生物医用高通量研究中的微液滴阵列

陈怡峰; 王聪; 任科峰; 计剑

doi:10.7536/PC200667

化学进展 ›› 2021, Vol. 33 ›› Issue (4) :543-554 DOI: 10.7536/PC200667

综述

扫码查看或转发全文

生物医用高通量研究中的微液滴阵列

陈怡峰 ¹ ,
王聪 ¹ ,
任科峰 ¹ ,
计剑 ¹^,^*

作者信息 +

Droplet Microarrays in Biomedical High-Throughput Research

Yifeng Chen ¹ ,
Cong Wang ¹ ,
Kefeng Ren ¹ ,
Jian Ji ¹^,^*

Author information +

文章历史 +

摘要

为快速、高效处理大量实验及其数据,进一步加快材料研发过程,高通量筛选成为了一种越来越重要的实验手段,被广泛应用于众多领域,以提升实验效率。而高通量实验平台是开展高通量实验的基础条件。现有高通量实验平台,如微孔板,在处理珍贵样品和试剂时,仍存在消耗量较大、实验通量较低等问题,仍有待进一步优化。而微液滴阵列作为一种新兴的微型化和集成化高通量平台,具有试剂及样品消耗少、反应时间短、高度集成化、可操作性强等优势,在生物医用领域得到了广泛的研究和应用。本文总结归纳了微液滴阵列的制备方法,将其划分为表面化学驱动和物理形貌辅助两大类,并对不同制备方法的优缺点进行了简要的分析;随后从2D细胞筛选、3D细胞培养、单细胞分析及全机体筛选四个方向对其在生物医用高通量研究中的应用进行了简要介绍,最后总结分析了微液滴阵列在应用过程中存在的问题和未来的发展方向。

Abstract

In order to handle a large number of experiment conditions and outputs and further accelerate the material development process, high-throughput screening has become a more and more important experimental method, which has been widely used in many fields to improve experimental efficiency. And the high-throughput platform is the basic condition for carrying out high-throughput experiments. Existing high-throughput platforms, like microtiter plates, still suffer from problems such as high consumption and low experimental throughput when dealing with precious samples and reagents and further optimization is still required. As an emerging miniaturized and integrated high-throughput platform, droplet microarrays have the advantages of low consumption of reagent and sample, short reaction time, high integration and strong operability, and have been widely studied and applied in the field of biomedicine. In this paper, the construction methods of droplet microarrays are summarized and divided into two categories: surface chemistry driving and physical morphology assisted. The advantages and disadvantages of different construction methods are briefly analyzed. Then the applications of droplet microarrays in biomedical high-throughput research are also briefly introduced from the four directions of 2D cell screening, 3D cell culture, single cell analysis and whole organism screening. Finally, the problems existing in the application process of droplet microarrays and its future development direction are also summarized and analyzed.

Contents

1 Introduction

2 Construction methods

2.1 Surface chemistry

2.2 Surface morphology

3 Applications in biomedical high-throughput research

3.1 2D cell screening

3.2 3D cell culture

3.3 Single cell analysis

3.4 Whole organism screening

4 Conclusion and outlook

Graphical abstract

关键词

微液滴阵列 / 制备方法 / 生物医用 / 高通量

Key words

droplet microarrays / construction methods / biomedicine / high-throughput

引用本文

引用格式 ▾

陈怡峰, 王聪, 任科峰, 计剑. 生物医用高通量研究中的微液滴阵列[J]. 化学进展, 2021, 33(4): 543-554 DOI:10.7536/PC200667

Yifeng Chen, Cong Wang, Kefeng Ren, Jian Ji. Droplet Microarrays in Biomedical High-Throughput Research[J]. Progress in Chemistry, 2021, 33(4): 543-554 DOI:10.7536/PC200667

登录浏览全文

4963

注册一个新账户忘记密码

1 引言

高通量实验手段借由并行和集成化的技术,可快速制备具有不同组成结构的材料,并获得其性能参数,能够大大提高实验的效率,是获得复杂材料系统最佳参数组合的有效工具之一。在过去的几十年里,微型化的概念作为高通量的一种手段被不断普及,并在生物和化学分析领域得到了广泛的应用^[1⇓~3]。微型化器件可进一步大幅度提高材料的制备和表征通量,因而具有极大的发展潜力和应用价值。在生物医学领域,微孔板是目前较为成熟的一种高通量实验平台。但是相对于实验中所需细胞或试剂的难获得程度^[4]以及所需探究影响因素的多元性而言,微孔板的试剂及样品消耗仍然较大,实验通量也较低。因此,进一步微型化的高通量实验平台仍有待开发。

微液滴阵列技术通过在表面构建亲疏水图案化区域或者构建规律分布的微孔、微柱等物理间隔来实现液滴的分裂捕获,从而形成众多具有特定几何形状的微小液滴组成的阵列(图1)。不同区域表面浸润性差异尤其是极端的超疏水-超亲水性对比或者密集的物理间隔引起的体积排斥和剪切作用使得分裂的微液滴可以紧密地排列,大大提升了在一次平行化操作中可以处理的通量。借由表面浸润性差异的技术,研究者可以更为自由地控制微液滴阵列的形貌和尺寸,而不必担心不同微液滴之间的交叉污染或者融合,保证了高通量实验的可靠性和重现性。作为一种新兴的高通量实验平台,阵列中单个液滴的体积极小,甚至可达80 nL及以下,相比于最小孔洞的1536孔微孔板,节约了20倍体积的用量,相比于最常用的384孔微孔板,更是节约了至少125倍体积的用量^[5];同时由于液滴体积小,也有效缩短了反应时间;作为一种集成化的芯片,微液滴阵列可以极大提高实验通量;而阵列上液滴的开放性则有利于后续实验中的加液、取液及分析等操作^[6]。正是由于微液滴阵列的这些优势,其在高通量筛选方面具有极大的潜力。本文将对微液滴阵列的制备方法进行简要概括,同时介绍其在生物医用领域的应用,并总结分析存在的一些问题和未来的发展方向。

2 微液滴阵列制备技术

微液滴阵列的制备过程就是众多微小液滴形成、分离、捕获和稳定的过程。总体而言,其制备方法可划分成两类:表面化学驱动和物理形貌辅助。前者使用较为广泛,有较为明确的理论依据,但其更加适用于高表面张力的液体(例如水);而后者的制备过程没有较为明确的理论规律,但其对低表面张力的液体(例如大部分有机溶剂)也有着较好的适用性。

2.1 表面化学驱动

表面化学的发展为表面性质的调节提供了十分有效的手段,如涂层^[9]、层层组装^[10]和光点击反应^[11]等。而通过构建具有浸润性差异的图案化表面则被广泛应用于微液滴阵列的制备。

Fang等^[12]通过热氧化处理在硅片表面制备亲水性二氧化硅层,经硅烷化变为疏水性,随后在光刻胶和光掩模作用下,经紫外光照射,并湿法刻蚀除去硅烷化涂层,从而获得亲水-疏水位点阵列,通过在亲水位点上滴加含有不同食用色素的水滴即可获得微液滴阵列,单个液滴体积为纳升尺度(图2)。而Liu等^[13]则利用聚二甲基硅氧烷(PDMS)印章法进行了微液滴阵列的制备。他们先使用软光刻技术制备图案化的PDMS印章,再将其与玻片贴合,经氧等离子体处理后剥离PDMS,则在与PDMS接触的玻片区域会残留一层疏水的PDMS纳米膜,而裸露出的玻片区域则呈亲水性(图3A);当在表面滴加水溶液时,由于疏水区域的排斥作用和亲水区域的浸润作用,可获得微液滴阵列。Lee等^[14]用激光直写技术替代上述软光刻技术,在无需掩膜的情况下先制备了微液滴阵列,然后在阵列上浇铸PDMS预聚物获得具有互补表面形貌的PDMS印章。而该印章反过来又可以制备上述微液滴阵列芯片,从而实现了两者间的相互转换。Huang等^[15]利用软光刻制备了具有并行微通道的微流控芯片,由此可以高效率地向目标基底分配液滴,同时利用湿法蚀刻和光刻技术制备了孔内亲水、孔外疏水的微孔阵列,从而避免相邻位点之间的液滴交叉污染。

而上述过程制备的都是亲水-疏水图案化表面,由于两者的浸润性差异较小,微液滴阵列的形成往往是通过滴管滴加或者借助专门化的液体处理设备来实现的,并且相邻液滴之间的间距难以进一步缩小,否则易引起液滴的融合。为了进一步简化实验操作,超亲水-超疏水图案化表面的制备得到了深入研究。Levkin等^[16]通过光引发共聚得到超亲水多孔聚合物层,然后在光掩模覆盖下进行光接枝制备超疏水区域(图3B)。他们^[7]在此基础上进一步发展,利用了超亲水-超疏水区域极端的浸润性差异,当在该图案化表面上滚动液体或者将该基底浸入水溶液中拉出时,将发生不连续去湿现象^[17],从而一步法制备得到由成千上万个皮升至微升体积的微液滴组成的阵列(图4A)。随后,他们^[18]将巯基-炔光点击反应应用到了超亲水-超疏水图案化表面的制备中,使得制备时间大大缩短。Song等^[19]则通过制备均匀多孔微纳米复合结构,并进行化学气相沉积修饰获得超疏水区域,然后在光掩模覆盖下深紫外照射得到超亲水图案,利用表面浸润性差异分裂液滴,制备均匀的皮升至飞升体积的微液滴阵列;同时探究了超亲水图案尺寸、接触力大小以及相对滑动速度等对微液滴体积的影响。Wang等^[20]将具有高效光催化作用的Ag-ZnO纳米棒分散到十八烷基三氯硅烷(OTS)基质中,然后沉积到铟锡氧化物基底上形成超疏水Ag-ZnO-OTS涂层,进一步在紫外辐射(UV)下获得超亲水图案(图4B)。而通过结合光刻法与其他技术^[21,22],硅片表面的超级浸润性差异成功获得,从而形成微液滴阵列用于转印技术的实现。超亲水-超疏水图案化极大程度上简化了微液滴阵列形成的操作,提高了操作的通量,然而其对于化学修饰的要求更高,并且由于尺寸的进一步降低,后续通过三明治法^[23]利用两块微液滴阵列叠加来添加其他化合物时, 对于叠加对齐的精密度提出了新的要求。

而介于上述亲水-疏水以及超亲水-超疏水浸润性差异之间,亲水-超疏水图案也得到了大量研究^{[24⇓⇓⇓~-28]}。Mano等^[26]利用聚氯乙烯贴片保护局部的聚苯乙烯基底,然后进行相分离制备超疏水表面,则在移除贴片后,原区域就保留了可浸润性。Zhao等^[28]受狭蝽甲虫不均匀纹理浸润性凸起的启发,直接使用天然的超疏水表面——大闪蝶翅膀来进行微液滴阵列的制备。大闪蝶翅膀在经过预处理后,用预凝胶溶液浸润,然后在光掩模覆盖下紫外光照引发聚合,从而得到亲水的凝胶位点。而作为亲水位点的替代,Mano等^[29]另辟蹊径,在超疏水表面制备微压痕,利用毛细作用力来固定微液滴,从而形成微液滴阵列。亲水-超疏水图案化技术虽然在通量上低于超亲水-超疏水技术,但是其对于表面化学修饰缺陷的容忍度更高。

2.2 物理形貌辅助

除了上述利用表面化学获得浸润性差异的方式,借助表面物理形貌来捕获微液滴也是制备微液滴阵列的一种十分直接有效的手段。

微孔阵列可用于捕获微液滴形成阵列。Blainey等^[30]借助软光刻技术制备了一种微孔阵列芯片,利用微量移液管可以将乳化的样品微液滴负载到该芯片上,每个微孔可以随机捕获两个微液滴,每个微液滴体积均为1 nL,并且每对微液滴都可以通过施加高压交流电场实现融合。为了防止蒸发和化学交叉污染,该微孔阵列用玻璃基底进行了封装。Zhang等^[31]利用光刻法等技术制备了一种微腔阵列,每个微腔都由亲水的底部和疏水的屏障构成,可捕获飞升体积的微液滴。而为了防止微液滴的蒸发,聚全氟醚油被用于微腔的密封。Lee等^[32]先通过光掩模覆盖下紫外光照固化单体层得到聚合物空腔阵列,随后在该阵列上形成一层导电聚合物薄膜。将该阵列按压到预先制备的聚氯乙烯凝胶上,则在每个空腔内都会得到一个微液滴,形成的微液滴阵列可作为微透镜阵列。

微柱等物理间隔也可被用来捕获微液滴。相比于上述微孔阵列,利用微柱间隙来捕获微液滴,不会阻断液体的流动,因而更加高效。Fang等^[8]利用软光刻技术制备了一种微笼阵列芯片用于快速形成大规模的二维微液滴阵列。每个微笼是由周围的四根微柱包围而成,油相可以通过这些微柱间的空隙快速地铺展开,而这些微笼则可以高效捕获油相中的微液滴,只需不到90 s,便可以形成含有约一百万个微液滴的阵列。Jeon等^[33]则借助溶剂辅助成型在聚苯乙烯表面制备了微柱阵列(图5)。与前一项工作不同,该工作不需要提前制备微液滴,当液滴主体在该微结构表面滑过时,由于剪切作用,微液滴被截留在微柱包围的区域中,从而直接形成微液滴阵列。同时,通过调整微柱的高度和间距等参数,可以获得不同的微液滴。

微液滴不仅可以在微柱之间被捕获,还可以被负载到微柱上。Zhang等^[34]利用穿孔的不锈钢板作为模板进行浇筑,得到PDMS微柱阵列。由于微柱具有较高的粘附作用,在每一个微柱上都可以负载一个微液滴,即使阵列发生旋转和变形,微液滴也仍能稳定存在。通过与集成电路进行结合,该阵列被用于葡萄糖浓度的电化学测定。受黏着态弹尾虫皮肤和壁虎脚的启发,Gu等^[35]利用基于双光子聚合(TPP)的3D打印技术制备了具有高分辨率的微型双重凹角阵列(图6A)。阵列上微结构的紧密排布可以有效捕获微液滴,而通过合理调整这种排布,可以实现三种不同的Cassie黏附行为。该阵列对水和不同的有机溶剂都适用,并且其环境相可以是空气,也可以是液体。

微孔、微柱阵列均提供了明确的物理边界来限制微液滴的扩散,最大程度上避免了液滴之间的融合,但是相应的制备成本一般较为高昂,如依赖于光刻技术等。微孔、微柱阵列捕获微液滴的技术通常不需求化学修饰,因此耐用性更高,不过随着微液滴尺寸的不断降低,相应对物理间隔的精度要求逐渐提升,成本问题愈发突出。

除了上述几种方式,其他一些物理作用也被探究用于微液滴阵列的形成。Mann等^[37]利用声学驻波来捕获水溶液中的pH响应性聚合物团聚体微液滴,原位形成图案化阵列。而在pH诱导下,分子在微液滴的表面及核心发生超分子组装,形成纳米长丝,纳米长丝发生缠结则形成了微图案化的水凝胶。Song等^[36]则利用破乳来实现微液滴阵列的图案化(图6B)。首先,利用传统光刻技术和深反应离子刻蚀制备亲水纹理基底,然后将水包油乳液滴加到该基底上,由于局部毛细差异,将形成多种乳液图案,而随着水和油的蒸发,从乳液图案的外边界到中心将沿径向发生破乳,从而如多米诺骨牌般形成微液滴阵列。利用声学等物理作用形成微液滴阵列的技术为研究人员提供了更广泛的选择余地,然而适用性更小,且难以对微液滴形状、尺寸等参数进行相应灵活的调节。

3 生物医用高通量研究中的应用

微液滴阵列所具有的样品消耗少、反应时间短、对多种分析手段的兼容性好等优势,使得其在众多领域得到了发展与应用,如微感应芯片^[38⇓~40]、微粒组装^[41⇓~43]等。而在生物医用领域,其同样具有极大的应用潜力。

3.1 2D细胞筛选

细胞培养与筛选是生物医用领域十分重要的研究手段,是生物医学实验中的基础操作。目前,细胞培养与筛选主要在微孔板中进行。但相对于一些珍贵样品而言,微孔板用量较大,难以适用。为了进一步减少样品消耗,并提高实验通量,微液滴阵列是一个不错的选择。阵列中的每个液滴都相当于一个单独的微型培养容器,不同细胞和试剂可以在这些液滴中孤立存在,有效避免了交叉污染。

Mano等^[44]利用可生物降解的PLLA制备超疏水表面,并用Ar等离子体处理不同时间,使得表面亲水性在超疏水和超亲水范围内可调(图7);同时,通过细胞培养实验表明,超疏水表面几乎无细胞黏附,而亲水性的增强则有利于细胞黏附。这就为基于表面不同区域亲疏水性差异的微液滴阵列划分细胞培养微区提供了保障。Huang等^[45]设计了一种聚二甲基硅氧烷微流道芯片用于微液滴形成并分配至微孔阵列,并成功实现了细胞的接种、传代、药物刺激等操作,蠕动泵的应用使得操控液体的精确度可以达到5 nL,为高通量细胞实验的准确性提供了保证。Xi等^[46]在玻璃基底上涂覆了一层聚(N-异丙基丙烯酰胺),并通过掩膜版等离子体刻蚀形成图案化表面,将miRNA或者siRNA溶液打印在图案化表面位点上,即可形成微阵列。由于细胞在聚(N-异丙基丙烯酰胺)上难以生长,

而在玻璃表面生长良好,则当细胞悬浮液被整个涂敷于上述阵列时,细胞可以被限制在每个位点上。同时利用聚(N-异丙基丙烯酰胺)的温敏特性使得其可以被溶解消除,细胞可以自由移动,他们借此研究了miRNA参与细胞迁移调节的行为。Levkin等^[47]进一步发展了一种制备多类型细胞复杂图案的方法,证明了在亲水-超疏水图案化表面可控制多种不同细胞类型的空间排布及几何形状,且至少可以维持3 d。利用微量移液管将不同细胞悬浮液分别滴加到对应亲水区域,从而得到众多孤立的微型培养容器。液滴形状取决于亲水区域的几何形状,周围则被超疏水边界包围。实验证明,即使在较高的初始细胞浓度下,50 μm的超疏水边界就能够有效防止相邻液滴的融合和细胞的迁移,从而大大提高了平台的通量。

利用微量移液管向阵列上逐滴滴加液体的方式操作过于繁琐,对于实际应用意义不大。而针对添加同一种液体的情况,利用不连续去湿作用^[17],Levkin等^[7]提出了超高密度微液滴阵列的一步形成法:当在超疏水-超亲水图案化表面滑动液体或者将平台从液体中拉出时,由于超疏水和超亲水区域极端的浸润性差异,液膜将发生破裂,从而在超亲水区域形成众多具有特定几何形状的微液滴。这极大简化了微液滴阵列的加液操作,提高了实验的效率。同时,所形成的液滴的体积均一性好,能够满足绝大多数实验的要求。当在实验中需要同步添加不同的试剂时,他们^[48]提出了一种三明治法(图8A),通过将对应的化学物质文库阵列和接种有细胞的微液滴阵列如三明治般上下叠合,从而实现化学物质的转移添加。

为了进一步验证微液滴阵列对试剂和样品的低消耗,Levkin等^[50]制备了亲水区域为正方形的微液滴阵列。当正方形位点边长分别为1000、500、350 μm时,液滴体积分别为80、9和3 nL,相比于常用的384孔微孔板可节约600、5000和15 000倍的培养基和试剂。利用上述阵列,他们进行了反向细胞转染。他们 ^[49]也利用微液滴阵列进行了细胞转染增强剂的高通量筛选实验(图8B),研究了美国食品药品监督管理局批准的774种药物对CHO-K1、Jurkat和HEK293T三种类型细胞转染效率的影响。同时,该实验表明,相比于384孔微孔板,进行同样的实验,微液滴阵列对细胞和试剂的消耗可减少2500倍。Song等^[19]则成功制备了体积均一的皮升至飞升微液滴,并系统探究了超亲水图案尺寸、接触力以及相对滑动速度等因素对微液滴体积的影响。

此外,微液滴阵列还被用于小鼠胚胎干细胞和肿瘤干细胞的高通量筛选^[4,51]。例如,Levkin等^[5]在微液滴阵列上培养小鼠胚胎干细胞,发现其具有抑制小鼠胚胎干细胞分化的能力,且抑制作用可长达72 h,这为高通量培养和筛选小鼠胚胎干细胞提供了一种无需小鼠胚胎成纤维细胞的体系。而小鼠胚胎干细胞这种行为的差异性则是由聚合物表面特殊的微纳米拓扑结构导致的^[52]。Ying等^[51]利用微液滴阵列作为微型化筛选平台研究了珍贵肿瘤干细胞的抗药性。由于干细胞的数量往往极为稀少,为了能够在大量细胞混合样品中高效捕获这些稀有细胞,Fuchs等^[53]构建了链霉亲和素微图案的阵列平台,从而实现了在肿瘤病人血样中捕获生物素化抗体预标记的循环肿瘤细胞,并且通过选用不同抗体可实现对不同细胞的捕获。

3.2 3D细胞培养

细胞的某些特定组织性质往往与其特定的空间结构有关,而2D细胞培养最终得到的仅是一层细胞层,往往会导致这些组织性质的缺失。为了更好地研究细胞在体内的生长情况,3D细胞培养是十分必要的。而在不同的3D细胞培养方式中,悬滴法培养细胞可以有效避免细胞对培养皿的黏附,从而形成具有特定大小、细胞数和组成的球状体^[54⇓~56],被广泛用于胚胎干细胞^[57,58]、肿瘤细胞^[59]等的培养。如Zhang等^[60]设计并3D打印了一种与96和384孔板相匹配的悬滴托环装置,细胞悬浮液可以滴加到托环上并在托环内通孔的下部形成悬滴。他们证实了这套装置可用于3D肿瘤球状体的药物检测等操作。

Mano等^[29]在超疏水聚苯乙烯(PS)表面通过微压痕进行图案化,从而得到微液滴阵列(图9A)。由于毛细作用力,液滴会渗入微压痕中,从而被固定,即使表面翻转向下也不会滴落,实现悬滴法细胞培养。将细胞悬浮液阵列向下放置培养24 h,在微重力环境下液滴中的细胞发生聚集,并在液气界面处形成球状体,从而可在单个液滴中进行药物筛选实验。在另一项工作中,他们利用不同细胞初始浓度的悬浮液进行培养,获得了不同尺寸和密度的球状体(图9B)^[61]。

除了上述微压痕的方式,他们^[26]在超疏水PS表面制备亲水图案,借助不连续去湿作用,通过一步法形成微液滴阵列,这相比于传统的滴加法更加省时高效;并且在该工作中,他们在平台上不同位置进行打孔(图10A),方便了悬滴法培养中的后续加液取液操作。Levkin等^[62]同样利用微液滴阵列对肿瘤细胞进行了悬滴法培养,实现了肿瘤球状体的快速形成和高通量筛选。Zhao等^[28]利用具有天然超疏水表面的大闪蝶翅膀作为基底,在其上用水凝胶进行图案化来制备微液滴阵列,进而实现悬滴法培养3D细胞球状体(图10B)。这种方法充分利用了自然界原有的生物材料,而无需进行超疏水表面修饰。

水凝胶也是3D细胞培养的一种常用手段,可以为细胞提供较柔软的空间支撑,更好地模拟体内细胞微环境。Mano等^[24]将含有细胞的天然生物材料沉积到阵列的亲水位点上,离子交联得水凝胶,探究了不同材料组合对两种细胞类型的影响;并且利用细胞骨架和细胞核染色剂、荧光显微镜图像分析进行了局部非破坏性细胞毒性和细胞数目的测定,所得结果与传统破坏性测试结果相符。

Levkin等^[7]利用超亲水-超疏水图案化表面制得微液滴阵列,从而得到封装有活细胞的微凝胶阵列(图11A)。他们先利用不连续去湿作用将聚乙二醇交联剂沉积在超亲水位点上,在空气中干燥,再用同样的方法制备含有马来酰亚胺功能化的聚乙烯醇的细胞悬浮液阵列,经交联形成微凝胶阵列。这就将非黏附细胞固定在了每个微凝胶中,从而避免了非黏附细胞在后续介质交换等过程中被冲刷掉,有效促进了非黏附细胞的筛选。而除了上述将交联剂预先沉积到超亲水位点上实现后续交联操作的方式,他们^[63]也利用三明治法将两块微液滴阵列进行融合实现凝胶化,并且通过调换交联剂阵列与细胞悬浮液阵列的上下位置,可以实现水凝胶阵列与水凝胶自由粒子的转换。该工作中也成功制得了包含活细胞的磁性水凝胶颗粒。

Liu等^[13]提出了一种制备异质3D细胞微环境阵列的方法。先利用PDMS印章法制备图案化亲疏水表面,然后将水凝胶预聚物加到该表面上形成微液滴阵列,凝胶化后得到微凝胶阵列。由于微凝胶阵列仍保持亲水区域的亲水性,利用同样的方法,先后使用两种不同的细胞悬浮液进行凝胶化,即可进行不同细胞的层层组装(图11B);而利用微液滴融合的方式则可以进行两种细胞的并排组装(图11C)。利用该方法可对细胞微环境的形状、尺寸、化学物质浓度、细胞密度、多组分3D空间分布等进行调控,实现高通量筛选。这表明具有复杂3D微环境的微凝胶阵列在研究细胞间及细胞基质相互作用方面具有巨大的潜力。

此外,与水凝胶阵列类似,也可以通过冻干的方式在图案化阵列上制备多孔聚合物支架^[25]来实现细胞的3D培养。

3.3 单细胞分析

单细胞分析对于研究细胞的生长、分化、迁移机理等都有着十分重要的意义^[64,65]。而微液滴阵列可以在特定位置固定得到单个细胞,从而进行后续分析过程。

Fang等^[12]在化学修饰的硅片上制备了低密度的纳升液滴阵列,进行定量逆转录-聚合酶链式反应(PCR)检测,其每次检测的RNA最小输入量为1 pg,可实现单细胞尺度的基因定量。相比于商业仪器,该体系的检测敏感度与之相近,而动态范围则更大,可达到6个数量级。随后,他们^[66]对上述体系进一步完善,整合了单细胞封装、细胞裂解、逆转录和实时荧光检测的定量PCR等一系列操作(图12)。首先在硅片上利用光刻法和湿法刻蚀技术制备亲水位点^[12],然后将细胞悬浮液滴加到位点上得到含有细胞的微液滴阵列,并在其上覆盖一层矿物油以防止液滴蒸发;随后进行细胞计数和细胞热裂解,并添加逆转录混合物,将RNA转变为互补DNA;再加入PCR混合物进行扩增,并利用实时荧光PCR来定量基因表达水平。而为了在微液滴阵列中得到最高的单细胞占比,需要对细胞悬浮液的浓度及液滴体积进行优化。在实验中,当液滴体积为2 nL且细胞悬浮液浓度为5×10⁵个细胞/mL时,可得到最高的单细胞占比,为35%。实验中液体的操作均由液滴机器人在连续打印模式下完成,为了验证液体操作的精度和均一性,分别使用液滴机器人在连续打印模式下打印2 nL、18 nL和30 nL后得到10×10的阵列,测定其荧光强度图像,其相对标准偏差分别为2.68%、2.73%和2.67%,表明其液滴操作具有较高的精度和可靠性。此外,该芯片在数月内通过清洗可重复利用上百次,有效降低了实验成本。但由于其检测限相对较高,该体系仍需进一步优化。

在大多数单细胞基因组研究中,全基因组扩增是关键的步骤,然而这项技术对于某些基因组区域的优先放大会影响结果的可靠性,多重置换扩增能有效降低扩增偏倚,Hansen等^[67]将其与非接触打印技术结合,评估了在纳米体积液滴单细胞阵列内多重置换扩增技术的有效性。他们首先在玻璃基底表面旋涂上一层PDMS膜,其疏水性被特别调整以保证打印微液滴的固着和避免相互污染,通过有限稀释得到含有单细胞的液滴,并通过非接触打印仪打印到基底上,随后在打印微阵列上涂覆一层油膜以减少挥发。后续对于正常二倍体细胞和卵巢癌细胞的研究表明了多重置换扩增技术对于大量数据集测量的准确性。

Song等^[19]利用液滴分裂的方法在图案化超亲水-超疏水表面获得活的单细胞阵列。通过电化学刻蚀、化学气相沉积(CVD)和光刻法制得图案化超亲水-超疏水表面,在其上滑动含有细胞的培养基即可得到体积可控且均一性好的单细胞微液滴阵列。当滑动的人乳腺癌细胞(MCF7)培养基液滴体积为10 μL,浓度为10 ⁷个细胞/mL时,可在边长100 μm的超亲水图案表面得到单细胞阵列。细胞用吖啶橙、碘化丙啶(AO/PI)染色,在488 nm荧光下成绿色,在546 nm荧光下几乎不可见,表明单个活细胞成功分离。Fuchs等 ^[53]利用链霉亲和素微图案的微阵列平台也成功捕获了特定稀少的单一细胞,并进行了单细胞分析。

Levkin等^[68]利用有限稀释和改变细胞密度及接种时间的方式对不同亲水位点大小的微液滴阵列上单细胞的分布进行了优化(图13)。先将细胞悬浮液加到图案化的芯片表面,等待一定时间后将芯片倾斜除去多余液体,即可得到含有细胞的微液滴阵列。实验表明在超亲水位点大小为500 μm、接种时间为60 s、细胞浓度为4×10 ⁴个细胞/mL条件下可得到最高的单细胞占比,约20%。而通过对细胞存活率及倍增时间的测定可得到,在微液滴阵列上的单细胞存活率约为100%,其倍增时间与海拉细胞在传统培养条件下的倍增时间相近。

3.4 全机体筛选

细胞和组织在生理上是相互联系的,这种相互作用在某些性质和功能表达上起到十分重要的作用^[69]。因此,一些在细胞层面成功进行的实验,在全机体层面进行时就难以获得预期结果。为了解决这一问题,全机体高通量筛选得到了发展与研究。而在几种全机体模型中,如秀丽隐杆线虫、黑腹果蝇等,斑马鱼由于更接近人类且其胚胎具有光学透明的特点,在近几十年里引起了学者们广泛的研究。

Levkin等^[27]将微液滴阵列应用于微型化全机体筛选(图14)。通过在玻片表面制备甲基丙烯酸羟乙酯-二甲基丙烯酸乙酯共聚物(HEMA-EDMA)薄膜,并借助巯基-炔点击反应进行表面修饰获得图案化超疏水-超亲水表面^[18,50]。随后借助不连续去湿作用^[17],将斑马鱼胚胎分散到超亲水位点上,即可得到每个液滴中含有单个斑马鱼胚胎的微液滴阵列,从而直接在该阵列上研究了几种荧光标记肽的器官特异性和一定浓度范围的氯化锌及硝酸银细胞毒性,所得结果与标准微孔板的实验结果一致。

4 结论与展望

从上述一系列介绍中我们可以看到,微液滴阵列作为一种新兴的高通量平台,其微型化的特点大大节约了样品消耗,而其高通量的特点则大大提高了实验效率,因而在生物医用等领域具有极大的发展潜力。

但与此同时,在推进微液滴阵列的进一步应用中,依然存在不少挑战:对于表面化学驱动的微液滴阵列来说,其形成取决于表面亲疏水区域的浸润性差异,如何建立稳定重复的界面化学组成和拓扑结构的快速制备方法,是微液滴阵列大规模应用的瓶颈问题之一。虽然现有微液滴阵列技术可通过平行拖拽方法获得多个平行试样,但是,在高通量实验中所需的多变量控制,依然需要利用打印仪进行化合物文库的滴加或者梯度的构建,如何建立差异化和集成化的微液滴阵列技术,是进一步提高该平台变量控制能力的关键问题。在近期的一些工作中,国内外研究者采用包括梯度模板^[13]、光偶联剂裂解^[70]、溶剂交换^[71]等方式进行了差异化液滴快速构筑的探索。在这些研究基础上,对微液滴阵列的微型化、集成化和多功能化的发展将为构筑一个材料高通量实验平台提供崭新的可能。

参考文献

原文顺序 | 出版日期 | 本文引用

[1]	Huebner A, Sharma S, Srisa-Art M, Hollfelder F, Edel J B, de Mello A J. Lab a Chip, 2008, 8(8): 1244.

[2]	Jenssen T K, Lægreid A, Komorowski J, Hovig E. Nat. Genet., 2001, 28(1): 21.

[3]	Kansy M, Senner F, Gubernator K. J. Med. Chem., 1998, 41(7): 1007.

[4]	Tronser T, Popova A A, Levkin P A. Curr. Opin. Biotechnol., 2017, 46: 141.

[5]	Tronser T, Popova A A, Jaggy M, Bastmeyer M, Levkin P A. Adv. Healthcare Mater., 2017, 6(23): 1700622.

[6]	Feng W Q, Ueda E, Levkin P A. Adv. Mater., 2018, 30(20): 1706111.

[7]	Ueda E, Geyer F L, Nedashkivska V, Levkin P A. Lab a Chip, 2012, 12(24): 5218.

[8]	Xu J G, Huang M S, Wang H F, Fang Q. Anal. Chem., 2019, 91(16): 10757.

[9]	Lee H A, Ma Y F, Zhou F, Hong S, Lee H. Acc. Chem. Res., 2019, 52(3): 704.

[10]	Ren K F, Hu M, Zhang H, Li B C, Lei W X, Chen J Y, Chang H, Wang L M, Ji J. Prog. Polym. Sci., 2019, 92: 1.

[11]	Arumugam S, Popik V V. J. Am. Chem. Soc., 2011, 133(39): 15730.

[12]	Zhang Y X, Zhu Y, Yao B, Fang Q. Lab a Chip, 2011, 11(8): 1545.

[13]	Li Y W, Chen P, Wang Y C, Yan S Q, Feng X J, Du W, Koehler S A, Demirci U, Liu B F. Adv. Mater., 2016, 28(18): 3543.

[14]	Kuo C T, Wang J Y, Lu S R, Lai Y S, Chang H H, Hsieh J T, Wos A M, Chen B P C, Lu J H, Lee H. Sci. Rep., 2019, 9(1): 10120.

[15]	Wang J B, Zhou Y, Qiu H W, Huang H, Sun C H, Xi J Z, Huang Y Y. Lab a Chip, 2009, 9(13): 1831.

[16]	Geyer F L, Ueda E, Liebel U, Grau N, Levkin P A. Angew. Chem. Int. Ed., 2011, 50(36): 8424.

[17]	Jackman R J, Duffy D C, Ostuni E, Willmore N D, Whitesides G M. Anal. Chem., 1998, 70(11): 2280.

[18]	Feng W Q, Li L X, Ueda E, Li J S, Heißler S, Welle A, Trapp O, Levkin P A. Adv. Mater. Interfaces, 2014, 1(7): 1400269.

[19]	Li H Z, Yang Q, Li G N, Li M Z, Wang S T, Song Y L. ACS Appl. Mater. Interfaces, 2015, 7(17): 9060.

[20]	Liu M, Feng L P, Zhang X Y, Hua Y, Wan Y Q, Fan C, Lv X, Wang H. ACS Appl. Mater. Interfaces, 2018, 10(38): 32038.

[21]	Hwang S H, Lee J, Khang D Y. ACS Appl. Mater. Interfaces, 2019, 11(8): 8645.

[22]	Mu Q C, Wang S G, Li J P, Zhou L H, Li L Q, Chi L F, Wang W C. Appl. Phys. Lett., 2019, 114(18): 183702.

[23]	Lei W, Demir K, Overhage J, Grunze M, Schwartz T, Levkin P A. Adv. Biosys., 2020, 4(10): 2000073.

[24]	Salgado C L, Oliveira M B, Mano J F. Integr. Biol., 2012, 4(3): 318.

[25]	Oliveira M B, Salgado C L, Song W L, Mano J F. Small, 2013, 9(5): 768.

[26]	Oliveira M B, Neto A I, Correia C R, Rial-Hermida M I, Alvarez-Lorenzo C, Mano J F. ACS Appl. Mater. Interfaces, 2014, 6(12): 9488.

[27]	Popova A A, Marcato D, Peravali R, Wehl I, Schepers U, Levkin P A. Adv. Funct. Mater., 2018, 28(3): 1703486.

[28]	Shao C M, Liu Y X, Chi J J, Chen Z Y, Wang J, Zhao Y J. Langmuir, 2019, 35(10): 3832.

[29]	Neto A I, Correia C R, CustÓdio C A, Mano J F. Adv. Funct. Mater., 2014, 24(32): 5096.

[30]	Kulesa A, Kehe J, Hurtado J E, Tawde P, Blainey P C. PNAS, 2018, 115(26): 6685.

[31]	Zhang Y, Minagawa Y, Kizoe H, Miyazaki K, Iino R, Ueno H, Tabata K V, Shimane Y, Noji H. Sci. Adv., 2019, 5(8): eaav8185.

[32]	Lan C P, Zhou Z W, Ren H W, Park S, Lee S H. J. Mol. Liq., 2019, 283: 155.

[33]	Park D, Kang M, Choi J W, Paik S M, Ko J, Lee S, Lee Y, Son K, Ha J, Choi M, Park W, Kim H Y, Jeon N L. Lab a Chip, 2018, 18(14): 2013.

[34]	Song Y, Xu T, Xiu J, Zhang X. Biosens. Bioelectron., 2020, 149: 111845.

[35]	Liu X J, Gu H C, Ding H B, Du X, He Z Z, Sun L D, Liao J L, Xiao P F, Gu Z Z. Small, 2019, 15(35): 1902360.

[36]	Li Z, Huang Z D, Li F Y, Su M, Li H Z, Zhang Z Y, Wang Y L, Song Y L. ACS Appl. Mater. Interfaces, 2019, 11(19): 17960.

[37]	Nichols M K, Kumar R K, Bassindale P G, Tian L F, Barnes A C, Drinkwater B W, Patil A J, Mann S. Small, 2018, 14(26): 1800739.

[38]	Xu T L, Shi W X, Huang J R, Song Y C, Zhang F L, Xu L P, Zhang X J, Wang S T. ACS Nano, 2017, 11(1): 621.

[39]	KernallÉguen A, Steinhoff R, Bachler S, Dittrich P S, Saint-Marcoux F, El Bakhi S, Vorspan F, LÉonetti G, Lafitte D, PÉlissier-Alicot A L, Zenobi R. Anal. Chem., 2018, 90(3): 2302.

[40]	Zeng Y, Du X, Gao B B, Liu B, Xie Z Y, Gu Z Z. ACS Appl. Mater. Interfaces, 2018, 10(4): 4222.

[41]	Zhao T H, Parker R M, Williams C A, Lim K T P, Frka-Petesic B, Vignolini S. Adv. Funct. Mater., 2019, 29(21): 1804531.

[42]	Bao L, Pinchasik B E, Lei L, Xu Q W, Hao H, Wang X H, Zhang X H. ACS Appl. Mater. Interfaces, 2019, 11(30): 27386.

[43]	Gao M, Kuang M X, Li L H, Liu M J, Wang L B, Song Y L. Small, 2018, 14(19): 1870086.

[44]	Song W L, Veiga D D, CustÓdio C A, Mano J F. Adv. Mater., 2009, 21(18): 1830.

[45]	Zhou Y, Pang Y H, Huang Y Y. Anal. Chem., 2012, 84(5): 2576.

[46]	Zhang H S, Hao Y, Yang J Y, Zhou Y, Li J, Yin S Y, Sun C H, Ma M, Huang Y Y, Xi J J. Nat. Commun., 2011, 2: 554.

[47]	Efremov A N, Stanganello E, Welle A, Scholpp S, Levkin P A. Biomaterials, 2013, 34(7): 1757.

[48]	Popova A A, Schillo S M, Demir K, Ueda E, Nesterov-Mueller A, Levkin P A. Adv. Mater., 2015, 27(35): 5217.

[49]	Liu Y X, Tronser T, Peravali R, Reischl M, Levkin P A. Adv. Biosys., 2020, 4(3): 1900257.

[50]	Popova A A, Demir K, Hartanto T G, Schmitt E, Levkin P A. RSC Adv., 2016, 6(44): 38263.

[51]	Lee Y Y, Narayanan K, Gao S J, Ying J Y. Nano Today, 2012, 7(1): 29.

[52]	Jaggy M, Zhang P, Greiner A M, Autenrieth T J, Nedashkivska V, Efremov A N, Blattner C, Bastmeyer M, Levkin P A. Nano Lett., 2015, 15(10): 7146.

[53]	Brinkmann F, Hirtz M, Haller A, Gorges T M, Vellekoop M J, Riethdorf S, Müller V, Pantel K, Fuchs H. Sci. Rep., 2015, 5: 15342.

[54]	Breslin S, O’Driscoll L. Drug Discov. Today, 2013, 18(5/6): 240.

[55]	Lin R Z, Chang H Y. Biotechnol. J., 2008, 3(9/10): 1172.

[56]	Tung Y C, Hsiao A Y, Allen S G, Torisawa Y S, Ho M, Takayama S. Anal., 2011, 136(3): 473.

[57]	Moscona A. Exp. Cell Res., 1952, 3(3): 535.

[58]	Keller G M. Curr. Opin. Cell Biol., 1995, 7(6): 862.

[59]	Kelm J M, Timmins N E, Brown C J, Fussenegger M, Nielsen L K. Biotechnol. Bioeng., 2003, 83(2): 173.

[60]	Zhao L, Xiu J D, Liu Y, Zhang T Y, Pan W J, Zheng X N, Zhang X J. Sci. Rep., 2019, 9: 19717.

[61]	Neto A I, Correia C R, Oliveira M B, Rial-Hermida M I, Alvarez-Lorenzo C, Reis R L, Mano J F. Biomater. Sci., 2015, 3(4): 581.

[62]	Popova A A, Tronser T, Demir K, Haitz P, Kuodyte K, Starkuviene V, Wajda P, Levkin P A. Small, 2019, 15(25): 1901299.

[63]	Neto A I, Demir K, Popova A A, Oliveira M B, Mano J F, Levkin P A. Adv. Mater., 2016, 28(35): 7613.

[64]	Svahn H A, van den Berg A. Lab a Chip, 2007, 7(7/5): 544.

[65]	Kawasaki E S. Ann. N Y Acad. Sci., 2004, 1020(1): 92.

[66]	Zhu Y, Zhang Y X, Liu W W, Ma Y, Fang Q, Yao B. Sci. Rep., 2015, 5: 9551.

[67]	Leung K, Klaus A, Lin B K, Laks E, Biele J, Lai D, Bashashati A, Huang Y F, Aniba R, Moksa M, Steif A, Mes-Masson A M, Hirst M, Shah S P, Aparicio S, Hansen C L. PNAS, 2016, 113(30): 8484.

[68]	Jogia G, Tronser T, Popova A, Levkin P. Microarrays, 2016, 5(4): 28.

[69]	Giacomotto J, SÉgalat L. Br. J. Pharmacol., 2010, 160(2): 204.

[70]	Brehm M, Heissler S, Afonin S, Levkin P A. Small, 2020, 16(10): 1905971.

[71]	Li M S, Yu H T, Bao L, Dyett B, Zhang X H. J. Colloid Interface Sci., 2019, 543: 164.

[1]	Huebner A, Sharma S, Srisa-Art M, Hollfelder F, Edel J B, de Mello A J. Lab a Chip, 2008, 8(8): 1244.
[2]	Jenssen T K, L?greid A, Komorowski J, Hovig E. Nat. Genet., 2001, 28(1): 21.
[3]	Kansy M, Senner F, Gubernator K. J. Med. Chem., 1998, 41(7): 1007.
[4]	Tronser T, Popova A A, Levkin P A. Curr. Opin. Biotechnol., 2017, 46: 141.
[5]	Tronser T, Popova A A, Jaggy M, Bastmeyer M, Levkin P A. Adv. Healthcare Mater., 2017, 6(23): 1700622.
[6]	Feng W Q, Ueda E, Levkin P A. Adv. Mater., 2018, 30(20): 1706111.
[7]	Ueda E, Geyer F L, Nedashkivska V, Levkin P A. Lab a Chip, 2012, 12(24): 5218.
[8]	Xu J G, Huang M S, Wang H F, Fang Q. Anal. Chem., 2019, 91(16): 10757.
[9]	Lee H A, Ma Y F, Zhou F, Hong S, Lee H. Acc. Chem. Res., 2019, 52(3): 704.
[10]	Ren K F, Hu M, Zhang H, Li B C, Lei W X, Chen J Y, Chang H, Wang L M, Ji J. Prog. Polym. Sci., 2019, 92: 1.
[11]	Arumugam S, Popik V V. J. Am. Chem. Soc., 2011, 133(39): 15730.
[12]	Zhang Y X, Zhu Y, Yao B, Fang Q. Lab a Chip, 2011, 11(8): 1545.
[13]	Li Y W, Chen P, Wang Y C, Yan S Q, Feng X J, Du W, Koehler S A, Demirci U, Liu B F. Adv. Mater., 2016, 28(18): 3543.
[14]	Kuo C T, Wang J Y, Lu S R, Lai Y S, Chang H H, Hsieh J T, Wos A M, Chen B P C, Lu J H, Lee H. Sci. Rep., 2019, 9(1): 10120.
[15]	Wang J B, Zhou Y, Qiu H W, Huang H, Sun C H, Xi J Z, Huang Y Y. Lab a Chip, 2009, 9(13): 1831.
[16]	Geyer F L, Ueda E, Liebel U, Grau N, Levkin P A. Angew. Chem. Int. Ed., 2011, 50(36): 8424.
[17]	Jackman R J, Duffy D C, Ostuni E, Willmore N D, Whitesides G M. Anal. Chem., 1998, 70(11): 2280.
[18]	Feng W Q, Li L X, Ueda E, Li J S, Hei?ler S, Welle A, Trapp O, Levkin P A. Adv. Mater. Interfaces, 2014, 1(7): 1400269.
[19]	Li H Z, Yang Q, Li G N, Li M Z, Wang S T, Song Y L. ACS Appl. Mater. Interfaces, 2015, 7(17): 9060.
[20]	Liu M, Feng L P, Zhang X Y, Hua Y, Wan Y Q, Fan C, Lv X, Wang H. ACS Appl. Mater. Interfaces, 2018, 10(38): 32038.
[21]	Hwang S H, Lee J, Khang D Y. ACS Appl. Mater. Interfaces, 2019, 11(8): 8645.
[22]	Mu Q C, Wang S G, Li J P, Zhou L H, Li L Q, Chi L F, Wang W C. Appl. Phys. Lett., 2019, 114(18): 183702.
[23]	Lei W, Demir K, Overhage J, Grunze M, Schwartz T, Levkin P A. Adv. Biosys., 2020, 4(10): 2000073.
[24]	Salgado C L, Oliveira M B, Mano J F. Integr. Biol., 2012, 4(3): 318.
[25]	Oliveira M B, Salgado C L, Song W L, Mano J F. Small, 2013, 9(5): 768.
[26]	Oliveira M B, Neto A I, Correia C R, Rial-Hermida M I, Alvarez-Lorenzo C, Mano J F. ACS Appl. Mater. Interfaces, 2014, 6(12): 9488.
[27]	Popova A A, Marcato D, Peravali R, Wehl I, Schepers U, Levkin P A. Adv. Funct. Mater., 2018, 28(3): 1703486.
[28]	Shao C M, Liu Y X, Chi J J, Chen Z Y, Wang J, Zhao Y J. Langmuir, 2019, 35(10): 3832.
[29]	Neto A I, Correia C R, Custódio C A, Mano J F. Adv. Funct. Mater., 2014, 24(32): 5096.
[30]	Kulesa A, Kehe J, Hurtado J E, Tawde P, Blainey P C. PNAS, 2018, 115(26): 6685.
[31]	Zhang Y, Minagawa Y, Kizoe H, Miyazaki K, Iino R, Ueno H, Tabata K V, Shimane Y, Noji H. Sci. Adv., 2019, 5(8): eaav8185.
[32]	Lan C P, Zhou Z W, Ren H W, Park S, Lee S H. J. Mol. Liq., 2019, 283: 155.
[33]	Park D, Kang M, Choi J W, Paik S M, Ko J, Lee S, Lee Y, Son K, Ha J, Choi M, Park W, Kim H Y, Jeon N L. Lab a Chip, 2018, 18(14): 2013.
[34]	Song Y, Xu T, Xiu J, Zhang X. Biosens. Bioelectron., 2020, 149: 111845.
[35]	Liu X J, Gu H C, Ding H B, Du X, He Z Z, Sun L D, Liao J L, Xiao P F, Gu Z Z. Small, 2019, 15(35): 1902360.
[36]	Li Z, Huang Z D, Li F Y, Su M, Li H Z, Zhang Z Y, Wang Y L, Song Y L. ACS Appl. Mater. Interfaces, 2019, 11(19): 17960.
[37]	Nichols M K, Kumar R K, Bassindale P G, Tian L F, Barnes A C, Drinkwater B W, Patil A J, Mann S. Small, 2018, 14(26): 1800739.
[38]	Xu T L, Shi W X, Huang J R, Song Y C, Zhang F L, Xu L P, Zhang X J, Wang S T. ACS Nano, 2017, 11(1): 621.
[39]	Kernalléguen A, Steinhoff R, Bachler S, Dittrich P S, Saint-Marcoux F, El Bakhi S, Vorspan F, Léonetti G, Lafitte D, Pélissier-Alicot A L, Zenobi R. Anal. Chem., 2018, 90(3): 2302.
[40]	Zeng Y, Du X, Gao B B, Liu B, Xie Z Y, Gu Z Z. ACS Appl. Mater. Interfaces, 2018, 10(4): 4222.
[41]	Zhao T H, Parker R M, Williams C A, Lim K T P, Frka-Petesic B, Vignolini S. Adv. Funct. Mater., 2019, 29(21): 1804531.
[42]	Bao L, Pinchasik B E, Lei L, Xu Q W, Hao H, Wang X H, Zhang X H. ACS Appl. Mater. Interfaces, 2019, 11(30): 27386.
[43]	Gao M, Kuang M X, Li L H, Liu M J, Wang L B, Song Y L. Small, 2018, 14(19): 1870086.
[44]	Song W L, Veiga D D, Custódio C A, Mano J F. Adv. Mater., 2009, 21(18): 1830.
[45]	Zhou Y, Pang Y H, Huang Y Y. Anal. Chem., 2012, 84(5): 2576.
[46]	Zhang H S, Hao Y, Yang J Y, Zhou Y, Li J, Yin S Y, Sun C H, Ma M, Huang Y Y, Xi J J. Nat. Commun., 2011, 2: 554.
[47]	Efremov A N, Stanganello E, Welle A, Scholpp S, Levkin P A. Biomaterials, 2013, 34(7): 1757.
[48]	Popova A A, Schillo S M, Demir K, Ueda E, Nesterov-Mueller A, Levkin P A. Adv. Mater., 2015, 27(35): 5217.
[49]	Liu Y X, Tronser T, Peravali R, Reischl M, Levkin P A. Adv. Biosys., 2020, 4(3): 1900257.
[50]	Popova A A, Demir K, Hartanto T G, Schmitt E, Levkin P A. RSC Adv., 2016, 6(44): 38263.
[51]	Lee Y Y, Narayanan K, Gao S J, Ying J Y. Nano Today, 2012, 7(1): 29.
[52]	Jaggy M, Zhang P, Greiner A M, Autenrieth T J, Nedashkivska V, Efremov A N, Blattner C, Bastmeyer M, Levkin P A. Nano Lett., 2015, 15(10): 7146.
[53]	Brinkmann F, Hirtz M, Haller A, Gorges T M, Vellekoop M J, Riethdorf S, Müller V, Pantel K, Fuchs H. Sci. Rep., 2015, 5: 15342.
[54]	Breslin S, O’Driscoll L. Drug Discov. Today, 2013, 18(5/6): 240.
[55]	Lin R Z, Chang H Y. Biotechnol. J., 2008, 3(9/10): 1172.
[56]	Tung Y C, Hsiao A Y, Allen S G, Torisawa Y S, Ho M, Takayama S. Anal., 2011, 136(3): 473.
[57]	Moscona A. Exp. Cell Res., 1952, 3(3): 535.
[58]	Keller G M. Curr. Opin. Cell Biol., 1995, 7(6): 862.
[59]	Kelm J M, Timmins N E, Brown C J, Fussenegger M, Nielsen L K. Biotechnol. Bioeng., 2003, 83(2): 173.
[60]	Zhao L, Xiu J D, Liu Y, Zhang T Y, Pan W J, Zheng X N, Zhang X J. Sci. Rep., 2019, 9: 19717.
[61]	Neto A I, Correia C R, Oliveira M B, Rial-Hermida M I, Alvarez-Lorenzo C, Reis R L, Mano J F. Biomater. Sci., 2015, 3(4): 581.
[62]	Popova A A, Tronser T, Demir K, Haitz P, Kuodyte K, Starkuviene V, Wajda P, Levkin P A. Small, 2019, 15(25): 1901299.
[63]	Neto A I, Demir K, Popova A A, Oliveira M B, Mano J F, Levkin P A. Adv. Mater., 2016, 28(35): 7613.
[64]	Svahn H A, van den Berg A. Lab a Chip, 2007, 7(7/5): 544.
[65]	Kawasaki E S. Ann. N Y Acad. Sci., 2004, 1020(1): 92.
[66]	Zhu Y, Zhang Y X, Liu W W, Ma Y, Fang Q, Yao B. Sci. Rep., 2015, 5: 9551.
[67]	Leung K, Klaus A, Lin B K, Laks E, Biele J, Lai D, Bashashati A, Huang Y F, Aniba R, Moksa M, Steif A, Mes-Masson A M, Hirst M, Shah S P, Aparicio S, Hansen C L. PNAS, 2016, 113(30): 8484.
[68]	Jogia G, Tronser T, Popova A, Levkin P. Microarrays, 2016, 5(4): 28.
[69]	Giacomotto J, Ségalat L. Br. J. Pharmacol., 2010, 160(2): 204.
[70]	Brehm M, Heissler S, Afonin S, Levkin P A. Small, 2020, 16(10): 1905971.
[71]	Li M S, Yu H T, Bao L, Dyett B, Zhang X H. J. Colloid Interface Sci., 2019, 543: 164.