糖基化在新型冠状病毒侵染中的机制及药物研发中的应用

刘文杰; 刘凯会; 张彦伟; 王良; 张梦裔; 李静

doi:10.7536/PC200647

化学进展 ›› 2021, Vol. 33 ›› Issue (4) :524-532 DOI: 10.7536/PC200647

综述

扫码查看或转发全文

糖基化在新型冠状病毒侵染中的机制及药物研发中的应用

刘文杰 ¹ ,
刘凯会 ¹ ,
张彦伟 ¹ ,
王良 ¹ ,
张梦裔 ¹^,^* ,
李静 ¹^,^*

作者信息 +

The Mechanism of Glycosylation in SARS-CoV-2 Infection and Application in Drug Development

Wenjie Liu ¹ ,
Kaihui Liu ¹ ,
Yanwei Zhang ¹ ,
Liang Wang ¹ ,
Mengyi Zhang ¹^,^* ,
Jing Li ¹^,^*

Author information +

文章历史 +

摘要

冠状病毒(Coronavirus, CoV)是一类具有包膜的正股单链RNA病毒,可感染人类和多种动物。2019年末,一种新的β-冠状病毒SARS-CoV-2(Severe acute respiratory syndrome-coronavirus-2)开始在人际间传播,该病毒引发的疾病“COVID-19”(Coronavirus disease 2019)对全球公共卫生构成严重威胁。糖基化是一种存在于蛋白质上的翻译后修饰,可影响蛋白质的折叠、稳定性及和受体之间的结合等,研究表明SARS-CoV-2包膜中的病毒嗜性决定因子-刺突蛋白(Spike,S)及宿主细胞上的主要受体血管紧张素转化酶2(Angiotensin-converting enzyme 2, ACE2)均为高度糖基化蛋白。为探明糖基化修饰在SARS-CoV-2病毒侵染及与宿主免疫应答中的作用,本文综述了该病毒的侵染机制,体外重组病毒S蛋白和宿主受体ACE2的糖基化类型及糖基化对病毒与宿主相互作用的影响,并提出基于糖基化的COVID-19诊断和药物研发新策略。

Abstract

Coronavirus(CoV) is a class of enveloped, positive-sense single-stranded RNA viruses which can infect humans and animals. At the end of 2019, a novel β-coronavirus SARS-CoV-2(Severe acute respiratory syndrome-coronavirus-2) has started to spread from person to person, and the virus-related disease "COVID-19"(Coronavirus disease 2019) poses a serious threat to global public health in different countries. Glycosylation is a post-translational modification that exists on proteins, which can affect the protein folding, stability, and the binding between virus and host receptors. Spike(S) protein determines the tropism of the virus to the host. A plenty of studies have shown that the spike(S) protein in the SARS-CoV-2 envelope and the main receptor on the host cell, Angiotensin converting enzyme 2(ACE2), are highly glycosylated proteins. To explore the role of glycosylation in virus infection and host immune response, this review summarizes the infection mechanism of SARS-CoV-2, the glycosylation modifications of recombinant S protein and host receptor protein ACE2, and the effects of glycosylation on the interaction between virus and host cells. Finally, based on the mechanism of glycosylation, we propose novel potential strategies for COVID-19 diagnosis and anti-virus drug development, which provides new directions for the diagnosis and treatment of COVID-19.

Contents

1 Introduction

2 The infection mechanism of SARS-CoV-2

3 S protein: highly glycosylated viral tropic protein

3.1 Viral glycosylation mechanism: host-dependent glycosylation modification system

3.2 Subtypes of glycosylation and the related sites

3.3 The role of viral protein glycosylation

4 Glycosylation modification of host receptor protein ACE2

5 SARS-CoV-2 detection and drug intervention strategies based on glycosylation

5.1 Development of efficient and sensitive kits using agglutination

5.2 Drugs that affects glycosylation

6 Conclusion and outlook

Graphical abstract

关键词

新型冠状病毒 / 糖基化 / 刺突蛋白 / 诊断 / 抗病毒药物

Key words

novel coronavirus / glycosylation / Spike protein / diagnosis / anti-virus drug

引用本文

引用格式 ▾

刘文杰, 刘凯会, 张彦伟, 王良, 张梦裔, 李静. 糖基化在新型冠状病毒侵染中的机制及药物研发中的应用[J]. 化学进展, 2021, 33(4): 524-532 DOI:10.7536/PC200647

Wenjie Liu, Kaihui Liu, Yanwei Zhang, Liang Wang, Mengyi Zhang, Jing Li. The Mechanism of Glycosylation in SARS-CoV-2 Infection and Application in Drug Development[J]. Progress in Chemistry, 2021, 33(4): 524-532 DOI:10.7536/PC200647

登录浏览全文

4963

注册一个新账户忘记密码

1 引言

冠状病毒(Coronavirus,CoV)是一类可侵染人类等脊椎动物的重要病原体。就基因组大小和遗传复杂性而言,它是迄今鉴定出的最大RNA病毒之一(基因组约25~32 kb;病毒粒子直径为118~140 nm)^[1]。CoV可以感染人类、家畜、小鼠和多种野生动物(如:鸟类和蝙蝠等)的呼吸道、胃肠道、肝脏及中枢神经系统,并引起程度不一的感染症状。冠状病毒亚科包括四个属:α-冠状病毒、β-冠状病毒、γ-冠状病毒和δ-冠状病毒(图1)。其中,α-冠状病毒和β-冠状病毒多感染哺乳动物,γ-冠状病毒和δ-冠状病毒多感染鸟类和鱼类。在2019年前,人们发现六种冠状病毒可引起人类疾病^[2],其中四种(229E、OC43、NL63和HKU1)主要感染上呼吸道和胃肠道^[3],通常在免疫正常的个体中仅引起普通感冒症状。然而,严重急性呼吸综合征冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus, SARS-CoV)和中东呼吸综合征冠状病毒(Middle east respiratory syndrome coronavirus, MERS-CoV)可感染下呼吸道并引起严重的呼吸系统疾病。

2019年末新发现第七种可引起人类疾病的β-冠状病毒,国际病毒分类学委员会根据其特征命名为SARS-CoV-2(Severe acute respiratory syndrome-coronavirus-2),在早期研究中该病毒也称2019-nCoV。由SARS-CoV-2引发的疾病称之为COVID-19(Coronavirus disease 2019)。基因序列分析显示,SARS-CoV-2与一种菊头蝠体内发现的冠状病毒序列(GISAID登录号EPI_ISL_402127-402130)一致性达96.2%,而与SARS的相似度仅有80.3%,证实了SARS-CoV-2的人畜共患起源^[4],然而该病毒的动物宿主尚未明确。人类感染SARS-CoV-2后疾病严重程度不一,存在无症状、轻症(仅出现轻度发热和轻微乏力,无肺炎表现)和小部分重症(出现呼吸困难和/或低氧血症),更为严重者则会出现急性呼吸窘迫综合征(Adult respiratory distress syndrome,ARDS)和其他器官功能衰竭等并发症。最新研究发现,SARS-CoV-2除感染肺泡造成肺泡塌陷并导致ARDS外,也可侵染人的心脏^[5]、大脑及神经系统^[6]、肾脏^[7]、肠道^[8]等部位,通过诱导过激的免疫应答,导致心脏、大脑及其他脏器的严重损伤。另外,该病毒也会影响患者的凝血功能,引发血栓^[9]。目前,COVID-19已在全球范围内造成了上亿确诊病例,数百万人的死亡,深入、全面认识SARS-CoV-2,对于COVID-19的诊断和药物研发具有重要意义。

SARS-CoV-2是一类具有包膜的正股单链RNA病毒,其基因组RNA和磷酸化核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein, N)组成的核衣壳埋在含有包膜蛋白(Envelope protein, E)、膜蛋白(Membrane protein, M)和刺突蛋白(Spike, S)的磷脂层中(图2)。S蛋白以三聚体形式存在,并与E蛋白和M蛋白相间排列,三者均存在高度糖基化修饰^[10]。E蛋白和M蛋白主要参与病毒的装配过程,N蛋白包裹基因组形成核蛋白复合体,S蛋白则主要通过与宿主细胞受体结合介导病毒的入侵。

2 新型冠病毒的侵染机制

SARS-Cov-2入侵机制比较复杂,一方面需要利用病毒S蛋白与宿主血管紧张素转化酶2(Angiotensin-converting enzyme 2, ACE2)^[11]结合进入宿主细胞,另一方面也需要宿主跨膜丝氨酸蛋白酶2(Transmembrane protease serine 2, TMPRSS2)与内体组织蛋白酶B和L(Cysteine proteases cathepsin B and L,Cat B/L)协同作用^[12]引发S蛋白,使病毒得以入侵宿主细胞。

S蛋白分为S₁和S₂两个功能亚基,S₁负责与ACE2结合,引起S蛋白构象变化,S₂负责与宿主细胞膜融合。Hoffmann等^[13]利用含SARS-CoV-2 S蛋白的复制缺陷性水泡口炎病毒(Vesicular stomatitis virus, VSV)模型来研究SARS-CoV-2进入细胞的机制,发现SARS-CoV-2易于侵染SARS敏感的细胞系,该研究表明两种病毒在受体选择上具有相似性。分析SARS-CoV-2 S蛋白的受体结合域(Receptor binding domain, RBD)发现,与ACE2结合的大部分必需氨基酸在SARS-CoV中是保守的,在对SARS和SARS-CoV-2均不敏感的BHK-21细胞系中表达ACE2后,SARS-CoV-2和SARS可侵染ACE2⁺ BHK-21细胞,而转染MERS-CoV的识别受体-二肽基肽酶4(Dipeptidyl peptidase 4, DPP4)或HCoV-229E的识别受体氨肽酶N(Aminopeptidase N, APN)^[14]则不能起到侵染的作用。该研究表明SARS-CoV-2和SARS相同,均以ACE2为受体入侵宿主细胞^[13]。该研究结果与张永振等^[15]和石正丽等^[16]发现的结果相同。2020年2月美国得克萨斯大学奥斯汀分校McLellan等^[17]报道了SARS-CoV-2 S蛋白的首个冷冻电镜结构,并发现SARS-CoV-2的S蛋白与ACE2的结合能力比SARS-CoV强10~20倍,然而在测试了3种已知的SARS-CoV RBD特异性单克隆抗体(S230、m396和80R)后,发现这三种抗体与SARS-CoV-2的S蛋白没有明显的结合,表明两种病毒RBD之间的抗体交叉反应性存在有限性,这可能由于SARS-CoV-2 S蛋白的独特残基L455、F486、Q493、S494、N501和Y505(与SARS-CoV相比较,这六个残基中有五个在SARS-CoV-2中发生突变)引起的。SARS-CoV S的两个刚性的脯氨酸残基在SARS-CoV-2 S中被柔性的甘氨酸残基取代,形成一个柔性的环。分子建模显示,SARS-CoV-2 S的RBD与ACE2结合更强,其柔性环中独特的苯丙氨酸(F486)可深入至ACE2的疏水性口袋中。由于ACE2保守且广泛表达于鱼、两栖动物、爬行动物、鸟类及哺乳动物中,这些动物的ACE2都可能结合SARS-CoV-2的RBD,成为该病毒的天然宿主。另外就某个宿主讲,ACE2表达于肠道、睾丸、肾脏等几乎所有组织或器官中,SARS-CoV-2不仅能够通过呼吸道飞沫传播,还能通过粪-口等其他途径传播^[18]。

SARS-CoV的包膜与ACE2识别后还必须经过膜融合才能入侵宿主细胞,而S蛋白在与膜发生融合之前需要被宿主蛋白酶切割。2016年Walls等研究发现SARS-CoV预融合构象中S₁和S₂亚基之间可被裂解^[19],S₂上存在可被宿主蛋白酶进一步切割的重要位点^[20,21],SARS-CoV的入侵依赖于TMPRSS2和Cat B/L对S蛋白的引发。为探索这两种蛋白酶在SARS-CoV-2入侵中的作用,Hoffmann等利用不表达TMPRSS2的293T细胞系(TMPRSS2^-, overexpress ACE2)和表达TMPRSS2的结肠癌细胞系Caco-2细胞(TMPRSS2⁺,ACE2),外加氯化铵(提高内体pH值,进而抑制Cat B/L活性)处理后发现,氯化铵能显著抑制SARS-CoV S和SARS-CoV-2 S蛋白介导的对TMPRSS2^- 293T细胞的入侵;却较小影响其对TMPRSS2⁺ Caco-2细胞的入侵。进一步使用卡莫司他甲磺酸盐(TMPRSS2的抑制剂)和化合物E64d(Cat B/L的抑制剂)后发现,卡莫司他甲磺酸盐可有效阻止SARS-CoV-2 S进入TMPRSS2⁺ Caco-2细胞,但不能阻止其进入TMPRSS2^- 293T细胞,而E64d的作用效果与之相反。该研究表明,CatB/L和TMPRSS2两种蛋白酶都能够协助SARS-CoV和SARS-CoV-2入侵细胞^[13]。

SARS-CoV-2和SARS-CoV在入侵细胞的方式上也存在着差异。该区别在于,SARS-CoV-2 S在S₁/S₂亚基之间的边界处具有独特的弗林(Furin)蛋白酶水解位点(RRAR),精氨酸(R)在病毒融合/进入及蛋白成熟过程中发挥关键作用,其增强了细胞-细胞的融合,却并不影响病毒进入细胞。因此,相对于SARS-CoV,弗林蛋白酶切位点的存在扩大了SARS-CoV-2对人类等哺乳动物细胞和组织的侵染范围,增加其传播性和/或改变其致病性^[22]。

3 S蛋白:高度糖基化的病毒嗜性蛋白质

糖基化修饰是生命体中最广泛、最复杂、也是最重要的蛋白质翻译后修饰之一,主要包括N-连接、O-连接、C-连接和糖基磷脂酰肌醇锚定连接四种方式,这些糖基化修饰可影响蛋白质的空间构象、稳定性、活性和定位,并在分子识别、信号转导和免疫应答等生物过程中发挥关键作用^[23]。S蛋白是冠状病毒表面上存在的唯一抗原,其糖基化程度较高,是I类病毒融合蛋白。研究S蛋白及其表面的糖基化修饰对病毒检测、疫苗研发及药物靶向都具有重要意义。

3.1 病毒糖基化的机制:依赖宿主的糖基化修饰系统

病毒结构简单,缺乏糖基化修饰的酶类,目前鉴定的病毒蛋白质的糖基化主要有2种:N-连接(N-glycan)和O-连接(O-glycan),这些糖基化的添加主要依赖于宿主细胞的糖基化修饰系统(图3)^[24,25]。

N-glycan:糖链通过蛋白质序列 Asn-Xaa-Ser/Thr或Asn-Xaa-Cys(Xaa是除Pro外的任何氨基酸)上的天冬酰胺(Asn,N)残基末端的—NH₂与蛋白质进行连接,根据其末端精细结构的不同可分为高甘露糖型、复杂型和杂合型。N-glycan的加工起始于内质网,成熟于高尔基体(Golgi)。首先是内质网膜内多萜醇磷脂(Dol-P)连接14个寡糖(GlcNAc₂Man₉Glc₃)前体的装配,然后在寡糖基转移酶(Oligosaccharyl transferase,OST)的作用下,Dol-P连接的寡糖被转移至蛋白质的Asn末端—NH₂上,糖链继续在内质网(ER)中由一系列糖基修饰酶加工,随后Man₈GlcNAc₂糖型的蛋白质被转运至高尔基体,并在Golgi中继续被糖基修饰酶加工:去除或添加不同的单糖分子,最终形成结构多样的糖型。

O-glycan:糖链通过蛋白质丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)残基末端的—OH与蛋白质进行连接,该糖基化发生于细胞质,起始于GalNAc-T催化的Ser/Thr-GalNAc,随后在不同糖基转移酶的催化下会产生8个不同的“核心(Core)糖型”,其中Core 1~4较为常见,这些核心糖型进一步被糖基转移酶加工,最终产生复杂多样的糖型。

3.2 糖基化的类型和位置

S蛋白是病毒感染细胞的关键蛋白,负责与宿主细胞受体结合和膜融合。通常S具有两种糖基化类型:N-糖基化和O-糖基化。早期,人们就发现SARS-CoV的S蛋白上有23个潜在天冬酰胺可发生N-glycan修饰,其中13个N位点(118、119、227、269、318、330、357、783、1056、1080、1140、1155和1176)的糖基化已通过质谱分析、蛋白质组学等方法证实^[26,27],另有研究通过氨基酸定点突变技术,鉴定了SARS-CoV S蛋白的7个N-glycan发生位点(109、118、119、158、227、589和699),它们与ACE2结合区(aa318-510)的功能不同,是树突细胞特异性细胞间黏附分子-3-结合非整合素分子(Dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule-3-grabbing nonintegrin,DC-SIGN) 及肝/淋巴结特异性细胞间黏附C型因子3结合非整合素分子(Liver/lymph node-specific ICAM-3-grabbing nonintegrin, L-SIGN)介导病毒进入宿主的关键结构^[28]。

Wrapp等^[17]构建了SARS-CoV-2 S蛋白的大部分胞外域,其中包括每个S蛋白三聚体上66个N-glycan的44个糖基化位点。2020年5月,英国南安普顿大学Crispin等使用位点特异性的质谱方法,鉴定了293F细胞重组SARS-CoV-2 S蛋白上的22个N-糖基化位点,其中18个糖基化位点在SARS-CoV S蛋白中是保守的(图4),同时发现N-glycan包括高甘露糖型、杂合型和复杂型三种类型(图3),其中复杂型糖链含量较高;不同糖基化位点的多糖种类和丰度差异较大,N234和N709主要为高甘露糖型;N61、N122、N603、N717、N801和N1074兼有高甘露糖型和复杂型^[29]。同时四川大学华西医院杨浩等^[30]利用相同的处理方法,对昆虫细胞和293细胞表达的S蛋白进行N-糖蛋白组学分析发现,昆虫细胞表达的S蛋白多为高甘露糖型,共含有38种N-糖链构型,而293细胞表达的S蛋白的糖链主要为复杂型糖链,含有157种N-糖链构型。乔治亚大学Azadi等^[31]利用293T细胞分别表达SARS-CoV-2 S蛋白的S₁亚基(Val16-Gln690)和S₂亚基(Met697-Pro1213),酶解后通过质谱分析鉴定了S蛋白的17个糖基化修饰,且糖链类型主要为高甘露糖型和复杂型,其中N234和N282位于S₁的RBD,其糖链末端含有较多的唾液酸,推测其可能涉及与ACE2的结合;与Crispin等报道的结果类似,该研究也发现Man₅GlcNAc₂的糖链存在于较多的糖基化位点上,而5个潜在N-糖基化位点(N17, N603, N1134, N1158, N1173)并未发现糖基化修饰。

另外,SARS-CoV-2 S蛋白的弗林蛋白酶位点前有一个脯氨酸(Pro,P)插入,形成PRRAR,P可以让蛋白主链原子被环化成环状结构,其形成的转角使附近Ser673、Thr678和Ser686位点发生O-glycan修饰,虽然不确定这些糖链的功能,但可能形成一个“Mucin-like domain”,屏蔽S蛋白的抗原表位或关键氨基酸^[32]。而Azadi等还在S₁亚基的RBD区域鉴定出2个新的O-糖基化位点(T323/S325),T323以Core 1型的O-glycan为主(HexNAc, HexNAcHex and HexNAcHexNeuAc2),而只有T323糖链结构为HexNAcHexNeuAc时,S325才会发生HexNAcHexNeuAc 的O-glycan修饰^[31]。

以上研究结果表明:不同的表达体系(HEK293和昆虫细胞),甚至相同细胞(HEK 293)的不同研究中所得到的S蛋白的糖基化水平和糖链种类存在差别,表明S蛋白的糖基化修饰具有多样性和异质性,该差异可能导致与ACE2结合活性的不同。因此,充分了解S蛋白糖基化,特别是RBD区域的糖基化,对于解析SARS-CoV-2的入侵及制备有效的疫苗抗原具有关键的作用。

3.3 病毒蛋白质糖基化的作用

病毒蛋白质的糖基化在蛋白质折叠、受体识别、传染性和免疫逃避中起着关键作用^[25]。某些糖基化位点的突变会导致蛋白质折叠失败,影响病毒最终的装配及成熟;还有一些糖链参与宿主细胞表面凝集素受体的识别,影响病毒对宿主的入侵;另有一些糖链会覆盖蛋白质的抗原表位,从而达到逃避宿主免疫监视的目的。

病毒已经进化出多种免疫逃避策略,其中冠状病毒S蛋白表面的聚糖掩盖了部分抗原表位,限制了宿主获得中和抗体的能力并阻碍了体液免疫反应,利于病毒的逃逸。Walls等^[33]的研究表明HCoV-NL63 S被广泛的聚糖层覆盖,该聚糖层含102个N-连接的寡糖,掩盖了其抗原表位,屏蔽了抗体的结合。Watanabe等^[29]也观察到SARS-CoV-2 S的RBD近端的糖链(N165、N234、N343)存在聚糖屏蔽,特别是当RBD处于与受体未结合的“向下(down)”状态时。

宿主细胞表面的C型凝集素(如DC/L-SIGN)可通过识别病毒蛋白质的糖链,从而启动机体的免疫效应。SARS-CoV S蛋白上的糖链主要是高甘露糖型和杂合型^[34],用内切糖苷酶H(Endoglycosidase H,Endo H)去除其糖链后,病毒的感染性在表达DC/L-SIGN的细胞中以时间依赖的方式急剧降低,在表达ACE2的细胞中也有下降,表明聚糖不仅结合DC/L-SIGN,还可能维持S蛋白与ACE2结合时的构象。某些特定位点的聚糖对L-SIGN介导的感染至关重要,这些位点的单突变(N109Q,N118Q,N119Q和N227Q)都将导致病毒结合L-SIGN能力的严重下降,突变病毒的感染能力也下降至原来的30%~40%。该研究表明,糖链在DC/L-SIGN介导的SARS-CoV入侵中具有重要作用,然而特定位点的去糖基化仅会引起感染性的下降,并不导致感染的完全丧失,表明糖链之间具有协同作用,共同维持病毒的入侵^[27]。也有研究表明甘露糖结合凝集素(Mannose-binding lectin, MBL)和DC-SIGN可能识别SARS-CoV S上某些相同的聚糖,因此,MBL可阻断SARS-CoV S与受体细胞DC-SIGN的有效结合,干扰病毒的入侵^[35]。此外,一些病毒糖蛋白也能够特异性识别宿主细胞表面某些聚糖,从而影响病毒入侵、感染和嗜性。如Li等^[36]研究发现,除DPP4外,MERS-CoV还与宿主细胞聚糖末端的唾液酸(Sia)结合,该特异性结合可能对其侵染的宿主范围和组织嗜性产生影响。

4 宿主受体蛋白ACE2的糖基化修饰

ACE2是一种外肽酶(EC 3.4.15.1),可催化血管紧张素Ⅰ转化为血管紧张素Ⅱ,分布于人或动物的心脏、肾脏、睾丸、胃肠道、大脑和肺内的细胞上。它是血管紧张素转换酶(ACE)的同源蛋白,然而却与ACE的生理功能相反。二者相互拮抗,共同维持肾素-血管紧张素系统(Renin-angiotensin system, RAS)的平衡,稳定血压和水电解质的内环境,调节心血管的功能。若ACE2相对缺乏,血管紧张素作用占优势,则导致血管收缩增强,引发高血压^[37]。

ACE2包含两个结构域:N端的肽酶区(Peptidase domain,PD)和C端的Collectrin样区(Collectrin-like domain)。近期西湖大学周强等^[38]解析了首个ACE2-B⁰AT1(肠道中的一种氨基酸转运蛋白)复合物的结构,其中在胞外的PD区发现了ACE2的5~7个糖基化位点,而PD区正是ACE2与S蛋白结合的区域,因此ACE2的糖基化可能会影响SARS-CoV-2的入侵。Shajahan等^[39]的最新研究报道了hACE2的N-glycan和O-glycan表征。该研究鉴定了hACE2上所有(7个)潜在N-糖基化位点(N53、N90、N103、N322、N432、N546和N690)的糖基化,其中复杂型聚糖比高甘露糖型和杂合型更为丰富,同时,该研究还发现了三个新的O-糖基化位点(Ser155、Thr496和Thr730)。另外一项计算机分子模拟的研究表明,N90和N322的糖基化会显著影响ACE2与SARS-CoV-2 S的结合^[40],作者认为:N322的糖基化可能会增强ACE2与病毒的结合,而N90的聚糖则与N322的聚糖共同竞争,且该位点的糖链遮盖了部分病毒S蛋白RBD的结合界面,不利于病毒的结合。将二者综合考虑,糖链的存在有利于病毒的结合。

ACE2作为SARS-CoV-2 S蛋白结合的受体,在病毒入侵过程中发挥着至关重要的作用,然而若干预ACE2的表达或活性,则会影响RAS平衡,导致高血压或肺内AT₁受体的过度激活,引起肺部毛细血管通透性增加,并导致急性肺损伤等系列脏器损伤的发生。因此,通过干预ACE2糖链,抑制病毒结合ACE2的能力,而不抑制ACE2的表达或活性是一种可行的抗病毒策略。

5 基于糖基化的新型冠状病毒检测和药物干预策略

5.1 利用凝集反应发展高效灵敏试剂盒

凝集反应是一种血清学反应,即颗粒性抗原(病原微生物、蛋白质、多糖等小分子)与相应抗体结合,在有电解质存在的条件下,经过一定时间,出现肉眼可见的凝集小块。参与凝集反应的抗原称为凝集原,抗体称为凝集素。ABO血型的诊断即基于该方法,抗体和红细胞表面的糖抗原在液体介质中发生肉眼可见的凝集反应^[41],由于其操作简单,结果易于读取,因此适宜大规模人群的筛查。我们也可以在质谱鉴定SARS-CoV-2 S蛋白聚糖组成的基础上,筛选获得针对其糖链特异的凝集素,然后利用该凝集素检测血清中的SARS-CoV-2。

5.2 干预糖基化的药物

糖基化蛋白在病毒的生命进程和宿主的免疫应答中均发挥重要作用。已有研究表明,在病毒蛋白质表面添加或删除糖基化位点,病毒的生物学特性、致病性和抗原性均会发生改变。抗流感病毒药物达菲的主要成分为磷酸奥司他韦,其可抑制病毒表面的神经氨酸酶活性,而神经氨酸酶可水解宿主细胞和病毒粒血凝素糖链末端的唾液酸残基,有助于新形成的病毒粒从感染细胞中的分离与扩散^[42]。

用内质网葡萄糖苷酶抑制剂——亚氨基糖处理细胞,ACE2的N-glycan结构发生改变,病毒和宿主的膜融合能力下降(不影响ACE2的表达及结合S蛋白的能力),HCoV-NL63的入侵受阻^[43]。2020年3月底美国食品和药物管理局(FDA)发布了两种用于治疗COVID-19的抗疟药物(氯喹和羟氯喹)的有限紧急使用授权,国内钟南山等也发现,使用氯喹的患者体内SARS-CoV-2病毒受到抑制的速度明显快于未使用的患者^[44]。2005年在SARS-CoV研究中,Vincent等发现氯喹可干扰ACE2的末端糖基化,导致ACE2与SARS-CoV S蛋白之间的结合亲合力降低^[45],鉴于SARS-CoV-2和SARS-CoV均以ACE2为受体,因此推断氯喹是对抗SARS-CoV-2的有效药物之一,然而临床试验中人们发现氯喹有较强的致心脏毒性副作用,详细机制仍需进一步研究(图5)。S蛋白的糖基化在SARS-CoV-2入侵中也发挥关键作用,因此抑制糖基化形成有望从ACE2和S蛋白两方面发挥抗病毒作用。本课题组前期曾开发系列糖苷酶抑制剂,而这些糖苷酶抑制剂可能也会通过影响宿主和病毒的糖基化进程,而发挥抗病毒效果,目前相关的测试工作正在开展^[46,47]。

6 结论与展望

SARS-CoV-2是新发现的一种可侵染人类的冠状病毒,其入侵依赖于包膜上的S蛋白和宿主细胞表面的ACE2,而这两种蛋白的糖基化在病毒入侵、受体结合、聚糖屏蔽以及免疫应答中均发挥重要作用。

然而,当前S蛋白和ACE2蛋白的糖基化分析多基于哺乳动物细胞或昆虫细胞表达体系获得的重组蛋白,这些体外重组蛋白的糖基化可能与COVID-19患者体内的病毒S蛋白和宿主ACE2蛋白的糖基化有所不同。基于重组蛋白的糖结构发展的药物干预,在不同COVID-19患者间可能存在差异。因此,迫切需要对COVID-19患者来源的病毒样本及组织样本进行糖基化分析,以便更精确、真实地解析糖基化在新型冠状病毒侵染及宿主免疫应答中的机制,有利于发展更为灵敏的SARS-CoV-2检测手段,开发更为特异的疫苗、抗体及抗病毒药物。

参考文献

原文顺序 | 出版日期 | 本文引用

[1]	Payne S. Viruses. Amsterdam: Elsevier, 2017.149.

[2]	Su S, Wong G, Shi W F, Liu J, Lai A C K, Zhou J Y, Liu W J, Bi Y H, Gao G F. Trends Microbiol., 2016, 24(6): 490.

[3]	Li S W, Lin C W. BioMedicine, 2013, 3(1): 43.

[4]	Ceraolo C, Giorgi F M. J. Med. Virol., 2020, 92(5): 522.

[5]	Shi S B, Qin M, Shen B, Cai Y L, Liu T, Yang F, Gong W, Liu X, Liang J J, Zhao Q Y, Huang H, Yang B, Huang C X. JAMA Cardiol., 2020, 5(7): 802.

[6]	Mao L, Jin H J, Wang M D, Hu Y, Chen S C, He Q W, Chang J, Hong C D, Zhou Y F, Wang D, Miao X P, Li Y N, Hu B. JAMA Neurol., 2020, 77(6): 683.

[7]	Diao B, Wang C, Wang R, Feng Z, Tan Y, Wang H, Wang C, Liu L, Liu Y, Liu Y, Wang G, Yuan Z, Ren L, Wu Y, and Chen Y. medRxiv, 2020, DOI: 10.1101/2020.03.04.20031120.

[8]	Xiao F, Tang M W, Zheng X B, Liu Y, Li X F, Shan H. Gastroenterology, 2020, 158(6): 1831.

[9]	Klok F A, Kruip M J H A, van der Meer N J M, Arbous M S, Gommers D, Kant K M, Kaptein F H J, van Paassen J, Stals M A M, Huisman M V, Endeman H. Thromb. Res., 2020, 191: 148.

[10]	Li G, Fan Y H, Lai Y N, Han T T, Li Z H, Zhou P W, Pan P, Wang W B, Hu D W, Liu X H, Zhang Q W, Wu J G. J. Med. Virol., 2020, 92(4): 424.

[11]	Li W H, Moore M J, Vasilieva N, Sui J H, Wong S K, Berne M A, Somasundaran M, Sullivan J L, Luzuriaga K, Greenough T C, Choe H, Farzan M. Nature, 2003, 426(6965): 450.

[12]	Glowacka I, Bertram S, Muller M A, Allen P, Soilleux E, Pfefferle S, Steffen I, Tsegaye T S, He Y, Gnirss K, Niemeyer D, Schneider H, Drosten C, Pohlmann S. J. Virol., 2011, 85(9): 4122.

[13]	Hoffmann M, Kleine-Weber H, Schroeder S, Krüger N, Herrler T, Erichsen S, Schiergens T S, Herrler G, Wu N H, Nitsche A, Müller M A, Drosten C, Pöhlmann S. Cell, 2020, 181(2): 271.

[14]	Raj V S, Mou H H, Smits S L, Dekkers D H W, Müller M A, Dijkman R, Muth D, Demmers J A A, Zaki A, Fouchier R A M, Thiel V, Drosten C, Rottier P J M, Osterhaus A D M E, Bosch B J, Haagmans B L. Nature, 2013, 495(7440): 251.

[15]	Wu F, Zhao S, Yu B, Chen Y M, Wang W, Song Z G, Hu Y, Tao Z W, Tian J H, Pei Y Y, Yuan M L, Zhang Y L, Dai F H, Liu Y, Wang Q M, Zheng J J, Xu L, Holmes E C, Zhang Y Z. Nature, 2020, 579(7798): 265.

[16]	Zhou P, Yang X L, Wang X G, Hu B, Zhang L, Zhang W, Si H R, Zhu Y, Li B, Huang C L, Chen H D, Chen J, Luo Y, Guo H, Jiang R D, Liu M Q, Chen Y, Shen X R, Wang X, Zheng X S, Zhao K, Chen Q J, Deng F, Liu L L, Yan B, Zhan F X, Wang Y Y, Xiao G F, Shi Z L. Nature, 2020, 579(7798): 270.

[17]	Wrapp D, Wang N S, Corbett K S, Goldsmith J A, Hsieh C L, Abiona O, Graham B S, McLellan J S. Science, 2020, 367(6483): 1260.

[18]	Chen Y, Guo Y, Pan Y H, Zhao Z J. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2020, 525(1): 135.

[19]	Walls A C, Tortorici M A, Bosch B J, Frenz B, Rottier P J M, DiMaio F, Rey F A, Veesler D. Nature, 2016, 531(7592): 114.

[20]	Belouzard S, Chu V C, Whittaker G R. PNAS, 2009, 106(14): 5871.

[21]	Millet J K, Whittaker G R. PNAS, 2014, 111(42): 15214.

[22]	Walls A C, Park Y J, Tortorici M A, Wall A, McGuire A T, Veesler D. Cell, 2020, 183(6): 1735.

[23]	Xiang T, Zhang X L. Prog. Biochem. Biophys., 2017, 44(10): 898.

[24]	向田, 章晓联. 生物化学与生物物理进展, 2017, 44(10): 898.

[25]	Vigerust D J, Shepherd V L. Trends Microbiol., 2007, 15(5): 211.

[26]	Watanabe Y, Bowden T A, Wilson I A, Crispina M. Biochim. Biophys. Acta Gen. Subj., 2019, 1863(10): 1480.

[27]

Ying W T, Hao Y W, Zhang Y J, Peng W M, Qin E D, Cai Y, Wei K H, Wang J, Chang G H, Sun W, Dai S J, Li X H, Zhu Y P, Li J Q, Wu S F, Guo L H, Dai J Q, Wang J L, Wan P, Chen T G, Du C J, Li D, Wan J, Kuai X Z, Li W H, Shi R, Wei H D, Cao C, Yu M, Liu H, Dong F T, Wang D G, Zhang X M, Qian X H, Zhu Q Y, He F C. Proteomics, 2004, 4(2): 492.

[28]	Krokhin O, Li Y, Andonov A, Feldmann H, Flick R, Jones S, Stroeher U, Bastien N, Dasuri K V N, Cheng K D, Simonsen J N, Perreault H, Wilkins J, Ens W, Plummer F, Standing K G. Mol. Cell. Proteom., 2003, 2(5): 346.

[29]	Han D P, Lohani M, Cho M W. J. Virol., 2007, 81(21): 12029.

[30]	Watanabe Y, Allen J D, Wrapp D, McLellan J S, Crispin M. Science, 2020, 369(6501): 330.

[31]	Zhang Y, Zhao W, Mao Y, Wang S, Zhong Y, Su T, Gong M, Lu X, Cheng J, Yang H. bioRxiv, 2020,April 19.

[32]	Shajahan A, Supekar N T, Gleinich A S, Azadi P. Glycobiology, 2020, 30(12): 981.

[33]	Andersen K G, Rambaut A, Lipkin W I, Holmes E C, Garry R F. Nat. Med., 2020, 26(4): 450.

[34]	Walls A C, Tortorici M A, Frenz B, Snijder J, Li W T, Rey F A, DiMaio F, Bosch B J, Veesler D. Nat. Struct. Mol. Biol., 2016, 23(10): 899.

[35]	Han D P, Kim H G, Kim Y B, Poon L L M, Cho M W. Virology, 2004, 326(1): 140.

[36]	Zhou Y C, Lu K, Pfefferle S, Bertram S, Glowacka I, Drosten C, Pohlmann S, Simmons G. J. Virol., 2010, 84(17): 8753.

[37]	Li W T, Hulswit R J G, Widjaja I, Raj V S, McBride R, Peng W J, Widagdo W, Tortorici M A, van Dieren B, Lang Y F, van Lent J W M, Paulson J C, de Haan C A M, de Groot R J, van Kuppeveld F J M, Haagmans B L, Bosch B J. PNAS, 2017, 114(40): E8508.

[38]	Gheblawi M, Wang K M, Viveiros A, Nguyen Q, Zhong J C, Turner A J, Raizada M K, Grant M B, Oudit G Y. Circ. Res., 2020, 126(10): 1456.

[39]	Yan R H, Zhang Y Y, Li Y N, Xia L, Guo Y Y, Zhou Q. Science, 2020, 367(6485): 1444.

[40]	Shajahan A, Archer-Hartmann S, Supekar N T, Gleinich A S, Heiss C, Azadi P. bioRxiv, 2020,DOI:10.1101/2020.05.01.071688.

[41]	Mehdipour A R, Hummer G. bioRxiv, 2020, DOI: 10.1101/2020.07.09.193680.

[42]	Zheng L, Zhang P, Wang Q, Lai F C. Chin. J. Blood Transfus., 2006, 19(1): 80.

[43]	郑磊, 张鹏, 王前, 赖福才. 中国输血杂志, 2006, 19(1): 80.

[44]	Gong X M, Xu J Y, Ding Y L. Progress in Pharmaceutical Sciences, 2002,(5): 266.

[45]	龚晓明, 许激扬, 丁玉林. 药学进展, 2002,(5): 266.

[46]	Zhao X S, Guo F, Comunale M A, Mehta A, Sehgal M, Jain P, Cuconati A, Lin H X, Block T M, Chang J H, Guo J T. Antimicrob. Agents Chemother., 2015, 59(1): 206.

[47]

Huang M X, Li M, Xiao F, Pang P F, Liang J B, Tang T T, Liu S X, Chen B H, Shu J X, You Y Y, Li Y, Tang M W, Zhou J H, Jiang G M, Xiang J F, Hong W X, He S M, Wang Z Q, Feng J H, Lin C Q, Ye Y N, Wu Z L, Li Y C, Zhong B, Sun R L, Hong Z S, Liu J, Chen H L, Wang X H, Li Z H, Pei D Q, Tian L, Xia J Y, Jiang S P, Zhong N S, Shan H. National Science Review, 2020, 7(9): 1428.

[48]	Vincent M J, Bergeron E, Benjannet S, Erickson B R, Rollin P E, Ksiazek T G, Seidah N G, Nichol S T. Virol. J., 2005, 2(1): 69.

[49]	Li Z H, Li T H, Dai S X, Xie X L, Ma X F, Zhao W, Zhang W M, Li J, Wang P G. ChemBioChem, 2013, 14(10): 1239.

[50]	Li T H, Guo L N, Zhang Y, Wang J J, Li Z H, Lin L, Zhang Z X, Li L, Lin J P, Zhao W, Li J, Wang P G. Carbohydr. Res., 2011, 346(9): 1083.

[1]	Payne S. Viruses. Amsterdam: Elsevier, 2017.149.
[2]	Su S, Wong G, Shi W F, Liu J, Lai A C K, Zhou J Y, Liu W J, Bi Y H, Gao G F. Trends Microbiol., 2016, 24(6): 490.
[3]	Li S W, Lin C W. BioMedicine, 2013, 3(1): 43.
[4]	Ceraolo C, Giorgi F M. J. Med. Virol., 2020, 92(5): 522.
[5]	Shi S B, Qin M, Shen B, Cai Y L, Liu T, Yang F, Gong W, Liu X, Liang J J, Zhao Q Y, Huang H, Yang B, Huang C X. JAMA Cardiol., 2020, 5(7): 802.
[6]	Mao L, Jin H J, Wang M D, Hu Y, Chen S C, He Q W, Chang J, Hong C D, Zhou Y F, Wang D, Miao X P, Li Y N, Hu B. JAMA Neurol., 2020, 77(6): 683.
[7]	Diao B, Wang C, Wang R, Feng Z, Tan Y, Wang H, Wang C, Liu L, Liu Y, Liu Y, Wang G, Yuan Z, Ren L, Wu Y, and Chen Y. medRxiv, 2020, DOI: 10.1101/2020.03.04.20031120.
[8]	Xiao F, Tang M W, Zheng X B, Liu Y, Li X F, Shan H. Gastroenterology, 2020, 158(6): 1831.
[9]	Klok F A, Kruip M J H A, van der Meer N J M, Arbous M S, Gommers D, Kant K M, Kaptein F H J, van Paassen J, Stals M A M, Huisman M V, Endeman H. Thromb. Res., 2020, 191: 148.
[10]	Li G, Fan Y H, Lai Y N, Han T T, Li Z H, Zhou P W, Pan P, Wang W B, Hu D W, Liu X H, Zhang Q W, Wu J G. J. Med. Virol., 2020, 92(4): 424.
[11]	Li W H, Moore M J, Vasilieva N, Sui J H, Wong S K, Berne M A, Somasundaran M, Sullivan J L, Luzuriaga K, Greenough T C, Choe H, Farzan M. Nature, 2003, 426(6965): 450.
[12]	Glowacka I, Bertram S, Muller M A, Allen P, Soilleux E, Pfefferle S, Steffen I, Tsegaye T S, He Y, Gnirss K, Niemeyer D, Schneider H, Drosten C, Pohlmann S. J. Virol., 2011, 85(9): 4122.
[13]	Hoffmann M, Kleine-Weber H, Schroeder S, Krüger N, Herrler T, Erichsen S, Schiergens T S, Herrler G, Wu N H, Nitsche A, Müller M A, Drosten C, P?hlmann S. Cell, 2020, 181(2): 271.
[14]	Raj V S, Mou H H, Smits S L, Dekkers D H W, Müller M A, Dijkman R, Muth D, Demmers J A A, Zaki A, Fouchier R A M, Thiel V, Drosten C, Rottier P J M, Osterhaus A D M E, Bosch B J, Haagmans B L. Nature, 2013, 495(7440): 251. 50fba2c4-d237-44c2-a8be-f73aceb241f2
[15]	Wu F, Zhao S, Yu B, Chen Y M, Wang W, Song Z G, Hu Y, Tao Z W, Tian J H, Pei Y Y, Yuan M L, Zhang Y L, Dai F H, Liu Y, Wang Q M, Zheng J J, Xu L, Holmes E C, Zhang Y Z. Nature, 2020, 579(7798): 265.
[16]	Zhou P, Yang X L, Wang X G, Hu B, Zhang L, Zhang W, Si H R, Zhu Y, Li B, Huang C L, Chen H D, Chen J, Luo Y, Guo H, Jiang R D, Liu M Q, Chen Y, Shen X R, Wang X, Zheng X S, Zhao K, Chen Q J, Deng F, Liu L L, Yan B, Zhan F X, Wang Y Y, Xiao G F, Shi Z L. Nature, 2020, 579(7798): 270.
[17]	Wrapp D, Wang N S, Corbett K S, Goldsmith J A, Hsieh C L, Abiona O, Graham B S, McLellan J S. Science, 2020, 367(6483): 1260.
[18]	Chen Y, Guo Y, Pan Y H, Zhao Z J. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2020, 525(1): 135.
[19]	Walls A C, Tortorici M A, Bosch B J, Frenz B, Rottier P J M, DiMaio F, Rey F A, Veesler D. Nature, 2016, 531(7592): 114.
[20]	Belouzard S, Chu V C, Whittaker G R. PNAS, 2009, 106(14): 5871.
[21]	Millet J K, Whittaker G R. PNAS, 2014, 111(42): 15214.
[22]	Walls A C, Park Y J, Tortorici M A, Wall A, McGuire A T, Veesler D. Cell, 2020, 183(6): 1735.
[23]	Xiang T, Zhang X L. Prog. Biochem. Biophys., 2017, 44(10): 898.
[23]	向田, 章晓联. 生物化学与生物物理进展, 2017, 44(10): 898.
[24]	Vigerust D J, Shepherd V L. Trends Microbiol., 2007, 15(5): 211. 2495ce6b-296e-4742-bca8-92930c351764
[25]	Watanabe Y, Bowden T A, Wilson I A, Crispina M. Biochim. Biophys. Acta Gen. Subj., 2019, 1863(10): 1480.
[26]	Ying W T, Hao Y W, Zhang Y J, Peng W M, Qin E D, Cai Y, Wei K H, Wang J, Chang G H, Sun W, Dai S J, Li X H, Zhu Y P, Li J Q, Wu S F, Guo L H, Dai J Q, Wang J L, Wan P, Chen T G, Du C J, Li D, Wan J, Kuai X Z, Li W H, Shi R, Wei H D, Cao C, Yu M, Liu H, Dong F T, Wang D G, Zhang X M, Qian X H, Zhu Q Y, He F C. Proteomics, 2004, 4(2): 492.
[27]	Krokhin O, Li Y, Andonov A, Feldmann H, Flick R, Jones S, Stroeher U, Bastien N, Dasuri K V N, Cheng K D, Simonsen J N, Perreault H, Wilkins J, Ens W, Plummer F, Standing K G. Mol. Cell. Proteom., 2003, 2(5): 346.
[28]	Han D P, Lohani M, Cho M W. J. Virol., 2007, 81(21): 12029.
[29]	Watanabe Y, Allen J D, Wrapp D, McLellan J S, Crispin M. Science, 2020, 369(6501): 330.
[30]	Zhang Y, Zhao W, Mao Y, Wang S, Zhong Y, Su T, Gong M, Lu X, Cheng J, Yang H. bioRxiv, 2020,April 19.
[31]	Shajahan A, Supekar N T, Gleinich A S, Azadi P. Glycobiology, 2020, 30(12): 981.
[32]	Andersen K G, Rambaut A, Lipkin W I, Holmes E C, Garry R F. Nat. Med., 2020, 26(4): 450.
[33]	Walls A C, Tortorici M A, Frenz B, Snijder J, Li W T, Rey F A, DiMaio F, Bosch B J, Veesler D. Nat. Struct. Mol. Biol., 2016, 23(10): 899.
[34]	Han D P, Kim H G, Kim Y B, Poon L L M, Cho M W. Virology, 2004, 326(1): 140.
[35]	Zhou Y C, Lu K, Pfefferle S, Bertram S, Glowacka I, Drosten C, Pohlmann S, Simmons G. J. Virol., 2010, 84(17): 8753.
[36]	Li W T, Hulswit R J G, Widjaja I, Raj V S, McBride R, Peng W J, Widagdo W, Tortorici M A, van Dieren B, Lang Y F, van Lent J W M, Paulson J C, de Haan C A M, de Groot R J, van Kuppeveld F J M, Haagmans B L, Bosch B J. PNAS, 2017, 114(40): E8508.
[37]	Gheblawi M, Wang K M, Viveiros A, Nguyen Q, Zhong J C, Turner A J, Raizada M K, Grant M B, Oudit G Y. Circ. Res., 2020, 126(10): 1456.
[38]	Yan R H, Zhang Y Y, Li Y N, Xia L, Guo Y Y, Zhou Q. Science, 2020, 367(6485): 1444.
[39]	Shajahan A, Archer-Hartmann S, Supekar N T, Gleinich A S, Heiss C, Azadi P. bioRxiv, 2020,DOI:10.1101/2020.05.01.071688.
[40]	Mehdipour A R, Hummer G. bioRxiv, 2020, DOI: 10.1101/2020.07.09.193680.
[41]	Zheng L, Zhang P, Wang Q, Lai F C. Chin. J. Blood Transfus., 2006, 19(1): 80.
[41]	郑磊, 张鹏, 王前, 赖福才. 中国输血杂志, 2006, 19(1): 80.
[42]	Gong X M, Xu J Y, Ding Y L. Progress in Pharmaceutical Sciences, 2002,(5): 266.
[42]	龚晓明, 许激扬, 丁玉林. 药学进展, 2002,(5): 266.
[43]	Zhao X S, Guo F, Comunale M A, Mehta A, Sehgal M, Jain P, Cuconati A, Lin H X, Block T M, Chang J H, Guo J T. Antimicrob. Agents Chemother., 2015, 59(1): 206.
[44]	Huang M X, Li M, Xiao F, Pang P F, Liang J B, Tang T T, Liu S X, Chen B H, Shu J X, You Y Y, Li Y, Tang M W, Zhou J H, Jiang G M, Xiang J F, Hong W X, He S M, Wang Z Q, Feng J H, Lin C Q, Ye Y N, Wu Z L, Li Y C, Zhong B, Sun R L, Hong Z S, Liu J, Chen H L, Wang X H, Li Z H, Pei D Q, Tian L, Xia J Y, Jiang S P, Zhong N S, Shan H. National Science Review, 2020, 7(9): 1428.
[45]	Vincent M J, Bergeron E, Benjannet S, Erickson B R, Rollin P E, Ksiazek T G, Seidah N G, Nichol S T. Virol. J., 2005, 2(1): 69.
[46]	Li Z H, Li T H, Dai S X, Xie X L, Ma X F, Zhao W, Zhang W M, Li J, Wang P G. ChemBioChem, 2013, 14(10): 1239. f3712739-dd37-443a-ba6d-ae060ada32db
[47]	Li T H, Guo L N, Zhang Y, Wang J J, Li Z H, Lin L, Zhang Z X, Li L, Lin J P, Zhao W, Li J, Wang P G. Carbohydr. Res., 2011, 346(9): 1083.