红光/近红外光硫醇荧光探针

党耶城; 冯杨振; 陈杜刚

doi:10.7536/PC200658

化学进展 ›› 2021, Vol. 33 ›› Issue (5) :868-882 DOI: 10.7536/PC200658

研究论文

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红光/近红外光硫醇荧光探针

党耶城 ¹ ,
冯杨振 ¹ ,
陈杜刚 ¹^,^*

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Red/Near-Infrared Biothiol Fluorescent Probes

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摘要

小分子生物硫醇,包括半胱氨酸(Cys)、同型半胱氨酸(Hcy)和谷胱甘肽(GSH),在生理活动中扮演了重要的角色,其浓度的异常变化常与多种疾病息息相关,因此对其进行检测就显得尤为重要。近几年来,荧光探针因具有操作简便、时空分辨率高、损伤小和可视化等优势,在硫醇的识别领域成为了研究热点之一。而在已报道的众多的硫醇荧光探针中,红光或近红外光发射的荧光探针又因其具有背景干扰小、穿透深度深、拉曼散射影响小等特点,而受到研究者的青睐。本综述重点回顾了近三年来文献中报道的性能优异、发射红光或近红外光信号的硫醇荧光探针,根据构成探针分子荧光团的种类不同而进行分类介绍,包括罗丹明类、二吡咯氟硼类、花菁类、天然色素类、给受体型共轭化合物和聚集诱导发光型化合物六类。本文主要从分子设计、荧光性质、识别机理和成像应用等方面对各种荧光探针进行综述,同时展望了长波长发射的硫醇荧光探针的应用前景及待解决的问题。

Abstract

Small molecular biothiols, including cysteine(Cys), homocysteine(Hcy), and glutathione(GSH), play an import role in physiological and pathological processes. The abnormal levels of biothiols in cells and organisms are closely relevant to various kinds of diseases. Therefore, the detection of biothiols is of great importance. In recent years, the fluorescent probe has shown favorable advantages compared to various other detecting techniques, owing to its facile operation, high temporal-spatial resolution, low destructiveness and visualization. Among the numerous reported thiol fluorescent probes, the probes with red/near-infrared(NIR) emission signal are especially concerned, because of the low background interferences, less disturbance by Raman scattering, deeper penetration depth and less photodamage to biological tissues. All these features endow the thiol fluorescent probes with better properties in cell imaging and great potential in in vivo imaging. Here, we mainly review the paper published in recent three years concerning a variety of thiol fluorescent probes with red or NIR emission. The probes are classified according to their fluorogens, with six kinds described here: rhodamine, BODIPY, cyanine, natural pigment(anthocyanidins and curcumin), donor-acceptor(D-A) conjugated molecules and fluorophores with aggregation induced-emission(AIE). We discuss the molecular design, fluorescent property, recognition mechanism and bioimaging application of each probe. At the same time, the unsolved problems and the prospect of biothiol fluorescent probes with long wavelength emission are also presented.

Contents

1 Introduction

2 Rhodamine-based biothiol fluorescent probes

3 BODIPY-based biothiol fluorescent probes

4 Cyanine-based biothiol fluorescent probes

4.1 Cy7-based biothiol fluorescent probes

4.2 Hemicyanines-based biothiol fluorescent probes

5 Natural pigments-based biothiol fluorescent probes

5.1 Anthocyanin-based biothiol fluorescent probes

5.2 Curcumin-based biothiol fluorescent probes

6 D-A compound-based biothiol fluorescent probes

7 AIE-based biothiol fluorescent probes

8 Conclusion and outlook

Graphical abstract

关键词

红光 / 近红外 / 硫醇 / 荧光探针 / 成像

Key words

red emission / near-infrared / biothiol / fluorescent probe / imaging

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党耶城, 冯杨振, 陈杜刚. 红光/近红外光硫醇荧光探针[J]. 化学进展, 2021, 33(5): 868-882 DOI:10.7536/PC200658

Yecheng Dang, Yangzhen Feng, Dugang Chen. Red/Near-Infrared Biothiol Fluorescent Probes[J]. Progress in Chemistry, 2021, 33(5): 868-882 DOI:10.7536/PC200658

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1 引言

小分子生物硫醇主要包括三种化合物:半胱氨酸(Cys)、同型半胱氨酸(Hcy)和谷胱甘肽(GSH)。它们广泛分布于细胞和生物体中,在生理和病理活动中起到了重要作用^{[1⇓⇓⇓~5]}(图1),其浓度的异常变化经常与各种疾病紧密相关。半胱氨酸在蛋白质的合成和新陈代谢中扮演了重要的角色。一系列的病理症状如生长缓慢、毛发色素脱色、水肿、嗜睡、肝功能损伤、肌肉松弛及肥胖、身体无力等都与其浓度的变化有关^[6⇓~8]。同型半胱氨酸的浓度水平值被称为H值,H值可以准确预测心脏病和中风的患病指数,并且Hcy的浓度水平过高极易引起心血管疾病和阿尔茨海默症^[9⇓~11]。谷胱甘肽是体内含量最高的小分子生物硫醇(1~10 mM),它分为还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽两种形式。一般情况下,以还原型谷胱甘肽的形式为主。它是细胞内调节代谢的一种重要物质,可参与有机体内多种生化反应,具有维持正常免疫、调节氧化作用和螯合排毒等功能^[12⇓~14]。

硫醇氨基酸对于维持生物体的正常生命活动意义重大,因此针对其浓度水平进行检测就显得格外重要。一般检测硫醇的方法有电化学法、高效液相色谱法、毛细管电泳法、质谱法、和免疫分析法等,这些方法操作繁琐,样品需求量大,成本高,检测时间长^{[15⇓⇓⇓~19]}。而荧光探针法因其操作简便、时空分辨率高、可视化和损伤小等优势,在硫醇的检测研究中越来越受到重视^{[20⇓⇓~23]}。

目前,报道的很多荧光探针分子,它们的吸收和发射波长都较短(< 550 nm),很易受到生物背景信号干扰,且组织穿透能力差,成像效果有限。而长波长发射的荧光探针,即发射红光或近红外光信号(> 600 nm),则能很好地规避这些问题。它们的信号穿透深度深,受自体背景干扰小,且随着波长增大,拉曼散射减小,使得散射干扰也大大减少,在实际应用中具有更大的优势^{[24⇓⇓~27]}。因此,本文主要聚焦具有红光或近红外光信号的荧光探针,根据组成探针的荧光团的种类而进行分类,具体为罗丹明、二吡咯氟硼、花菁、天然色素、一般的给受体共轭化合物和聚集诱导发光型化合物类等,分别从分子设计、光学性质、识别机理和细胞乃至活体应用等方面重点综述了近三年来本领域的研究进展。

2 基于罗丹明的硫醇荧光探针

罗丹明是一种邻苯二酚类的荧光染料(图2),自1887年首次发现以来,被广泛用于荧光标记、小分子检测和生物成像等生物技术领域^[28]。它具有摩尔吸光系数大、荧光量子产率高、激发波长较长等优点,目前,研究人员以此结构为母体已开发出多种硫醇荧光探针^[28,29]。

根据已报道的文献,我们发现对罗丹明的结构进行修饰,将氮原子烷基化可以使激发和发射波长产生明显的红移。如Fan等^[30]报道的一种靶向线粒体的检测Cys/Hcy的比率型荧光探针1(图3)。该探针以4-甲基硫代苯酚作为硫醇的识别基团,二乙基罗丹明为荧光基团,同时二乙基胺阳离子为线粒体的定位基团。在PBS缓冲溶液中(10 mM,pH 7.4)加入Cys/Hcy后,首先硫醇的巯基和4-甲基硫代苯酚发生亲核芳香取代反应,接着氨基进攻巯基发生分子内重排反应,反应后分子的吸收峰从590 nm蓝移至460 nm处,在580 nm光激发下,位于620 nm处荧光强度降低,而在455 nm光的激发下,540 nm处出现一个新的发射峰。通过F_{540 nm}/F_{620 nm}荧光强度比值的变化实现了对Cys/Hcy的比率型检测。探针1对Cys/Hcy选择性高,灵敏度好(检测限:Cys 22 nM;Hcy 23 nM),响应速度快(Cys 5 min;Hcy 10 min),荧光信号比率变化大(Cys 163倍;Hcy 125倍)。

将该探针应用在监测MCF-7细胞中线粒体内的硫醇在H₂O₂诱导下氧化还原平衡的过程中(图4A),H₂O₂可以氧化细胞内的硫醇,从而导致其含量减少。从图中可以看出,细胞经H₂O₂处理后,绿色通道的荧光信号减弱,红色通道信号增强,这表明H₂O₂确实对细胞内的硫醇起到了氧化调节作用。该探针也成功应用于肾脏组织中Cys/Hcy的比率检测和大型水蚤的荧光成像(图4B)。水蚤经Cys培养后,绿色通道的荧光信号明显增强,显示出了探针在活体内对Cys的选择性响应效果。

将罗丹明的氧原子用硅取代,可以获得新的荧光团。Guo等^[31]报道的一种以硅-罗丹明为荧光团,4-甲氧基硫代苯酚为识别基团构建的荧光探针2(图5)。在探针的PBS缓冲溶液中(10 mM,pH 7.4)加入Cys后,通过连续的亲核芳香取代和分子内重排反应,快速生成荧光团2b,并在2 min内,最大吸收峰由688 nm蓝移至472 nm,同时在620 nm处荧光发射强度明显增强。加入GSH也能与探针反应,仅在1 min内就生成化合物2c,使688 nm处的初始吸收峰降低,但并无荧光变化。特别的是,在2c中加入Cys后,在688 nm处的吸收峰在4 min内进一步下降至0,同时在472 nm处出现新的吸收峰,620 nm处荧光发射增强。这表明Cys可以迅速置换化合物2c中的GSH单元。因此,GSH的存在不会对Cys的特异性检测造成干扰。他们进一步研究了Cys在癌细胞中的调节作用,发现耗尽细胞内的Cys能使癌细胞对于化学疗法更加敏感。

Urano等^[32]报道了一种基于荧光共振能量转移(FRET)检测GSH的可逆比率型荧光探针3(图6)。探针3是以四甲基罗丹明(TMR)为能量供体、以硅-罗丹明(SiR)为能量受体相连而成。它具有良好的细胞穿透性,由于是阳离子型化合物,可以选择性地在线粒体内聚积。在PBS/DMSO(V∶V = 95∶5,0.2 M,pH=7.4)混合溶液中,由于FRET作用,探针的荧光主要来自SiR(632 nm),加入GSH后,与探针发生Michael加成反应,SiR的共轭结构被破坏,632 nm处的荧光强度逐渐降低,而来自TMR(593 nm)的荧光强度则逐渐增强。通过荧光比(F_{593 nm}/

F 632 nm

)和GSH浓度的拟合可以计算出探针3的K_d值(GSH的解离常数)为3.0 mM,而根据细胞内GSH实际含量可知K_d值在1~10 mM为最佳。因此探针3非常适用于真实细胞环境内GSH含量的检测。他们利用该探针定量检测出多种细胞系中GSH的浓度。

除了上述两种结构修饰,还可以将罗丹明与其他荧光团联合起来构建比率型荧光探针。2019年,Liu等^[33]也报道了一种基于FRET的比率型近红外荧光探针4(图7)。探针4以香豆素作为能量供体,以罗丹明作为能量受体,以哌嗪作为间隔基团相连,三氟甲基苯硫酯部分作为硫醇的识别基团。在PBS/乙醇(V∶V = 7∶3,pH=7.4)的混合溶液中,由于FRET作用,探针在467 nm处(香豆素部分)荧光发射很弱,而在645 nm处(罗丹明部分)有很强的荧光。而加入Cys后,巯基会与探针的苯硫酯部分发生取代和分子内重排反应,随后在罗丹明部分形成无荧光的闭环螺内酰胺结构,FRET过程被阻断,导致罗丹明部分(645 nm)荧光强度降低了45%,香豆素部分(467 nm)荧光强度增强了18倍。同时,

F 467 nm

/F_{645 nm}的荧光强度比值从0.235增至4.237,实现了对于Cys的比率型检测。该探针成功应用于可视化监测HeLa细胞和果蝇幼虫中Cys的浓度变化。

3 基于二吡咯氟硼的硫醇荧光探针

二吡咯氟硼(BODIPY)是一类光物理化学性能优异的荧光团(图8)。它具有摩尔吸光系数大、荧光量子产率高、易于修饰以及光稳定性较好等特点,在荧光探针领域广泛应用^[34,35]。但该类化合物母体的吸收和发射一般位于短波长区域,因此,研究者们对该分子进行各种修饰使得其发射波长更长。

延长分子的共轭长度和增强体系中给受体的强度是使分子发射波长红移的常见方法。2019年,Gu等^[36]报道了检测GSH的比率型荧光探针5(图9)。探针5在BODIPY的2号位引入三氟甲基取代的氰基苯乙烯,扩大了分子的共轭程度,增强了受体的强度。同时这种吸电子基团的引入,可使识别基团氯原子的反应活性增强,探针的响应速率加快。在探针5的PBS/乙腈(V∶V = 1∶1,pH=7.4)混合溶液中加入GSH后,巯基进攻氯原子发生亲核取代反应,15 min内反应完毕,巯基的给电子作用会使其荧光光谱红移。在这一过程中,位于574 nm处的吸收峰逐渐降低,并且在609 nm处出现一个新的吸收峰。同时,在550 nm光的激发下,位于590 nm的荧光发射峰逐渐降低,621 nm处的发射增强。而加入Cys/Hcy,探针中的氯原子被硫醇取代后,会发生分子内重排反应,最后生成氨基取代的产物,该产物会导致探针位于574 nm处吸收峰降低并发生蓝移,590 nm处的荧光强度减小,与加入GSH后的信号不一样。探针5通过红色通道和绿色通道中荧光比率的不同成功区分了HeLa细胞中的GSH和Cys。

Qian等^[37]报道了检测GSH的高灵敏度双光子近红外荧光探针6(图10)。探针6在BODIPY的3, 5号位分别引入给体三苯胺,增强分子内电荷转移(ICT)作用,使其发射光谱进入近红外区域;在BODIPY的8号位引入2,4-二硝基苯磺酰基,作为荧光猝灭基团和硫醇识别基团。在探针的PBS/THF(V ∶ V = 1∶1,pH=7.4)混合溶液中加入GSH后,由于GSH与探针发生亲核芳香取代反应,导致2,4-二硝基苯磺酰基从分子中裂解,光致电子转移(PET)作用被消除,从而恢复探针的荧光发射。在这一过程中,吸收峰从691 nm蓝移至679 nm。在670 nm光的激发下,719 nm处的荧光发射强度明显增强。该探针对GSH的检测限为25.46 nM,识别GSH后荧光团的荧光量子产率为0.44。因其双光子吸收截面值较大(σ ₂= 410 GM),该探针有潜力应用于GSH的双光子成像。

他们还报道了多个与探针6结构相似、通过修饰给体部分调节发射波长的荧光探针。如近红外荧光探针7^[38](图11)在BODIPY的3, 5号位引入4-甲氧基苯乙烯基团作为电子给体,识别GSH后,656 nm处荧光开启,发射强度增强了45倍。同样,双光子荧光探针8^[39]在BODIPY的3, 5号位引入给体4-羟基苯乙烯,并在分子两端各引入2,4-二硝基苯磺酰基作为识别位点,与GSH反应后,675 nm处的荧光增强了27倍,同时用800 nm激光也能激发出明显的荧光,表明该探针有潜力应用于双光子生物成像。而Liu等^[40]报道的探针9在BODIPY的8号位引入五氟苯基,以增加荧光团受体的强度,与Cys反应后,610 nm处的荧光发射强度增强了43倍。

4 基于花菁的硫醇荧光探针

花菁染料的历史可以追溯到一个半世纪之前,Williams在1856年发现了花菁染料,该类染料具有异常灵敏的感光能力,是一类典型的近红外发光材料。通常,这些染料可分为五类:花菁染料、半花菁染料、氧杂酚染料、部花菁染料和方酸菁染料。在这些染料中,花菁和半花菁在荧光探针的开发中应用较多^[41,42]。

4.1 基于花菁染料的硫醇荧光探针

花菁染料结构包含两个含氮杂环,其中一个带正电荷并通过奇数个碳原子链与另一个含氮中心共轭连接(图12)。花菁染料的吸收和发射光谱可随着共轭多甲川链长度(即n)的变化而调节^[43]。而多甲川花菁染料分子的共轭体系越大,分子的基态与第一激发态之间的能差就越小,从而分子的吸收波长和发射波长越长。其中吲哚七甲川花菁染料(Cy7,n=3)因具有近红外发射性质,常被用于构建荧光探针。

2019年,Yuan等^[44]报道了一种具有双发射信号检测线粒体中GSH的近红外荧光探针10(图13)。探针10以2-(4-羟基苯乙烯基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮(DCM)和花菁染料(Cy7)为双荧光团,以芳基醚作为GSH的响应位点。在HEPES/DMSO(V∶V = 9∶1,0.1 M,pH=7.4)的混合溶液中,探针仅在可见光区域有较弱的荧光。而加入GSH后,巯基会与探针的醚键发生亲核芳香取代反应,从而释放两个荧光团10-DCM和10-Cy7。在这一过程中,在358 nm和700 nm的吸收峰增强;同时位于可见光区域520 nm和近红外区域810 nm处荧光强度也明显增强。浓度滴定实验表明在两个不同光通道中检测GSH的检测限分别为24 nM(可见光)和32 nM(近红外)。H22荷瘤小鼠模型实验表明,肿瘤组织在可见光通道有较强的蓝色荧光,在近红外通道具有较强的红色荧光;但是在有炎症的组织中,仅在可见光通道中有较弱荧光,而近红外通道没有荧光信号。该探针的多通道荧光成像性质,使其具有区分肿瘤和炎症组织的潜力。

Yin等^[45,46]报道的荧光探针11、12都是由花菁和萘酰亚胺构建而成(图14)。探针11中阳离子花菁靶向线粒体,含吗啉的萘酰亚胺靶向溶酶体。在PBS/DMSO(V∶V = 99∶1,10 mM,pH=7.4)的混合溶液中加入GSH后,得到两个不同荧光发射的产物(11-Cy和11-Na)。在这一过程中,785 nm处出现新的吸收峰;在710 nm光的激发下,812 nm处荧光强度明显增强。他们还发现GSH倾向于优先进攻探针的花菁部分形成11-Cy。在探针12中,由于哌嗪环中的叔胺氮引起ICT过程,导致探针荧光猝灭。与GSH反应后,495 nm和795 nm处的荧光强度增强。Yang等^[47]报道的探针13,以2-巯基吡啶作为离去基团,加入Cys/Hcy后,750 nm处荧光发射开启。

4.2 基于半花菁染料的硫醇荧光探针

半花菁染料在结构上具有给体-π-受体(D-π-A)的特征(图15)。其一端以羟基、烷氧基或氨基作为电子给体,另一端以带正电荷的氮杂环作为电子受体,它们通过共轭系统相连。半花菁染料一般都具有较大的斯托克斯(Stokes)位移^[48]。

Guo等^[49]报道了一种实时监测GSH的可逆比率型荧光探针14(图16)。探针14以罗丹明和苯并噻唑构成的半花菁作为荧光团。在探针的PBS缓冲溶液中(10 mM,pH=7.4)加入GSH后,GSH会与双键发生Michael加成反应,阻断苯并噻唑的π共轭,导致半花菁的近红外荧光猝灭,从而释放出罗丹明的荧光。在这一过程中,位于580 nm处的吸收峰降低,在530 nm处出现一个新的吸收峰。同时在688 nm处的荧光发射峰降低,在560 nm处出现一个新荧光发射峰。探针与GSH响应的荧光值与其浓度在0~7 mM范围内具有良好的线形关系,检测限为9.43 μM。

2019年,Liu等^[50]报道了一种具有多个响应位点的荧光探针15(图17)。探针15以香豆素和吲哚盐构成的半花菁为荧光团,引入磺酸盐烷基链以改善探针的水溶性。在探针的PBS缓冲溶液中(10 mM,pH=7.4)加入Cys/Hcy时,先后发生亲核取代、分子内重排和分子内环化反应,得到15-a3(七元环)/15-b3(八元环)。然而,GSH的巯基与位点1发生亲核取代反应生成15-c1,随后进行分子内环化形成15-c2 (十四元环)。但是,由于十元环的不稳定性,15-c1中不会发生分子内重排形成15-c3。

通过不同的激发光照射,三种生物硫醇表现出不同的荧光响应,表明该探针可以有效地区分生物硫醇,同时A375细胞成像实验证明,该探针具有实时监测活细胞中内源性生物硫醇的能力。2020年,Chen等^[51]也报道了一种由7,8-吡喃香豆素和吲哚盐组成的半花菁荧光探针16。它与硫醇反应后,751 nm处的荧光开启,该探针还可以应用于检测细胞的氧化应激状态(图17)。

Tang等^[52]报道了一种检测Cys的光声和荧光双模成像探针17(图18)。探针17以半花菁为荧光团,以丙烯酸酯基团为荧光猝灭基团和硫醇的识别基团。在探针的PBS/DMSO(V∶V = 99∶1,pH 7.4)的混合溶液中,Cys会与探针的丙烯酸酯基团发生共轭加成和分子内环化反应,生成内酰胺从分子中裂解下来,从而恢复半花菁荧光团的发射。在这一过程中,吸收峰从585 nm处红移至680 nm,在710 nm处的荧光发射强度增强26.7倍。探针对Cys的检测限为0.21 μM。在患有肺纤维化(PF)患者的肺中GSH的浓度较低,但是,目前尚不清楚这种现象是否是由于Cys的含量过低所致。而他们通过小鼠体内成像对比实验发现,肺纤维化小鼠肺中Cys含量高于健康小鼠,表明GSH的有限合成不是由Cys缺乏引起的。通过比较PF小鼠,肺炎小鼠和健康小鼠中探针的荧光和光声信号,发现只有PF小鼠表现出明显的荧光和光声信号。这表明该探针可作为一种临床区分肺纤维化和肺炎的有效手段,并且还可以用于肺纤维化新药物的潜在靶标。

Chen等^[53]报道了一种用于特异性检测Cys的远红光至近红外荧光探针18(图19)。在探针的PBS/乙醇(V∶V = 99∶1,10 mM,pH=7.4)的混合溶液中加入Cys后,会发生亲核取代和分子内重排反应。在这一过程中,探针18的最大吸收从660 nm蓝移至540 nm。在550 nm光的激发下,随着Cys浓度的增加,710 nm处的发射峰逐渐减小,626 nm出现一个新的荧光发射峰并逐渐增强。荧光强度比(

F 626 nm

F 710 nm

)从0.23增加到9.5,增强了41倍,实现了对于Cys的比率检测。

基于菁类染料的荧光探针有一共同的缺点就是光稳定性较差,而且它的共轭链容易被体内其他活性物质进攻,使得其选择性也面临问题。因此,为了发挥其长波长发射的优势,在菁类染料的后续开发中,应从提升光稳定性和结构稳定性方面入手。

5 基于天然色素的硫醇荧光探针

5.1 基于花青素的硫醇荧光探针

花青素是自然界中一类广泛存在于植物的天然色素^[54](图20)。基于花青素的母体结构,将可旋转的碳碳单键通过成环固定,可以使其荧光量子产率和双光子吸收截面值均增大。

2019年,Cheng等^[55]报道的一种双光子荧光探针19和Song等^[56]报道的一种红光探针20(图21),它们都是以花青素衍生物为荧光团,以丙烯酸酯作为Cys的识别基团构建的。在探针19的PBS/乙腈(V∶V = 4∶1,25 mM,pH 7.4)的混合溶液中,加入Cys 15 min之后,在550 nm光的激发下,611 nm处的荧光发射强度增强了51倍,探针19的检测限为24.1 nM。探针20与Cys反应后,最大吸收峰从540 nm红移至580 nm,同时在615 nm处的荧光发射开启。

5.2 基于姜黄素的硫醇荧光探针

姜黄素是从姜科和天南星科中的一些植物根茎中提取的一种化学成分,为二酮类化合物^[57,58](图22)。其两端的羟基很容易通过化学修饰而功能化,中间的β-二酮结构可以和氟化硼配位使其拉电子能力增强从而使其发射波长红移。

Chen等^[59,60]报道的荧光探针21、22(图23),它们都是以姜黄素为荧光团构建的D-A-D型对称的荧光探针。

探针21以2,4-二硝基苯磺酰基作为硫醇的响应基团,在探针的乙醇/HEPES(V∶V = 4∶1,pH 7.4)混合溶液中加入硫醇后,610 nm处荧光开启,荧光强度明显增强(Cys:17.8倍;Hcy:14.2倍;GSH:7.3倍),检测限分别是Cys 0.59 μM,Hcy 2.25 μM,GSH 3.38 μM。探针22是以丙烯酸酯基团作为Cys的响应基团,与Cys反应后,最大吸收峰由461 nm红移至510 nm处,在615 nm处的荧光强度增加了11倍。探针22成功应用于MCF-7细胞中内源性Cys的选择性成像。

6 基于给受体共轭化合物的硫醇荧光探针

有机荧光团一般都具有较大的π电子共轭体系,而在体系中引入给体-受体(D-A)结构,则能通过增强ICT作用,使得发射光谱红移,进而用来构建红光或近红外光的荧光探针。常见的电子给体有三苯胺、烷基胺、羟基等基团;而常见的电子受体有氰基,2-(3-氰基-4,5,5-三甲基呋喃-2(5H)-亚甲基)丙二腈(TCF)、异佛尔酮等基团^[61⇓~63](图24)。

Dong等^[64]报道一种基于激发态分子内质子转移(ESIPT)的荧光探针23(图25)。在探针的HEPES缓冲溶液中(H₂O ∶THF = 99∶1,50 mM,pH 7.4)加入Cys 8 min后,在450 nm光的激发下,位于640 nm处的荧光强度增加至最大。在此过程中,探针和Cys反应释放了质子供体(—OH),质子供体(—OH)和相邻的受体(—C=O)之间形成分子内氢键,激发了ESIPT效应,从而产生很强的红色荧光发射。该探针对Cys的检测限为5 nM,成功应用于HepG2细胞中内源性和外源性Cys的荧光成像。

2019年,Chen等^[65]报道了一种具有较大的Stokes位移、发红光的荧光探针24(图26)。探针24是由羟基萘为电子给体、TCF为电子受体组成的荧光团。在探针的HEPES/乙醇(V∶V = 1∶1,pH=7.4)混合溶液中加入硫醇后,最大吸收峰从420 nm红移至480 nm,在480 nm光的激发下,位于640 nm处的荧光强度增强了32倍,其Stokes位移达到了160 nm,有效地规避了荧光自吸收的影响。检测限分别为Cys 0.11 μM,Hcy 0.47 μM,GSH 0.35 μM。同年,Qi等^[66]也报道了一种含有TCF的D-A型荧光探针25。探针25以氧杂蒽为给体、TCF为受体、丙烯酸酯作为识别基团构建。与Cys反应后,770 nm处的荧光开启。此外,加入硫醇后,探针溶液由浅紫色分别变为绿色(Cys)、浅绿色(GSH)和无色(Hcy),表明探针25还可作为区分硫醇的比色指示剂。

2018年,Jiang等^[67]报道了一种由萘酚和受体二氰基异佛尔酮衍生物组成的荧光团,以丙烯酸酯作为Cys的识别基团构建的荧光探针26(图27)。在探针的PBS/DMSO(V ∶ V = 1∶ 1,pH=7.4)混合溶液中加入Cys后,418 nm处的吸收峰降低,在441 nm处出现新的吸收峰,等吸收点为433 nm;同时,在631 nm处荧光强度显著增强。同年,Zhu等 ^[68]也报道了一种以二氰基异佛尔酮为受体的荧光探针27。该探针以3, 5-二硝基吡啶为识别位点,与硫醇反应后,3, 5-二硝基吡啶离去,697 nm处荧光开启,强度增强了71倍。

7 基于AIE型化合物的硫醇荧光探针

Tang等^[69]在2001年首次提出了聚集诱导发光(AIE)的概念。常见的分子荧光探针在水溶液中容易发生聚集导致荧光猝灭(ACQ),从而影响探针的性能,而AIE型探针则能很好地规避这个问题^[70⇓~72]。在构建AIE探针分子时,四苯乙烯(TPE)是最经典同时也是最广泛应用的结构之一(图28)。TPE中的四个苯环连接到中心烯烃结构上,在溶解状态下,苯环的旋转以非辐射跃迁的方式消散能量,导致TPE几乎没有荧光;然而,在分子聚集状态时,苯环的旋转受到物理限制,即分子内运动受限(RIM),从而开启TPE的荧光发射。并且,AIE分子的扭曲结构能阻碍π-π堆积相互作用,避免荧光猝灭,进一步有助于荧光增强^[73,74]。

Tang等^[75]报道的一种基于TPE的比率型双光子荧光探针28(图29)。探针以间二硝基苯取代的苄基苯酚作为识别基团,分子带正电荷可以靶向线粒体。在探针的PBS/DMSO(V∶V=1∶1,pH=7.4)混合溶液中加入GSH后,巯基进攻二硝基苯,发生亲核芳香取代反应,识别基团从探针分子中脱除,位于631 nm处的荧光发射减弱,而在500 nm处的荧光发射强度增强。发射蓝移的现象归因于四苯基乙烯吡啶的ICT效应比探针弱。同时,由于该探针的双光子吸收截面值较大(σ₂= 1790 GM),已成功应用于双光子鱼幼虫细胞成像实验。在图30中可以看出,探针孵育的鱼幼虫,其在绿色通道的荧光发射强度增加,红色通道荧光减少。同时,他们发现GSH可能主要位于眼睛、肝脏和肠道中。而和GSH一起通过特定的吸收系统有效地吸收到整个肠上皮,积累在肝脏和肌肉中,这为筛选体内潜在抗肿瘤药物提供了可能性。因为,在癌症转移治疗中,GSH在肝脏依赖性组织间流动起着重要作用。

2019年,Ma等^[76]报道一种检测Cys/Hcy的AIE型荧光探针29(图31)。探针29通过苯环和碳碳双键将电子给体三苯胺与受体二氰基苯乙烯和醛基结合在一起,形成一个非平面的D-π-A-π-A型的分子。醛基作为Cys/Hcy的识别基团,通过环化反应形成噻唑烷/噻嗪烷。在探针的DMSO/H₂O(V∶V=3∶1)混合溶液中加入Cys/Hcy 2 min后,618 nm处的弱荧光发射蓝移至596 nm,且伴随着荧光强度的增强。荧光蓝移归因于醛基向噻唑烷/噻嗪烷的转化,使得D-π-A-π-A的结构变成了D-π-A。而且与探针29相比,新生成产物的溶解度降低,形成的聚集体由于分子间氢键的作用,进一步限制了分子内的运动,使得AIE效果增强,从而导致橙红色的荧光发射增强。同时,探针29黄色溶液在检测过程中变为无色,表明该探针也可以通过比色法检测生物硫醇。

8 结论与展望

鉴于长波长发射信号具有背景干扰小、组织穿透深、光损伤小等优势,本综述重点讨论了近3年来有代表性的部分红光/近红外光硫醇荧光探针的研究情况。三种小分子生物硫醇从结构上来讲,一方面它们具有共同点,即都是含巯基的氨基酸,在生理环境下,巯基的亲核性较强;另一方面不同点也较突出,即在亲核能力和分子大小方面具有差异。研究者们利用这些特性,通过设计合成不同的荧光基团和识别基团,以亲核芳香取代、Michael加成、分子内重排等反应机理,分别得到了对硫醇或者某种特定硫醇具有选择性响应的荧光探针。在荧光团的构建中,主要通过扩大分子共轭程度和引入强的给体受体基团,使得发射波长红移。我们以构成荧光团的种类不同进行分类,系统地讨论了领域内的研究进展。迄今,不仅实现了活细胞中内源性硫醇的选择性检测,还通过比率型探针的设计,定量地检测细胞内硫醇的浓度,并实时监测浓度的变化。另外,通过巧妙地在探针中引入定位基团,也可实现对细胞器内特定硫醇的靶向检测。而双光子荧光成像技术的引入,实现了较深组织乃至活体内硫醇的选择性成像;同时,AIE型探针的设计,可以避免聚集荧光猝灭效应,并增加探针的抗光漂白作用。最后,部分工作还对硫醇在生理活动中的作用进行了初步探讨。

在红光/近红外光硫醇荧光探针的研究领域,已取得了较大的进展,但也存在一些明显的问题,如探针的聚集诱导荧光猝灭、光漂白和细胞内滞留能力不佳等,还有细胞中三种硫醇实际浓度相差较大而带来的选择性问题,都值得我们进一步地去研究。在此,我们希望对已有工作的总结,能给研究者们提供更有益的思路,也希望此领域的进步最终能对相关疾病的诊疗做出贡献。

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