FAHFAs:生物功能、分析及合成

朱泉霏; 郝俊迪; 严靖雯; 王雨; 冯钰锜

doi:10.7536/PC200741

化学进展 ›› 2021, Vol. 33 ›› Issue (7) :1115-1125 DOI: 10.7536/PC200741

综述

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FAHFAs:生物功能、分析及合成

朱泉霏 ¹ ,
郝俊迪 ¹ ,
严靖雯 ¹ ,
王雨 ¹ ,
冯钰锜 ¹^,²^,^*

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FAHFAs: Biological Functions, Analysis and Synthesis

Quanfei Zhu ¹ ,
Jundi Hao ¹ ,
Jingwen Yan ¹ ,
Yu Wang ¹ ,
Yuqi Feng ¹^,²^,^*

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摘要

羟基脂肪酸支链脂肪酸酯(branched fatty acid esters of hydroxy fatty acids,FAHFAs)是一类新发现的生物活性脂质分子。FAHFAs在哺乳动物体内具有重要的生理功能,如改善葡萄糖耐量、增强胰岛素敏感性、维持血糖稳态和抗炎等。目前,FAHFA相关研究已成为脂质领域研究的一个新方向,受到科学家们的关注。本文总结了自FAHFAs发现至今的主要研究成果,从FAHFA的生理功能、代谢、生物体内的储存形式、分析检测和化学合成等五个方面进行介绍,以期为未来FAHFAs领域的研究提供一些借鉴。

Abstract

Branched fatty acid esters of hydroxy fatty acids (FAHFAs) are a new class of functional lipids. It has been reported that they play important roles in mammals, such as improving glucose tolerance, enhancing insulin sensitivity, maintaining blood glucose homeostasis, and anti-inflammatory. Since its discovery in 2014, FAHFA has been attracting more and more attention of scientists, and has become a new branch of lipid research. This review summarizes the research advances of FAHFA since its discovery, covering the physiological function, metabolism, storage in organism, analysis and chemical synthesis of FAHFA.

Contents

1 Introduction

2 Advances since the discovery of FAHFAs

2.1 FAHFAs biological functions

2.2 FAHFAs metabolism

2.3 Storage forms of FAHFAs in vivo

2.4 FAHFAs analysis

2.5 FAHFAs synthesis

3 Conclusion and outlook

Graphical abstract

关键词

羟基脂肪酸支链脂肪酸酯 / 生物功能 / 分析检测 / 化学合成

Key words

FAHFAs / biological function / analysis and detection / chemical synthesis

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朱泉霏, 郝俊迪, 严靖雯, 王雨, 冯钰锜. FAHFAs:生物功能、分析及合成[J]. 化学进展, 2021, 33(7): 1115-1125 DOI:10.7536/PC200741

Quanfei Zhu, Jundi Hao, Jingwen Yan, Yu Wang, Yuqi Feng. FAHFAs: Biological Functions, Analysis and Synthesis[J]. Progress in Chemistry, 2021, 33(7): 1115-1125 DOI:10.7536/PC200741

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1 引言

脂质是生物系统的重要组成部分,在生物体内具有许多重要生理功能,如构成细胞屏障和膜基质,参与细胞间信号传导,储存能量等。脂类的组成是高度复杂和动态的,根据其结构上极性头部基团和所链接脂肪链的差异,可将脂质分为数个类别及亚类别^[1]。目前已知的脂质分子种类约为数十万种,其含量水平在amol/L ~ nmol/L之间。目前,随着脂质组学研究技术的发展以及生物学研究的深入,一些新的、具有重要生理学功能的脂质分子又陆续被发现。

2014年,Yore等^[2]利用脂质组学分析技术,通过比较过表达葡萄糖转运载体 4(glucose transporter 4,Glut4)的转基因模型小鼠(AG4OX)和野生型小鼠(WT)的脂肪组织中脂质的变化,发现在AG4OX小鼠的脂肪组织中有一类分子,其含量相较WT型小鼠上调了约16~18倍。经过分析鉴定,该类分子被确定为一类新发现的脂质分子,其化学结构由一分子脂肪酸(fatty acid, FA)和一分子羟基脂肪酸(hydroxy fatty acid,HFA)通过酯键连接而成。他们将其命名为羟基脂肪酸支链脂肪酸酯(branched fatty acid esters of hydroxy fatty acids,简称FAHFAs)。其中,不同的FA和HFA,可以形成不同的FAHFAs家族,而每一个FAHFA家族又可根据酯键位置的不同,构成酯键位置异构体^[2]。例如,由棕榈酸(PA)和羟基硬脂酸(HSA)经酯键连接而形成的化合物为palmitic acid-hydroxy stearic acid(PAHSA);当PA与羟基位置不同的HSA异构体结合生成PAHSA时,会产生多个酯键位置异构体,如3-PAHSA、5-PAHSA和9-PAHSA等。此外,通过研究FAHFAs的生物学功能,Yore等发现,FAHFAs在哺乳动物体内具有改善葡萄糖耐受性、促进胰高血糖素样肽(glucagon-like peptide-1, GLP-1)和胰岛素的分泌、增强胰岛素刺激的葡萄糖转运以及减少免疫巨噬细胞中炎症因子的产生等功能^[2]。因此,FAHFAs在哺乳动物体内具有抗二型糖尿病(T2D)和抗炎作用,并有望作为一种药物用于T2D的治疗^[2⇓~4]。

鉴于FAHFAs具有重要的生物学功能,自发现起便受到了化学家和生物学家的关注。本文总结了自FAHFAs发现至今相关领域的主要研究,重点从FAHFAs的生理功能、代谢、生物体内的储存形式、分析技术和化学合成等五个方面进行阐述,以期为FAHFAs的相关研究提供一点借鉴。

2 FAHFAs主要研究及其发展

2.1 FAHFAs的生理功能

如前所述,2014年Yore等^[2]首次发现FAHFA并对其生理功能进行了研究(图1)。他们发现PAHSAs水平与胰岛素敏感性高度相关,且在胰岛素抵抗者的脂肪组织和血清中明显减少。PAHSAs可以激活G蛋白偶联受体120(GPR120),促进葡萄糖受体GLUT-4的转运,从而增强胰岛素刺激的葡萄糖摄取。给予小鼠PAHSAs可以降低血糖,改善糖耐量,同时刺激GLP-1和胰岛素分泌。此外,PAHSAs激活的GPR120可以减少免疫巨噬细胞中白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的产生,从而缓解肥胖相关炎症。以上这些结果表明PAHSAs在维持葡萄糖稳态中起着重要的作用。研究这些脂质分子的水平及功能,可以为代谢性和炎症性疾病的发病机制及其治疗提供新的途径。

Yore等的研究提示FAHFAs与慢性疾病密切相关。基于此,目前针对FAHFAs生物功能的研究主要是探索其与多种慢性类疾病之间的关系。根据疾病的种类,我们从FAHFAs与炎症、FAHFAs与糖尿病以及 FAHFAs的其他生理功能研究这三个方面,对其生理功能的主要研究进行简述。

2.1.1 FAHFAs与炎症

分子的抗炎活性尤其重要,因为胰岛素抵抗、T2D的发展都与慢性低级别炎症密切相关。有关FAHFAs与炎症的报道最早来自Yore等的研究,他们通过测量喂食9-PAHSA 3天后的小鼠AT巨噬细胞(ATMs)中TNF-α和IL-1β的水平,发现了在高脂饮食喂养的小鼠体内,TNF-α和IL-1β在ATMs中的表达降低,说明9-PAHSA具有缓解肥胖相关炎症的作用^[2]。此后,一些课题组也陆续分享了关于FAHFAs抗炎活性的研究成果^[5⇓~7]。

2016年,Lee等^[5]通过给患有慢性结肠炎的小鼠灌胃5-PAHSA和9-PAHSA,考察它们对治疗溃疡性结肠炎的作用。他们发现5-PAHSA和9-PAHSA可以降低小鼠的体重,使 T淋巴细胞活性减弱,促炎因子和趋化因子的分泌减少。这些结果提示PAHSAs有望通过调节肠道的免疫系统来治疗慢性结肠炎。同年,Kuda等^[6]在脂多糖(LPS)刺激的巨噬细胞中发现了一种新的具有抗炎作用的FAHFA分子——docosahexaenoic acid-13-hydroxy linoleic acid(13-DHAHLA)。它可以通过减弱LPS诱导的巨噬细胞活化、增强酵母聚糖颗粒吞噬,从而达到抗炎、促炎症消退的作用。最近,Kolar等^[7]发现燕麦油馏分中富含FAHFAs,且观察到燕麦油馏分在LPS刺激的细胞因子分泌实验中表现出抗炎活性。为此,他们鉴定出燕麦油中含量比较丰富的三种LAHLAs,分别是15-LAHLA、13-LAHLA和9-LAHLA,其中13-LAHLA的含量最高。接着,他们进一步考察了13-LAHLA的抗炎活性,发现13-LAHLA可以抑制LPS刺激的细胞因子分泌和促炎基因表达,并显示出了比9-PAHSA更强的抗炎活性。

2.1.2 FAHFAs与糖尿病

在Yore等研究的基础上,针对FAHFAs的抗糖尿病特性,科学家们开展了更深入的研究。2016年,Saghatelian和Kahn等^[8]以PAHSAs为对象,深入研究其在抗T2D抗炎中的功能。他们发现PAHSAs水平与胰岛素敏感度高度相关。相较于健康人,PAHSAs的水平在胰岛素抵抗人群中更低。摄入PAHSAs可以有效增强胰岛素敏感度、促进胰岛素分泌。这些结果提示PAHSAs可能与T2D的患病病因有关,有望成为衡量胰岛素抵抗和T2D风险的新的生物标志物。随后,通过研究PAHSAs对T2D的治疗效果,发现长期的PAHSAs治疗可以显著改善高脂饮食喂养(HFD)小鼠体内的血糖调节失常症状。在被治疗的HFD小鼠血清中PAHSAs含量显著上升,胰岛素敏感性和葡萄糖耐量均显著改善,同时其皮下白色脂肪中的炎症因子水平也有下降。此外,该研究还发现,另一个重要的G蛋白偶联受体GPR40,也是PAHSAs的作用靶标。这项研究进一步证实了FAHFAs的抗T2D功能,也为临床医学中治疗T2D提供了新的思路。安全的胰岛素增敏剂可用于预防和治疗胰岛素抵抗、T2D及心血管并发症。目前除噻唑烷二酮外,市面尚无主要用于改善胰岛素敏感的糖尿病药物,安全的胰岛素敏化剂有望弥补医疗需求缺口,而FAHFAs或可作为该类药物的侯选物^[8,9]。

此外,科学家们也对FAHFAs与胰岛素依赖型糖尿病(Ⅰ型糖尿病,T1D)的关系进行了研究。Kahn等发现,每天向非肥胖糖尿病模型(NOD)小鼠喂服PAHSAs,可以显著降低T1D的发生率,延迟T1D的发病时间^[10,11]。这是由于PAHSAs可以通过减弱自身免疫应答,直接对胰岛β细胞起到保护作用,维持β细胞的存活和功能。同年,Hamad等^[12]也报道了相似的结果。鉴于目前临床上缺乏有效的T1D治疗方法,且PAHSAs的已知副作用很少,因此PAHSAs对于具有T1D风险的个体具有治疗潜力。

2.1.3 FAHFAs的其他生理功能研究

2018年,Brezinova等^[13]首次对母乳中的FAHFAs进行了研究。他们在母乳中检出了多种PAHSAs,其中5-PAHSA在母乳中的水平明显高于血清和其他组织。此外,他们还发现母亲的胖瘦程度与其母乳中PAHSAs的浓度有关,即:在体型瘦弱母亲的母乳中,PAHSAs的含量高于体型肥胖的母亲。小鼠母乳实验的结论也符合这一特征。FAHFAs可以由母亲的胃肠道吸收、再转移到新生儿的体内,而母乳中含量较丰富的5-PAHSA在新生儿发育中的影响尚待确定。

2019年,Balsinde等^[14]通过分析人体结肠直肠肿瘤中9-羟基硬脂酸(9-HSA)和PAHSAs的变化,首次探讨了PAHSAs与结直肠癌之间的关系。他们观察到,与癌旁组织相比,结肠直肠肿瘤组织中9-HSA水平降低,而PAHSAs的水平升高。鉴于9-HSA可能是9-PAHSA的合成前体,并且已被证明可以诱导细胞周期停滞和凋亡。因此,他们进行了细胞实验以考察9-PAHSA和9-HSA对结直肠癌细胞(HT-29和HCT-116)的影响。他们向结直肠癌细胞中分别添加9-PAHSA和9-HSA,观察了细胞的凋亡情况,发现在较宽的9-PAHSA浓度范围内不会造成结直肠细胞系的凋亡,而添加9-HSA则可以在细胞凋亡前增强9-PAHSA的合成。因此,他们推测在结直肠癌细胞中,PAHSAs的合成过程类似“一个缓冲系统”,对结直肠癌细胞的凋亡表现出保护作用。最近,Liu等^[15]的研究也从侧面支持了以上结果,他们发现PAHLAs在结直肠癌病人血浆中含量升高。关于FAHFAs与癌症的关系研究,2017年,本课题组也曾做过初步的探索。我们分析了健康人和乳腺癌病人血清中16种FAHFAs含量的变化,观察到与健康对照组相比,乳腺癌患者血清中的9-PAHSA、13-PAHSA、12-SAHSA和13-SAHSA的水平显著降低^[16]。这暗示了FAHFAs和乳腺癌症之间可能具有潜在联系,但具体机制需进一步探索。

最近,本课题组分析了来自九个不同月龄(1、2、3、6、9、12、15、18和24个月)的80只C57BL/6J雄性小鼠的内脏脂肪组织样品,研究了FAHFAs与年龄的关系^[17]。我们观察到随着小鼠年龄的增长,其内脏脂肪中的FAHFAs的种类逐渐增多,所检测到的FAHFAs家族数目,从幼年时期的35个家族(1个月龄)增加到老年时期的46个家族(18个月龄)。此外,我们还发现小鼠内脏脂肪组织中FAHFAs的含量与年龄也是高度相关的。FAHFAs的质量浓度在中年时期(3~15个月龄)普遍低于幼年时期(1~2个月龄)和老年时期(18~24个月龄)。然而,由于中年小鼠的内脏脂肪质量远大于幼龄或老龄小鼠,因此,在中年小鼠的内脏脂肪中,FAHFAs的总量又会偏高。该研究提供了小鼠内脏脂肪中的FAHFAs在整个生命周期中的代谢足迹,有助于FAHFAs在生长、发育和衰老过程中作用机制的研究。

从最初发现FAHFAs具有抗T2D和抗炎症功能至今,关于FAHFAs生理功能的研究逐渐扩展。目前,已经探究了与癌症、肥胖和衰老等慢性疾病或生理状态之间的关系,并取得初步成果。这些初步成果暗示了生物体内的FAHFAs可能与多种疾病或生理状态都有关系。遗憾的是,目前这些研究大多数都停留在初步现象的观察,而有关作用机制并未清楚,更深层次的研究有待进行。

2.2 FAHFAs的代谢

FAHFAs代谢研究是揭示FAHFAs生理作用机制的关键。但目前FAHFAs代谢机制仍然知之甚少,FAHFAs的合成酶尚未见报道。迄今已发现的FAHFAs水解酶有三种。

Parsons等^[18]通过蛋白活性实验(activity-based protein profiling)发现androgen-induced gene 1 protein(AIG1)和androgen-dependent TFPI regulating protein(ADTRP)两种酶可以特异性地水解FAHFAs。这两种水解酶具有区域选择性,当FAHFAs结构中的酯键位置距离羧酸基团越远时,水解速率越快;反之,则越慢。随后,Kolar等又报道了第三种FAHFAs特异性水解酶,carboxyl ester lipase(CEL)^[19]。CEL存在于胰腺细胞膜上,其水解FAHFAs的速率是AIG1和ADTRP的两倍左右,且同样具有与AIG1和ADTRP相似的区域选择性。

关于FAHFAs在哺乳动物体内的合成,Kuda等^[20]提出了一个可能合成路径。该路径与核因子Nrf2和PRDX6调控的抗氧化途径有关。以9-PAHSA为例,他们推测合成途径如下:首先,膜磷脂(phospholipid,PhL)被活性氧氧化成磷脂过氧化物(PhL-OOH);随后,PhL-OOH经过过氧化物酶催化进一步转化为带羟基脂肪酸的磷脂(PhL-OH);最后,HSA又从PhL-OH中释放出来并在酰基辅酶A(acyl-CoA)的作用下,合成9-PAHSA(图2)。这种合成路径理论上倾向于优先合成酯键位置在羟基脂肪酸链中间的异构体,而对于酯键位置在羟基脂肪酸链两端的异构体的合成机制有待研究。

FAHFAs的分子多样性使得FAHFAs合成代谢和分解代谢途径更加复杂。FAHFAs代谢研究是FAHFAs研究领域面临的关键问题和重要难点,其合成酶、水解酶以及代谢途径的发现和确定需要生物学家和化学家的通力合作。

2.3 FAHFAs在细胞内的储存形式

在生物体内,FAHFAs除了游离态之外,还存在结合态的形式。McLean等^[21]最先在甘油三酯(TAG)中观察到FAHFAs。他们通过分析毛尾袋貂(一种原产于澳大利亚的有袋动物)泪道旁腺中的脂质,发现了约150种可能的FAHFA-TAGs。值得注意的是,他们在其他部位的脂肪组织(如腹部和肾脏周围的脂肪)中未检测到FAHFA-TAG,因此,他们猜测这些存在于泪道旁腺中的FAHFA-TAGs可能是一种有助于动物之间嗅觉交流的信号分子。此工作首次发现了FAHFA-TAG的存在,但并未对其化学结构进行准确鉴定。

直到2019年,Saghatelian等^[22]采用化学合成法合成了FAHFA-TAGs标准品,并研究其质谱裂解规律(图3)。他们对小鼠脂肪组织中的FAHFA-TAGs进行了检测和鉴定,发现在脂肪组织中FAHFA-TAGs的含量高于游离的FAHFAs的含量。他们猜测FAHFA-TAGs相当于在生物体内的 FAHFAs的“储存器和缓冲器”,通过调节脂肪酸酯化和TAGs水解的平衡,维持细胞中FAHFAs含量的稳定。脂肪甘油三酯脂酶(adipose triglyceride lipase, ATGL)则是控制FAHFA-TAGs水解的“开关”。

FAHFA-TAGs的发现丰富了关于FAHFAs在生物体内储存形式的认识。除了已发现的FAHFA-TAGs以外,在其他脂质分子,如甘油二酯、磷脂、胆固醇酯中是否也存在FAHFAs结合的形式?如果有,这种FAHFAs结合型脂质在生物体的分布如何?有什么样的功能?这些问题还有待研究。

2.4 FAHFAs分析方法

如前所述,FAHFAs在哺乳动物体内具有许多重要的生理功能;而这些功能的研究依赖于高效的FAHFA分析技术。在过去的五年中,基于液相色谱-质谱技术(LC-MS、LC-MS/MS或LC-MS³),已开发了数种复杂样品中FAHFAs的目标性绝对定量和非目标性全分析方法,基本实现了稳定、可靠、快速和高灵敏度的FAHFAs绝对定量分析和FAHFAs的筛查。

2.4.1 FAHFAs绝对定量分析

FAHFAs在生物体内的含量很低(人体血清中含量约为0.2~15 nmol/L;小鼠脂肪组织中约为10~2500 pmol/g^[2])且生物样品基质组成复杂,因此,在检测之前通常需要对生物样品进行前处理,对FAHFAs进行富集纯化。此外,每个FAHFAs家族含有多个同分异构体,其分子质量相同,化学性质相似,因此要将他们分离并实现同时检测对分析方法的分辨能力是一个巨大的挑战。

2016年,Kahn等^[23]报道了一种FAHFAs的LC-MS定量检测方法,该方法与Yore等工作^[2]中所使用的分析方法一致。基本流程如下:首先,利用Bligh-Dyer脂质提取技术对生物样品中的脂质化合物进行提取;然后,采用固相萃取技术(solid-phase extraction, SPE)进一步除杂和纯化。该步骤主要基于正相色谱原理,以硅胶为萃取柱填料,正己烷、乙酸乙酯为溶剂,去除脂质提取物中的大部分中性脂质杂质如甘油三酯和甘油二酯等,减少对FAHFAs的检测的干扰;最后,使用高效液相色谱/电喷雾电离-三重四极杆质谱(HPLC-ESI-QqQ MS)对FAHFAs进行检测。在LC-MS分析过程中,为了实现FAHFAs异构体的基线分离,他们使用了等度洗脱,整个LC分析时间约为90 min。该方法的重现性好,但样品前处理过程复杂、分析耗时长、有机溶剂消耗大且检测灵敏度较差。为了提高分析效率,他们又对上述方法进行了改进,使用了分离效率更高的UPLC系统,用Acquity UPLC BEH C18(2.1 × 50 mm, 1.7 μm, Waters)色谱柱对FAHFAs进行分离,在维持原有分离分辨率的基础上,将色谱分析时间由90 min缩短至30 min( 图4)^[24]。较快的分析速度有助于实现FAHFAs的高通量分析。

为了实现快速、自动化的分析,López-Bascón等^[25]将自动化固相萃取(Auto-SPE)技术与LC-MS分析相结合建立了检测人体血清中FAHFAs的方法。他们使用Hysphere C8 cartridges (7 μm, 10 × 2.0 mm, Spark Holland) 作为SPE萃取柱,构建在线富集方法,达到自动化富集和分离分析同时进行的效果。Auto-SPE的应用使得操作更加快速、自动化,降低了样品前处理的压力,减少了样品分析的时间(每个样品的检测时间约25 min),但是它的检测灵敏度有限,并且只能分离FAHFAs家族,不能分离位置异构体。

上述分析方法虽然可以实现复杂样品中FAHFAs的绝对定量,但是分析灵敏度较低,不利于低丰度的FAHFAs的检测。FAHFAs在ESI-MS中检测灵敏度较低的原因可归结为:FAHFAs结构中含有羧酸基团,通常在负离子模式下检测,电离效率较低,从而限制了检测灵敏度。为了解决这个问题,分析化学家们将化学衍生化技术和柱后溶剂增敏技术引入到了FAHFAs的检测中,以提高FAHFAs分析的检测灵敏度。

化学衍生化技术是通过利用羧酸的衍生化试剂对FAHFAs进行标记,在FAHFAs结构上加入质谱增敏基团(如易在正离子模式下电离的碱性基团)从而提高其在ESI中的离子化效率,增强质谱响应^[26,27]。利用该技术,本课题组开发了一种FAHFAs的高灵敏定量方法^[16]。整个分析策略如图5所示。在该策略中,我们使用了强阴离子交换固相萃取(SAX SPE)技术对实际样品中的FAHFAs的提取物进行分离纯化。此外,用一对同位素标记试剂N,N-二甲基乙二胺(DMED)和d₄-DMED标记FAHFAs。DMED上含有的叔胺基团可作为增敏基团,

提高质谱响应;而d₄-DMED标记的FAHFAs标准品作为同位素内标,校正质谱信号。经DMED标记后,FAHFAs的检测灵敏度提高约两个数量级,色谱分析时间也有缩短(20 min以内即可完成16个FAHFAs的基本分离)。该方法适用于多种生物样品中FAHFAs的绝对定量分析。

基于衍生化技术,Han等^[28]也提出了一种多维质谱鸟枪法脂质组学(MDMS-SL)结合化学衍生的方法对生物样品中的FAHFAs进行检测。N-[4-(氨甲基)苯基]吡啶(AMPP)被用作衍生化试剂与FAHFAs进行酰胺化反应,其结构中的季铵基团可以显著提高FAHFAs的质谱信号(图6)。该方法的特点在于样品经前处理和化学衍生后,不使用色谱分离,直接进行ESI-MS分析,可以大大缩短分析时间,缺点是只能对一个FAHFAs家族进行整体的定性定量分析,不能完成同分异构体的分离和定量。

Cindrić等^[29]于2019年运用Nano-LC和柱后溶剂增敏结合ESI-MS技术,分析了约20种食物(苹果、柑桔等)中16种FAHFAs的含量。他们使用甲酸乙酯作为柱后流动相改性剂,以提高FAHFAs在负离子模式下的离子化效率,从而获得与正离子模式相当的检测灵敏度。通过分析这20种食物中的FAHFAs的含量,他们发现在燕麦、柑桔、大蒜和菠萝中FAHFAs的含量最高;SAHSAs在具有抗氧化、抗炎作用的食品中的含量最为丰富;而某些食物,如萝卜、梨、芒果、柠檬、樱桃番茄和猕猴桃中未检测到PAHSAs(先前被证明具有降血糖和胰岛素敏感作用^[2,8])。

2.4.2 FAHFAs的筛查分析

前期研究表明,生物体内含有十分丰富的脂肪酸和羟基脂肪酸,它们的存在有可能为FAHFAs 的合成提供重要的前体。Fiehn等^[30]利用计算机模拟对自然界中可能存在的 FAHFAs 结构进行了预测,结果显示自然界中存在的 FAHFAs分子数目可能超过1000种。为了完善FAHFAs的分子种类信息,目前已开发了两种FAHFA非目标性筛查分析方法,用于新型FAHFAs分子的发现。

2018年,本课题组开发了化学同位素标记辅助液相色谱-质谱联用(CIL-LC-MS)的策略对水稻和拟南芥中FAHFAs进行筛查分析^[31]。整个策略如图7所示。水稻和拟南芥组织经过样品前处理后,分别用DMED和d₄-DMED试剂进行标记;随后,将两份标记样品按照1∶1混合进行LC-MS分析。在质谱分析方面,我们根据DMED和d₄-DMED标记后的 FAHFAs 的碎裂规律,设计出可能的 FAHFAs母离子和子离子,然后采用三重四极杆质谱的多重反应监测(multiple reaction monitoring,MRM)模式对样品中可能的FAHFAs进行检测。记录一对“轻”/“重”标记的MRM扫描质谱图中保留时间一致,质谱信号强度相似的峰,即为潜在的FAHFAs化合物。利用该方法,我们一共在水稻和拟南芥中检测到了49个FAHFA家族(262种异构体),其中有41个FAHFAs家族是首次报道。该发现扩大了已知的FAHFAs家族种类,同时提示FAHFAs不仅是一类哺乳动物脂质分子,在植物体内也广泛存在。

Zhang等^[32]利用超高液相色谱结合四极杆飞行时间质谱(UHPLC-Q-TOF MS)对仓鼠的脂肪组织中的FAHFAs进行了筛查。Q-TOF MS可以同时采集化合物的一级和二级高分辨质谱图,再根据FAHFAs的精确分子量和碎裂特征从中筛选出潜在的FAHFAs。最终,他们在仓鼠脂肪中一共检测到了17个FAHFAs家族(64种异构体),其中有9个家族是首次报道。

FAHFAs筛查方法的建立和应用扩大了关于FAHFAs分子种类的认识。截至目前,包括Kuda等和Thomas等在巨噬细胞和鹿肉中发现的11种FAHFAs家族在内^[6,33],研究人员一共在多种生物样品中发现75个FAHFAs家族,约300余个异构体(表1)。

2.4.3 FAHFAs的鉴定

FAHFAs的结构鉴定对于解释其生物化学相关性至关重要。常用的FAHFAs鉴定方法有:标准品比对法、代谢库搜索法和质谱解析法。标准品比对法适用于有可市售标准品的FAHFAs的鉴定;质谱解析技术可以提供FAHFAs的家族归属信息,但难以确定低丰度异构体的酯键位置^[34];在数据库方面,截至目前,人类代谢组数据库(Human Metabolome Database, HMDB, https://hmdb.ca/)和Lipid Map数据库(http://www.lipidmaps.org/)共记录了103个FAHFAs分子结构,这些信息为FAHFAs的鉴定提供重要的参考。

除了上述常用的代谢物鉴定技术以外,本课题组通过研究FAHFAs在反相色谱柱(C18柱)上的保留行为与其结构之间的关系,发现FAHFAs的两种色谱保留规律,酯键位置规律和碳数规律^[31]。酯键位置规律:在同一个家族中,当FAHFAs异构体的酯键距离羧酸基团越近时,在C18柱上的保留越强,且保留因子(log₁₀k)与酯键的位置线性相关。碳数规律:当FAHFAs结构上的FA或HFA固定不变时,保留时间随FA或HFA碳数的增加而线性增加。基于这两个规律,我们建立了预测模型,用于识别来自不同FAHSAs家族的位置异构体的结构(图8)。此外,为了辅助FAHFAs的识别,最近本课题组和Fiehn等合作,开发了一个DMED-FAHFAs的计算机模拟数据库。该质谱库涵盖了264个FAHFAs家族种类,包括4290个高分辨率串联质谱图数据^[35]。

在绝对定量分析方面,目前已开发的FAHFAs定量分析方法基本可以实现毫克级生物样品中FAHFAs的检测。在未来的定量分析方法研究中,简便、快速、高通量、更好的分离分辨率以及更高的检测灵敏度仍然是FAHFAs定量分析技术追求的目标。良好的FAHFAs异构体分离对于研究FAHFAs的异构体特异性而言非常重要,而更高灵敏度的FAHFAs分析方法的开发将有利于从细胞层面探究FAHFAs的水平,这些技术水平的提升对于FAHFAs作用机制的研究都具有重要意义。在FAHFAs筛查分析方面,鉴于FAHFAs具有分子多样性,并且不同的生物体内所含有的FAHFAs不尽相同,因此,对FAHFAs进行深度筛查是非常重要的。这不仅有助于发现新的FAHFAs分子,对于完善关于FAHFAs分子种类的认识也具有重要意义。FAHFAs结构鉴定是FAHFAs分析的重点和难点。尽管目前我们所开发的基于色谱保留规律的定性技术在一定程度上可以解决部分饱和FAHFAs鉴定的问题,但对于广泛存在的不饱和FAHFAs的鉴定仍然非常困难。因此,如何实现由不饱和脂肪酸组成的FAHFAs的结构鉴定将是未来FAHFAs分析研究的努力方向。

2.5 FAHFAs化学合成

FAHFAs的合成有助于FAHFAs分子的结构鉴定及其生物功能研究^[36]。目前已报道的FAHFA的化学合成方法主要有以下三种。

(1)Yore等^[2]在2014年首次报道了FAHFAs的合成。基本化学合成步骤如图式1所示:① 以十四烷醛为原料,与4-戊烯基溴化镁反应得到相应的醇;② 该醇与十六烷酸酸酐发生酯化反应得到烯酯;③ 最后,烯酯经臭氧氧化反应以及Pinnick氧化反应得到5-PAHSA。这条合成路径的优点是反应步骤较少,缺点是产率较低,在酯化反应中原子利用率不高,反应原料十四烷醛价格比较昂贵。

(2)2016年,Balas等^[37]发展了第二种合成FAHFAs的方法。基本化学合成路径如图式2所示。以9-PAHPA的合成为例:①先利用TBSCl对烯醇的羟基进行TBS保护;②末端的烯基在mCPBA作用下生成环氧化合物;③环氧化合物在炔基锂和三氟化硼作用下发生开环反应,得到β-炔醇;④ 炔醇的炔基通过氢化还原,得到了相应的仲醇;⑤ 仲醇通过Steglich酯化反应生成酯;⑥ TBAF作用下脱TBS保护得到伯醇;⑦ 伯醇通过琼斯氧化反应生成相应的羧酸,即9-PAHPA。该合成方法的优点是可用于合成多种FAHFA同系物,缺点是在合成的最后一步使用了铬,有一定的化学毒性。

(3)2017年,Nelson等^[38]报道了9(R)-PAHSA和9(S)-PAHSA对映异构体的合成方法(图式3)。他们使用手性池策略来确保所需的羟基结构。① 在铜促进下使用格氏试剂对光学纯的环氧氯丙烷进行区域选择性开环和烷基化反应;② 在碱性条件下重新生成环氧化物;③ 使用另一种格氏试剂重复上述步骤进行区域选择性开环得到相应的醇;④ 该醇进行酯化取代反应与氧化反应,最终合成9(R)-PAHSA。该反应总产率约为35%,所收获产物纯度为98%。同理,使用R-环氧氯丙烷可以生成9(S)-PAHSA对映异构体。

FAHFAs的合成对于其分析检测和生理功能研究十分重要。FAHFAs标准品是分析研究的基础,也是生理功能和代谢路径研究必不可少的工具。目前,已开发的FAHFAs化学合成方法可以基本满足一般性标准品合成需求。未来FAHFAs合成方法的开发会朝着更简单、便宜和高产率的方向进行改进。考虑到FAHFAs具有成为糖尿病治疗药物的可能,实现高产率、大批量的FAHFAs的合成非常重要。此外,除了已开发的FAHFAs化学合成方法外,生物合成技术也是一种有前景的合成技术。它具有反应条件温和、反应产率高、对环境污染小和易放大生产等优点。遗憾的是,目前关于FAHFAs的催化合成酶的研究尚未成熟,有关该技术在FAHFAs合成中的研究仍需进一步探索。

3 结论与展望

随着FAHFAs研究的逐渐深入,FAHFAs在脂质组学研究领域的影响也逐步扩大。目前,关于FAHFAs的生理功能、代谢、储存形式、分析检测和合成等多个方面开展了较丰富的研究,并取得了一定的成果。在FAHFAs生理功能研究方面,从最初的抗T2D和抗炎症功能研究逐步向与多种慢性炎症性疾病的相关性研究扩展,并观察到一些有趣的现象。但可惜的是,这些现象背后的作用机制很多还不清楚,FAHFAs的代谢途径及其合成酶也未确定,这也是未来FAHFAs相关研究的重要方向,其对于阐释FAHFAs的生理功能而言至关重要。在分析技术方面,快速、高通量、高灵敏度以及更好的分离分辨率仍是未来FAHFAs分析研究的目标。高效的分析技术将对于从细胞层面去研究FAHFAs的作用机制以及完善关于FAHFAs分子种类的认识都具有重要意义。在合成技术上,简单、便宜和高产率是合成技术改进的方向,这将有助于将来FAHFAs作为药物的批量化生产。

参考文献

原文顺序 | 出版日期 | 本文引用

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基金资助

国家自然科学基金项目(21635006)

国家自然科学基金项目(31670373)

国家自然科学基金项目(21721005)

国家自然科学基金项目(21904099)

中国博士后科学基金项目(2018M642893)

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Received	Published	Revised
2020-07-20	2021-07-20	2020-11-18
Online Date
2020-12-28

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