浓度梯度微流控芯片在药物筛选中的应用

张芳娟; 刘海兵; 高梦琪; 王德富; 牛颜冰; 申少斐

doi:10.7536/PC200717

化学进展 ›› 2021, Vol. 33 ›› Issue (7) :1138-1151 DOI: 10.7536/PC200717

综述

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浓度梯度微流控芯片在药物筛选中的应用

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Concentration-Gradient Microfluidic Chips for Drug Screening

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摘要

微流控芯片技术作为21世纪极具代表性的微型分析平台技术之一,以其试剂消耗低、分析微型化、可集成化、易于控制、自动化和良好的生物相容性等优点而成为研究热点,在生物、医学、食品和环境等多个领域都有杰出表现,尤其是药物筛选领域。其中备受关注的浓度梯度微流控芯片更是取得了显著成果。本文综述了近年来用于药物筛选的浓度梯度纸基芯片、浓度梯度水凝胶芯片、浓度梯度液滴芯片、浓度梯度聚二甲基硅氧烷(PDMS)芯片的研究进展;同时对浓度梯度微流控芯片在单细胞分析、组合药物筛选、三维(3D)细胞培养和细胞微环境模拟等方面的应用及优缺点进行了阐述,并在此基础上对其发展前景进行了展望。

Abstract

Microfluidic chip is one of the most representative technologies of micro-analysis platform in this century. It has many advantages such as low reagent consumption, analytical miniaturization, easy control and integration, high automation and good biological compatibility. It has outstanding performances in many fields such as biology, medicine, food and environment, especially in the field of drug screening which has achieved a series of achievements with its own advantages. This article summarizes the research progress of concentration gradient microfluidic chips for drug screening in recent years, including paper chip, hydrogel chip, droplet chip and polydimethylsiloxane (PDMS) chip. Furthermore, the advantages and disadvantages of concentration gradient microfluidic chip in single cell analysis, combination drug screening, three-dimensional (3D) cell culture, cell microenvironment simulation are described. Finally, we provide a perspective for its application prospects.

Contents

1 Introduction

2 Characteristics of concentration-gradient microfluidic chip

3 Type of concentration-gradient microfluidic chip

3.1 Paper chip

3.2 Hydrogel chip

3.3 Droplet chip

3.4 PDMS chip

4 Application of concentration-gradient microfluidic chip

4.1 Single cell analysis

4.2 Combination drug screening

4.3 3D cell cultures

4.4 Simulated cell microenvironment

5 Conclusion and outlook

Graphical abstract

关键词

微流控芯片 / 浓度梯度 / 药物筛选

Key words

microfluidic chip / concentration gradient / drug screening

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张芳娟, 刘海兵, 高梦琪, 王德富, 牛颜冰, 申少斐. 浓度梯度微流控芯片在药物筛选中的应用[J]. 化学进展, 2021, 33(7): 1138-1151 DOI:10.7536/PC200717

Fangjuan Zhang, Haibing Liu, Mengqi Gao, Defu Wang, Yanbing Niu, Shaofei Shen. Concentration-Gradient Microfluidic Chips for Drug Screening[J]. Progress in Chemistry, 2021, 33(7): 1138-1151 DOI:10.7536/PC200717

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1 引言

基因测序技术和蛋白质组测序技术为了解各种生物过程和疾病机制打开了新的大门^[1]。药物开发领域的快速发展,能够有效帮助人类预防感染和治疗疾病,同时有利于医疗成本的大幅降低^[2]。然而,在药物筛选领域,传统方法面临诸多挑战,传统的药物筛选主要通过多孔板和培养皿等进行,这些方法需要耗费过多的时间和人力成本。同时,由于细胞培养是在半静态环境中进行,所以不能准确地模拟细胞微环境。动物模型在药物筛选和开发中起着至关重要的作用,但出于伦理方面的考虑,科学界正在减少动物在实验中的使用。更严重的是,由于平台等限制因素,筛选出的候选药物在临床试验中的失败现象极大地降低了药物开发的效率。因此,关于高效药物筛选平台的研究备受关注。

微流控芯片技术,是一种微流体界面精确操作技术,由瑞士科学家Manz和Widmer于20世纪90年代初提出,同时也是21世纪极具代表性的微型分析技术平台之一^[3]。相对于传统分析技术而言,微流控芯片是一个一“微”而“全”的分析技术平台,同时它又具有操作简单、省时和高效等优点。近年来,作为当前微全分析系统发展的重点,微流控芯片技术的应用已涉及多学科交叉研究领域,在生物/医学研究、生物模拟、有机合成、疾病诊断、药物筛选和环境监测等方面均有杰出表现^[4⇓~6]。在微流控芯片的研究系统中,浓度梯度微流控芯片是生物研究中最重要的组成部分之一。浓度梯度微流控芯片可以同时产生各种浓度梯度,而无需手动移液构建浓度梯度^[7]。药物筛选和治疗优化等通常需要研究不同药物浓度下的剂量依赖性细胞反应,因此,浓度梯度微流控芯片成为这一领域的有力工具。浓度梯度微流控芯片可以定量、大规模地评估不同药物的毒性和最佳作用浓度,不但可以提高吞吐量、降低实验成本,而且可以快速、精确地控制和互作,具有更高的梯度分辨率。

结合本课题组前期在微流控芯片领域的研究经验^{[8⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓~16]},本文综述了基于浓度梯度微流控芯片在药物筛选领域的最新研究进展,对不同类型的浓度梯度微流控芯片进行阐述,主要包括纸基微流控芯片、水凝胶微流控芯片、液滴微流控芯片和聚二甲基硅氧烷(PDMS)微流控芯片,同时对浓度梯度微流控芯片在单细胞分析、组合药物筛选、三维(3D)细胞培养和细胞微环境模拟等方面的应用进行了阐述,在此基础上,对浓度梯度微流控芯片的发展前景进行了展望。

2 浓度梯度微流控芯片特点

传统的药物浓度梯度实验主要在多孔板上进行,这种方式不仅需要繁琐和重复的步骤,而且需要投入过多的时间和精力。随着微流控技术的进步和微流控芯片在生物学研究中的广泛应用,基于微流控芯片的浓度梯度发生器正在蓬勃发展,浓度梯度微流控芯片以其试剂消耗低、易于控制和自动化等优点而备受关注,并被广泛应用于药物筛选领域^{[17⇓⇓~20]}。同时,与宏观尺度系统相比,微流控装置微尺度的特点可以有效减少化学试剂和贵重药物的使用量,并且可以通过提供灵活的药物浓度调节产生精确的浓度梯度。另外,一系列的浓度可以在一个系统中的不同反应室中同时产生,使得生物和化学反应可以在不同药物浓度下同时进行,在此情况下,每个反应室都是一个研究系统,能够同时研究不同浓度药物对细胞的影响^[21,22]。浓度梯度微流控芯片所获得的梯度是可预测和可重复的,同时又是可控制和定量的。除此之外,浓度梯度微流控芯片在速度、成本、样品/试剂消耗、污染、效率和自动化等方面都展示出了巨大优势,有着广泛的应用前景。

3 浓度梯度微流控芯片类型

3.1 纸基微流控芯片

纸基微流控芯片设备是最有前途的医疗点测试平台之一,与基于平版印刷的微流控芯片相比,纸基微流控芯片设备具有便携性、可吸收性、可处置性和低成本性的优点,并且操作过程中无需像传统液体设备那样使用精密的泵或阀门^[23]。此外,纸是一种由纤维素制成的多孔基质,在吸液方面非常出色,当纸的某些区域疏水性改性时,应用于纸的水溶液将被毛细管效应精确地引导穿过亲水性区域。纸基微流控芯片设备在便携式和低成本分析中具有广阔的应用前景,特别是在基于生物测定的个性化医疗保健、护理诊断和药物筛选方面显示出巨大潜力^[24]。

Liu等^[25]开发了一种简单的3D打印纸基微流控平台。该平台在芯片装置的顶层和底层分别设计了可以持续产生浓度梯度的“圣诞树”结构和用于药物筛选研究的纸基芯片细胞培养区。如图1A所示,两层结构使浓度梯度形成层与细胞培养层分离,简化了细胞在微流控芯片中的培养,其支架可以保护细胞免受连续液体流动的剪切力的影响,便于细胞培养和后续检测。随后,通过该纸基微流控平台研究H₂S对人肝癌细胞(SMMC-7721)的作用情况。结果表明,H₂S进入癌细胞后,与细胞内的NO相互作用,形成具有生物活性的中间多硫化物,使癌细胞发生一系列生理变化,最终导致细胞发生凋亡。这种新型的3D打印纸基微流控平台在细胞研究和药物筛选中具有广泛的应用前景。如图1B所示,Wu等^[26]提出了一种简单、低成本的纸基微流控芯片连续灌注装置(μPAD)。该平台主要由供液装置和吸收装置两部分组成。将人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)接种于μPAD的9个细胞培养区,通过灌注装置将紫杉醇药液灌注到μPAD中,利用连续灌注装置可同时在一个μPAD中形成不同浓度的紫杉醇药液,将其作用于细胞培养区的细胞。实验结果表明,不同浓度的紫杉醇药液处理过的细胞,其细胞活力存在较大差异。该装置作为一种轻量级且基于生物流体的微流控平台,可应用于细胞培养和药物筛选等生物学和医学领域。

此外,Hong等^[27]设计了一个纸基浓度梯度产生器,通过纸纤维扩散产生一系列不同浓度的阿霉素,作用于培养在微阵列中的人宫颈癌细胞(HeLa)。结果表明,将HeLa细胞于药物中培养8 h后,药物抑制效率与药物浓度呈正相关。这种结合了纸基微流控芯片和细胞培养阵列的设备展现出在药物开发和高通量药物筛选方面的潜力。Chen等^[28]设计了一种用于细胞培养和药物筛选的纸基微流控芯片装置,在纸基微流控芯片上培养人肝癌细胞(HepG2)24 h后,使用不同浓度的药液(环磷酰胺)孵育黏附的HepG2细胞24 h。数据显示,当药物浓度增大时,细胞死亡率呈上升趋势。该结果表明,这种纸芯片装置可作为一种高效、廉价和高通量的细胞药物筛选工具。Ge等^[29]通过在纸基片上设计微孔,开发了一个简单的高通量药物筛选平台。为了验证药物筛选的可行性,选用了两种人肝癌细胞(Huh7和HepG2)和阿霉素、依托泊苷两种药物。在纸基质中培养Huh7细胞和HepG2细胞,使用不同浓度的阿霉素和依托泊苷作用于两种细胞,并绘制了不同细胞系和药物组合的剂量-反应曲线。实验结果表明,Huh7细胞的耐药率高于HepG2细胞,阿霉素治疗肝癌的疗效优于依托泊苷。该装置为细胞的药敏性研究以及药物筛选提供了一个定量、简便和高通量的平台。

纸作为微流控芯片设计最便宜的材料之一,制造成本低,而且容易堆叠形成多层微流控通道。然而,挑战同样存在,由于纸具有低表面张力,液体无法很好地限制在疏水性通道内,而且明渠中的液体容易挥发,导致样品发生渗漏以及样品的利用率降低;与此同时,纸基微流控芯片的检测灵敏度往往不是很高,无法实现高精确度的检测。

3.2 水凝胶微流控芯片

细胞微环境由细胞外基质(ECM)、邻近细胞和可溶性因子组成。ECM为细胞提供机械支持和化学刺激,引导细胞增殖、迁移、分化和凋亡,ECM还含有可溶性大分子,如生长因子、趋化因子和细胞因子^[30,31]。因此,在体外构建梯度发生器时,复制体内细胞微环境是非常重要的。水凝胶基质具有多孔性和孔径可控性,能够模拟细胞外基质的特征,在细胞培养过程中有效吸收水分,还对气体、营养物质、蛋白质和信号分子具有渗透性^[32,33]。基于水凝胶的微流控梯度发生器提供了比传统方法更高精度、定量和时空梯度控制水平,可以大大提高人们对多种生物现象的理解。

细胞外基质不仅对细胞的结构起支持作用,而且在胚胎发育、成年期、伤口愈合和组织修复过程的不同生物学过程中对细胞的引导都很重要。细胞外基质由嵌入可溶性和基质结合的生物活性分子(生长因子、细胞因子、激素、营养、气体等)的支架大分子组成,因此,在生物材料中实现可溶或共价附着的细胞导向线索对生物材料的研究和生产提出了很大的挑战,而水凝胶被认为是天然细胞外基质的合成替代品,因为其具有3D固体支撑、纤维结构、气体和营养渗透性等关键功能,并允许生物活性分子的储存和释放。如图2(a)所示,水凝胶3D梯度能够提供可溶性的指导线索,允许细胞在顶部或3D水凝胶基质内培养,并且水凝胶基质含有共价固定的生长因子梯度或引导细胞的特异性黏附序列,有利于研究细胞在3D环境中的排列和迁移情况^[34]。Ladet等^[35]提出了一种基于双亲性聚合物的物理水凝胶材料加工方法,壳聚糖具有生物降解性、生物活性和生物相容性,是一种双亲性天然共聚物,其乙酰化残基和去乙酰化残基的相对比例在亲水和疏水相互作用之间起着重要的平衡作用,在细胞增殖和组织再生中也具有重要作用。他们提出了基于壳聚糖水凝胶的洋葱状多膜生物材料,并研究了不同浓度氢氧化钠(NaOH)水溶液的中和步骤以及凝胶中和过程中壳聚糖质量分数随中和液中NaOH浓度的变化。这种方法大大简化了复杂形状和多膜结构凝胶的处理,具有潜在的生物医学应用。此外,He等^[36]开发了一种快速简单的基于水凝胶的微流控化学浓度梯度产生方法。该方法通过集成便携式微流控操作和光聚合,能够快速、简便地生成具有连续变化的浓度梯度,并且所制得的水凝胶具有一定的细胞黏附性和孔隙率,有望成为广泛的生物和组织工程应用的有力工具。如图2(b)所示,Hu等^[37]开发了一种用于高通量药物筛选的浓度梯度水凝胶阵列微流控装置。将人类单核白血病细胞(THP-1)聚集成数百个大小可控的多细胞团。用选择性区域曝光法代替连续的块状材料,获得了药物浓度梯度下含有细胞团簇的光敏明胶-甲基丙烯酰(GelMA)水凝胶柱阵列。结果表明,细胞聚集活性与水凝胶柱中药物浓度成反比,对药物毒性的敏感性低于单层培养细胞。三维多细胞阵列提供了许多体外肿瘤模型,可直接用于下游药物测试。这种技术继承了声学组装的优点,同时具有更灵活、更实用和高通量的优点。Mahadik等^[38]描述了一种基于微流体-流体混合平台在反梯度水凝胶中重复创造包含造血干细胞(HSC)和一个或多个假定的小生境细胞的异质微环境的方法。如图2(c)所示,该方法基于HSC生态位的启发,创建包含细胞和基质成分重叠模式的小体积三维水凝胶结构。用多种分析方法在多尺度(单细胞到整体结构)验证了多梯度水凝胶的有效性。通过三种不同的分析方法来描述这些水凝胶在多个尺度上的局部特性:(1)整体结构荧光分析;(2)结构内单个细胞的多光子成像;(3)从水凝胶培养后的离散亚区提取。该系统在一个单一的、光学半透明的三维生物材料中创建形成一系列稳定梯度,从而能够进行关于微环境信号如何影响细胞命运的研究,还可以促进细胞体外扩增培养平台的优化。Liu等^[39]报道了一种利用多向水凝胶屏障同时建立多生化线索梯度的微流控平台,用于研究轴突的吸引和排斥反应整合。如图2(d)所示,该平台通过执行片上仿生神经元培养,控制多梯度浓度分布研究轴突的吸引和排斥反应整合,可用于神经发育、药物开发筛选和损伤组织修复等多方面的研究分析。

水凝胶通常具有生物相容性,类似于胞外基质,在水凝胶中可以建立微通道进行溶液输送和细胞培养等。但由于水凝胶固有的低密度和低强度缺陷,导致水凝胶在微米级尺度加工的分辨率比其他聚合物(纳米级尺度)的分辨率更低,影响芯片内部通道的精确构建。此外,包裹细胞的水凝胶常与一些微加工工艺产生不兼容现象,影响微装置的制备。

3.3 液滴微流控芯片

液滴微流控技术近年来备受关注,是因为其提供了一种制备单分散液滴的方法,当加入化学或生物试剂时,液滴可用作单独的微型反应器。同时,液滴微流控技术还具有分室化、低污染、低分散、快速混合、低试剂消耗和低交叉污染等优点,显示出巨大的分析检测潜力,微尺度的模块化操作优势有利于样品制备和分离,通过模板化操作,更多的分析和检测均可以更好地被集成化^[40,41]。

Song等^[42]提出了一种独特的微流控系统,可以在毫秒尺度范围内控制多种化学反应。如图3(a)所示,它能够控制每个反应开始的时间、分离或与其他反应结合之前的发展时间,以及每个反应何时被分析或终止的时间。微流控通道内形成的液滴可以作为微反应器,在含有试剂A、试剂B和含有缓冲液的分离流液滴中进行反应,并且液滴能够通过微通道进行传输。该系统实现了毫秒级的混合和传输,有利于对化学分析和合成以及复杂反应网络的研究。Rotman^[43]通过简单地将极稀的β-D-半乳糖苷酶水溶液分散到油滴中并用荧光显微镜测量转化率来研究液滴中的单酶动力学。使用常规技术形成的液滴远远没有利用微流控平台形成的液滴均匀统一。这种基于微流控平台制备单分散液滴进行单酶动力学分析可用于生物和化学等实验研究。此外,如图3(b)所示,Sun等^[44]提出了一种基于独特物理原理的梯度生成方法,通过连续提取片上样品,使样品与塞子内的水混合,然后将梯度塞破碎成化学性质不同的液滴,在长移动的塞子中产生浓度梯度。它可以产生包含单个液滴之间化学浓度变化的移动液滴阵列。该方法具有以下显著优点:(1)浓度的稀释范围可以通过各种控制参数(包括塞流速度、固定液滴和移动塞的体积)来调节,从而更具灵活性;(2)一步可提供多个稀释塞,从而实现对原始样品的无限稀释;(3)具有较高的吞吐量和精细的分辨率,每小时至少产生6500个10 nL的液滴;(4)能够替换预先存储的样品滴并进行连续稀释,从而实现筛选多个目标。该方法具有装载、更换和稀释芯片上多个样品的能力,有效实现了浓度梯度的快速生成和梯度范围的动态控制,可以进行高通量和高分辨率筛选。再者,Cai等^[45]描述了一种如图3(c)所示的基于微流控液滴的酶抑制分析梯度发生器,通过将流动注射梯度技术与液滴微流控技术相结合,生成具有浓度梯度的液滴阵列,采用无阀流动注射分析模式,自动向芯片内注入纳米级样品溶液。在2.5 min的分析时间内,可进行240多个不同抑制剂浓度的液滴酶抑制反应,与多孔平板筛选系统相比,抑制剂用量减少了1000倍,该设备以极低的样品消耗,生成了大规模浓度梯度,展示了在高通量药物筛选中的潜力。

液滴微流控芯片的主要特点是能够产生单分散的液滴。这种单分散的液滴可以作为单独的微型反应器,具有体积小、低扩散和交叉污染低等特点。但液滴微流控芯片也存在一些缺点,例如操作难度较大、形成的液滴不稳定、水性液滴容易蒸发和液滴分选困难等。

3.4 PDMS微流控芯片

聚合物芯片是在硅/玻璃芯片之后几年推出的。高分子材料种类繁多,在选择具有特定性能的材料时具有很大的灵活性,与无机材料相比,高分子材料容易获得,价格低廉,已成为最常用的微芯片材料。微流体中最流行的弹性体是聚二甲基硅氧烷(PDMS),PDMS的优点是易于微加工和低成本。此外,PDMS还具有高弹性和透气性的特性,这对密封微通道中的细胞长期培养至关重要,其表面也与细胞培养相容。同时与传统的培养皿相比,PDMS芯片在进行细胞培养时能够提供更加可控的微环境^{[46⇓⇓⇓~50]}。

如图4(a)所示,本课题组^[16]使用PDMS构建了一种双重浓度梯度结构。该结构能够同时形成对称的9组浓度梯度,用于研究抗肿瘤药物紫杉醇对肿瘤细胞(MCF-7和HepG2)的作用。该装置减少了细胞培养过程中的环境干扰,系统定量地研究了基于独特双螺旋混合器的浓度梯度的形成,实现了同时评价紫杉醇对两种肿瘤细胞株的作用效果,并对不同剂量药物作用24 h后两种肿瘤细胞的活性进行实时观察和分析。该装置可以降低操作的复杂性,从而为建立浓度梯度相关生化研究中的低成本实验室芯片平台奠定基础。此外,如图4(b)所示,Gómez-Sjoberg等^[51]建立了一种基于PDMS芯片的全自动细胞培养筛选系统,定量分析了短暂刺激对人原代间充质干细胞增殖、成骨分化以及运动的影响。该装置实现了96个独立培养室中多种培养基配方同时创建,并保持细胞存活数周。最后可根据细胞接种密度、培养基组成等制定最佳培养条件。基于PDMS形成的浓度梯度系统进行器官芯片构建及环境污染分析逐渐成为近年来的研究热点。如图4(c)所示,Zhang等^[52]描述了一种化学梯度发生器辅助微流控细胞系统,用于动态研究代表性环境污染物诱导的支气管上皮损伤。该装置不仅证明了用于精密和长期化学梯度生产的操作优化微流控系统的稳定性和可靠性,还进行了微环境控制的微流控支气管上皮构建,具有高活性和结构整合性。此外,在该装置上还可以进行不同浓度苯并芘刺激支气管上皮损伤的芯片研究。根据已建立的系统,对不同的支气管炎症和细胞毒性反应进行了时间监测和测量,成功评估了苯并芘诱导的炎症和细胞毒性。

PDMS比硅或者玻璃模板更容易制备加工,而且成本较低,同时由于PDMS具有透气性、表面与细胞培养相容,因此被广泛用于细胞培养、细胞筛选和生化分析等生物反应研究。但该材料也具有一定的局限性,由于允许气体的渗透,导致与有机溶剂的不相容性,而且PDMS器件在水溶液中的应用也受到一定程度的限制。

4 浓度梯度微流控芯片的应用

4.1 单细胞分析

单细胞分离和操作的策略在疾病诊断、药物传递和癌症生物学等领域发挥着极其重要的作用^[53]。通常情况下,同种细胞在对特定药物反应时会有广泛的外源性反应,传统的药物筛选方法无法观察到这种异质性,而单个细胞的异质性可能对细胞的生存至关重要。使用群体平均反应的方法通常掩盖了个体细胞的差异。为了充分了解细胞间的变异性,对单个细胞(从其活态到细胞裂解物)进行全面分析是必不可少的^[54,55]。然而,传统的单细胞分析技术具有处理复杂度高和耗时长的特点,并且需要昂贵的设备,极大限制了其在细胞异质性研究中的应用^[56]。在单细胞水平上快速、可靠地评估药物的耐药性,以及从单个细胞的固有微环境中监测耐药程度的技术仍然缺乏^[57]。多组分的高灵敏度检测和大量单个细胞的高通量分析仍然是实现这一目标的关键挑战。在这种背景下,微流体和芯片实验室展示出巨大的优势,微流控系统的微加工和越来越灵敏的分子放大工具的发展使得单细胞分析平台的小型化成为可能,已成为最有希望解决这些问题的新技术。

Chung等^[58]提出了如图5(a)所示的微流控设备,该设备含有64个单细胞培养阵列,用于研究多个细胞分裂过程中的细胞异质性,该设备将单个细胞捕获到一个微孔阵列中,培养细胞以允许克隆扩增,随后进行药物治疗反应。为了便于操作,原型设计为采用流体力学单元捕捉方法独立操作,该方法利用流体阻力差和重力驱动的自然流动机制能够将超过80%的单细胞捕获到单个微孔中,并且不需要外部能源/泵进行细胞操作。此外,为了探讨该设备用于评估癌症中异质细胞群的潜力,在微孔中捕获并培养了单个PC3前列腺癌细胞,在癌症模型中鉴定了三种不同的亚表型,进行化疗,并将其克隆药物反应性与细胞表型相关联。Liang等^[59]设计了一种微流控芯片,为单细胞水平的耐药监测和控制提供了一种新的工具。如图5(b)所示,该芯片集成了549个细胞陷阱和一种微流控混合器,在单细胞水平上探讨了不同浓度的氮对急性髓系白血病细胞Molm-13细胞的影响。该设计具有较高的灵敏度,在单细胞质量评价和药物分析中具有重要的临床应用前景。如图5(c)所示,Song等^[60]开发了一种能够实现静态和动态浓度梯度分布的单细胞微流控装置。它能在单个装置中产生动态时间刺激,观察表皮生长因子(EGF)在脉冲和斜坡刺激下的胞外信号调节激酶(ERK)活性,量化在极低EGF浓度下ERK的激活,这在传统技术中是很难观察到的。另外,该微流控装置与活细胞成像技术相结合,不仅能够提供至少12 h的多功能刺激,还有助于在单细胞水平上长期实时观察细胞反应,适用于单细胞动力学的研究。再者,Fernandes等^[61]开发了一种弹性单细胞微流控装置,为利用转基因酵母细胞研究单细胞分辨率和高通量提供了一种强有力的方法。如图5(d)所示,该装置包含化学梯度发生器和9个含有细胞陷阱的腔室,以研究酿酒酵母中的蛋白α-突触核蛋白产生和聚集。这项研究通过捕获单个细胞对环境因素和蛋白α-突触核蛋白表达水平的联合作用进行了分析。Pei等^[62]提出了一种基于药物敏感性的微流控芯片(DS-chip)。如图5(e)所示,该芯片由药物梯度发生器和并行细胞陷阱组成,实现连续的单个循环肿瘤细胞(CTC)捕获、药物梯度分布、药物刺激、荧光探针标记和三色荧光成像。利用这一装置,对5例肿瘤患者的单个CTC进行了最佳药物反应剂量的测定。该装置允许在治疗期间对患者肿瘤细胞的药物敏感性进行无创和实时测量,能有效指导个性化用药的药物选择和疗效评价。

微流控芯片为单细胞分析提供了便捷的操作平台,对于研究单个细胞的异质性及其对特定药物的反应十分有利。然而,在进行单个细胞的生物学行为监测分析时,往往需要结合其他分析设备和显示设备,以期建立更加全面的分析方法和规范化的处理过程,但是目前在集成化方面仍然存在一定难度。

4.2 组合药物筛选

近年来,随着各种抗生素和抗癌药物的广泛使用,部分细胞和细菌产生了一定程度的耐药性,甚至出现了对抗生素耐药的“超级细菌”,因而,两种或两种以上抗生素和抗癌药物的组合治疗对多种耐药病原菌和癌细胞的抑制作用研究日益受到重视^{[63⇓⇓⇓~67]}。然而,大规模筛选需要昂贵和复杂的液体处理系统来实现自动化,因此降低了临床医生或生物学家的可及性,限制了顺序药物组合在临床应用和学术研究中的潜力。利用微流控芯片进行药物筛选,允许空间和时间控制多个微环境,减少了在高通量大规模筛选中耗时的操作,拓宽了大规模筛选精密药物的应用范围。此外,微流控芯片在进行组合药物筛选时还可进行平行实验、对照和多剂量治疗等综合分析^[68,69]。

如图6(a)所示,组合药物治疗法能够比使用单一药物产生更强大的抑制效果,单一药物通过特定途径发挥作用,而多种药物通过多种途径发挥作用,可以显示出增强的抗癌活性,此外,单药治疗需要大剂量,从而对正常细胞产生毒性,而不同药物组合协同作用可降低单药剂量,从而降低毒性^[70]。因此,确定适当的药物浓度和类型对开发有效的组合治疗至关重要,微流控芯片利用其特殊的流体特性可以实现这一功能,微流控药物筛选装置引起了广泛关注。如图6(b)所示,Kim等^[71]提出了一种可编程的全自动微流控细胞阵列,该阵列集成了片上细胞培养、药物浓度生成以及成对组合,在64个单独的细胞培养室中细胞可以按顺序或同时以成对浓度组合培养和暴露于不同药物,而无需连续灌注含药介质。通过使用两种临床相关的致敏药物(阿霉素或米托蒽醌)对PC-3人骨转移性前列腺癌细胞进行致敏实验,或同时将癌细胞暴露于致敏剂和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的成对组合,证明了该平台的实用性。同时,该装置进行连续和同时治疗的能力也有助于探索毒理学和生物学中不同剂量的研究。虽然使用联合疗法通常比使用单一治疗(协同作用)产生更强大的作用效果,但某些组合可能会产生干扰,导致作用效果被抑制(拮抗)。如图6(c)所示,Kim等^[72]制备了一种基于微流控的表型筛选芯片,通过在细菌捕获的琼脂糖凝胶上自动生成两个正交浓度梯度来研究抗生素的组合效应,验证浓度组合的同时建立,并对不同的抗生素进行了各种类型的分析,促进了芯片药物测试的稳定性和有效性。此外,本课题组^[15]开发了一种宽流量范围操控的微流控芯片装置,如图6(d)所示,该装置可以在0.1~ 200 μL·min ^-1的流量范围内,基于迪恩流快速构建多溶质的三个浓度梯度,通过化学梯度动力学进行系统定量的研究分析,建立了三个稳定、准确和可控的药物梯度,成功评估了抗癌药物(阿霉素和顺铂)在相同条件下对肿瘤细胞株(MCF-7和HepG2)的个体作用和相互作用,促进了针对肿瘤细胞特异性药物筛选工具的开发。

组合药物筛选芯片实现了单种药物和多种药物组合的多重浓度梯度筛选,同时还能够探究药物组合中出现的协同作用和拮抗作用,但是,随着大量新的靶标和先导化合物不断被发现,药物研究和筛选的效率需要进一步提高,同时,基于细胞和分子构建的微流控药物筛选模型与体内模型还存在差距,因而还无法全面反映药物的药理学等方面的信息。

4.3 3D细胞培养

当前药物开发技术的缺点之一就是使用单层细胞培养,药物在后期(即药物开发的临床阶段)的治疗结果受体外2D细胞培养模型和体内3D细胞结构之间的差异影响。利用微流控芯片构建的3D细胞培养设备能够模拟细胞-细胞和细胞-基质相互作用,在生理学上更适用于预测复杂异源癌的药物反应,在药物毒性和疗效分析方法方面也具有显著的潜力,同时,利用微流控芯片设备可以进行长期球体培养和观察,使得多条件刺激和原位分析成为可能。此外,基于微流控的3D细胞培养结合定量分析可以大大提高模拟和理解体内系统的能力^[73]。

如图7(a)所示,在2D细胞培养中,细胞仅限于单一材料的表面,大多数为塑料(通常为聚苯乙烯),这种塑料具有粗糙度、刚度和有限结合位置等表面特性,细胞可以无限制地增殖和迁移,这并不是许多细胞体内条件的精确模拟。而3D细胞培养平台允许细胞全方位生长,不像2D细胞培养将细胞限制在平面上,3D培养允许细胞采用优选的方向来优化细胞极性,细胞极性可以在对刺激的反应中发生变化,细胞中的信号分子和化学梯度不受阻碍,整个细胞都可以接触到,更接近体内真实环境^[74]。Toh等^[75]开发了一种微流控3D肝细胞芯片设备,如图7(b)所示,该设备含有多个微流控通道,每个通道中都有一个3D微环境来维持肝细胞的合成和代谢功能,并且多个通道允许同时给功能性原代肝细胞多个药物剂量,而加入的浓度梯度发生器使体外剂量依赖性药物反应能够预测体内肝毒性。同时,构建集细胞培养、微环境调控、生化分析等于一体的多功能细胞培养平台也逐渐成为研究热点。如图7(c)所示,Sart等^[76]构建了一种微流控平台,在一个芯片中进行高密度3D培养、可控刺激和观察。该装置扩展了液滴微流控技术对贴壁细胞进行长期培养的能力。利用每个芯片500个球体的阵列,进行了多尺度细胞分析,此外,还提取单个球体进行进一步分析或培养,这将有助于在动态条件下对3D培养物进行定量研究,并对片上3D细胞培养、芯片器官以及癌症微环境的研究分析产生影响。

利用微流控芯片制备3D 细胞,有效模拟了体内细胞的生长特性,对于体外细胞的研究分析不再局限于平面培养操作,在生理学分析和预测药物反应等方面显示出巨大潜力,然而,3D细胞培养操作较为复杂,培养条件要求较高,对操作人员有一定的要求。除此之外,目前在有效回收3D培养物以及定量分析等方面仍面临挑战。

4.4 细胞微环境模拟

细胞微环境的时空调控对于监测细胞反应,探索潜在的生理机制起着至关重要的作用,到目前为止,体外细胞外化学微环境的操作通常是通过传统的(基于培养皿或烧瓶的)细胞培养系统来完成的,这些系统缺乏精确性和可控性^[77⇓~79]。微流控多器官芯片模拟了组织培养微环境,实现了器官等效物的互连,使该技术成为临床前药物筛选的有力工具^[80]。

如图8(a)所示,从复制复杂的脉管系统结构、共培养各种细胞到模仿细胞-细胞相互作用,以及模拟肿瘤暴露的剪切应力,压力或生物物理和生化梯度等,微流控肿瘤模型具有以相对简单和具有代表性的方式再现肿瘤复杂的微环境的独特优势^[81]。此外,微流控肿瘤模型还可以进行实时监控,为监测疾病和药物筛选提供了新的平台^[82]。如图8(b)所示,Chen等^[83]提出了一种新的微井阵列微流控系统,旨在实现多细胞肿瘤球高通量培养,该系统构建了一种用于药物筛选研究的仿生体外肿瘤微组织模型,该设备中的柱状微孔阵列和直形微通道,能够有效地输送营养,并为进行抗癌药物筛选实验提供条件。除此之外,由于癌症治疗困难以及细胞的异质性,基于3D细胞微环境微环境条件下评估不同癌细胞系对不同药物组合的反应备受人们关注。Zhang等^[84]设计了一种如图8(c)所示,基于3D肿瘤模型的可扩展药物筛选装置。装置中的圣诞树形网络可以在不同药物对之间产生连续的浓度梯度,同时还构建了肿瘤球体来模拟肿瘤微环境,该装置具有样品消耗低和易操作等优点,此外,浓度梯度的形成以及肿瘤球的培养对细胞培养、精密药物作用和高通量药物筛选具有重要意义。

微流体模型概括了多种生理学相关的体内条件,将人体组织的多种特性纳入系统中,构建了较为全面完整的细胞微环境,当前的微流体模型已经在结合血管系统、细胞类型共培养和模拟升高的间质液压力以及剪切应力的重要性方面取得了很大成就。然而,由于细胞体积小和化学分子的迅速扩散以及血管结构,共培养模型中使用的细胞系和模拟元件的功能而言,微流体芯片中的人工微环境距离人体真实环境还有很长的路要走。

5 结论与展望

本文阐述了浓度梯度微流控芯片的特点,讨论了浓度梯度纸芯片、浓度梯度水凝胶芯片、浓度梯度液滴芯片以及浓度梯度PDMS芯片的优势与不足,并对浓度梯度微流控芯片在单细胞分析、组合药物筛选、3D细胞培养和细胞微环境模拟方面的应用进行了阐述。浓度梯度微流控芯片省时高效、材料灵活多变、结构易于调控,为药物筛选提供了新的技术方法。但是,在未来的发展中,仍然存在一些需要解决的问题,主要包括:(1)系统操作复杂,对技术人员有一定的要求。(2)尽管微流控芯片材料有多种选择,但其制作工艺仍然存在一定的局限性。(3)与其他分析设备、显示设备等的集成化仍然存在一定难度。

作为目前发展迅速的高新技术和多学科交叉研究的前沿领域之一,微流控芯片分析系统的出现使实验研究微型化、集成化、自动化和便携化成为可能。用于生化分析、细胞培养、食品检测和药物筛选等的微流控芯片分析技术展现了巨大的发展潜力和应用价值,正逐步成为人们关注和研究的热点。微流控浓度梯度系统也在不断发展,与传统梯度生成方法相比,具有节约时间、降低实验成本、灵活控制浓度分布和分析条件可控等优势。此外,微流控浓度梯度发生器还可以为化学信号的反应提供微环境^[85,86],因此,微流控浓度梯度发生器在多重药物筛选、器官芯片和生物体研究等方面都有着广泛应用^[87,88]。随着人们对精确医学认识的进一步提高,在未来的研究中,浓度梯度微流控芯片将继续为药物筛选和疾病模型开发等提供有效的平台支撑,并进一步扩大这些系统的可用性,不仅在实验应用中提供便利,还会在实际工程中发挥重要作用。

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