激活型有机光声造影剂的应用

刘加伟; 王婧; 王其; 范曲立; 黄维

doi:10.7536/PC20072

化学进展 ›› 2021, Vol. 33 ›› Issue (2) :216-231 DOI: 10.7536/PC20072

综述

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激活型有机光声造影剂的应用

刘加伟 ¹ ,
王婧 ¹ ,
王其 ¹^,²^,^* ,
范曲立 ¹^,^* ,
黄维 ³

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Applications of Activatable Organic Photoacoustic Contrast Agents

Jiawei Liu ¹ ,
Jing Wang ¹ ,
Qi Wang ¹^,²^,^* ,
Quli Fan ¹^,^* ,
Wei Huang ³

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摘要

光声(PA)成像作为一种结合了光学和声学成像优势的新型成像方式,具有深层组织穿透和高空间分辨率等优点,在重大疾病的早期影像诊断方面有着巨大的应用前景。然而传统的PA造影剂依然存在信噪比低、选择性及特异性差等不足,容易产生假阳性诊断结果。激活型PA造影剂可以有效的降低背景噪声,并提升成像的灵敏度和特异性,是目前PA造影剂设计与构筑的主要趋势。本综述首先简单介绍了PA成像的原理,然后结合近几年在金属离子、酶、活性氮和活性氧等相关方面的生物成像应用,梳理了可激活探针在不同微环境中的响应方式。最后,对激活型探针在PA成像中的应用进行了总结和展望。

Abstract

Photoacoustic(PA) imaging, as a new type of imaging technique that offers strong optical absorption contrast and high ultrasonic resolution, shows great application prospects in the early disease diagnosis for its characteristics of deep tissue penetration and high spatial resolution. However, traditional “always on” PA contrast agents have many disadvantages such as low signal-to-noise ratio, poor selectivity and specificity. In contrast, activatable PA contrast agents, where the imaging signal can be changed in response to pathologic parameters, have shown decreased background signal and improved selectivity and specificity in early disease diagnosis. Moreover, these contrast agents can obtain pathological parameters and information of various diseases at the molecular level by rational design to their structures, providing important guidelines for the optimization of treatment options. Therefore, activatable PA contrast agents hold greater promise in clinical practice than traditional “always on” PA contrast agents. In this review, we describe the recent advances in the development of activatable PA contrast agents. The design mechanisms and proof-of-concept applications of these activatable PA contrast agents are summarized in detail. The use of these activatable probes to detect different pathologic parameters(such as metal ions, enzymes, reactive nitrogen and reactive oxygen species) is highlighted. Finally, current challenges and future perspectives in this emerging field are also analyzed.

Contents

1 Introduction

2“Always on”versus activatable PA imaging

3 Applications of activatable PA imaging contrast agents

3.1 Metal ions

3.2 Enzymes

3.3 RONS

3.4 pH

3.5 Gasotransmitters

3.6 Glutathione(GSH)

3.7 Hypoxia

3.8 Others

4 Conclusion and outlook

Graphical abstract

关键词

光声成像 / 造影剂 / 肿瘤微环境 / 激活探针 / 生物成像

Key words

photoacoustic imaging / contrast agents / tumor microenvironment / activatable probes / biological imaging

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刘加伟, 王婧, 王其, 范曲立, 黄维. 激活型有机光声造影剂的应用[J]. 化学进展, 2021, 33(2): 216-231 DOI:10.7536/PC20072

Jiawei Liu, Jing Wang, Qi Wang, Quli Fan, Wei Huang. Applications of Activatable Organic Photoacoustic Contrast Agents[J]. Progress in Chemistry, 2021, 33(2): 216-231 DOI:10.7536/PC20072

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1 引言

生物医学成像是分析生物体组织结构及各种生理功能的重要研究手段,目前常见的成像技术通常以光波、超声波和核磁共振等作为成像检测的媒介,如荧光(FL)成像^[1⇓~3]、光声(PA)成像^{[4⇓⇓⇓⇓⇓~10]}、电子计算机断层扫描(CT)成像^[11,12]、超声(US)成像^[13,14]和磁共振(MR)成像^[15]等。其中PA成像作为一种非侵入、非电离及无辐射的新型生物医学成像方式,已经成为当前生物医学成像领域的研究热点之一。目前,人们已经在大脑、甲状腺和乳腺等人体部位的PA成像方面开展了临床应用的转化工作^[16]。PA成像原理如下^[17]:生物组织体中的光吸收剂(造影剂)接收短脉冲激光的照射后,将吸收的光能转化为热能,由于局部温度的瞬时上升,组织体通过热弹性膨胀形成压力波(声波),这些声波由体外的超声探测器采集,并根据其到达的时间进行图像重建获得成像信息。由于光声成像同时结合了光学成像和声学成像的优势,因此可以实现深层次组织的高对比度及高分辨成像。

PA成像使用的造影剂通常分为内源性造影剂和外源性造影剂。虽然内源性造影剂已成功用于肿瘤、血红蛋白浓度、心血管疾病及血氧饱和度等检测和功能成像^[18],但是它们存在成像对比度差和检测深度有限等问题,因此科学家们着力于开发具有更高性能的外源性造影剂。有机分子由于具有生物相容性好、结构易修饰、光学性质易调节、吸光和产热性能优异等特点,在生物体PA成像领域具有重要的应用价值^{[19⇓⇓~22]}。其中可激活型造影剂可以特异性响应病变组织微环境标志物^[23⇓~25],具有低背景噪声、高灵敏度和特异性、信号和疾病状况间的实时相关性等特点,因此设计开发具有近红外(NIR)吸收的可激活型有机光声造影剂已成为该领域研究的重要趋势^[25⇓~27]。鉴于激活型PA探针的重要研究价值,本文对激活型有机PA造影剂的相关研究进行综述,分别总结了造影剂用于金属离子、酶、活性氧和活性氮(RONS)、pH等病变组织微环境标志物检测诊断的应用实例,系统概括了近年来领域内的代表性研究成果,并对未来激活型PA造影剂的发展趋势做出展望。

2 信号始终开启型与激活型PA成像对比

近年来,PA成像已越来越多地应用于生物医学领域。PA成像可以有效地、精确地呈现生物组织结构和功能,为研究其形态结构、生理特性、病理特征和代谢功能提供了必要的信息。优异的PA成像应具备两个特征:(1)病变组织PA信号最大化;(2)背景信号最小化。研究表明传统PA造影剂(信号始终开启型)可以通过被动靶向或主动靶向的方式最大富集于病变组织,进而有效地提高病变组织PA信号强度。但该类型PA造影剂在进入生物体后无论是否到达目标组织都会产生很强的PA信号,从而导致背景信号高、成像信噪比低,容易导致“假阳性”诊断结果,大大限制了PA成像的实际临床应用。目前,设计构筑可激活型PA造影剂已成为解决这些问题的最佳方案之一。该类造影剂可以与病变组织微环境中大量存在的某种标志物(金属离子、酶、RONS、pH、气体信号分子等)发生反应,从而引起造影剂PA信号的特异性变化,因此具有病变组织特异靶向性、背景干扰低和成像信噪比高等优点,能够从分子水平来获取不同疾病的病理参数及病理机制等信息,为治疗方案的优化提供重要指导。另外,与信号始终开启型探针相比,激活型PA探针具有成像速率更快和检测极限更低等优点,因此该类探针在生物医学领域具有更加广阔的应用空间(图1)。

3 激活型PA成像造影剂的应用

众所周知,正常的生理微环境对生物体稳定运行至关重要。研究表明病变组织生理微环境与正常组织生理微环境具有明显的差异性,且这些差异性与肿瘤、心血管疾病、阿尔茨海默症、组织损伤及炎症等多种疾病密切相关,设计开发病理微环境标志物激活型PA成像造影剂为实现病变组织特异性精准诊断带来了新契机。

3.1 金属离子

金属离子是许多生物过程中必不可少的辅助因子,如能量代谢和储存、信号转导和核酸加工^[28],因此开发高效稳定的金属离子检测方法对医学成像诊断、环境监测和食品安全等领域具有重要意义。目前PA成像已经被用于一些生物相关的金属离子检测,包括Cu^2+[29~33]和MeHg^+[34]、Hg^2+[35]、Ca^2+[36]、Li^+[37]、UO₂^2+[38]、Pd^2+[39]等。其检测原理大致为金属离子(特别是一些过渡金属)原子轨道最外层未填充电子的空轨道可以与具有孤对电子的“N”和“O”等形成配位键,从而调节探针的光学性质。根据探针分子和金属离子的作用结果,可将探针分为三类:(1)金属离子直接与发色团上的原子配位;(2)金属离子配位诱导特定的反应;(3)金属离子与非发色团类的配体结合,间接影响发色团的PA信号。

(1)金属离子直接与发色团上的原子配位。Lin等^[33]报道了一种信号开启型的Cu²⁺响应探针(LET-2),该探针由七甲胺花菁IR823衍生物和二烯丙基乙二胺DPEN部分(金属离子螯合剂)构成。当DPEN与Cu²⁺发生配位后,其吸收峰从625 nm红移至715 nm(图2A),并且在715 nm处产生强的PA信号,由715 nm处的相应PA值计算出检出限为10.8×10^-9 mol/L(图2B)。他们认为光学性质改变的原因是Cu²⁺配位后降低了DPEN部分胺的电子密度。另外,他们使用该探针对小鼠肝脏处的Cu²⁺进行成像,进一步验证了其在活体中对Cu²⁺的监测能力。

Zhang等^[30]设计了一系列Cu²⁺激活的探针RPS1-RPS4,分子结构中的苯胺衍生物可以特异性地与Cu²⁺螯合形成自由基,在近红外区域产生增强的吸收和PA信号。其中探针RPS1可在几秒之内对Cu²⁺快速响应,并具有高选择性和低检测限(90.9 nmol/L)。由于该探针低的相对分子质量(小于438 Da),可以有效穿过血脑屏障,进而通过PA成像实现阿尔茨海默症(AD)小鼠大脑中Cu²⁺的可视化检测。除此之外,Jokerst等^[38]利用卟啉类大环化合物的配位反应进行铀酰阳离子的PA成像检测。Westmeyer等^[36]报道了首例细胞渗透性和选择性的Ca²⁺传感器。Cai等^[39]基于花菁染料设计了一种比率型的Pd²⁺探针。

(2)金属离子配位诱导特定的反应。Chen等^[31]设计构筑了一种新型比率型PA成像探针(NRh-IR-NMs)用于Cu²⁺的高效检测,该比率型探针由Cu²⁺敏感性染料(NRh)和Cu²⁺惰性染料(IR)组成(图3A)。Cu²⁺与NRh配位使得酰胺结构改变,716 nm处的PA信号增强,而834 nm处来自IR的PA强度保持不变,利用ΔPA₇₁₆/ΔPA₈₃₄的比例信号可进行Cu²⁺的检测。Chan等^[32]在氮杂-BODIPY分子上引入2-吡啶甲酸酯,设计了一种Cu²⁺检测的比率型探针APC-2。当存在Cu²⁺时,探针APC-2发生水解得到酚盐的产物(图3B),同时吸收峰从697 nm红移至767 nm,PA₆₉₇信号降低,PA₇₆₇信号增强。该探针吸收峰红移的原因是吸电子的吡啶甲酸酯基离去和生成的酚盐增强了氧原子的给电子性。Huang等^[34]报道了一例用于活体MeHg⁺检测的比率型探针(LP-hCy7),在MeHg⁺作用下,hCy7经过环化反应转变为hCy7'(图3C),吸收峰从690 nm红移至860 nm,因此可以通过PA₈₆₀/PA₆₉₀的比例变化检测MeHg⁺浓度。他们以斑马鱼为模型进行PA成像实验,研究发现经MeHg⁺孵育后的PA比率是正常组的10.44倍。

(3)金属离子与非发色团类的配体结合。Clark等^[37]设计了一种监测Li⁺浓度的探针,该探针由一种Li⁺载体VI(L)、质子化的发色团(CH⁺)及电荷平衡剂R^-组成(图4A)。当Li⁺被识别并提取到探针的疏水性聚合物核中,导致CH⁺的去质子化,从而改变了探针的PA信号强度。Kopelman等^[40]用类似的方法设计了一种K⁺的PA探针,当加入K⁺时,离子载体与K⁺结合,发色团去质子化,其540 nm处的吸收峰上升,660 nm处的吸收峰则下降(图4B)。这类探针中发色团本质上是一个pH指示剂,随着金属离子浓度变化质子化或者去质子化。

3.2 酶

酶是一类生物大分子催化剂,细胞中的代谢过程都离不开酶。异常的酶活性与各种疾病的病理密切相关,近年来对酶活性的精准检测已成为研究的焦点^[41⇓~43]。酶激活探针设计策略一般为:(1)将酶激活部分(一般是短肽链或蛋白质)连接到发色团上;(2)材料发生酶促反应并诱导性质发生变化。其中材料性质变化途径主要有:(1)切除部分支链引发分子的自组装;(2)离去吸电子基团,建立新的能量转移过程;(3)切断两个发色团间的连接;(4)氧化还原反应改变基团吸/给电子性能。

(1)切除部分支链引发分子的自组装。酶切除亲水链后分子可在π-π堆积等非共价键作用力下自组装,这种方式实现PA信号激活的染料一般具有聚集诱导发光猝灭(ACQ)的性质,主要包括酞菁、卟啉和花菁类衍生物等。Liang等^[44]报道了一例碱性磷酸酶(ALP)触发的纳米粒子自组装探针1P。探针1P由花菁染料IR775和连有磷酸基团的短肽链组成,当ALP切断磷酸后,纳米粒子在肿瘤处自组装,795 nm处PA信号增强了6.4倍。为了增加探针在病变组织处的累积和保留,Wang等^[45]设计合成了一种具有主动靶向能力的智能响应探针Probe 1。该分子由发色团红紫素18(P18)、酶响应肽链Pro-Leu-Gly-Val-Arg-Gly(PLGVRG)和靶向配体Arg-Gly-Asp(RGD)组成(图5A)。当探针进入体内后,首先被细胞膜上的α_vβ₃受体识别,随后明胶酶选择性切断PLGVRG链,由于疏水性和空间位阻的改变,探针原位自组装形成纳米纤维,延长了在肿瘤中的保留时间。探针在琼脂模型中与明胶酶(15 ng·mL^-1)孵育1 h后,730 ± 1 nm处的PA信号增强了3.5倍( 图5B)。在U87异种移植小鼠模型的PA成像实验中,注射8 h后,Probe 1处理的肿瘤处平均PA强度较Probe 2(对照组)高16倍(图5C)。另外,当P18分子中的酸酐基团水解后,分子亲水性的增强有利于纳米纤维的解离和排出体外。基于Probe 1的设计思路,Wang等^[46,47]又报道了两种激活型探针,分别可对细菌感染处的明胶酶和肿瘤处的半胱氨酸蛋白酶(ATG4B)进行识别响应。

除了基于酶解后非共价键作用的自组装,共价键参与的自组装纳米探针也有报道。Gambhir等^[48]设计了一种弗林蛋白酶激活的探针ESOR-PA01,在肿瘤微环境被激活后,探针中2-氰基-6-氨基苯并噻唑(CABT)的氰基和半胱氨酸的1,2-氨基硫醇基团缩合形成寡聚物,并进一步自组装成纳米粒子(图6A)。细胞成像表明,其产生的PA信号比在弗林蛋白酶缺陷型细胞中的信号高2.6倍(图6B)。活体成像表明,带有MDA-MB-231肿瘤(过度表达弗林蛋白酶)的小鼠在注射ESOR-PA01探针后检测到PA信号显著增加(图6C)。Ye等^[49]利用该缩合反应设计了一种半胱氨酸蛋白酶-3识别的探针,不同的是酶促反应后发生分子内缩合反应得到环状产物。

(2)离去吸电子基团,改变发色团电荷性质,实现PA信号的放大。Pu等^[50]报道了一种尿激酶(uPA)激活的探针P-Dex(图7A),可用于区分浸润性和非浸润性乳腺癌。酶切除酰胺键和自发的1,6消除反应后,染料处于“解封”的状态,氧原子的给电子能力增强,690 nm处的PA信号显著增强(图7B)。Lin等^[51]通过碱性磷酸酶(ALP)水解探针LET-3中磷酸基团,增强了探针中氧原子的给电子性,将PA强度提升了27倍。

(3)通过酶切断两个发色团间的连接也是设计酶激活探针的常用方法。Gambhir等^[52]设计了一种基质金属蛋白酶(MMP-2和MMP-9)激活的探针B-APP-A,其中猝灭剂BHQ3(A1)与一种细胞穿透肽聚精氨酸相连,荧光分子Alexa750(A2)与无细胞穿透能力的聚谷氨酸链相连,两种氨基酸之间通过肽序列Pro-Leu-Gly-Leu-Ala-Gly(PLGLAG)相连。激活后A1进入细胞,A2离去,PA₆₈₀(来自A1)和PA₇₅₀(来自A2)之差增大。在小鼠甲状腺肿瘤的PA成像中,注射140 min后的信号强度之差较注射前增强了1.7倍。Lu等^[53]将猝灭剂和荧光团通过DNA适体相连,制备的探针实现了对凝血酶的比率型响应。

(4)氧化还原反应改变基团吸/给电子性能。Cai等^[54]设计了一种在乏氧环境下对硝基还原酶响应的探针IR1048-MZ,探针中硝基被还原后,980 nm处吸收增强,PA信号开启,该探针实现了厘米级别深层组织穿透的肿瘤PA成像。

3.3 RONS

活性氧和活性氮(RONS)在生物代谢和细胞间信号传导中起关键作用^[55⇓~57]。其中ROS是一类氧的单电子还原产物,包括

O 2 · -

、H₂O₂、^·OH、¹O₂、HOCl/^-OCl等;RNS指NO及其高级氧化物,包括

NO 2 ·

、ONOO^-、NO₃^-等。RONS响应的分子及其机制已有不少的综述总结^[58⇓~60],这里仅讨论RONS的氧化作用如何改变探针的PA信号。根据氧化反应的作用结果可以分为两大类:(1)氧化并诱导亲水链分解,促使探针分子自组装;(2)氧化发色团或其相邻的基团,从而直接调整光学性质。

(1)氧化分解亲水链,促使探针分子自组装。Pu等^[61]开发了一种半导体大分子可激活探针PCBP,并采用原位自组装的方法应用于体内的RONS靶向增强PA成像。该探针由一个近红外吸收的酞菁核、RONS响应的自消链段及亲水性的聚(乙二醇)(PEG)臂组成。当分子与H₂O₂或ONOO^-作用后,芳基硼酸酯首先被氧化,硼酸频那醇酯离去,苯酚通过醌甲基化合物重排分解,同时清除亲水的PEG链,疏水性的酞菁在疏水作用力和π-π堆积作用力下进行自组装(图8A)。其中经H₂O₂处理后纳米粒子的半径由之前的20 ± 2 nm增长到约350 nm,同时700 nm处的PA强度最大增强了1.4倍。在皮下4T1异种移植肿瘤模型中,注射后8 h,经D,L-蛋氨酸-( S,R)-硫代亚胺(BSO,一种提高ROS水平的药物)预处理的小鼠ΔPA₇₀₀比未经处理的小鼠高2.0倍(图8B),表明升高的ROS可以激活探针并产生更强的PA信号。

(2)氧化发色团或其相邻基团时可以根据氧化的程度分为两个小类:(i)结构不发生降解;(ii)结构发生降解。

(i)结构不发生降解。Liu等^[62]设计了一种H₂O₂激活的纳米探针Lipo@HRP&ABTS,当存在H₂O₂时,无色的ABTS将被氧化为具有强近红外吸收的

ABTS · +

(图9A),800 nm处的吸收和PA强度显著增强。Zhang等^[63]报道了一种检测

O 2 · -

的探针BDP-DOH,该探针中BODIPY分子上的邻酚羟基很容易被氧化(图9B),使得在680和750 nm处的吸光度分别降低和增加,从而导致PA₇₅₀/PA₆₈₀的比值增大。

近红外Ⅱ区(NIR-Ⅱ,1000~1700 nm)的成像凭借其深穿透和高对比度的优势成为近年来研究的热点,Xing等^[64]报道了一种H₂O₂激活的探针SHT,并实现了NIR-Ⅱ区域肿瘤光声成像。在H₂O₂和低pH条件下,探针中3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)和它的二价阳离子氧化物自组装形成电荷转移纳米复合物,从而在750~1200 nm产生增强的吸收带和PA信号。激活后的探针SHT具有深的组织穿透能力,甚至在2 cm的组织深度上仍有清晰的成像对比度(信噪比为10 dB)。在4T1荷瘤小鼠的成像实验中,肿瘤部位的PA信号随时间变化逐渐增强,并在注射后4~6 h达到峰值,并且对比肿瘤和正常组织PA图像可以观察到两者强度的显著差异(p < 0.001)。另外值得一提的是,近年来激活型NIR-Ⅱ的荧光成像 ^[23]和化学发光成像^[65]取得了很大的进展,然而可激活的NIR-Ⅱ有机PA探针报道的仍不是很多,因此这类探针是今后发展的重要趋势。

(ii)结构发生降解。在RONS氧化促使发色团分解方面,Pu等^[66]报道了一种对ClO^-响应的比率型探针SOA-NIR775,该探针由可被ClO^-降解的两亲性染料SOA和惰性组分NIR775构成。在ClO^-作用下,SOA分子中硫原子被氧化并逐步降解整个发色团,导致其相应的吸收强度降低,NIR775的吸收强度则保持不变。激活后PA₇₈₀/PA₆₈₀的比率值是初始未激活状态的8.3倍。

花菁染料可以在一些RONS的作用下分解,Chen等^[67]将一种花菁染料IR790s和接有顺铂前药的苝酰亚胺(PDI)衍生物及铁离子组成比率型纳米探针PDI-IR790s-Fe/Pt(图10A)。纳米粒子在体内首先释放顺铂激活NOX(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶),催化形成H₂O₂和超氧化物,然后Fe³⁺通过芬顿反应将H₂O₂转化为

· OH

。产生的自由基分解IR790s,并导致IR790s在790 nm处的吸收强度降低,而来自PDI分子680 nm处的吸收强度则保持不变,从而可以利用比率型的PA成像追踪RONS产生和肿瘤治疗效果。在体内实验中,注射PDI-IR790s-Fe/Pt纳米粒子(5 mg·mL^-1, 200 μL)24 h后,ΔPA ₆₈₀/ΔPA₇₉₀的比值较注射2 h后的比值高了1.7倍(图10B),表明其对RONS具有较好的监测能力。另外还有一些文献也报道了基于氧化花菁染料原理设计的探针^[68,69]。

在诱导发色团的相邻基团分解方面,Pu等^[70]报道了一类ONOO^-响应的探针OSN-B1,当RONS使得探针中BBD分子的苯基硼酸频那醇酯裂解后(图11A),680 nm处的PA强度保持不变,750 nm处的PA信号明显增强,探针OSN-B1在PA₇₅₀/PA₆₈₀的比率较激活前增强了7倍。另外,他们发现掺杂的硼烷可以有效的阻隔H₂O₂对BBD分子的氧化,从而增加了探针检测的特异性。本课题组^[71]通过季铵化反应将苯硼酸频哪醇酯与氮杂-BODIPY相连,构建了一种对H₂O₂响应的探针OEG-Aza-BODIPY-BAPE。在H₂O₂作用下,氮杂-BODIPY上的季铵变为叔胺(图11B),产生了从720到825 nm的吸收红移。利用PA₈₂₅/PA₇₂₀的比率变化,估测得肿瘤处H₂O₂的平均浓度为60 μmol/L。这种季铵化的连接方式可以很好地排除ONOO ^-对检测的干扰,确保探针分子对H₂O₂的特异性响应。Uchiyama等^[72]利用H₂O₂除去探针分子(Probe 8)中的S-苄基硫代碳酸酯部分,含有酚羟基的弱芳香性苯酞菁互变异构为具有强芳香性的醌型结构,在880 nm处表现出强吸收峰和PA信号。

3.4 pH

pH的调节对维持人体内环境平衡起着重要的作用,大分子和蛋白质的电荷状态也与pH值密切相关^[73]。pH值的变化也会诱发一系列疾病,包括癌症、局部缺血、肾脏疾病和子宫内疾病等。因此,监测体内微环境的酸度变化对疾病的早期预防和治疗具有重要的意义。pH的检测实质是H⁺/OH^-的反应,可以分为三类:(1)质子化/去质子化;(2)酸性环境诱导化学键断裂;(3)作为协同条件参与某些反应。

(1)质子化/去质子化。质子化通常发生在含有孤对电子的原子上,包括氮^[74⇓~76]、氧^[77,78]等。Lin等^[74]设计了一种pH响应的PA探针LET-4用于胃酸分泌的监测。其中近红外染料IR-pH在酸性条件下发生质子化(图12A),使得探针在808 nm处的吸收强度和PA信号增强,pH = 3时的PA₈₀₈信号强度比pH = 7时增强了3.45倍。Pu等^[77]报道了一种比率型探针Probe 3并用于体内pH成像,该探针由惰性组分F-DTS和pH响应的硼二吡咯亚甲基(pH-BDP)分子组成(图12B)。在酸性环境下,pH-BDP上的羟基质子化,进而导致750 nm处的吸收强度和PA信号降低,在pH = 5.5时,PA₆₈₀/PA₇₅₀的值分别是pH = 6.4和7.4时的1.8和3.1倍。另外,该探针利用F-DTS和pH-BDP之间的光致电子转移(PET)过程实现了PA信号的放大。

(2)酸性环境诱导化学键断裂后可以触发纳米粒子的自组装。Xing等^[79]基于葡聚糖设计了一种pH响应型近红外纳米探针NP1,由于H聚集作用,IR-783在708和785 nm处有两个吸收峰。酸化后腙键断裂(图13A),IR-783单体解离,PA₇₈₅/PA₇₀₈的比率增加(图13B)。Chang等^[80]在黑色素样纳米颗粒(MelNPs)表面引入易水解的柠康酰胺,在酸性环境下MelNPs发生聚集,并使得PA信号较中性环境增强了8.1倍。

(3)作为协同条件参与某些反应。MnO₂在酸性条件可与H₂O₂反应生成Mn²⁺,本课题组^[81]利用该反应设计了一种肿瘤微环境响应的PA探针PBP@MnO₂ NPs(图14A)。在探针中,接枝有BODIPY分子的聚合物(PBP)作为惰性组分,同时可以用它来包封MnO₂纳米粒子。在酸性环境和H₂O₂的作用下,MnO₂的吸收峰(680 nm)逐渐降低,而PBP的吸收峰(825 nm处)则几乎不变。活体成像实验中,注射24 h后ΔPA₈₂₅/ΔPA₆₈₀比值较注射2 h后的信号比率增强了3.7倍(图14B)。

3.5 气体信号分子

气体信号分子广泛存在于生物有机体中,同时对生理和病理过程具有重要的调节作用。硫化氢(H₂S)在血管舒张、血管生成、抗氧化、抗炎症和中枢神经调节中发挥作用^[82],H₂S的异常可导致多种疾病,包括唐氏综合征和阿尔茨海默氏症等。H₂S分子的检测一般基于其与探针的亲核反应和还原反应。He等^[83]设计了一种比率型的PA探针(HS-CyBz)并用于体内H₂S的成像。HS^-对探针分子中的酯基进行亲核取代,得到的烯醇式花菁衍生物进一步会向酮式转变(图15A),同时PA₈₂₅/PA₇₇₅的比率增加。本课题组^[84]利用HS^-与花菁染料的亲核反应设计了探针CyCl-1和CyCl-2(图15B),其中探针CyCl-1的Cl原子被取代后最大吸收和PA峰由800 nm蓝移至720 nm,利用ln(ΔPA₇₂₀/ΔPA₈₀₀)的变化可以监测小鼠体内的H₂S浓度。

Xing等^[85]基于H₂S对叠氮的还原作用设计了一种比率型探针AzHD-LP,当探针中AzHD分子的叠氮被还原为氨基后(图15C),吸收峰值从600 nm逐渐红移至700 nm,PA₇₀₀与PA₅₃₂的比值增强。在阿尔茨海默症小鼠脑组织中的H₂S成像实验中,正常组的PA₇₀₀/PA₅₃₂比值增加了6.5倍,而患病组仅增强了1.2倍,表明正常鼠脑中的H₂S含量要明显高于患病鼠。

一氧化氮(NO)有助于放松血管平滑肌、舒张血管,并且是记忆的神经递质^[86],然而NO异常产生也是许多疾病的原因,如溶酶体贮积病和神经退行性损伤等。用于NO特异性反应的官能团有邻苯二胺、芳族仲胺和二氢吡啶等^[87]。Zhang等^[88]设计了一种在NO/酸性环境激活的PA探针DATN,该探针由刺激响应分子邻苯二胺衍生物NRM和惰性组分NIM构成。在NO作用下,NRM分子中二胺基团转变为三唑基,导致受电子能力增强(图16A)。基于分子内电荷转移(ICT)原理,激活后该分子在近红外680 nm处出现明显的吸收峰,而来自参比NIM的950 nm处的吸收峰则保持不变,因此可以通过PA₆₈₀/PA₉₅₀的比值来监测肿瘤炎症处的NO含量。他们发现该探针在双因素(NO和酸)激活下显示出更显著的光声信号增强,分别为单独NO的9.8倍和单独酸条件的132倍。

Chan等^[89]基于BODIPY设计了五种NO响应PA探针,其中APNO-5分子通过N-甲基胺与NO结合形成N-亚硝基产物(图16B),该探针对NO具有最好的响应效果。在鼠脂多糖诱导的炎症模型中内源性NO检测实验中,PA₆₈₀/PA₇₇₀值较对照组增强了1.3倍。

3.6 谷胱甘肽(GSH)

谷胱甘肽(GSH)作为还原性物质之一,在调节机体氧化还原态的平衡方面发挥着巨大作用^[90,91]。本课题组^[92]基于GSH对二硫键的还原作用设计了一种GSH响应的PA探针IR806-PDA,该探针由两亲性的花菁衍生物构成,当分子中的二硫键被打断后,巯基与仲胺发生交换(图17A),使其在658 nm处的吸收降低,820 nm上升,同时纳米粒子的尺寸由激活前的25.9 ± 2.3 nm减小至2.98 ± 1.1 nm。在皮下HeLa异种移植肿瘤模型成像实验中,注射4 h后的ΔPA ₈₂₀/ΔPA₆₈₀(0.53 ± 0.01)是0.5 h后(0.18 ± 0.03)的2.94倍( 图17B)。

Chen等^[93]报道了一种肿瘤微环境GSH激活的比率型探针CR-POM,该探针由一种有机染料CR和钼基多金属氧酸盐POM团簇自组装合成,这两种组分与GSH反应后NIR吸收强度呈现相反的变化趋势。其中CR分子被还原后700 nm处的吸收降低;而POM中Mo(Ⅵ)被还原为Mo(Ⅴ)时,866 nm的吸收强度增强,两者的变化导致PA₈₆₆与PA₇₀₀的比值增大。

3.7 乏氧

乏氧通常发生在包括癌症在内的许多疾病中,当供氧不足时会导致生理功能的损害。Chan等^[94]设计了一种用于乏氧检测的探针HyP-1,HyP-1上的N-氧化物可以在乏氧的环境下被生物还原(图18A),从而在770 nm处产生增强的PA信号。Wu等^[95]将可在乏氧环境下被打断的偶氮基团引入到荧光团中(图18B),当偶氮链分解后,探针分子(NR-azo)在680 nm处出现吸收峰及PA信号。另外,分解得到的氮芥(active drug)可作为治疗药物来抑制肿瘤生长,该探针实现了肿瘤成像治疗的一体化。

3. 8 其他

在某些病理微环境中(如温度和极性等),探针分子可保持自身分子结构不变,而通过微环境调控其激发态来实现PA信号的改变。这类探针可以动态地反应生理信息。

Zheng等^[96]报道了一种对温度响应的PA探针,他们将捕光剂卟啉连接至磷脂尾部并将其插入脂质基质中,当温度低于脂质的相转变温度时,由于卟啉分子间的J聚集使得824 nm处有强的Q_y吸收峰,但当温度高于相转变温度时,Q_y吸收峰蓝移至750 nm,同时该波长下的PA强度增强。

Tang等^[97]设计了一种对内质网极性响应的探针ER-P,用于糖尿病引起的肝损伤的诊断。基于分子内电荷转移(ICT)效应,该探针的吸收峰在极性溶剂中出现明显的红移,因此可以通过PA₇₀₀/PA₈₀₀的比值来量化介质的极性。

4 结论和展望

PA成像结合了光学和声学成像的优势,可以提供更高的空间分辨率和更深的组织穿透深度。近年来激活型的PA造影剂得到了广泛的关注和迅速的发展,因为它可以很好地克服传统PA造影剂的一些不足,如信噪比低、选择性及特异性差等。激活型探针只有在与特定目标反应后才能引起PA信号的变化,从而具有更高的成像信噪比,并能在分子水平上建立与病理过程的实时关联,已被应用于金属离子、酶、RONS、pH和气体信号分子等的检测和成像。当然激活型的PA探针仍有巨大的提升空间,这也是今后探针设计的重要发展方向。这些发展方向包括:(1)开发单组分比率型探针。比率型探针可以进行信号强度的自校准,采用单组分探针不存在双组分染料分子“泄露”的问题,因此能更准确地进行定量分析。(2)设计可逆型的PA探针。可逆型探针可以动态地反映生理组织参数,从而避免了探针激活后离开目标位带来的信号干扰问题。此类探针一般基于可逆型反应设计,如质子化-去质子化、氧化-还原和配位-解离等。(3)激活后触发纳米粒子自组装。探针在特定环境自组装形成粒径更大的粒子,可以提高保留能力,而未激活的分子则被代谢。(4)设计双重或多重因素协同激活的探针,即“双锁”或“多锁”。有些基团可以在多种环境下被识别反应,比如一些酯基可以同时被酯酶和活性物种水解,对检测产生了很大的干扰。多重响应需要匹配多重参数,因此具有更高的准确度。(5)引入靶向基团。主动靶向的纳米探针可以增加在特定部位的富集,从而进一步提升了成像信噪比。(6)吸收波长在近红外Ⅱ区(NIR-Ⅱ)。PA成像需要外光源激发,组织肌体对激发光的吸收和散射越小,获得图像分辨率和清晰度越高。尽管可激活PA探针仍处于基础研究阶段,但我们相信在不久的将来会出现灵敏度更高、更智能的PA探针,并应用于人类临床疾病的诊断与治疗。

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