐; 庞绪良; 王蕾; 李连之; 林英武

doi:10.7536/PC200611

化学进展 ›› 2021, Vol. 33 ›› Issue (3) :380-393 DOI: 10.7536/PC200611

综述

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多肽基金属离子传感器

于帅兵 ¹ ,
王召璐 ¹ ,
庞绪良 ¹ ,
王蕾 ¹ ,
李连之 ¹^,^* ,
林英武 ²^,^*

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Peptide-Based Metal Ion Sensors

Shuaibing Yu ¹ ,
Zhaolu Wang ¹ ,
Xuliang Pang ¹ ,
Lei Wang ¹ ,
Lianzhi Li ¹^,^* ,
Yingwu Lin ²^,^*

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摘要

多肽基金属离子传感器作为一种基于多肽序列而设计的新型传感器,越来越受到研究者的关注。多肽作为一类重要的生物小分子,具有合成方法成熟、简便、成本低,且能够以多齿配位状态与金属离子结合等优点。多肽基传感器对金属离子具有高灵敏性和高选择性,且可以通过调节多肽序列进一步优化。与其他类型传感器相比,多肽基金属离子传感器具有良好的水溶性、生物相容性以及低毒性,因而在环境检测和生物医学分析与诊断,尤其是金属离子成像等方面,有重要的应用前景。本文主要综述了近年来不同类型的多肽基金属离子传感器,包括基于紫外-可见吸收光谱法、荧光光谱法和电化学分析法等的研究进展,以及它们在一些领域中的应用,特别是针对具有高生物学毒性的重金属离子(如Hg²⁺、Cd²⁺),以及在生物体内发挥重要功能的金属离子(如Cu²⁺、Zn²⁺)等的检测与生物成像等。最后,文章总结了多肽基金属离子传感器的优缺点,并展望了其未来发展方向和应用前景。

Abstract

Peptide-based metal ion sensors, as a new type of sensor designed based on peptide sequences, have attracted more and more attention from researchers. As important small biological molecules, peptides have advantages of simple and well-developed synthetic methods with low costs, and can provide multidentate coordination to metal ions. Peptide-based sensors have high sensitivity and high selectivity to metal ions, and can be further optimized by adjusting the peptide sequence. Compared with other types of sensors, peptide-based metal ion sensors have good water solubility, biocompatibility, and low toxicity, and therefore have important applications in environmental detection and bioanalytical diagnosis, especially for metal ion imaging. This review focuses on the progress of different types of peptide-based metal ion sensors in recent years, including those based on UV-Vis absorption spectroscopy, fluorescence spectroscopy, and electrochemical analysis, and their applications, especially for detections and bioimaging of highly toxic metal ions(Hg²⁺, Cd²⁺, etc.), and metal ions playing key roles in biological systems(Cu²⁺, Zn²⁺, etc.). Moreover, the advantages of peptide-based metal ion sensors are summarized and their future developments and applications are prospected.

Contents

1 Introduction

2 Peptide⁃based UV⁃vis colorimetric sensors

3 Peptide⁃based fluorescent chemical sensors

3.1 Mechanism of fluorescence chemical sensors

3.2 Modified peptides with dansyl

3.3 Modified peptides with pyrene

3.4 Modified peptides with FAM/FITC

3.5 Modified peptides with aggregation⁃induced emission fluorophore

3.6 Other peptide fluorescence sensors

4 Peptide⁃based electrochemical sensors

5 Conclusion and outlook

Graphical abstract

关键词

多肽 / 传感器 / 金属离子 / 荧光光谱 / 电化学

Key words

peptide / sensor / metal ion / fluorescence spectrum / electrochemistry

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于帅兵, 王召璐, 庞绪良, 王蕾, 李连之, 林英武. 多肽基金属离子传感器[J]. 化学进展, 2021, 33(3): 380-393 DOI:10.7536/PC200611

Shuaibing Yu, Zhaolu Wang, Xuliang Pang, Lei Wang, Lianzhi Li, Yingwu Lin. Peptide-Based Metal Ion Sensors[J]. Progress in Chemistry, 2021, 33(3): 380-393 DOI:10.7536/PC200611

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1 引言

随着工业化的不断发展,某些违规废弃物的排放造成了重金属的污染,过量重金属严重威胁着环境和人体健康^[1]。重金属不能被生物降解,它们可积聚在环境和生物体中,长期的积累会对环境和生物体造成一系列的危害^[2]。当重金属离子进入人体内后,可导致蛋白质的变性和酶活性的降低甚至完全丧失^[3],从而影响人体健康并造成某些疾病。铅、镉、汞、铬和砷等重金属都会对人体产生较大的危害。例如,Cr(Ⅵ)被认为是人类致癌物,在环境中具有较大的溶解性、流动性和毒性^[4]。世界卫生组织允许Cr(Ⅵ)的最大排放量限制在5 μg/L^[5]。因此,如何快速、简便和高效地检测重金属的含量,对于生命科学、环境化学、医药学和农业等相关领域都具有重要意义。

另一方面,金属离子在生命体中具有重要作用。生物体内存在的多种金属蛋白和金属酶,例如血红蛋白和肌红蛋白是以铁卟啉为辅基的金属蛋白^[6];血蓝蛋白是含铜的金属蛋白^[7];锌指蛋白则是含有锌离子的一种DNA结合蛋白^[8]。金属元素的含量过少或过多,都会对生命体产生危害作用。如缺铁会造成缺铁性贫血症^[9];人体中铝元素含量高时会对神经系统造成严重伤害,甚至会诱发帕金森病^[10]。金属离子的含量对于生命体的影响非常大,因此对体内金属离子浓度进行准确检测是非常必要的。

对于生物体和环境中金属离子的检测,已经发展了多种方法^[11⇓~13],如配位滴定法、原子吸收光谱法(Atomic Absorption Spectroscopy,AAS)^[14]、原子发射光谱法(Atomic Emission Spectrometry,AES)^[15]、原子荧光光谱法(Atomic Fluorescence Spectrometry,AFS)、电感耦合等离子体法(Inductive Coupled Plasma,ICP)、电感耦合等离子质谱法(Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry,ICP-MS)、紫外可见吸收光谱法(Ultraviolet-Visible Spectroscopy,UV-Vis)、荧光光谱分析法和电化学方法等^[16]。这些方法存在着一些缺点,如样品需要预处理、检测不够快速和价格昂贵等^[17]。因此,迫切需要发展快速、准确、低成本和选择性好的金属检测方法^[18]。

基于多肽的金属离子检测是近年来发展起来的一种快速简便方法。有关多肽与金属离子键合作用的应用研究引起了人们的广泛关注^[19]。多肽由氨基酸脱水缩合而成,是一个多齿配体。多肽具有以下优点:(1) 已具有成熟的合成方法,可通过Fomc-固相多肽合成法(Solid Phase Peptide Synthesis, SPPS)来合成不同序列的多肽^[20]。(2) 是含有多配位原子的多齿配体,可与金属离子快速键合形成非常稳定的螯合物^[21]。因此,可对金属离子进行高灵敏性检测。(3) 多肽的不同序列赋予其不同结构和性质,与不同金属离子的结合能力不同,即不同的多肽对金属离子检测具有高选择性。(4) 可以通过改变多肽的氨基酸序列来进一步优化,提高多肽对靶金属离子的键合能力,以达到更高的选择性和灵敏度。(5) 水溶性好,是内源性生物活性分子,它有很好的生物相容性和细胞穿透能力。因此,可用于细胞及特殊细胞器中金属离子检测和生物成像。由于多肽的上述优点,使得基于多肽的化学传感器成为当今检测重金属离子的有效方法之一。其中,UV-Vis吸收光谱法、荧光光谱法和电化学分析方法是目前应用广和效果好的检测方法。

2 多肽基紫外-可见比色传感器

利用UV-Vis法进行定量检测的基本原理是朗伯-比尔定律,即透明溶剂中发色团的吸光度随着样品池光程和发色团浓度的变化而呈线性变化(A=εbc)。分光光度分析有两种,一种是利用物质本身对紫外-可见光的吸收进行测定;另一种是以生成有色化合物的显色反应为基础进行测定。虽然有些无机离子在紫外-可见光区有吸收,但其强度一般较弱,所以很少直接用于定量分析。加入显色剂使待测物质转化为在紫外-可见光区有吸收的化合物来进行光度法测定,是目前应用最广泛的测试手段之一。吸收光谱法对于重金属离子的检测具有显著的优越性,如设备简单、操作方便、高效和廉价等。

纳米金是指直径在1~100 nm间微小的金颗粒,分散在水中一般以溶胶的形式存在,因此又被称作胶体金^[22]。纳米金具有优异的光学性能如摩尔消光系数高,特别是具有很强的表面等离子体共振(Surface Plasmon Resonance,SPR)性能。在UV-Vis光谱中,纳米金颗粒的特征等离子体吸收峰在510~550 nm波长之间,并且随着纳米金颗粒尺寸的增加或颗粒间距离的减小,紫外吸收峰的位置会逐渐向长波长处移动即发生红移^[23]。肉眼观测纳米金的颜色主要呈现为鲜亮红色的溶液,当纳米金颗粒团聚到一定的程度即2个颗粒之间的距离小于粒径的2倍时,纳米金溶液的颜色就会发生明显的变化,由其原来鲜亮的红色变为蓝紫色。

近年来,基于多肽的纳米金颗粒的紫外-可见比色法受到人们的广泛关注。Chen等^[24]设计了一种多肽(CGGG)修饰的纳米金粒子(p-AuNPs)的铜离子比色传感器。在Cu²⁺存在下,多个p-AuNPs协同结合在一起,导致p-AuNPs的聚集和沉淀,从而使其颜色由酒红色变为无色(图1),并且其他金属离子对铜离子检测几乎没有干扰,该传感器对Cu²⁺具有很好的选择性。Li等^[25]研究了一种灵敏的银离子检测方法,是基于多肽(RFPRGGDD)修饰的金纳米粒子(AuNPs)通过其多肽上氨基酸残基与Ag⁺的相互作用,使AuNPs产生聚集发生颜色改变,从而通过光谱比色法测定Ag⁺。该方法可以在水溶液中进行检测,检出限可达7.4 nmol/L。Chai等^[26]用L-Cys和纳米金颗粒结合形成的Cys-GNPs检测Hg²⁺。当体系中加入Hg²⁺时,Cys-GNPs就会与Hg²⁺发生反应,使Cys-GNPs聚集为尺寸较大的颗粒,使纳米金溶液的颜色发生改变。该比色法对Hg²⁺具有良好的选择性,检测限达到100 nmol/L。

基于多肽修饰的纳米金颗粒还可以实现可视化检测。例如,Si等^[27]用羧基化的肽链(NH₂-Leu-Aib-Tyr-OMe,Aib:α-氨基异丁酸)修饰纳米金颗粒,制备出基于多肽功能化的纳米金传感器。室温时在Hg²⁺存在下,该传感器可以不依靠任何模板自组装成纳米金的一维阵列。这种自组装导致的溶液颜色变化及吸收光谱的变化使该传感器在水溶液中对汞离子的肉眼检测限达到ppm级。Li等^[28]合成了一个序列为Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Ala-Arg的七肽,多肽上半胱氨酸的巯基与纳米金形成Au—S键,降低了纳米金表面的电荷,促进纳米金的聚集使溶液的颜色由酒红色变为蓝色。而加入Zn²⁺以后,多肽会优先与Zn²⁺结合,而不与纳米金结合,溶液的颜色不会产生变化(图2a)。Du等^[29]利用类似的原理,将粒径为13 nm的纳米金和多肽混合,用比色法灵敏地检测了 Hg²⁺。

本课题组的Feng等^[30]设计了一种七肽基的比色传感器(Cys-Pro-Gly-Cys-Pro-Gly-Cys-NH₂,P7)(图2b)。当P7加入到GNP中后,多肽链上半胱氨酸的巯基与纳米金结合时形成Au—S键,纳米金粒子间通过不同的巯基键合连接起来,促进纳米金的进一步聚集,使溶液的颜色由酒红色变为蓝色。但是,当Hg²⁺和P7同时加入到GNP中后,GNP的颜色仍是红色;而当其他金属离子和P7同时加入到GNP中则会变成蓝色。因此,该传感器可选择性地检测Hg²⁺,其检出限为0.1 μmol/L。

在资源短缺的情况下,比色分析法是一种非常重要的分析方法,用肉眼易于观察并且不需要复杂的仪器操作程序。在比色分析法中,反应媒介中信号是通过视觉的颜色变化来体现的。由于纳米金有独特的表面等离子体共振性,不同粒径的纳米金颗粒呈现出不同的颜色。利用多肽与纳米金结合的性质,基于多肽的纳米金光谱比色法测定金属离子的研究将会受到更广泛的关注。

3 多肽基荧光化学传感器

常见的荧光化学传感器主要是由以下几部分构成。(1) 识别基团又称为受体,它是被测物种的识别部分,可以选择性地结合被测底物;(2) 连接体,是连接识别基团和荧光基团的中间体;(3) 荧光基团即信号报告基团,在识别基团与被分析物结合后可发射易被检测的荧光信号,从而利用荧光光谱达到检测目标分析物的目的。

3.1 荧光化学传感器的机理

常见的荧光传感器的荧光传感机理有以下三种。

(1)光诱导电子转移机理

光诱导电子转移(Photoinduced Electron Transfer,PET)^[31]是荧光化学传感器中常见的机理之一。基于PET机理的传感器,一般由接受体部分(键合基团)、荧光基团以及间隔基团三部分组成的,通常接受体部分或者荧光基团作为电子供体或电子受体。其中荧光团部分是吸收和发射荧光的场所,接受体部分则用来结合客体,这两部分被间隔基隔开,又靠间隔基相连而成一个分子,构成了一个在选择性识别客体的同时又给出光信号变化的分子体系。光诱导电子转移反应是指电子供体或电子受体收到激发后,电子供体与电子受体之间发生电子转移的现象。

当荧光传感器的键合基团作为电子供体,荧光基团作为电子受体时,传感器受到光照激发,作为电子供体的键合基团能够将其处于最高能级的电子转移至基态的荧光基团空的电子轨道,从而使受光激发的电子无法回到原基态轨道发射荧光,造成荧光猝灭。当客体加入时,键合基团会与客体结合,导致键合基团的给电子能力减弱,则光诱导电子转移过程受阻,此时荧光基团受光激发的电子可以跃迁到原基态轨道发射荧光,从而使荧光恢复。简而言之,当传感器未与检测物结合时,荧光发生猝灭;当与检测物结合时,荧光恢复。这类传感器呈现出明显的荧光“关”与“开”状态,所以又被称为荧光分子开关。

(2)分子内(光致)电荷转移机理

分子内(光致)电荷转移(Internal Charge Transfer,ICT)^[32]的荧光团上同时含有识别客体作用的电子供体和电子受体。当荧光团受光激发时,电子供体会将电荷转移给受体,从而辐射荧光信号。当客体存在时,荧光团的供体或受体与客体键合,从而导致分子内供体与受体间的电荷转移过程受阻,则表现为荧光发射光谱的红移或蓝移现象。

(3)荧光共振能量转移机理

荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer,FRET)^[33]与其他两种机理不同的是,FRET要有一对合适的荧光团可以构成一个能量供体和能量受体对, 其中供体的发射光谱与受体的吸收光谱要有重叠,当它们在空间上相互接近到一定距离时,激发供体而产生的荧光能量正好被附近的受体吸收,使得供体发射的荧光强度衰减,受体荧光团的荧光强度增强。能量传递的效率和供体的发射光谱与受体吸收光谱的重叠程度、供体与受体跃迁偶极的相对取向、供体与受体之间的距离等有关。FRET的产生需要满足严格的条件:(1) 供体部分和受体部分必须足够接近(10~100 Å);(2) 能量受体吸收光谱与能量供体发射光谱之间必须存在重叠;(3) 供体与受体之间的空间排列必须适当。

多肽基荧光传感器具有易于合成、水溶性好和生物相容性好等优点,所以多肽基荧光传感器应用于检测重金属离子越来越引人注目。表1列出了目前报道的一些多肽基荧光传感器。

对于多肽基荧光传感器来说,由于某些氨基酸如色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)具有内源荧光,所以可以利用这些氨基酸作为荧光基团,也可以利用外源性荧光团,例如丹磺酰氯(Dansyl)、羧基荧光素(FAM)、异硫氰酸荧光素(FITC)以及芘磺酰氯(PySO₂)等进行修饰。

3.2 Dansyl修饰的多肽

丹磺酰氯作为最常用的荧光团,可以用来修饰多肽作为标记信号,因此在荧光传感器设计中有着广泛的应用。

Walkup等^[34]最早设计合成了一个基于锌指蛋白的Zn²⁺荧光化学传感器,如图3a所示。该多肽呈规则的螺旋结构,当加入Zn²⁺后,Zn²⁺与多肽中的2个半胱氨酸和2个组氨酸配位,引起多肽的结构发生折叠,使荧光基团丹磺酰胺基(Dansyl)的极性环境发生了变化,从而导致荧光发射的变化。此传感器对Zn²⁺有高度的亲合性,其他金属离子不会对Zn²⁺的检测造成干扰。但由于半胱氨酸易氧化,因此这种传感器的应用受到了氧化还原环境的限制。

Godwin等^[35]在1996 年也报道了一种用于检测Zn²⁺的荧光比率传感器。与Walkup等所报道传感器的相同点是多肽中也含2个半胱氨酸和2个组氨酸残基,不同点是该传感器中含有两个荧光基团即荧光素(F)作供体,而丽丝胺(L)作受体。在多肽传感器分子中,两个荧光基团之间距离相对较远,其分子内的能量转移也很弱;当在多肽传感器中加入Zn²⁺后,Zn²⁺与多肽中2个半胱氨酸和2个组氨酸残基发生配位作用,使多肽链发生折叠,导致两个荧光基团之间的距离拉近,从而使两个荧光基团之间可发生分子内能量转移,即加入Zn²⁺后多肽可发生荧光共振能量转移(图3b)。

Wan等^[36]通过合成特定的肽序HL(Dansyl-Cys-Pro-Gly-His-NH₂),设计了一种新颖的检测Zn²⁺的多肽荧光化学传感器。在体外和体内活细胞中,对Zn²⁺检测均呈现出较高的灵敏性和选择性,其检出限约为82 nmol/L。该传感器细胞毒性低,可用作生物体系中高选择性Zn²⁺测定的化学传感器。

Wang等^[37]设计了两种基于Dansyl的多肽荧光传感器,多肽序列分别为Dansyl-Gly-Trp-COOH(DGT,1)和Dansyl-Gly-Gly-Trp-COOH(DGTT,2)。当Hg²⁺存在时,DGT和DGTT的荧光发射会增强并且发生蓝移;但是DGT对Cu²⁺有明显的荧光猝灭作用,而DGTT则对其他金属离子没有荧光响应;在中性条件下DGT与Pb²⁺结合会产生沉淀。因此,利用DGT对不同金属离子的作用可将这个体系设计为一个离子开关。

Donadio等^[38]发展了一种肽基荧光传感器dH3w(dansyl-His-Pro-His-Gly-His-Trp-NH₂)。加入Zn²⁺和Cu²⁺时,分别表现为荧光增强的“开”和荧光猝灭的“关”响应,而且其他常见金属离子对Zn²⁺和Cu²⁺的影响很小。dH3w可以穿透 HeLa细胞用来测定胞内Zn²⁺和Cu²⁺。在此基础上,Siepi等^[39]进一步发现Hg²⁺对dH3w的亲合力要远高于Zn²⁺和Cu²⁺,大约是Zn²⁺的1000倍。当Hg²⁺和Cu²⁺加入到Zn²⁺/dH3w体系中时,会使Zn²⁺/dH3w体系的强荧光发生猝灭。因此,Zn²⁺/dH3w体系可用来测定Hg²⁺ 和Cu²⁺,在pH=4和pH=7时的检出限分别为(422±80)和(363±73)nmol/L。

2015年,Wang等^[40]设计并合成了一种含赖氨酸主链的多肽荧光化学传感器H₂L,赖氨酸分子上的两个氨基分别与两个半胱氨酸和丹磺酰基耦合在一起,其结构如图4所示。该多肽传感器对Cd²⁺具有较高的选择性和敏感性,检出限为52 nmol/L。当Cd²⁺存在时,H₂L的荧光发射强度增强,是由光诱导电子转移(PET)效应所致。H₂L具有优良的细胞渗透性能和较低的生物毒性,成功用于HeLa细胞中Cd²⁺含量的检测。次年,Wang等^[41]又报道了一种Dansyl修饰的四肽荧光“开关”化学传感器L(Dansyl-Ser-Pro-Gly-His-NH₂)。当向L中加入Cu²⁺后会产生荧光猝灭,再加入S^2-后又会使荧光增强,该传感器对Cu²⁺和S^2-具有较高的选择性和灵敏度,其检出限分别为88 nmol/L和75 nmol/L。

Wang等^[42]还报道了一种检测Zn²⁺的多肽基荧光化学传感器,其多肽序列为Dansyl-His-Pro-Gly-His-Trp-Gly-NH₂,对Zn²⁺的检出限约为97 nmol/L。随后,Wang等^[43]又设计了一种可以灵敏地检测Zn²⁺的四肽荧光“开启”响应化学传感器(Dansyl-Glu-Pro-Gly-His-NH₂)。基于光诱导电子转移(PET)机理,该传感器可以在100%的水溶液中特异性地检测Zn²⁺,检出限为18 nmol/L。在生理条件下可用于HeLa细胞中Zn²⁺的荧光成像。继而,他们又设计了一种“开关”型多肽荧光化学传感器(Dansyl-His-Pro-Gly-Glu-NH₂)^[44]。该传感器中加入Zn²⁺和Cu²⁺分别表现为荧光增强的“开”和荧光猝灭的“关”效应。对Zn²⁺和Cu²⁺均具有高度灵敏性,其检出限分别为4.9 nmol/L和15 nmol/L。

另外,Wang等^[45]又报道了四肽基检测Cd²⁺的荧光“开启”化学传感器(Dansyl-Glu-Pro-Gly-Cys-NH₂)。研究发现其在HEPES缓冲液中对Cd²⁺具有高度灵敏的荧光识别作用, 检出限为45 nmol/L。通过离子干扰实验发现,即使在其他的竞争离子包括Zn²⁺、Pb²⁺、Hg²⁺和Cu²⁺存在时,对Cd²⁺也具有很高的选择性。该传感器也被成功应用于活细胞中选择性检测Cd²⁺的生物成像。近年,Wang等对多肽基金属离子传感器做了进一步的研究,设计合成了以下几种传感器:Dansyl-Ser-Cys-NH₂^[46],基于光诱导电子转移(PET)机理对Cd²⁺有良好的选择性,检出限为13.8 nmol/L;Dansyl-Ser-Pro-Gly-His-Gly-NH₂^[47],与Cu²⁺结合会导致荧光的猝灭,检出限为23.5 nmol/L,传感器与Cu²⁺的混合体系可以检测H₂S,检出限为17.2 nmol/L;Dansyl-Ser-Lys-Ser-Dansyl^[48],通过Lys作为中间连接体将两个Ser-Dansyl荧光团连接起来,与Hg²⁺的结合会导致荧光的猝灭,检出限为7.59 nmol/L;Dansyl-Gly-Cys-NH₂^[49],作为一种“开关”荧光传感器,加入Cd²⁺和Cu²⁺分别表现为荧光的“开”和“关”,检出限分别为14.5 nmol/L和26.3 nmol/L。

Joshi等^[50]合成了通式为Dansyl-Cys-X-Gly-His-X-Gly-Glu-NH₂)(X=Pro, Gly)的三个七肽荧光传感器:Dansyl-Cys-Gly-Gly-His-Gly-Gly-Glu-NH₂(GG2),Dansyl-Cys-Pro-Gly-His-Pro-Gly-Glu-NH₂(PG2)和Dansyl-Cys-Gly-Gly-His-Pro-Gly-Glu-NH₂(PG1)。研究发现,多肽的二级结构会对金属离子的选择性产生重要的影响,含有两个Gly-Gly序列的GG2表现出仅对常见金属离子中的Cu²⁺具有显著的选择性测定;相反,含有两个Pro-Gly序列的PG2则对Zn²⁺具有高选择性测定;而含有一个Pro-Gly序列的PG1则对Cu²⁺和Zn²⁺分别表现为荧光“关”和“开”的选择性检测。在此基础上,将PG1修饰到PEG-PS树脂上^[51],从而实现选择性检测Cu²⁺和Zn²⁺的目的。另外,将树脂用EDTA简单进行洗涤过滤后,可以实现树脂的有效再利用。

Kim等^[52]设计了一种二硫键连接的含双组氨酸残基的检测Ag⁺的对称肽荧光化学传感器DPG1。Ag⁺引起DPG1荧光强度大幅度增大,而Cu²⁺和Hg²⁺可引起DPG1荧光强度猝灭,其他金属离子未引起DPG1荧光强度变化。由于DPG1对Ag⁺的亲合力远大于对Cu²⁺和Hg²⁺的亲合力,即使在Cu²⁺或Hg²⁺存在下,DPG1也能较灵敏地检测Ag⁺。它还被用于银纳米粒子和活细胞中Ag⁺的测定。

In等^[53]合成了一种检测Al³⁺的多肽荧光化学传感器,其肽序列为Dansyl-Ser-Glu-Glu-NH₂。该多肽传感器对于Al³⁺具有高度的灵敏性,由肽序列上Glu残基上的游离羧基、Ser残基上的游离羟基和丹磺酰基上的氧原子与Al³⁺发生配位作用,导致其荧光强度增强,该多肽传感器的检出限为230 nmol/L。Jung等^[54]设计了多肽序列为Dansyl-Lys-Lys-Cys-NH₂的Cu⁺特异性荧光化学传感器,该传感器主要通过半胱氨酸上的巯基、磺胺基和酰胺基与Cu⁺配位结合。它与Cu⁺配位引起荧光强度增强,可灵敏地检测水溶液、活细胞和高尔基体中的Cu⁺。

Azuma和Fukushima^[55]设计了两种含半胱氨酸Cys的二肽荧光传感器(DNS-γGlu-Cys,DNS-Cys-Glu)。研究表明,Hg²⁺对DNS-Cys-Glu具有强的荧光猝灭效应,而对DNS-γGlu-Cys的荧光没有影响。这是因为DNS-Cys-Glu中的巯基和磺酰亚胺基相邻可以与Hg²⁺结合,产生电子转移,从而导致荧光猝灭。基于此,DNS-Cys-Glu表现出高灵敏检测Hg²⁺的能力。

Zhang等^[56]合成了一种多肽基荧光化学传感器Dansyl-Ser-Pro-Gly-His-Trp-Gly-NH₂(DSH)。DSH是基于Trp(供体)到Dansyl(受体)的荧光共振能量转移(FRET)来检测Zn²⁺,DSH在体外和体内对Zn²⁺均表现出较强的荧光响应。在体外,DSH能够区分锌离子和其他金属离子,且检出限能达到124 nmol/L。在体内,DSH可穿透HeLa细胞并与Zn²⁺结合增强了荧光响应,表明该传感器可用于检测复杂生物体系中的Zn²⁺,且具有较低的细胞毒性。

本课题组的Li等^[57]采用Fmoc固相合成法合成了一种检测Cd²⁺的多肽荧光传感器Dansyl-Cys-Pro-Gly-Cys-Trp-NH₂(D-P5)。D-P5对Cd²⁺具有高的选择性,在Cd²⁺的存在下,D-P5的荧光发射强度可通过共振能量转移(FRET)和螯合增强荧光(CHEF)显著增强。同样,Wang等^[58]合成了Dansyl-Cys-Pro-Pro-Cys-Trp-NH₂,它也能特异性识别Cd²⁺,其检出限为11.5 nmol/L。Pang等^[59]设计了一种可以检测Cu²⁺和Hg²⁺的双功能多肽荧光比率传感器(Dansyl-His-Pro-Gly-Trp-NH₂,D-P4)。D-P4与Cu²⁺结合可以使其荧光猝灭(图5),而与Hg²⁺的结合则会产生荧光比率增强响应,而其他金属离子没有干扰。D-P4对于Hg²⁺和Cu²⁺的检出限分别为37和105 nmol/L。

之后,我们合成了一个多肽基多功能荧光传感器Dansyl-Gly-His-Gly-Gly-Trp-COOH(D-P5)^[60]。其与Hg²⁺结合导致D-P5的构象发生折叠,拉近了色氨酸和荧光团Dansyl之间的距离,两者间发生荧光共振能量转移,使Dansyl的发射峰强度增强。但其与Cu²⁺结合则会造成荧光强度的降低,这是由于Dansyl与Cu²⁺之间的电子转移造成的。该传感器对Hg²⁺和Cu²⁺的检出限分别为25和85 nmol/L。更有趣的是,在D-P5-Hg和D-P5-Cu体系的基础上实现了对S^2-的选择性检测。S^2-的加入使D-P5-Hg和D-P5-Cu这两个体系的荧光强度急剧猝灭,它们对S^2-的检出限分别为0.22和0.38 μmol/L。Pang等 ^[61]又设计合成了一个多肽荧光传感器Dansyl-Glu-Cys-Glu-Trp-NH₂(D-P4)。对Hg²⁺具有很好的选择性检测,检出限为23 nmol/L。同时,该体系可以对生物巯基进行很好的可视化检测,在Cys的存在下,D-P4-Hg溶液的荧光绿色加深,对Cys的检出限为52 nmol/L。

3.3 Pyrene修饰的多肽

芘(Pyrene)作为一个非常好的荧光功能基团,具有双重荧光发射(单体和准分子),常被用于荧光化学传感器的设计。Thirupathi等^[62]设计了一种基于芘荧光团的四肽荧光传感器PySO₂-His-Gly-Gly-Lys(PySO₂)-NH₂。在水溶液中,它只对Hg²⁺有选择荧光响应,其他金属离子对Hg²⁺没有干扰。Hg²⁺与传感器中His咪唑基和磺酰胺基配位结合,两个芘荧光团在肽中相互作用导致芘的荧光猝灭。Jung等^[63]设计了一种可用于水溶液、尿液和活细胞中检测Cd²⁺的多肽荧光传感器Pyrene-Cys-Gly-Pro-Cys-COOH(图6),检出限达到23 nmol/L。Hwang等^[64]合成了基于Pyrene荧光团的二肽传感器(Py-Ser-Asp-COOH),通过比率响应来检测地下水、自来水以及尿液中的Al³⁺,检出限为138.1 nmol/L,此值低于美国环境保护署(EPA)规定饮用水中含有的铝离子浓度。

Mehta等^[65]设计合成了一种具有对称结构的二聚体多肽传感器(Py-His-Gly-Gly-Cys-NH₂),该传感器中的组氨酸His咪唑基团在选择性高亲合性结合Zn²⁺中扮演重要角色。通过比率荧光响应可灵敏地检测水溶液中Zn²⁺,它可进入结肠癌细胞(RKO),与Zn²⁺结合发出明显的绿色荧光。Mehta等^[66]模拟含Cu(Ⅰ)金属蛋白中Cu⁺的配位基团合成了一种多肽荧光传感器(Py-Trp-Pro-His-NH₂)。当Cu⁺与两分子的传感器结合时,荧光传感器表现出对Cu⁺灵敏且具有选择性的比率荧光响应。结合模式研究表明,多肽上的咪唑和吲哚基团在与Cu⁺的强结合中起着关键作用。它被成功用于A549活细胞和细胞器高尔基体中Cu⁺的成像。

此外,Jang等^[67]设计了一种基于二肽的芘衍生物荧光化学传感器(PySO₂-Trp-His-NH₂),在生理pH条件下对Ag⁺和纳米银离子具有高灵敏的荧光比率响应。Pyr-WH能穿透活的HeLa细胞,并表现出对细胞内Ag(Ⅰ)的比率响应。

3.4 FAM/FITC修饰的多肽

羧基荧光素(FAM)和异硫氰酸荧光素(FITC)都是荧光素的衍生物,常被作为荧光标记物。相较于FAM,FITC更具活性,也是目前应用最广泛的一种荧光素。

Lv等^[68]设计了一种新颖的检测Cu²⁺的多肽荧光化学传感器,该传感器在N末端用6-羧基荧光素(6-FAM)荧光团标记,在C末端Lys的ε-N上用4-(4'-二甲氨基苯基偶氮)苯甲酸(Dabcyl)猝灭剂标记。在Cu²⁺存在下,多肽链裂解后,裂解片段的释放导致显著的荧光增加,对Cu²⁺的检出限为10 nmol/L。

Xu等^[69]设计了一种新颖的多肽荧光传感器L(FITC-Ahx-Gly-Cys-Ala-NH₂),它以异硫氰酸荧光素(FITC)对多肽进行修饰标记。Cu²⁺和Ag⁺可引起L的荧光猝灭,而S^2-则会使其荧光恢复,完成荧光的“开-关-开”循环。Cu²⁺和S^2-在L-Cu的体系中的检出限分别为37和15 nmol/L,Ag⁺和S^2-在L-Ag的系统中的检出限为13和70 nmol/L。该传感器在水溶液和活细胞中能同时检测Cu²⁺、Ag⁺和S^2-。

近期,Wang等^[70]报道了一种新型多肽基的多功能比色和荧光传感器(FITC-Ahx-Gly-His-Lys-NH₂,L),该传感器模拟了铜蓝蛋白中Cu²⁺的结合位点,它对Cu²⁺具有高度的灵敏性以及选择性,检出限为21.6 nmol/L。引人注意的是,L-Cu体系可以通过比色和荧光变化检测H₂S,并且检出限低至14.7 nmol/L。另外,L即使在高浓度下也表现出优异的水溶性和低生物毒性,并且细胞成像结果表明,其可用于通过共聚焦荧光显微成像监测活结肠癌细胞(RKO)中的Cu(Ⅱ)和H₂S。

3.5 聚集诱导发光荧光团修饰的多肽

传统的荧光生色团在高浓度下荧光会减弱甚至不发光,这种现象被称为“浓度猝灭”效应。浓度猝灭的主要原因跟聚集体的形成有关,故浓度猝灭效应通常也被称为“聚集导致荧光猝灭”(Aggregation-Caused Quenching,ACQ)。近年来,唐本忠等发现并提出了“聚集诱导发光”(Aggregation-Induced Emission,AIE)效应。他们发现一些噻咯分子在溶液中几乎不发光,而在聚集状态或固体薄膜下发光大大增强。近年来,AIE荧光团如四苯基乙烯(TPE)和噻咯由于其独特的发光特性备受关注。

利用这一原理,Neupane等^[71]合成了基于四苯基乙烯(TPE)荧光团的多肽荧光传感器(TPE-Ser-His-CONH₂),如图7所示。在含有NaCl的缓冲水溶液中,其在16种金属离子中只对Hg²⁺具有选择性开启响应。该传感器与Hg²⁺配位后产生聚集效应,从而使470 nm处荧光发射强度明显增强。Hg²⁺的检出限为5.3 nmol/L,远低于EPA规定的饮用水中Hg²⁺的最大允许浓度。在此基础上,他们进一步优化多肽序列,将Ser替换为Asp。结果表明,该传感器对金属离子的选择性与缓冲溶液的性质有关^[72]。在中性pH的蒸馏水和磷酸盐缓冲液中,它对Hg²⁺表现出选择性的荧光聚集开启响应,但在中性Tris和酸性六亚甲基四胺缓冲液中,则对Al³⁺表现出高选择性的荧光聚集响应。这表明,缓冲溶液的性质对不同金属离子引起的该传感器聚集诱导发光效应起重要作用。

Liu等^[73]设计合成了一种聚集诱导发光基的多肽传感器(TPE-Py-EEGTIGYG),在水溶液和活细胞中选择性地检测Cu²⁺,其中多肽EEGTIGYG具有提高水溶性和特异性与细胞膜结合的双功能。在高浓度(25 μmol/L)的TPE-Py-EEGTIGYG水溶液中能自装配成纳米聚集体,由于TPE-Py上苯环分子内旋转受限,因此该纳米聚集体产生强的荧光。Cu ²⁺可明显猝灭这种荧光,而其他金属离子则不能,从而实现对水中Cu²⁺的选择性检测。TPE-Py-EEGTIGYG在低浓度(5 μmol/L) TPE-Py-EEGTIGYG的水溶液中以单分子形式存在且荧光很弱。然而,当它结合在细胞膜上时其荧光强度大大增强,这种荧光能被Cu ²⁺选择性猝灭。因此,它可被用来测定进出细胞的Cu²⁺浓度。

除TPE可以作为聚集诱导荧光团外,Neupane等^[74]合成了一种新型聚集诱导荧光分子。基于该荧光分子设计合成了一种传感器,如图8所示。在Tris缓冲溶液中,分子中的Asp基团与Al³⁺特异性配位结合,引起聚集诱导荧光效应,导致600 nm处的红色荧光发射强度增强,并伴随着535 nm处荧光发射强度的减小。利用这种比率荧光响应性质可灵敏地检测Al³⁺。

3.6 其他多肽荧光传感器

除上述类型多肽基荧光传感器外,近年来有关纳米离子修饰多肽和环肽荧光传感器也有报道。Lin等^[75]报道了一种新的检测Ca²⁺的多肽功能化碳点传感器f-CDs。f-CDs表现出对Ca²⁺的特异性识别,钙离子结合后会使f-CDs的荧光猝灭,且猝灭强度在较大范围内与Ca²⁺浓度呈线性关系。该传感器具有良好的生物相容性,并具有很小的细胞毒性。

Viswanathan等^[76]设计合成了一种三肽(Gly-Gly-His)联接的荧光杂化纳米粒子传感器。在Cu²⁺存在下,荧光杂化纳米粒子传感器中的三肽上组氨酸咪唑环可与Cu²⁺形成六元环螯合物,触发能量转移,导致荧光猝灭。该传感器对Cu²⁺的检测限可低至0.5 μmol/L。

Yang等^[77]设计合成了一种新型的检测UO₂²⁺的环多肽荧光传感器,环十肽的结构如图9所示。他们首先研究了环肽A对UO₂²⁺的荧光响应,结果表明,UO₂²⁺可使其360 nm处的色氨酸荧光发生猝灭,但是也发现其他金属离子如Th⁴⁺、Nd³⁺和Cu²⁺也会引起其荧光猝灭。因此,进一步设计了环肽B,即环肽A中的组氨酸被磷酸化的丝氨酸取代以获得UO₂²⁺与磷酸基团的结合能力;天冬氨酸被谷氨酸所取代,因为谷氨酸较弱的酸性和灵活的侧链会增强与UO₂²⁺的结合能力。结果表明,UO₂²⁺与环肽B的结合会导致其荧光猝灭,而其他金属离子不产生干扰。环肽B对UO₂²⁺具有高选择性和高灵敏性的检测,并且成功用于河水中UO₂²⁺检测的荧光传感器。

4 多肽基电化学传感器

电化学分析法是近几年来发展比较快的一种方法,它以经典极谱法为基础,在此基础上又衍生出了示波极谱法和阳极溶出伏安法等方法^[78]。它是根据被测物质的溶液所呈现出的电学和电化学性质及其变化而建立起来的分析方法。这类方法通常以试液作为电解质溶液选配合适的电极,构成一个电化学电池,通过测量电化学电池的某些电参数如电导、电位、电量和电流等,或者测量这些电化学参数在某个过程中的变化情况来求得分析结果。近年来,基于多肽的电化学方法检测金属离子研究取得了重要进展。

Gooding等^[79]用还原型谷胱甘肽(GSH)修饰电极检测Cd²⁺并得到其检测限为5 nmol/L。由于GSH没有电化学活性,限制了它在溶液电化学检测重金属离子方面的应用。刘又年等^[80]选用二茂铁基来修饰GSH,首次合成了还原型谷胱甘肽-二茂铁化合物(GSH-Fc)(图10),并根据巯基化合物易与金反应生成稳定的Au—S键的性质,将GSH-Fc修饰在金电极上。由于谷胱甘肽含多个活性基团可以与重金属离子发生配位反应,导致电极电化学性质的变化。因此,可利用GSH-Fc的电极来检测Cd²⁺,该传感器检测限为0.1 nmol/L。刘又年等^[81]利用氧化型谷胱甘肽和二茂铁合成了电活性的传感器Fc-GSSG-Fc,用循环伏安法研究了其电化学性质和其与锌离子的配位作用。结果发现,Zn²⁺与Fc-GSSG-Fc 结合比为 1∶1。

Chow等^[82]设计了四种化学修饰的金电极,其中三种电极分别用多肽Gly-Gly-His、γ-Glu-Cys Gly和人血管紧张素Ⅰ通过自组装的硫辛酸单层膜进行共价结合修饰,第四种电极仅用硫辛酸修饰。利用这些电极测定了Cu²⁺、Cd²⁺和Pb²⁺三种金属离子混合物的电化学性质。伏安法研究表明有一个明显的还原峰存在,归属于铜的还原;还有一个峰归属于镉和铅的重叠,这个重叠峰难以用传统方法来定量分析。因此,采用了多维偏最小二乘(N-PLS)回归校准法分析混合物中Cu²⁺、Cd²⁺和Pb²⁺的痕量浓度(100 nmol/L~10 mmol/L),得到了满意的结果。Lin等^[83] 报道了一种选择性检测Pb²⁺的肽基电化学传感器。用方波伏安法(Square wave voltammetry,SWV)测定了该多肽修饰电极的电化学性能。如图11所示,裸金电极本身并没有明显的电化学特征。经多肽修饰后呈现出明显的SWV响应,SWV在364 mV处有一独特的峰,可能是由肽中Cys的存在所致。当加入Pb²⁺后,在-307 mV出现了一新峰。该传感器在50~700 nmol/L范围内对Pb²⁺具有高灵敏响应。

Clara等^[84]发展了一种谷胱甘肽修饰的丝网印刷碳纳米纤维电极(GSH-SPCNFE)。将GSH-SPCNFE与经典的谷胱甘肽修饰的丝网印刷碳电极(GSH-SPCE)进行比较,同时利用伏安法测定了Cd²⁺和Pb²⁺。它们的电化学性质和分析性能表明,SPCNFE能更好地支撑GSH的固定化。GSH-SPCNFE对环境样品中低浓度Cd²⁺和Pb²⁺的测定具有良好的重复性和准确性。

Liu等^[85]利用未修饰金纳米粒子(AuNPs)和Zn²⁺特异性结合肽(CCPGC),发展了一种简单、灵敏和成本低廉的检测Zn²⁺的电化学阻抗光谱法。将AuNPs修饰在玻碳电极(GCE)上,含巯基的多肽与电极上的AuNPs共价结合,会产生较大的电子转移电阻。当Zn²⁺存在时,由于Zn²⁺与多肽(CCPGC)具有很高的亲合力,因而两者优先结合在一起。这样多肽便不能再与电极上AuNPs作用,降低了电子转移电阻。因此,通过分析电子转移电阻的降低值,可以定量测定Zn²⁺。

这种测定Zn²⁺方法的灵敏性可与原子吸收光谱法相比且高于荧光、比色和电化学传感器。该法具有高的离子选择性,在环境检测和临床应用上具有很大潜力。Roozbahani等^[86]以含天冬氨酸多肽为螯合剂,调节电解质溶液pH值,控制多肽配体及其金属离子配合物的净电荷,研制了一种快速、实时和无标记的纳米孔传感器(图12)。通过检测被分析物通过单个纳米孔所产生的离子电流,可以确定分析物的浓度。该传感器可以检测Th⁴⁺,该方法灵敏度高,检出限为0.45 nmol/L。该传感器具有很高的金属离子选择性,即使比Th⁴⁺浓度高10³数量级的UO₂²⁺、Pb²⁺、Cu²⁺、Ni²⁺、Hg²⁺、Zn²⁺、As³⁺、Mg²⁺、Ca²⁺也不会对Th⁴⁺的检测产生干扰。该法成功应用于模拟水样品的分析。

5 结论和展望

环境中的金属特别是有毒重金属污染严重威胁着生态环境和人体健康;另一方面,微量金属在生物体内发挥着重要的生物学功能,微量金属的失衡导致多种疾病的发生。对于环境和生物金属离子的准确测定至关重要。因此,设计合成具有高灵敏度、高选择性和良好的生物相容性等优点的新型金属离子传感器仍是目前化学和生物医学等学科研究的热点课题之一。近年来,多肽基金属传感器发展迅猛是因其具有以下几个优点:多肽的合成方法比较成熟,可通过Fomc-固相多肽合成法来合成不同序列的多肽;多肽可与金属离子快速键合形成非常稳定的螯合物以保证对金属离子检测的高灵敏性;不同序列的多肽与不同金属离子的结合能力不同,这决定了对金属离子检测的高选择性;多肽的氨基酸序列可进行优化以提高其选择性和灵敏度;多肽具有良好的生物相容性和细胞穿透能力。因此,基于多肽的化学传感器成为当今检测环境重金属离子和活细胞中金属离子及金属生物成像的一类有效方法之一。我们对近年来所报道的一些多肽基金属离子传感器进行了综述,包括多肽基紫外-可见吸收比色传感器、多肽基荧光传感器和多肽基电化学传感器,尤其是对环境污染重金属离子(如Hg²⁺、Cd²⁺)和生物必需金属离子(如Cu²⁺、Zn²⁺)等的检测及其在生物成像中的应用进行了重点概述。虽然多肽基传感器在金属离子检测及生物成像方面的研究取得了一些重要进展,但是多肽基金属传感器仍然存在一些问题尚需进一步研究和探索。例如,多肽基金属离子传感器的特异性仍然取决于多肽和不同金属离子结合能力的差异,这意味着其他金属离子的一些干扰是不可避免的;多肽基金属离子传感器的设计仍处于不成熟的经验性阶段;目前所研究的主要是多肽基荧光传感器,其他类型多肽基传感器的研究较少;所报道的多肽基传感器仍不能满足商业化需求。

针对目前的研究现状,我们可从以下几方面入手,进一步研究发展新型的多肽基金属离子传感器并探索其应用。(1) 通过模拟天然金属蛋白/金属酶中金属离子活性结合位点,实现多肽与金属离子的特异性结合,设计合成高选择性和高灵敏性的传感器。(2) 利用计算机辅助设计或理论计算来设计更加有效的特异性传感器。(3) 除常见的荧光传感器外,其他类型多肽基传感器的研究需要进一步加强。创新传感器设计原理,开发新的检测机理研究。(4) 除荧光团外,进一步研究其他材料如纳米粒子、聚合物、量子点、碳点、石墨烯和近红外染料等被用作信号标记物的多肽基金属传感器。(5) 研究具有肿瘤、细胞和细胞器等生物靶向的多肽基金属传感器。(6) 开发便携式满足商业化需求和基于芯片技术的多金属检测的功能的多肽传感器。相信随着对多肽基金属传感器的不断探究和探索,发现新的方法以及策略会更进一步地推动金属传感器的发展与应用。

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