微流控阻抗流式细胞仪在单细胞检测中的应用

冯迪; 王广华; 唐文来; 杨继全

doi:10.7536/PC200615

化学进展 ›› 2021, Vol. 33 ›› Issue (4) :555-567 DOI: 10.7536/PC200615

综述

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微流控阻抗流式细胞仪在单细胞检测中的应用

冯迪 ¹ ,
王广华 ¹ ,
唐文来 ¹^,²^,³^,^* ,
杨继全 ¹

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Application of Microfluidic Impedance Cytometer in Single-Cell Detection

Di Feng ¹ ,
Guanghua Wang ¹ ,
Wenlai Tang ¹^,²^,³^,^* ,
Jiquan Yang ¹

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摘要

单细胞水平的检测能够在细胞群中分辨出稀有的异常细胞,在生物医学领域如疾病的早期诊断和治疗评估等方面有着至关重要的作用。通过整合微流控技术、电阻抗技术与流式细胞术,微流控阻抗细胞仪能够在微流体精确操控条件下,实现流动态单细胞的连续、无损阻抗检测。与传统的单细胞检测方法相比,微流控阻抗细胞仪具有非标记、多参数、低污染和检测速度快等显著优势,为细胞的种类鉴别与状态监测提供了强有力的工具,因此近年来研究学者已成功开发出各式具有不同结构和功能的微流控阻抗细胞仪。本文首先介绍直流阻抗细胞仪、交流阻抗细胞仪以及形变阻抗细胞仪的工作原理和开发进展,随后讨论微流控阻抗细胞仪在血细胞、癌细胞和微生物等生物样品检测中的最新应用情况,并从集成化和微型化两方面阐述微流控阻抗细胞仪在临床即时检测中的应用前景,最后总结了现有微流控阻抗细胞仪存在的不足并探讨了该领域的未来发展趋势。

Abstract

Single-cell level detection can distinguish rare abnormal cells from large cell populations, which plays a vital role in biomedical fields such as early diagnosis and treatment evaluation of diseases. By integrating microfluidics, electrical impedance spectroscopy and flow cytometry, the microfluidic impedance cytometer has attracted extensive attention, as it can realize non-destructive impedance detection of single cells in a continuous way with precise flow control. Compared with traditional single-cell detection methods, microfluidic impedance cytometer has significant advantages such as label-free, multi-parameters, low pollution and high throughput, providing a powerful tool for cell population identification and status monitoring. Therefore, various microfluidic impedance cytometers with different structures and functions have been successfully developed in recent years. In this review, we first summarize the working principles and recent developments of DC impedance cytometer, AC impedance cytometer and deformability impedance cytometer, and then focus on the latest applications of microfluidic impedance cytometer in the detection of biological samples such as blood cells, cancer cells and microorganisms. Later, the application prospect of microfluidic impedance cytometer in clinical real-time detection from the aspects of integration and miniaturization are also presented. Finally, the shortcomings of the existing microfluidic impedance cytometers and the future development trend in this field are discussed.

Contents

1 Introduction

2 Microfluidic impedance cytometer

2.1 DC impedance cytometer

2.2 AC impedance cytometer

2.3 Deformability impedance cytometer

3 Applications in single-cell detection

3.1 Blood cells

3.2 Cancer cells

3.3 Bacteria

4 Applications in point-of-care testing

4.1 Chip integration

4.2 Chip miniaturization

5 Conclusion and outlook

Graphical abstract

关键词

单细胞 / 微流控 / 阻抗流式细胞仪 / 非标记 / 多参数

Key words

single-cell / microfluidics / impedance flow cytometer / label-free / multi-parameters

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冯迪, 王广华, 唐文来, 杨继全. 微流控阻抗流式细胞仪在单细胞检测中的应用[J]. 化学进展, 2021, 33(4): 555-567 DOI:10.7536/PC200615

Di Feng, Guanghua Wang, Wenlai Tang, Jiquan Yang. Application of Microfluidic Impedance Cytometer in Single-Cell Detection[J]. Progress in Chemistry, 2021, 33(4): 555-567 DOI:10.7536/PC200615

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1 引言

近年来,单细胞的分析越来越受到研究人员的重视,传统的细胞检测通常是在一组细胞中进行,以整体细胞群的平均特性来概括全部细胞,掩盖了单个细胞之间的个体差异^[1,2]。这种由细胞异质性导致的细胞间差异广泛存在于细胞、器官、乃至个体的成长过程中,对生命体活动的单元过程有着重大影响^[3,4]。细胞样本的高度异质性,对于临床研究和生物医学工程是一个巨大的挑战。近些年来,在肿瘤学、干细胞研究或传染病等领域,人们对分离、富集和计数各种类型的“稀有细胞”(即存在于大量细胞群中的一个非常小的亚群)或血液中的细菌产生了极大的兴趣^[5]。单细胞检测可以有效鉴别细胞群体中少量的异常细胞,能够为疾病的早期诊断、药物筛选提供科学依据,从而指导对其进行针对性地靶向治疗^[6]。

与传统的宏观方法相比,微流体诊断工具在样本容量、成本、可移植性和集成性等方面具有许多优势^[7]。在微流控技术的众多优点中,与细胞尺寸相当的微米级通道带来的对细胞操控的便利性显得尤为突出,使得微流控装置能精确控制细胞的微环境,利于对单细胞的操控和表征^[8⇓⇓~11]。此外,微流控的高通量和精准控制能够提供更多更全面的细胞信息^[12⇓~14],因此微流控技术成为单细胞分析的重要工具。由于生物样品的成分复杂,基于微流控技术的单细胞分析通常涉及样品的分选富集和检测表征两个方面^[15]。在过去的二十年中,研究人员开发了众多微流控技术来实现对不同种类细胞或微粒的分离,比如惯性分选^[16]、流体动力分选^[17⇓~19]等依赖于流道结构与流体流动的被动方法,以及利用光^[20⇓~22]、磁^[23⇓~25]、电^[26⇓~28]、声^[29⇓~31]等外场作用的主动技术。

对于经过分选预处理后的细胞检测与表征,现有研究主要通过光学方法来实现,比如使用荧光标记方法实现分子特异性检测,从而对细胞进行标定分类。如Hung等^[32]开发了一种微流控分选仪,基于免疫荧光检测原理,使用现场可编程门阵列进行所有电子器件之间的通信和排序决策,极大地提高了荧光寿命测量和排序的吞吐量。然而,免疫荧光检测方法需要繁琐的标记步骤,且流程耗时、检测成本较高^[33,34]。因此,已经有越来越多的研究致力于开发非标记的细胞检测和鉴定方法^[35⇓~37]。其中较有前景的有基于细胞电学特性的微流控检测方法,包括利用电旋转^[38]、微电阻抗谱技术^[39,40]等来表征细胞膜电容和细胞质电导等电学参数的方法。虽然这些技术能够完成对细胞电学性能的测量,但各自都存在一些缺陷,细胞检测通量不高。比如电旋转技术难以实现细胞在缓冲液中的有效旋转,且细胞需要操纵固定,其过程繁琐导致检测耗时久,电阻抗谱技术是将细胞在电极附近捕获,极易引起电极污染且实验进程缓慢^[41]。通过整合微流控技术、电阻抗技术与流式细胞术,微流控阻抗细胞仪能够在单细胞悬浮液通过检测区域的短时间内表征细胞的介电参数^[3]。与上述两种技术相比,微流控阻抗细胞仪显著提高了单细胞的检测通量,能够在较短时间内获得大量细胞的统计学信息以排除细胞检测的偶然性与随机性,展现出巨大的应用优势。

基于微流控阻抗细胞仪在单细胞检测中的最新进展,本文主要从阻抗细胞仪的系统构建及其在临床上的应用现状等方面进行综述。重点阐述不同检测方法的工作原理、系统类型及电极结构,并根据细胞类型将微流控阻抗细胞仪的临床应用分为血细胞、癌细胞和细菌等方面,且总结了微流控阻抗细胞仪的集成化与微型化两大临床即时应用趋势。最后讨论微流控阻抗细胞仪在单细胞检测的应用前景,为单细胞分析的相关研究提供更多的可能性。

2 微流控阻抗流式细胞仪

流式细胞仪在快速、高通量的单细胞统计分析中得以广泛应用,然而传统的流式细胞仪需要大型的仪器、复杂的激发装置和特殊的生物标记,这种标记会对细胞造成不可逆转的伤害^[42,43]。相比之下,与微流控技术、电阻抗检测技术相结合的微流控阻抗流式细胞仪(Electrical Impedance Flow Cytometry, IFC)是一种无标记、非入侵式的单细胞检测技术,具有样品完整度高、细胞检测速度快等优点^[6]。

IFC能够对通过检测区域的单细胞悬浮液进行实时阻抗检测,得到的阻抗信号及表征的细胞特性与施加的激励电信号有关。电阻抗定义为悬浮细胞液的激励电压和响应电流之比^[44],即:

(1)

Z * = V * I *

式中,Z^*是电阻抗,V^*是激励电压,I^*是电流响应,上标^*表示复数。

根据Maxwell混合理论,细胞悬浮液的复介电常数可由细胞的复介电常数、悬浮介质的复介电常数和细胞体积与通道体积之比的体积分数三个参数确定,即:

(2)

ε mix * = ε med * 2 (1 - φ) + (1 + 2 φ) ε cell * ε med * (2 + φ) + (1 - φ) ε cell * ε med *

式中,

ε *

表示复介电常数,

φ

为体积分数即检测通道内单元体积与介质体积之比。下标“mix”、“cell”和“med”分别表示混合液、细胞和介质。含有细胞的混合物的阻抗(Z_mix)可由式(3)计算:

(3)

Z mix = 1 j ω ε mix * lG

其中,G是校正非均匀电场和边缘场影响的常数, l是通道的宽度,不同电极结构的校正常数可由已知研究文献来计算。

为提高细胞阻抗检测的准确性,研究人员还利用细胞自身的可变形性来密封收缩通道以降低电信号的泄漏。因此,本节将按照直流/低频、交流和形变阻抗流式细胞仪来分类,阐述不同类型微流控阻抗细胞仪的基本原理和检测方法。

2.1 直流/低频阻抗流式细胞仪

直流/低频阻抗细胞仪用于测量悬浮在流动流体中细胞的体积并对其进行计数,而细胞计数是实验室研究和临床应用的基本要求。直流阻抗细胞仪的原理由Coulter在1956年提出,早期装置被称为库尔特计数器^[45]。其工作原理为:当悬浮在电解槽中的细胞通过检测区域(典型的库尔特计数器中是小孔)时,细胞会置换检测区域内的电解质,通过在检测区域附近的两个电极上施加恒压电路,细胞在直流信号或低频交流信号作用下具有的绝缘性使得小孔间电阻瞬时变化形成电流脉冲,测得的电流脉冲个数与峰值和单细胞的个数以及体积成正比。在20世纪90年代后期,这一原理被应用于微系统中,Larsen等^[46]首先利用平面硅结构制作微型库尔特粒子计数器,在硅基底的微流道上采用四电极结构以检测小孔内的电阻变化,同时减少电极/液体接触造成的影响,该实验证明了微型库尔特原理对液体悬浮液中活细胞和颗粒进行计数和分类的能力,奠定了微型库尔特计数器的应用基础。

之后,Choi等^[47]提出一种基于直流阻抗的微库尔特计数器,该系统由集成微流控芯片、阻抗检测电路和信号采集系统组成,微流控芯片由样品储存室、鞘液夹流单元和两个聚电解质凝胶电极组成,该系统可以检测两个电极在低直流电压下的直流阻抗变化,利用循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells, CTCs)和血细胞之间的大小差异,有效计数血液中稀有的CTCs。虽然单通道库尔特计数器能得到可靠结果,但是分析时间过长无法在很短的时间内处理大量的分析样品。因此,Zhe等^[48]开发出一种具有多通道结构的高通量、高灵敏度的库尔特计数器,采用将传感电极布置在微流道中心的独特设计,有效地阻止了多通道检测间的耦合问题,但是电路设计相对复杂。为简化多通道微型库尔特计数器的电路,Khodaparastasgarabad等^[49]提出一种由一个主通道(300 μm宽)和两个传感通道(40 μm宽)组成的微流控库尔特计数器,结构如图1(a)所示。工作原理为:当流体从主通道被迫进入两个较窄的传感通道后,利用传感通道中两对共面金属电极(宽100 μm)来计数。两个传感通道同时检测粒子,可增加吞吐量并消除了粒子的流体动力聚焦需要。该装置能够成功地计数和区分10 μm和20 μm的聚苯乙烯微粒和癌细胞。与单通道的库尔特计数器相比,多通道的结构设计可以同时通过多个传感通道分析粒子,提供了更高的检测通量。

多通道微流控芯片中为每个通道分配一个专用库尔特计数器或通过分时驱动每个微流控通道的多路复用等方法来完成电学检测,这意味着需要与更多的电极连接,容易造成芯片的结构复杂。并且与电极相连的接口数量随着微流控通道的增多而线性增加,从而导致整个芯片可扩展性受限。为解决这些问题,Liu等^[50]利用码分多址(Code Division Multiple Access, CDMA)扩频通信技术正交检测多个微流控通道中的粒子,将多路复用的每个微型库尔特计数器在检测到粒子时产生不同的数字代码称为微流控编码,编码相互正交可以通过计算来区分重叠代码。该芯片仅使用3个电极,结构简单且可扩展,理论上可适用于在任意数量的微流控通道中正交检测粒子。他们利用具有四个微流控通道的装置,证明可检测到每个微流控通道磷酸盐缓冲液(PBS)中的单个人卵巢癌细胞。然而,采用Gold序列在异步传输下保持相互正交的方法尽管能够成功地识别因重合粒子而干扰的信号,但依赖于特定的代码序列会给系统带来挑战,如正交性约束不仅限制了库尔特计数器在网络中的数量,还需要复杂的设计来进行缩放,而且迭代方法的复杂计算妨碍了实时检测的实现。面对这些问题,Wang等^[51]提出一种由10个微流控库尔特计数器组成的网络,对其进行编码以产生随机的非正交波形,建立了一种基于卷积神经网络深度学习结构的信号处理算法来提取传感器信号,整个系统的工作流程如图1(b)所示。

在传统的微流控细胞计数中,两个及以上的粒子同时进入检测区域的可能性被最小化,方法是通过周围的鞘状流将样品流聚焦到一个非常窄的通道中。为避免鞘液夹流的引入,进一步简化芯片结构,Tang等^[52]结合了惯性聚焦和液体电极技术,利用惯性预聚焦技术将细胞单列排序以减少黏连,并使用Ag/AgCl液体电极,优化系统实现了5000个细胞/每秒的检测通量。他们还提出了一种新颖的3D打印方法,以低成本且高效的方式制作出半椭圆形、三角形、正方形和圆形截面的微通道。研究发现,在大流量范围内,半椭圆微通道和三角形微通道均可实现靠近流道底面的三维单列聚焦^[53],这种较低的单列粒子聚焦将对在通道底部制作检测电极的微流控阻抗细胞计数器十分有价值。

最近,为克服库尔特计数器在分析细胞样品时通常缺少预处理功能的缺陷,Kong等^[54]研发出一种能够富集稀有CTCs并对其进行计数的微流控库尔特细胞仪(micro-Coulter Counter, μCC)。该装置由含有电极的玻璃基底、PDMS微腔室及传感孔组成,如图1(c)所示,集成了亲和富集和非标记计数功能,能从健康供体血样和CTCs的混合液中分离CTCs并进行计数。实验验证了该方法具有检测直径大于5.9 μm生物细胞的能力,并且细胞无需标记从而保持原生状态以用于后续的细胞分析和培养。

直流阻抗流式细胞仪具有结构简单、通量高、灵敏度高的优点,其广泛应用于各类细胞计数和分类,已经成为生物学与医学研究领域不可或缺的工具。但库尔特计数器的直流/低频信号只能获取细胞的尺寸信息,无法分析其内部结构与组成,因此难以区分大小体积相近的生物细胞。

2.2 交流阻抗流式细胞仪

在交流阻抗流式细胞仪中,阻抗检测电路对快速通过检测区域的细胞悬浮液进行实时测量,交流电信号下,细胞质膜的阻碍作用明显下降,使得电信号可以穿透部分细胞膜和细胞内液,测得的阻抗值反映了细胞大小与细胞内部信息。除此之外,交流信号下金属电极表面的双电层作用十分微弱,可简化微流控芯片金属电极的设计并提高检测的灵敏度。Han等^[55]提出第一个概念上的交流阻抗分析仪,利用捕捉腔底部的圆形小孔向腔内施加负压以完成细胞捕获,小孔两侧的一对微电极可得到交流阻抗测量值,并以此成功区分出正常的乳腺细胞与异常的乳腺癌细胞。

阻抗流式细胞仪系统中的微电极一直以来都是设计的关键,为此Iqbal等^[56]系统研究了微电极尺寸、介质阻抗、电路电阻和微通道尺寸对电阻抗传感输出的影响。悬浮介质中的细胞阻抗使用了等效电路模型的方法来建模,细胞悬浮液的整体电路如图2(a)所示。通过微电极施加频率范围为100 Hz到100 MHz的电压信号作为激励信号,实现对细胞样品的宽频阻抗测量。结果表明,微电极的面积可以对细胞的电不透明度(高低频下的细胞阻抗比)产生显著影响,为交流阻抗流式细胞仪的传感器设计和表征提供有价值的指导。在大多数微流控阻抗细胞仪中,器件的制作依赖于洁净室内的先进微加工技术,如采用金属溅射/气相沉积在基板(玻璃或硅片)上制作金属电极,并将基板与流道键合以完成共面微电极集成微通道的组装,这种复杂而昂贵的微电极制造工艺限制了微流控阻抗细胞仪在临床诊断中的应用。为了绕开传统的金(铂)电极制备方法,Panwar等^[57]在多层弹性体器件中采用单步光刻制作了共面“接触”场金属微电极(“in-contact” Field’s Metal, icFM),结构如图2(b)所示。这种微电极在检测单个红细胞时显示出优异性能,并且具有很高的灵敏度和长期的工作稳定性,且可以进一步利用非导电流体聚焦或鞘液夹流来降低检测体积,实现更高的灵敏度从而实现细胞分类和微生物检测等更具挑战性的应用。

由于生物样品固有的异质性,细胞分离是各种生物医学应用中必不可少的一步。通常研究人员采用光学观测的方法来评估粒子或细胞在微流道内的横向分布情况,然而这类方法需要透明的材料和对大量图像数据的处理,并且无法实现细胞在微流道截面位置上的定量表征。由于电信号测量和分析的便捷性和空间相关性,基于电阻抗方法的细胞位置检测有效解决了光学检测系统中存在的上述问题。比如Brazey等^[58]提出了一种基于阻抗测量的实时传感器来表征沿通道长度的粒子纵向位置。Solsona等^[15]利用电场中的梯度来探测沿通道宽度的横向粒子位置。Reale等^[59]用两组不同的电极对单个粒子的横截面位置进行电测量,粒子的横向位置由五对电极和由此产生的两个差动电流确定。为克服现有研究大多是沿着一个方向进行粒子位置检测的不足,Reale等^[60]针对粒子截面位置(沿通道宽度和高度)的检测作更进一步的研究,采用非传统布置方案增强电信号来测量通道截面中粒子的横向位置和纵向位置,如图2(c)所示。

该微流控阻抗式细胞仪完成了对单个流动红细胞横截面位置的高通量检测,有望成为研究微尺度颗粒运动、微流控分选和分离应用以及颗粒聚焦系统设计优化的有效工具。最近,Yang等^[61]提出了一种新型的微流控阻抗流式细胞仪,利用N型电极设计来测量单个细胞和微粒的横向位置,从N型电极收集的差分电流编码单个粒子的流动轨迹。根据电流信号和流动微粒、电极、微通道位置之间的几何关系,可以计算出单个微粒或细胞在N形电极中的横向位置。该系统测量微粒和人体红细胞在200 μm宽通道中不同流速流动的横向位置,结果表明与传统的显微成像方法有很好的相关性和一致性。该系统不仅电信号处理快速、准确、通量高,还可以方便地与其他微流控平台集成并实时测量单个细胞横向位置和物理特性。

为了能够实现细胞在高速流动过程中的检测,需要开发高通量的实时信号处理方法。为此,Honrado等^[62]提出将神经网络方法应用在交流微流控阻抗分析仪中,用于实现从测得的阻抗信号中提取细胞的多个性能参数,如图2(d)所示。提出了一种用于多参数数据提取的微流控阻抗芯片设计,将测量含有时间序列的信号波形输入到神经网络中,选择适合处理具有时间维数据的递归神经网络(Recurrent Neural Network, RNN),并训练该网络以预测细胞的大小、速度和横截面位置(即横向和纵向位置)。综合实验数据表明,经过训练的网络能够准确地描述微粒、红细胞和酵母的大小、速度和横截面位置,预测时间为0.4 ms,表明微流控阻抗细胞检测和机器学习的结合可以作为实时单细胞分析和分类的有效基石。

交流阻抗细胞仪是一种能够表征细胞内部电学特性的技术,具有高通量、无标记等优点,在细胞状态分析和干细胞分化检测上应用广泛。然而,由于悬浮在流体中的细胞在检测过程中仅占检测区域的部分空间,容易造成检测电信号的泄露,从而使得整个检测系统的灵敏度不高。

2.3 形变阻抗细胞仪

形变阻抗流式细胞仪是在单细胞挤压通过收缩微通道时对其进行阻抗测量的一种装置,其常见配置是将两个电极放置在收缩通道的两侧,在一个电极上施加交流电压,从另一个电极上测量电流^[63]。其工作原理是:当单细胞流过收缩通道时,细胞会暂时阻塞收缩通道的电场,导致两个电极上测得的阻抗增加。细胞进入与离开收缩通道时阻抗变化之间的时间间隔还能够用作表征细胞变形能力的一个指标。如Yang等^[64]通过评估每个红细胞流经微尺度收缩通道(横截面5 μm×5 μm)挤压时的通过时间来测量细胞变形能力,可在1 min内分析 30 000 多个红细胞,以500个细胞/秒的速度进行疟原虫血症的定量分析。

基于电阻抗的可变形性表征装置通常采用单收缩通道,让单个细胞通过后表征其可变形性和电阻抗特性,例如Zhou等^[65]开发一种能够以高通量的方式同时表征单个生物细胞的力学和电学特性的单收缩微流控装置。实验证明了将力学性能和电阻抗信息结合起来,可以显著提高区分不同细胞群的能力和效率。然而,采用单一收缩通道测量细胞生物物理特性的形变阻抗细胞仪通常具有较低的检测通量。增加收缩通道的数量可有效提高单细胞表征的速度与准确性,如Ren等^[66]提出了一种含有四个并行传感收缩通道的新型微流装置,每个通道包括两个由细胞恢复区隔开的收缩结构。所有通道共用一对电极记录电阻抗以得到不同频率下单细胞阻抗的大小和相位,

具体如图3(a)所示。利用该装置对乳腺细胞株和正常上皮细胞株进行了区分,单细胞水平的检测精度达到97%。证明了多通道微流控装置能够研究细胞的变形和恢复行为,与单收缩通道装置相比,提高了区分癌细胞和正常细胞的效率。然而,现有的能够评估细胞变形特性的多收缩通道微流控器件依赖于高速显微成像技术。为解决这一问题,Yang等^[67]利用低熔点合金研制了一种具有自对准三维电极的差分多收缩通道微流控装置,如图3(b)所示。用电阻抗法代替图像分析法研究细胞的变形和恢复过程,通过比较连续收缩过程中细胞的通过时间信息,研究了单个细胞的变形指数,还开发了一种反向传播神经网络,并将其应用于细胞类型分类的量化。结果表明,显著提高分类准确率,具有较高的灵敏度和特异性,为单细胞检测和分类提供了巨大的潜力。

尽管上述提到的方法都能有效记录阻抗信号并能完成单细胞的表征,但通常只能采集原始的物理标记(如细胞经过收缩通道的通过时间和阻抗信号变化),而没有表征细胞内在的生物物理特性(如细胞质电导和膜电容)。为此,Zhao等^[68]设计了一种包含侧通道的交叉收缩通道,当细胞连续挤压通过收缩通道时,布置在侧通道内的电极实时监测检测区域的电阻抗变化,结合建立的等效电路模型,可在无需显微成像的情况下获取细胞的细胞膜电容和细胞质电导等性能参数。然而,该方法测量时细胞在通过收缩通道时易发生向侧通道内部变形的情况,破坏相应的等效电模型从而造成测得的细胞电学特性不准确。为解决上述难题,Zhang等^[63]对上述器件进行改进,在侧通道内引入鞘液流作用,使得细胞在其移动过程中的位置得到了适当的控制。更具体地说,预先在侧流道内引入鞘液流流动,当细胞沿主收缩流道进入交叉收缩通道时,两侧鞘液流的压力作用使得细胞无法进入侧通道,从而保证了细胞阻抗测量的可靠性。实验结果表明,所研制的微流控系统可以获得10万个A549肿瘤细胞的比膜电容和细胞质电导率,比以往的实验结果更准确。此外,该装置可以区分低转移和高转移癌细胞类型,证实了细胞电学特性在细胞类型分类中的潜在应用价值。

最近,Liu等^[69]还对具有交叉收缩通道的形变阻抗细胞仪进行了进一步的改进,即当细胞沿主收缩流道进入交叉收缩通道时,向侧通道内施加负压将细胞吸吮至侧通道,结合建立的电学模型,根据测得的阻抗变化信号转化为细胞黏度、细胞质电导和细胞膜电容等固有特性,如图3(c)所示。该系统实现了对数百个HL-60细胞的量化,以及对HL-60与HL-60+CD细胞和HL-60与HL-60+ConA的成功分类。与以往的方法相比,该方法能同时得到单个细胞的多个生物力学和生物电特性,可以显著提高细胞类型分类的成功率。

形变阻抗流式细胞仪能够连续表征单细胞的变形能力和阻抗特性,该技术具有精度高、数据处理简单等优点,可用于单细胞的快速、实时、精准分析,在细胞分类和单细胞检测方面有非常广阔的应用前景。

3 阻抗细胞仪在单细胞检测中的应用

近年来,研究开发用于生物医学研究和疾病诊断的微流控芯片系统引起了广泛关注,这些微系统可以在降低成本和尺寸的同时实现高灵敏度检测,分析和表征单个细胞或微粒的生物化学和生物物理特性。其中,微流控阻抗细胞仪能够在单细胞悬浮液通过检测区域的短时间内表征细胞的多个介电参数,为研究人员提供了一种无创伤、高通量的单细胞分析方法。为此,本文将介绍微流控阻抗细胞仪在血细胞(白细胞、红细胞)、癌细胞和细菌等检测方面的应用。

3.1 血细胞

大量证据表明,在镰状细胞贫血^[70]、脓毒症^[71]、疟疾^[72]、遗传性血液病^[73,74]、癌症^[65]和糖尿病^[75]等疾病的发展过程中,血细胞的生物物理特性发生了改变。因此,了解血细胞的生物物理和电学特性是相关疾病早期诊断和治疗效果评估的必要手段。本节总结了利用微流控阻抗流式细胞仪研究各种血细胞介电特性的研究,主要包括白细胞和红细胞。

3.1.1 白细胞

白细胞存在于免疫系统中,参与保护身体免受感染和外来入侵,传统的白细胞分析方法为医学专家提供了有价值和准确的信息^[76],比如荧光和磁分选方法用于白细胞分离,但这些方法需要进行复杂且昂贵的抗体标记。Petchakup等^[77]研发了一种以非标记的方式进行白细胞连续分选和单细胞分析的高通量集成平台,该平台可以在几分钟内直接从稀释或溶解的血液样本中分离出中性粒细胞和单核细胞,随后将白细胞惯性集中于蛇形通道内进行阻抗检测,为开发快速和无标记白细胞分析平台提供基础。

为解决白细胞计数问题,Subramaniam等^[78]使用的微流控阻抗细胞计数仪是通过芯片上的微电极测量每个细胞的阻抗,记录数据后对白细胞亚群计数,还可以区分出三个不同的白细胞群,其检测原始数据散点图如图4(a)所示。在不同频率对细胞阻抗测量有助于准确地识别三种白细胞,且不需要任何生物标记,试剂的成本降低,使其能够在资源匮乏的环境下广泛应用。

巨噬细胞是由单核细胞分化而来的白细胞,位于各种组织中。这些细胞在机体发育、体内平衡、组织修复和病原体免疫应答等方面具有重要意义。Zhang等^[79]提出了一种基于介电泳的方法,利用微流控设备进行液体活检和现场检测,快速分离和纯化巨噬细胞,该设备可以很容易地进行机械操作,以便直接分离。在不同电场条件下测定巨噬细胞的介电泳力,利用微流控芯片成功从巨噬细胞和乳腺癌细胞的混合物中分离出巨噬细胞,纯度高达99%以上。进一步研究流速和电压对巨噬细胞分离效率的影响,能为巨噬细胞疾病监测和实时快速诊断提供技术基础。

3.1.2 红细胞

在对红细胞的检测中,Gawad等^[80]首先发现正常红细胞和异常红细胞(它们的细胞质被低渗溶液代替)在15 MHz的阻抗信号上的区别,得知这两种红细胞之间的差异是源于细胞质的导电性。之后,Cheung等^[81]研究在不同频率下的阻抗信号对红细胞和戊二醛混合红细胞的影响,采用平行电极的设计区分出三种不同浓度下红细胞:健康红细胞、异常红细胞和与戊二醛混合红细胞。结果表明混合细胞的阻抗信号高于正常红细胞,证明了混合红细胞的细胞质导电性降低即不透明性增加。Bilican等^[82]研制了一种无聚焦微流控检测系统,采用将解析法、数值法和实验法相结合的方法进行几何优化。利用所开发的系统对红细胞和白血病细胞进行了实验检测和区分,结果如图4(b),该图为细胞类型的通过时间和峰值振幅的散点图,其中红细胞峰值积累在0.65±0.3 mV左右。结果表明,不需要标记和聚焦就可以实现细胞阻抗的可靠分析。

与健康人群相比,研究发现心血管病人的全血黏度升高,而血细胞比容和红细胞变形能力是全血黏度的主要决定因素。因此Kim等^[83]利用阻抗流式细胞仪揭示红细胞的细胞质电阻、血浆电阻、细胞膜电容等电学特性,从而进行全血指标的分析。红细胞的寄生虫入侵可改变疟疾红细胞的介电特性,Honrado等^[84]研发了一种具有高灵敏度石墨烯晶体管的微流控流式细胞仪,经抗体功能化的晶体管能够感应疟疾感染的红细胞,用于选择性捕获疟疾感染的细胞,在释放细胞之前测量电导能够有效区分两个不同阶段的疟疾感染。

3.2 癌细胞

单细胞分析能够通过测量细胞的物理特性,来研究癌症干细胞以了解疾病的进展并及早发现以便于更有效的化疗^[85,86]。血液中的循环肿瘤细胞可以为检测、诊断和监测癌症提供有价值的信息,Zhou等^[65]开发的微流控装置能够以高通量的方式同时表征单细胞的力学和电学特性,在该研究中,MCF-7乳腺癌细胞的可变形性是基于单个细胞通过小于细胞大小的收缩通道所需要的通过时间来确定。图4(c)显示出未处理的MCF-7细胞与不同剂量PMA处理的MCF-7细胞之间的差异,可得出与其他群体相比更高剂量PMA处理的细胞表现出明显的阻抗增加。该微流控装置可以测得癌细胞的变形能力和电阻抗,从而得到癌细胞的力学性能和电学性能。

Raillon等^[87]提出了一种非标记的高通量微流控平台,将癌细胞通过涡流芯片进行富集后用阻抗芯片里的电极测量细胞通过时产生的电场波动。实验结果表明,涡流芯片能够有效富集癌细胞,利用阻抗芯片可以对癌细胞进行计数和鉴别,这种组合装置能够从癌症患者样本中进行完全集成的非标记循环肿瘤细胞分离和计数。癌细胞的侵袭性转移是癌症患者死亡的主要原因,Ruzycka等^[88]尝试将微流控分析系统作为研究肺癌转移的创新工具,研究了单癌细胞分析、内皮细胞迁移和新生血管生成,展示了微流控系统在肺癌细胞与周围肿瘤微环境的细胞间作用机理研究中的应用。

3.3 细菌

库尔特原理自提出以来,已广泛应用于临床检测和其他许多行业,如Parker等^[89]尝试利用库尔特计数器来测量细菌孢子在萌发和生长过程中的大小分布。在这之后,对于细菌检测,Haandback等^[90]研究了一种用于检测亚微米小球和细菌的新型共振增强阻抗细胞仪。然而,由于在低频作用下细菌和2 μm小球的介电性质相差无几,所提出的技术不能用于区分不同类型的细菌。之后他们还提出能够在高达500 MHz的频率下对单个细胞进行介电表征的装置 ^[91],该装置能够将野生型酵母与突变体区分开,并且发现利用250 MHz左右频率下突变体的大小和液泡的分布来区分介电性能的差异。

Claudel等^[92]提出了一种基于生物阻抗细胞检测技术的流式细胞仪,在酵母菌的静态和动态条件下进行测试,在低电导率介质中测量如酵母细胞的所有电特性,实验结果为完全表征细胞提供了可能性,能够更好地检测单个细胞并测量其大小以及膜和细胞质的电特性。Mernier等^[93]提出液体电极结构实现对细胞介电泳聚焦与阻抗检测,成功分析了酵母菌的活性。

4 阻抗细胞仪在临床即时检测中的应用

疾病的发生往往伴随着人体内某些细胞状态的异常变化,快速有效地检测疾病相关细胞状态是疾病预防、疾病治疗和疾病控制的有力保障。传统的医学设备虽然可以对医学样本进行非常准确的检测,但这些设备往往需要复杂的操作程序和较长的检测时间,并且在疾病治疗过程中,需要多次检测来及时调整治疗方案会花费更多时间^[94]。随着微流控阻抗流式细胞仪的不断发展,其小体积低成本的优点愈发明显,并使芯片实验室和临床即时检测应用成为可能^[95⇓~97]。

4.1 阻抗检测芯片的集成化

单细胞分析已经成为生物学和生物医学研究中的一个新兴领域,而流式细胞术是一种广泛用于单细胞分析的高通量技术,但缺乏有限环境控制的能力从而限制了其应用^[42]。基于此,Petchakup等^[77]研发了一种结合螺旋惯性微流控和阻抗流式细胞术的新型集成平台,如图5所示,图中不同颜色的方框突出显示了不同的功能单元,即细胞分选(红色)和阻抗检测(蓝色),由于细胞分选和阻抗测量均采用非标记方法,阻抗测量后的细胞可以连续在芯片外收集以用于下游检测。集成化后的平台不仅可以用于白细胞分类、鉴定和计数,还能分辨不同疾病之间的显著差异,大大提高了工作效率。

由于互补金属氧化物半导体技术能够有效缩小电学器件尺寸,使系统集成到单个芯片上成为可能,为阻抗分析检测中芯片的集成化和单细胞分析广泛应用提供了基础^[98]。在许多生物学和医学应用中,稀有细胞的富集和检测是必不可少的,如Wang等^[99]制备了一种集成微系统装置,采用交错微电极芯片用于大肠杆菌的富集检测。采用微加工的方法制备的微流控芯片使微电极阵列与细菌悬浮液具有足够的接触面积,以提高富集效率和检测灵敏度。该方法成功地应用于大肠杆菌的检测,实验结果显示检测时间仅为6 min,可知优化后的大肠杆菌的检测速度明显提高。还有Nguyen等^[100]在微流控装置中采用介电泳操纵和圆形微电极阻抗测量相结合的方法检测循环肿瘤细胞。该装置的芯片是通过标准的软光刻制作,利用所提出的微芯片把肺癌细胞(A549)引导到工作区域的中心,然后捕获到所需的传感电极上,通过测量阻抗识别肺癌细胞。这些集成化的低成本方法为开发用于未来应用的细胞诊断系统开辟了新途径。

4.2 阻抗检测系统的微型化

阻抗检测系统的微型化能够使其便于携带检测,为产品的商业发展提供有利条件。Furniturewalla等^[101]提出了一种可穿戴的微流控阻抗细胞仪,将柔性电路腕带与在线智能手机读数结合得到便携式生物计数分析。可穿戴检测系统如图6(a)所示,腕带是由一个自制的锁相放大电路、一个模拟-数字转换器(ADC)以及无线蓝牙模块组成。测量得到的Android智能手机上的数据可输出给研究人员和医疗专业人员进行深入分析和远程健康监测,实验证明了该系统血细胞计数的能力,可以应用于实时临床检测。

Nguyen等^[102]提出一种与微晶片整合的手持式电子集成电路模组,利用介电泳阻抗测量来表征癌细胞。芯片结构如图6(b)所示,该芯片由圆形微电极组成,用于检测细胞的浓度和阻抗,而手持式电子模块能在很大的频率范围内提供正弦电信号来测量微芯片中癌细胞的阻抗。同时观察了人肺癌细胞和人肺上皮细胞的导纳变化与细胞数量的线性关系,这些特征线斜率的差异可以用来区分肺细胞的两个状态,该装置操作简单,灵敏度高,价格低廉,便于携带。

目前,基于血液测试的诊断仍主要集中在实验室,依赖庞大且昂贵的细胞仪或显微镜,还需要专业的实验室技术人员,而在偏远地区无法获取有效的基础医疗保障。面对这一问题,Abbasi等^[103]研制了一种便携式的全血细胞计数仪,检测血液中的白细胞、红细胞、血小板和血红蛋白,用于在资源贫乏环境下的快速诊断,该仪器由一个小型的一次性芯片组成,预装有与环境绝缘的试剂,执行必要的流体处理和阻抗测量,1 min内即可得到检测结果,提出的设计得益于微流控和芯片实验室制造技术的发展,使传统的细胞仪小型化,大大降低了成本。除此之外,Talukder等^[104]也提出了一种便携式的个性化血细胞计数系统,该系统由微流控阻抗式细胞仪和便携式模拟读出电子设备组成,输入到模拟-数字转换器,并通过蓝牙传输到用户可访问的移动应用程序,数据传输如图6(c)所示,所有的通信都是通过手机上的移动接口控制。虽然传感平台使用了低端的硬件设备,但它能够检测到最小为0.032%的阻抗变化,能够在300 μm宽的通道中检测到直径为3 μm的颗粒。

个性化健康监测等应用要求设备运行稳定、抗阻塞能力强,最好避免使用与被检测粒子相当的通道以保持高可靠性。系统灵敏度应该与高端台式阻抗谱仪相当,上述研究都能证明微流控阻抗细胞仪在低成本健康监测方面的潜力,展示微流控阻抗流式细胞仪技术在简单快捷的单细胞检测、细胞计数方面的应用。

5 结论与展望

芯片实验室技术的进步促进了微流控阻抗流式细胞仪在学术研究和商业仪器中的推广应用,使其成为快速分析单个细胞和微粒的最有力技术之一。相较于传统技术,微流控阻抗细胞仪无需标记,且可大大减少时间消耗并降低成本。在分析单细胞时,微流控器件的快速分析和高通量允许用户在更少的时间做更多的检测工作。微流控阻抗细胞仪的另一个优势是对纯电学信号的处理有利于实现系统的集成化和微型化,研究人员利用这种良好的兼容性开发了许多不同的微流控平台来分析细胞,使得单细胞阻抗分析应用于辅助临床决策。比如由于肿瘤细胞的高异质性和缺乏生物标志物信息,采用传统的免疫荧光方法来检测蛋白质表达很难确定一些癌症,当与单细胞阻抗检测技术相结合时,能更精确地完成临床诊断任务。

现阶段大多数的阻抗测量是基于中低频交流信号来分析细胞的尺寸和膜电容特性,对于细胞内部空泡或细胞核的阻抗特性表征仍处于初级阶段。在未来的研究中,单细胞高频阻抗测量的重要性将日益凸显,因为高频阻抗信号可以提供有关细胞核和细胞器的内部信息,有助于发展生物学或基因组学研究。为了能够提高微流控阻抗流式细胞仪在临床即时诊断中的实际应用能力,研究人员正在尝试通过多通道结构设计来实现单细胞的高通量检测,以及利用印刷电路板或微针电极来消除临床即时检测系统对微电极的依赖以此来降低生产成本。除此之外,为方便医学应用中用户的操作,未来大量研究工作将集中在微流控阻抗细胞仪的功能集成方面,如细胞样品的聚焦预处理以及检测后不同细胞种类的自动化分选等。总体而言,微流控阻抗流式细胞仪在单细胞检测的应用中潜力巨大,随着芯片的集成化与系统的微型化,可广泛应用于生物医学和临床即时诊断中。

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基金资助

国家自然科学基金项目(51805272)

江苏省重点研发计划(BE2018010)

中国博士后科学基金资助项目(2020M671450)

江苏省博士后科研资助计划(2020Z042)

东南大学江苏省微纳生物医疗器械设计与制造重点实验室开放研究基金资助课题(KF202008)

江苏省高等学校自然科学研究项目(20KJA460004)

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Received	Published	Revised
2020-06-05	2021-04-20	2020-06-28
Online Date
2020-11-30

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