石墨烯在神经电信号检测中的应用

吕苏叶; 邹亮; 管寿梁; 李红变

doi:10.7536/PC200811

化学进展 ›› 2021, Vol. 33 ›› Issue (4) :568-580 DOI: 10.7536/PC200811

综述

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石墨烯在神经电信号检测中的应用

吕苏叶 ¹^,²^,³ ,
邹亮 ¹^,²^,³ ,
管寿梁 ¹^,²^,³ ,
李红变 ¹^,²^,^*

作者信息 +

Application of Graphene in Neural Activity Recording

Suye Lv ¹^,²^,³ ,
Liang Zou ¹^,²^,³ ,
Shouliang Guan ¹^,²^,³ ,
Hongbian Li ¹^,²^,^*

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摘要

神经电极是监测大脑活动的重要工具,在理解大脑运行机制和治疗神经系统疾病等领域发挥着重要作用。实现神经电极对神经电信号的长期稳定检测,构筑可靠的电极-神经界面是关键。传统的神经电极多采用刚性材料,与柔软的神经组织力学性能不匹配,限制了其对神经电信号的长期稳定记录。石墨烯是一种具有单原子层厚度的二维碳纳米材料,具有高的导电性、力学柔性和良好的生物相容性,可以与神经细胞/组织构筑稳定的电极-神经界面,从而实现神经电信号的长期稳定记录。本文梳理了石墨烯在神经电信号检测中的应用,包括石墨烯-细胞的相互作用及利用石墨烯神经电极进行体外和在体神经电信号的检测和记录等。最后,对石墨烯在神经电信号检测方面的未来发展方向进行了展望。

Abstract

As a powerful tool for monitoring brain activities, neural electrodes have been playing a crucial role in the understanding of brain functions and the treatment of neurological disorders. In particular, the construction of a stable electrode-neural interface is critical for the stable chronic neural recording. However, conventional neural electrodes are mainly constructed with rigid materials, whose Young’s moduli are several orders of magnitude higher than that of the brain tissue. This large mechanical mismatch causes the micromotion of the neural electrodes, which elicits inflammatory response of the brain tissue and thus limits the stable chronic neural recording. With the one-atom thickness, graphene has been considered as a promising active material for neural electrodes with stable electrode-neural interfaces for its high conductivity, excellent flexibility and good biocompatibility. In this review, we provide an overview of graphene for neural activity recording, from their modulation on the growth of neurons to applications in bothin vitro and in vivo neural activity recording. At last, challenges and prospects of graphene for neural activity recording are proposed.

Contents

1 Introduction

2 Graphene microelectrodes for cell culture and in vitro neural activity recording

2.1 Graphene for cell growth and modulation

2.2 Graphene microelectrodes for in vitro neural activity recording

3 Graphene microelectrodes for in vivo neural activity recording

3.1 Graphene-based electrocorticography(ECoG) electrodes for neural activity recording

3.2 Graphene-based intracortical electrodes for neural activity recording

4 Conclusion and prospects

Graphical abstract

关键词

石墨烯 / 神经电极 / 电生理 / 界面 / 长期稳定记录

Key words

graphene / neural electrodes / electrophysiology / interface / stable chronic recording

引用本文

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吕苏叶, 邹亮, 管寿梁, 李红变. 石墨烯在神经电信号检测中的应用[J]. 化学进展, 2021, 33(4): 568-580 DOI:10.7536/PC200811

Suye Lv, Liang Zou, Shouliang Guan, Hongbian Li. Application of Graphene in Neural Activity Recording[J]. Progress in Chemistry, 2021, 33(4): 568-580 DOI:10.7536/PC200811

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1 引言

人类大脑的功能实现依赖于大量神经元的协同电生理活动^[1]。利用神经电极对神经元电生理活动进行记录以及对神经元进行刺激从而调控神经电活动,对于提高人们对神经环路机制的理解以及神经性疾病(如帕金森综合征、癫痫等)的治疗具有重要意义^{[2⇓⇓⇓~6]}。此外,通过神经电极在神经元和外部装置之间建立脑-机接口,开发新一代用于控制假肢和运动康复的神经假体设备,实现对外部驱动假肢的控制,为修复或替代受损的神经功能提供了新的契机^[7,8]。实现对神经电信号的高灵敏、稳定测量以及对神经元的高效、稳定刺激,构建可靠的电极-神经界面是关键^[9]。经过近七十年的发展,以犹他电极^[10⇓~12]、密西根电极^[13,14]和金属微丝电极^[15]为代表的神经电极已经可以对神经元电活动进行高时空分辨率的记录和刺激。同时,基于神经电极的快速发展,脑-机接口的建立已经让运动和感觉功能丧失的患者突破自身行动障碍与外界进行交流^[3,16]。但是,目前神经电极主要由刚性材料,如硅和贵金属(金、铂、铱)等组成^{[10,13,17⇓⇓⇓~21]},该类材料的杨氏模量约为100~500 GPa,而脑组织的杨氏模量仅为100 Pa~10 kPa^[22]。巨大的力学性能差异使得传统神经电极植入大脑后会随着头部活动及心跳、呼吸等生理活动产生微移动,进一步诱发胶质细胞聚集,形成胶质瘢痕^[23⇓~25]。随时间延长,胶质细胞作为绝缘层包裹于神经电极表面,从而阻碍电极对神经元电生理信号的长期稳定记录^[26,27]。此外,金属电极的易腐蚀性^[28⇓~30]也极大限制了传统神经电极的应用和发展。

石墨烯是一种由sp²杂化的碳原子组成的具有单原子层厚度的二维纳米材料^[31]。作为神经电极活性材料,石墨烯具有其他材料所不具备的诸多优势:(1)石墨烯具有良好的力学柔性^[32],可以与柔软的大脑组织形成紧密的接触从而构筑稳定的电极-神经界面。(2)石墨烯兼具良好的导电性能和优异的载流子迁移率,其载流子迁移率高达100 000 cm²·V^-1 ·s ^-1[33],这为基于石墨烯场效应晶体管的神经电极对神经电信号的高灵敏检测提供了条件。(3)由于只有单原子层厚度,石墨烯具有超高的比表面积,结合其独特的电学性能,使得石墨烯神经电极具有低的电化学阻抗和高的电荷注入能力^[34],为其对神经组织进行有效电刺激奠定了基础。(4)石墨烯具有高的透明度,单层石墨烯的透过率高达97.3%^[35]。因此,使用石墨烯电极可以在记录电生理信号的同时观察位于电极下方细胞、血管等随电生理活动的变化,为更加清晰地认识大脑结构和功能提供了技术手段。此外,基于高透明特性,石墨烯神经电极还可以与光遗传等技术相结合,实现对神经电活动的光学调控。基于以上诸多优势,石墨烯在基础神经科学和脑相关疾病等领域具有巨大的发展潜力。

本文概述了石墨烯在神经电生理检测中的研究进展,主要包括石墨烯对神经细胞的调控、利用石墨烯电极对体外和在体神经电信号进行记录等。最后,对石墨烯神经电极未来的发展方向进行了展望。

2 石墨烯与细胞的相互作用及对体外神经电信号的检测

神经细胞是组成脑组织的重要单元,神经电信号的产生主要是基于神经细胞的电生理活动。在细胞电生理活动时,大量的K⁺、 Na⁺穿过离子跨导膜,引起细胞外环境电势的变化^[36]。神经电极可以通过记录神经细胞外环境电势的变化,了解神经细胞的活动及病变机制。利用神经电极对细胞或体外组织进行电信号监测,可以避免神经电极对活体造成的侵入性伤害,为在体实验提供指导。以下将从石墨烯与神经细胞的相互作用和利用石墨烯电极进行体外神经电信号检测两方面介绍石墨烯对所培养神经细胞的调制及其在神经电信号检测中的应用。

2.1 石墨烯与神经细胞的相互作用

石墨烯具有良好的化学稳定性和生物相容性,因此其可以为神经细胞的培养提供理想的平台。此外,石墨烯还可以对其表面培养细胞的生长、分化、增殖等进行调节。在此基础上,进一步调控神经网络的电学性能,从而帮助重建受损的中枢神经环路,实现神经损伤修复。石墨烯自身为疏水结构,通过在其表面修饰聚乙二醇^[37⇓~39],聚赖氨酸^[40]、聚丙烯酸^[41]等亲水分子,可以增强细胞在其表面的贴附,从而促进神经细胞在石墨烯基底上的存活和生长。例如,Li等^[42]以化学气相沉积法制备的石墨烯薄膜为培养基底,进一步在其表面涂覆多聚赖氨酸(PLL)涂层以增强细胞在其上的贴附。与传统的聚苯乙烯基底相比,所培养的小鼠海马神经元细胞在培养初期具有更快的突触发芽和生长速度。此外,Agarwal等^[43]分别在单壁碳纳米管网络和石墨烯薄膜上培养大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤(PC12)细胞、少突胶质细胞和成骨细胞。结果显示,PC12细胞、少突胶质细胞和成骨细胞在石墨烯薄膜上均能得到很好的增殖,但是在碳纳米管网络上,细胞的增殖和活性则受到抑制。

近年来,神经干细胞(NSCs)作为一类在中枢神经系统中具备自我更新能力的多能细胞群受到了人们的广泛关注。神经干细胞有两个主要特性:(1)具有无限的自我更新能力。(2)多能性,可以分化为中枢神经系统神经外胚层谱系中所有类型的细胞,例如神经胶质细胞和各种神经细胞。利用神经干细胞进行脑修复和神经再生是目前治疗多种神经系统疾病的关键。NSCs的分化受细胞外和细胞内因素的共同影响,特别是其所处的特定微环境和细胞的代谢状态。通过在石墨烯和氧化石墨烯表面修饰胶原蛋白^[44]、层粘连蛋白^[45]和纤连蛋白^[46]等可以构建仿生微环境,从而促进人类神经干细胞(hNSCs)的附着、生长、增殖和分化^[47]。例如,Park等^[45]利用层粘连蛋白修饰的石墨烯薄膜作为基底培养人类神经干细胞,发现石墨烯衬底可以为人类神经干细胞提供更有利的微环境,从而促使神经干细胞向神经元分化(如图1a所示)。除此之外,在化学作用、物理或机械刺激的辅助下,石墨烯还可以促进人类间充质干细胞(hMSCs)分化为非间充质来源的组织,如神经元。Wang等^[47]利用氟化石墨烯中碳-氟键的强极性诱导骨髓间充质干细胞向神经元谱系分化。研究发现,具有强极性的石墨烯可以诱导细胞形貌产生方向性,由不规则多边形变成梭形,同时细胞核增长,从而更有利于向神经元分化。此外,在没有化学诱导物的情况下,通过将氟化石墨烯图形化为定向排列的长条微通道,也可以诱导间充质干细胞向神经元谱系的分化(如图1b,1c所示)。之后,Kim等^[48]发现在高度均匀的石墨烯基底上培养hMSCs的初期,hMSCs会短暂形成三维球体的形状。这种三维球体使得hMSCs中神经生成相关基因的表达上调,从而促进hMSCs向神经元谱系分化。

虽然通过氨基酸、蛋白质等修饰可以有效增加细胞在石墨烯上的贴附,但是这些涂层的引入也增加了神经元/界面的阻抗,影响了界面处的电荷转移,降低了电生理信号检测的灵敏度和可靠性。因此,在石墨烯基底上直接培养神经细胞,可以增强石墨烯与神经细胞的接触和电耦合,从而实现微弱电信号的检测。Bendail等^[49]首次证实初级视网膜神经节细胞可以在没有任何神经胶质支撑层或蛋白涂层的石墨烯基底上存活,虽然突触长度较有PLL涂层的石墨烯基底上有所减小。Fabbro等^[50]直接以液相剥离和球磨法制备的石墨烯微米片为基底培养海马神经元细胞,发现没有蛋白涂层的石墨烯基底是一种惰性的神经界面材料,可以保留神经细胞的电生理特性,不影响神经细胞之间的电荷转移。此外,Veliev等^[51]还发现石墨烯的结晶度在神经细胞的附着、生长和轴突的形成中起着重要的作用。高质量的石墨烯是神经细胞在其表面有效贴附的必要条件,随着石墨烯晶体质量的下降,神经细胞在其表面从高度贴附变为完全排斥。

生物体中的神经细胞存在于一个三维的生长环境中^[52]。相比于石墨烯薄膜,三维石墨烯支架更能模拟生物体的真实环境,如细胞-细胞、细胞-基质的相互作用等^[52],因此,以三维石墨烯支架作为细胞培养载体更能反映真实生物体中神经细胞的电生理行为。此外,三维支架更能促进PC-12细胞和神经干细胞的增殖和分化^{[53⇓⇓~56]}。三维石墨烯泡沫^[56]和rGO纤维细胞支架^[57]由于其纳米级多孔结构可以保证神经干细胞新陈代谢所需营养物质的大规模运输,从而使得神经干细胞处于活跃的增殖和分化状态。例如,Li等^[54]利用在泡沫镍上通过化学气相沉积法合成的三维石墨烯泡沫作为支架培养hNSCs(如图1d,1e所示)。研究发现三维石墨烯泡沫可以显著增强hNSCs向神经细胞和神经胶质细胞的分化。由于石墨烯具有良好的导电性,其还可以作为电极刺激分化后的hNSCs。除此之外,石墨烯的三维管状支架还可以用于创建具有高度精确几何形状的细胞结构,通过对空间排列的细胞结构进行高阶组装,可构建类脑功能组织。Sakai等^[58]提出一种可自折叠形成微卷的石墨烯/聚合物双分子层薄膜用于神经细胞的培养。同时,在微卷上创建小孔,使得神经细胞轴突通过小孔延伸与周围环境形成功能连接(如图1f,1g所示)。Qian等^[59]进一步将三维石墨烯衬底应用在人工神经导管中(如图1h所示)。该导管由聚多巴胺/多肽和石墨烯/聚己内酯逐层打印而成,其中聚多巴胺与多肽可以增加石墨烯与细胞的亲和性,石墨烯和聚己内酯可以强化管状结构,为长期在体研究提供一定的刚度。该神经导管在坐骨神经损伤动物模型中有效促进了轴突和髓鞘的再生,实现了外周神经的修复(如图1i所示)。

神经网络电信号是指构成功能性连接的群体神经元的电生理协同活动。研究神经元网络的电生理活动是理解神经环路形成的关键,合理地调控神经网络的电信号对于神经系统疾病的治疗具有重大意义。Tang等^[60]在石墨烯基底上分化hNSCs,发现分化后的hNSCs可以在石墨烯表面生长,并形成功能性连接的网络。此外,石墨烯基底上的神经网络的兴奋性和活跃性得到了明显增强,证明了石墨烯在体外调节神经网络行为的可行性。之后,Pampaloni等^[61]发现单层石墨烯可以限制靠近其表面的钾离子的迁移能力,从而调节神经元通讯并增强膜离子电流。研究发现,在石墨烯基底上记录的神经元突触电流与对照组相比频率明显提高(如图1j所示)。

以上研究结果表明,石墨烯对神经细胞具有良好的相容性。此外,石墨烯还可以对神经细胞的生长行为及神经网络电信号进行有效调控。基于这些特性,石墨烯有望被用于开发对神经系统友好的神经界面,为新型神经电极的制备创造机遇。

2.2 石墨烯神经电极对体外神经电信号的检测

石墨烯具有优越的生物相容性和电学性能,可以实现与神经组织有效的功能交互,使得大范围、高时空分辨率和长期稳定的神经电生理活动调控和记录成为可能。此外,相比传统金属电极,石墨烯具有极高的透明度,可以转移到透明衬底上制备透明神经电极阵列,在记录神经细胞电生理信号的同时不影响位点下方的成像。目前,基于石墨烯的液栅晶体管^{[62⇓⇓⇓~66]}和电极阵列^[67,68]已经被广泛用作心肌细胞和心肌样细胞的细胞外动作电位测量。与心肌细胞和心肌样细胞相比,大脑皮层神经网络的电生理活动更为复杂和随机。因此,对电极活性材料的电学性能要求更高。Chen等^[69,70]通过在石墨烯表面进行蒸气等离子体处理,降低石墨烯的阻抗,实现了小龙虾轴突动作电位的记录。该电极只有一个非常大的记录位点,限制了电极记录的分辨率。Du等^[71]以石英为基底制备了石墨烯微电极阵列用来记录从大鼠胚胎中分离的大脑皮质神经细胞的电生理活动(如图2a, 2b所示)。该器件的信噪比为10.31±1.2(如图2c所示)。之后,Kireev等^[72]以SiO₂/Si和硼化物玻璃为基底制造了类似的石墨烯微电极阵列。该器件在记录大鼠胚胎皮质神经细胞的电生理信号时信噪比达到(48±26)。相比于平面电极,三维电极可与细胞进行更好的耦合,在细胞外电位测量方面更有优势。Jeong等^[73]开发了一种基于石墨烯和碳纳米管阵列杂化材料(Graphene-VACNT)的神经电极(如图2d所示)。垂直碳纳米管与培养的神经细胞可以形成更紧密的接触界面(如图2e所示)。因此,该电极显示了较平面TiN电极更高的信噪比(如图2f所示)。

为实现石墨烯微电极对单个神经细胞电生理信号的检测和记录,石墨烯微电极的尺寸应该与单个神经元大小相当。然而,随着微电极尺寸的减小,其阻抗增加,器件的热噪声增加,信噪比降低。与微电极阵列相比,晶体管器件具有信号自放大、噪声低、灵敏度高等优点。此外,其跨导依赖于通道的几何形状因子(长宽比),突破了微电极阵列尺寸效应的限制,更易构筑高空间分辨率的神经电极。Cheng等^[74]首次利用石墨烯液栅晶体管(SGFET)电极记录了培养在其表面上的大脑皮层神经元的自发放电信号。与同类的晶体管器件相比,SGFET表现出更高的跨导率和更低的噪声水平。此外,该器件具有良好的力学柔性,经反复多次弯曲后,器件性能保持不变,为用于活体电生理信号检测的柔性神经电极的制备奠定了基础。此后,Veliev等^[75]分别在柔性聚酰亚胺基底和透明基底(蓝宝石,玻璃,SiO₂/Si)上制备了石墨烯液栅晶体管器件(如图2g所示),并将其用于小鼠初级海马神经元的神经信号记录(如图2h~2j所示)。实验证明,以蓝宝石为基底的石墨烯液栅晶体管的灵敏度最高,这可能与被束缚在蓝宝石基底界面的电荷密度较低有关。除此之外,为构建更稳定的石墨烯-神经元界面,Kireev等开发了一种新型的石墨烯液栅晶体管封装方法^[76]。通过只封装芯片上的金属线,防止培养神经元在接近石墨烯时产生弯曲应力,从而减少神经元与石墨烯之间的间隙。由于只有单原子层厚度,石墨烯往往需要借助高分子支撑层从生长基底转移至器件基底。该过程会在石墨烯的表面引入高分子残胶,从而增加石墨烯与金属电极之间的接触电阻,造成高的接触噪声。Schaefer等^[77]利用紫外线臭氧对石墨烯进行处理清除石墨烯表面的残胶,降低石墨烯与金属间的接触电阻。研究表明,臭氧处理的石墨烯器件较未处理的器件在周期性产生的海马片层信号记录中显示了更低的接触噪声和更高的信噪比。

以上结果显示,石墨烯在体外神经信号记录中显示了优异的电学性能和生物相容性。通过表面修饰或杂化,可以进一步降低石墨烯与生物界面的阻抗,从而提高所记录电生理信号的信噪比,为其在活体内的电生理信号记录奠定基础。

3 石墨烯神经电极对在体神经电生理信号的记录

相比于体外神经电生理信号,在体神经电生理信号的检测可以受到更少外界培养环境的干扰,更能体现脑组织中神经元的真实活动。石墨烯具有良好的力学柔性和生物相容性,兼具优异的电学性能,可以在避免引起脑组织严重免疫反应的同时满足长期稳定记录和电刺激的功能。本部分将从基于石墨烯的脑皮层电极和植入式电极两方面介绍石墨烯在颅内电极中的应用。

3.1 基于石墨烯的脑皮层电极

脑皮层电极(ECoG电极)可以记录多个底层神经元的集成信号。同时,相比于植入式电极,脑皮层电极对组织造成的创伤更小,已被广泛应用于神经系统疾病(如癫痫)的临床判断。石墨烯具有良好的透明度和优良的导电性,可用于构建透明的ECoG电极。这种神经电极与光学成像技术结合可以将组织观察和神经信号检测联系起来,有助于更加清晰完整地认识大脑的结构与功能。2014年,Park等^[78,79]利用四层石墨烯在聚氯代对二甲苯(parylene-C)基底上制备了具有17个检测位点的透明μECoG电极阵列(如图3a所示)。与传统金属电极相比,该电极显示了更高的透明度,可通过荧光显微镜和光学相干断层成像技术对石墨烯位点下方的血管进行观察(如图3b所示)。他们还结合光遗传技术,利用石墨烯μECoG电极阵列记录了转基因Thy1::ChR2小鼠在不同光照强度下大脑皮层的响应信号(如图3c所示)。可见石墨烯在透明神经电极领域具有良好的应用前景。在此基础上,他们将此透明石墨烯电极用作刺激电极调控小鼠脑皮层的神经电活动,并结合转基因GCaMPf6小鼠中的钙离子成像技术绘制了神经元在电刺激下的时空活动^[80]。Kuzum等^[81]通过将石墨烯表面暴露于浓硝酸(70%)中掺杂单层石墨烯增强其导电性,进一步利用掺杂的石墨烯制作透明的μECoG电极阵列。被掺杂的石墨烯具有界面电容大、电荷转移电阻小等特性,使得该神经电极的信噪比较相同尺寸的金电极高5~6倍。

透明神经电极与光遗传技术的结合实现了对电极位点处神经细胞在光刺激下活动状态的观察。但是由于光电(贝克勒尔效应)和光热效应,光刺激往往伴随着光伪迹,它在电生理记录中以瞬变或振荡的形式出现,从而干扰电生理信号的测量。Thunemann等^[82]采用“鼓泡法”转移工艺和基于聚甲基戊二酰亚胺(PMGI)的双层光刻技术,制备了一种无裂痕、无残胶的石墨烯透明神经电极阵列(如图3d所示)。研究发现,该电极可以消除光学引发的伪迹干扰,从而直接对小鼠大脑皮层的电生理活动进行高分辨、高信噪比记录(如图3e,3f所示)。此外,该研究还将神经电生理记录与深度分辨双光子成像、转基因钙离子成像等光学技术相结合,实现了由光遗传刺激引发的电极位点下方小动脉扩张以及血流动力学响应的光学观察,从而将透明石墨烯神经电极推广至一个适用于多种不同实验环境的通用平台^[82,83]。

虽然利用等离子处理、硝酸掺杂等化学处理可以降低石墨烯阻抗,但是化学处理对阻抗降低的作用有限,一般只能降低2~10倍。这主要是因为以上处理只是通过降低石墨烯的费米能级,提高其空穴浓度。然而,由于石墨烯量子电容太小,即狄拉克点态密度很低,因此,降低费米能级对空穴浓度的提高有限。针对这一问题,Lu等发展了一种通过在石墨烯上电沉积铂纳米粒子(PtNP)降低电极阻抗的方法^[84]。这种电极在保持光学透明度的同时,突破量子电容极限,将电极阻抗降低了100倍。利用该石墨烯/PtNP微电极阵列可以在记录大脑皮层表面神经信号的同时对不同深度的细胞进行钙离子成像。除了通过对石墨烯电极进行掺杂和修饰降低其阻抗外,调控石墨烯形貌也是一种有效降低电极阻抗的方法。Lu等^[85]利用激光热解法和硝酸掺杂在聚酰亚胺基底上制备了一种检测位点为三维多孔石墨烯的柔性ECoG电极阵列。该电极较平面电极显示了更大的比表面积和更低的电化学阻抗。这种电极在记录来自大脑皮层的低振幅诱发电位时显示了高的信噪比。

电极的阻抗并不是决定电极性能的唯一因素,这主要是因为与电极阻抗相关的热噪声并不是影响神经记录的唯一噪声源。记录系统中的电子噪声、生物噪声和其他与记录电极相关的噪声源极大地降低了神经电信号的检测和分类。相对于微电极阵列,场效应晶体管具有固有信号放大的性质,可以有效降低外部噪声从而提高器件的灵敏度^[86]。Garrido等^[87,88]利用化学气相沉积生长的单层石墨烯在聚酰亚胺基底上制备了一种石墨烯液栅晶体管(如图3g所示),并首次利用石墨烯液栅晶体管记录了大鼠在麻醉状态下脑皮层产生的自发慢波活动(如图3h所示)、视听觉皮层引发的响应信号和癫痫的同步放电活动。他们发现石墨烯电极的信噪比在低频的范围比铂黑电极更高(如图3i所示)。随后,他们对石墨烯液栅晶体管记录大脑皮层信号进行了更深一步的研究,证实了该石墨烯液栅晶体管可以在一个宽的电生理带宽中记录神经信号,特别是在低频范围内(<0.1 Hz)记录的信号信噪比更高,适用于记录皮层扩散性抑制信号,为实现高保真、高空间分辨率的低频信号的记录提供了可能^[89]。除此之外,为了解决金属作为源漏电极与石墨烯沟道之间接触电阻较大,且在发生柔性变形时,石墨烯和接触电极之间杨氏模量不匹配引起的分裂脱层问题,本课题组发展了一种全碳石墨烯晶体管器件。该晶体管由石墨烯沟道和石墨烯/碳纳米管杂化膜的源漏电极组成^[90]。由于沟道中的石墨烯与杂化电极中的石墨烯同步形成,晶体管沟道与源漏电极之间形成无缝连接结构。而且,与传统金属电极相比,石墨烯/碳纳米管杂化电极与石墨烯沟道的力学性能更加匹配,使得器件在承受弯曲形变时,石墨烯的跨导不发生变化。在此基础上,我们进一步采用机械压缩法制备了全碳褶皱纳米神经电极^[91]。与平面电极相比,该电极在保持有效面积相同前提下具有较低的投影面积,使得该器件用于检测大鼠癫痫信号时显示了较平面器件更高的空间分辨率。对于石墨烯场效应晶体管电极,电极位点数量的快速增加会导致连接器占用空间增加,现有的ECoG技术仍无法提供准确地绘制大脑高部化活动的分辨率。

Schaefer等^[92]在石墨烯液栅晶体管阵列中使用多路复用读出的办法,使得电极位点的增加变得更为合理,且制作器件的复杂性降低。石墨烯液栅晶体管中的畸变机制使得大振幅或高频率的信号记录失真的问题也受到研究人员的关注。Garcia-Cortabella等^[93]对石墨烯液栅晶体管中的谐波失真和非理想频率响应进行了详细的描述和建模。这种对于石墨烯液栅晶体管中输入输出关系的精确描述可以定义电压和频率相关的传递函数。最后,利用这种函数关系校准了从大振幅低频皮层扩散性抑制信号到低振幅高频动作电位等多种不同类型的电生理信号。

脑皮层电极作为检测大脑活动的实用工具可以揭示大脑特定区域在身体功能中的作用。然而,有些特定的信息(比如精确的移动)是由一小部分神经元以单个电位峰值的形式展现的。这样微弱的神经群体的电生理信号很容易在大脑皮层中消失,因此无法被检测到。这也限制了ECoG电极在微弱电生理信号检测方面的应用。

3.2 基于石墨烯的植入式电极

与皮层神经电极相比,植入式电极可以与神经元形成更紧密的接触,从而检测到微弱的神经集群的电生理信号。通过降低电极检测位点的尺寸,可以实现对单个神经元电信号的记录。由于石墨烯具有良好的生物相容性和电学特性,其作为刚性神经电极的表面涂层,可降低脑组织对神经电极的免疫反应。例如,Bourrier等^[94]将单层石墨烯薄膜用作密歇根电极的涂层。结果显示,具有石墨烯涂层的密歇根电极植入后其周围的星形胶质细胞和小胶质细胞的增殖减少,神经电极的信号质量和耐久性得到提升。Zhao等^[95]利用低压化学气相沉积法在铜微丝上合成无缝、全覆盖的石墨烯涂层(如图4a所示),有效降低了铜微丝的细胞毒性(如图4b所示)。该电极可以用于记录大鼠脑内局部场电位和单细胞动作电位(如图4c所示),且不会在MRI扫描仪中产生图像伪影。然而,涂层与电极之间结合的不稳定性可能会导致长期使用时涂层脱落和电极的失效。为了避免涂层脱落,Garrett等^[96]利用湿法纺丝制备了柔软的还原氧化石墨烯微纤维,并将其用作独立的神经刺激和记录电极。他们利用parylene-C封装还原氧化石墨烯微纤维,并对其前端进行激光烧蚀,形成“刷”状电极,以提高神经界面的质量。之后,Wang等^[97]通过在石墨烯纤维上修饰Pt涂层(如图4d、4e所示),制备了一种低阻抗的石墨烯复合微电极。在体研究表明,植入大鼠皮层内的电极可以在小至单个神经元的区域检测到高信噪比的神经元活动(如图4f所示)。

同样,石墨烯晶体管也可以作为植入式神经电极进行神经电信号记录。本课题组发展了一种基于石墨烯晶体管的双模式神经探针(如图4g所示)^[98]。该电极既可以作为脑皮层电极,又可以作为植入式电极(如图4h所示)。利用此电极同步记录大鼠大脑皮质表面和皮质内部的癫痫信号,结果显示脑皮层表面的癫痫信号幅值明显大于皮质内,且在皮层表面的放电信号先于皮质内信号出现(如图4i所示),说明癫痫的放电始于皮层表面。除此之外,Garrido等^[89]也利用双模式的石墨烯晶体管检测大脑皮层扩散性抑制信号诱发的低频电压变化的深度分布。研究发现,从皮层表面的长去极化到深部的超极化,脑皮层的扩散性抑制信号发生在整个皮层深度。近年来,尽管取得了一定进展,石墨烯在植入式神经电极中的应用仍不普遍。

4 结论与展望

石墨烯结合了许多适合做神经电极活性材料的特性,如良好的相容性、化学稳定性、柔韧性、光学透明性和高导电性等,为构筑同步检测及调控的双向神经界面提供了新的选择。本文对石墨烯与神经细胞的相互作用,以及利用石墨烯微电极阵列和石墨烯晶体管进行神经细胞、脑片和活体大脑神经电生理信号的检测与刺激进行了综述。研究结果表明,石墨烯与神经细胞具有良好的相容性,可以促进神经干细胞向神经元分化,同时可以增强神经网络的电信号。将石墨烯转移到柔性基底上制备的柔性神经电极,相比传统的刚性金属电极可以更好地与脑组织贴附,从而实现高时空分辨率和高信噪比的神经元电信号记录。此外,基于石墨烯的柔性透明神经电极兼具力学柔性与透明性,可以同时进行光学成像和电生理信号记录,以及对电极下方神经细胞活动进行光遗传调控。最后,石墨烯作为植入式电极可有效降低脑组织的免疫反应,使得神经电极的耐久性得到提升。

尽管石墨烯为理想神经电极的构筑提供了新的可能,基于石墨烯的神经电极仍有很大的发展空间:(1)为了获得更高的信噪比及时间和空间分辨率,实现柔性电极的高密度和高通量集成,适当的表面处理方式、关于石墨烯的孔隙结构设计以及多路复用和无线传输等技术需要进一步发展。(2)为实现神经环路机制分析,需要进一步开发石墨烯材料在植入式神经电极检测技术中的应用潜能。(3)新一代的神经电极需要同时提供多种功能,包括电生理信号记录和调控,神经递质及其他神经相关的生物分子识别,以及控制药物输送的能力。(4)神经电极技术需与大脑其他调控和检测技术(如光遗传技术、磁共振成像等)联合应用,这对于研究大脑机制有很大的帮助。开发具有高灵敏性、高稳定性的多功能复合石墨烯电极,实现其在基础神经科学和脑相关疾病治疗领域的应用,涉及化学、材料、医学、工程等学科,需要多领域研究人员的共同努力,才有可能取得实质性的创新成果和技术。

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