DNA水凝胶在生物传感中的应用和发展

张开宇; 高国伟; 李延生; 宋钰; 温永强; 张学记

doi:10.7536/PC200921

化学进展 ›› 2021, Vol. 33 ›› Issue (10) :1887-1899 DOI: 10.7536/PC200921

综述

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DNA水凝胶在生物传感中的应用和发展

张开宇 ¹ ,
高国伟 ¹^,² ,
李延生 ¹^,³^,^* ,
宋钰 ¹ ,
温永强 ⁴^,^* ,
张学记 ⁵

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Development and Application of DNA Hydrogel in Biosensing

Kaiyu Zhang ¹ ,
Guowei Gao ¹^,² ,
Yansheng Li ¹^,³^,^* ,
Yu Song ¹ ,
Yongqiang Wen ⁴^,^* ,
Xueji Zhang ⁵

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摘要

脱氧核糖核酸(DNA)是一种重要的生物分子,具有许多独特的性质如:信息传递、分子识别、可编辑等。DNA水凝胶同时具有DNA分子和水凝胶材料的优势,并且可以引入其他纳米材料获得多功能杂化水凝胶。相比于传统水凝胶,DNA水凝胶具有良好的特异识别能力以及可以按需设计的性质,从而被广泛应用于生物传感领域。本文围绕DNA水凝胶的合成、响应机制以及在传感领域的应用进行综述。按照不同的合成方法可分为线性DNA链缠绕水凝胶、枝状DNA自组装水凝胶、杂合DNA水凝胶。根据传感机制的不同又可以分为包埋封装法和非包埋封装法,包埋封装发法又分为:酶的包埋释放、抗原-抗体的包埋释放、纳米材料的包埋释放。本文总结了近几年DNA水凝胶在重金属离子检测、核酸检测、葡萄糖检测、蛋白质和代谢小分子检测,以及细胞检测等热门领域的研究情况,最后对其未来的发展进行了展望。

Abstract

Deoxyribonucleic acid(DNA) is an important biological molecule with many unique properties such as information transmission, molecular recognition, editability, etc. DNA hydrogels have the advantages of both DNA molecules and the hydrogel materials, and can introduce other nanomaterials to obtain multifunctional hybrid hydrogels. Compared with traditional hydrogels, DNA hydrogels have good specific recognition ability and the properties that can be designed on demand, so they are widely used in the field of biosensing. This article reviews the synthesis, response mechanism and application of DNA hydrogels in the field of sensing. According to different synthesis methods, DNA hydrogels can be divided into linear DNA strand interwinded hydrogel, dendritic DNA self-assembly hydrogel, and hybrid DNA hydrogel. According to the different sensing mechanism, DNA hydrogels can be divided into encapsulation type DNA hydrogels and non-encapsulation type DNA hydrogels. The encapsulation method is divided into: enzyme embedding release, antigen-antibody embedding release, and nanomaterial embedding release. This article summarizes the application and research of DNA hydrogels in the detection of heavy metal ions, nucleic acid detection, glucose detection, protein and metabolic small molecule detection, and cell detection in recent years, and finally prospects its future development.

Contents

1 Introduction

2 Synthesis of DNA Hydrogel

2.1 Ultralong linear DNA intertwined hydrogel

2.2 Dendritic DNA assembled hydrogel

2.3 Hybrid DNA hydrogel

3 Biosensing mechanisms

3.1 Encapsulation

3.2 Non-encapsulation

4 Application of DNA hydrogel biosensing device

4.1 Environmental monitoring

4.2 DNA hydrogel for medical sensing

5 Conclusion and outlook

Graphical abstract

关键词

DNA水凝胶 / 生物传感 / 智能水凝胶 / 特异性识别

Key words

DNA hydrogel / biosensing / intelligent hydrogels / specific recognition

引用本文

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张开宇, 高国伟, 李延生, 宋钰, 温永强, 张学记. DNA水凝胶在生物传感中的应用和发展[J]. 化学进展, 2021, 33(10): 1887-1899 DOI:10.7536/PC200921

Kaiyu Zhang, Guowei Gao, Yansheng Li, Yu Song, Yongqiang Wen, Xueji Zhang. Development and Application of DNA Hydrogel in Biosensing[J]. Progress in Chemistry, 2021, 33(10): 1887-1899 DOI:10.7536/PC200921

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1 引言

脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic Acid,缩写为DNA)是生物细胞内含有的四种生物大分子之一,其作用是编码、存储和传递遗传信息^[1]。1982年,Seeman^[2]成功地利用DNA的碱基互补配对机理,构建了十字形状的纳米结构,这项创新性的研究成果标志着DNA作为纳米材料的开始。其中由DNA作为关键功能分子构建的DNA水凝胶材料受到了研究者的广泛关注。DNA水凝胶是一种兼具水凝胶的三维网格结构和DNA分子优秀特性的智能水凝胶,可以通过精确设计DNA的序列来获得特定的功能。这种具有优异特性的新型纳米材料在众多领域中被广泛应用,如:智能设备^[3]、纳米机械^[4,5]、医药^{[6⇓⇓⇓~10]}和医学领域^[11,12]。

与传统水凝胶相比,DNA水凝胶具有生物特性(靶标与适体的特异识别,DNA可以在酶的作用下剪切、拼接等)。例如,通过使用限制性核酸酶来裂解核酸单体之间的磷酸二酯键^[13⇓~15],DNA连接酶可以催化磷酸二酯键的形成,通过磷酸二酯键将DNA链连接在一起。目前已经合成了很多酶辅助或酶刺激响应的DNA水凝胶^[16],在水凝胶中对特定的酶位点整合,可以直接帮助实现DNA水凝胶的修饰、剪切、拼接以及功能化。不仅酶可以刺激DNA水凝胶,一些金属离子也可以产生同样的效果,这极大地扩展了DNA水凝胶的刺激响应模式^[17],使其在传感领域中表现出巨大的开发潜力。因此越来越多的研究者开始进行DNA水凝胶结构改造的研究,并通过对DNA链的精确设计,设计出很多具有优异性质的智能水凝胶材料^{[18⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓~35]}。DNA水凝胶的出现填补了纳米材料在传感应用领域的空缺,本文从传感应用的角度综述了DNA水凝胶的合成方法、传感机制以及应用实例,并对其在传感领域的发展进行了展望。

2 DNA水凝胶的合成

以DNA为结构或者功能单元的水凝胶称为DNA水凝胶。最早合成DNA水凝胶的是Matsuda和Nagahara^[36]。他们利用DNA溶于水的特性将DNA作为水溶性共聚物中的交联分子来制备溶胀性水溶胶。互补性ssDNA(single-stranded DNA)在室温下就可以自发杂交,所以生物活性分子和其他物质可以在室温下被固定于水凝胶中,而且不会在水凝胶形成的过程中发生化学反应。在这之后,学者发现了DNA在功能性水凝胶构建中的巨大优势。在2006年,Luo等^[37]从支链DNA纳米结构中提取了首批纯净的DNA水凝胶。DNA水凝胶形成3D网络主要靠三种方式:线性DNA链的缠绕、枝状DNA的自组装和其他材料的杂化。

2.1 线性DNA链的缠绕

DNA水凝胶可以利用DNA的延伸来进行制作。Luo等^[38]在2006年使用聚合酶Φ29对DNA链进行了拼接和延长。该水凝胶可以通过循环复制环状DNA来延长引物DNA,并且同时从模板中不断置换合成DNA片段来延长DNA链,这种方法被称为滚环扩增(RCA)。该DNA水凝胶与其他水凝胶相比具有不同的机械性质:它在水中时为固态,没有水时变为液态。而且,这种变形是可逆的。Luo等的这项工作为使用RCA技术合成DNA水凝胶开辟了一条新道路。利用RCA技术,通过将功能片段扩增到RCA产生的DNA链中便可以制备DNA水凝胶。Tian等^[39]便将i-motif结构作为重复序列扩增到了RCA产生的DNA链中,制备出了刺激响应DNA水凝胶。2017年,Nöll等^[40]从质粒DNA中制备出了DNA水凝胶,该DNA水凝胶可以通过发酵大量制备。用酶分解质粒DNA从而获得具有互补“黏性”末端基因的线性DNA构建块,然后将它们连接成线性DNA链,并通过连接酶介导的催化反应缠结到凝胶中。

2.2 枝状DNA的自组装

大多数DNA水凝胶是由带有“粘性”末端基团的支链DNA构建块组装成的,这些末端基团可以彼此粘连形成3D网络。2017年,Wang等^[41]研发出了一种杂交链反应的DNA水凝胶制备技术。如图1所示,发夹DNA链H1可以通过回环结构在5'端(d段)杂交形成发夹二聚体(H1-二聚体)。I链先结合到H1的脚趾区域,然后通过DNA链置换过程打开茎和环。最后H1用相同的方式打开H2的茎和环,然后H2再打开另一个H1的茎和环。一个H1-二聚体具有两个功能分支,所以H1可以形成一个三臂结构或者四臂结构,该结构为之后的杂交链反应形成3D网络,这个反应称为钳制杂交链反应。通过线性杂交链反应,将引发剂预先设定为需要的模式,然后水凝胶开始从固定引发剂的DNA链开始扩展,形成没有外部限制的二维DNA水凝胶模式。这种构建DNA水凝胶的方法简单,可用于构建需要特定组成和形状的DNA水凝胶。

2.3 DNA水凝胶的杂化

使用官能团或无机纳米材料对DNA水凝胶进行复合改进得到多功能的杂化水凝胶,其可以弥补传统DNA水凝胶在响应速度、温度性能等方面的缺陷,并且可以获得更多特性。Shin等^[42]将鞣酸(TA)整合到DNA水凝胶中,合成了TNA杂化水凝胶(TA+DNA)。磷酸二酯键可逆的连接方式,使得TA变成了分子之间的胶水(分子胶)。该杂化DNA水凝胶可以拉长黏附到人体组织上,并且因为具有丰富的多酚基团,使其具有出色的体内止血效果。Willner等^[43]通过把刺激反应型DNA结构整合到丙烯酰胺聚合物中,合成了动态聚合物DNA杂化水凝胶。DNA链可以在酸性条件下自组装为i-motif结构,在碱性条件下溶解,这种特性使得DNA链能够实现溶胶和凝胶之间的转变。Singh等^[44]报道了一种用于体内靶向传递药物的DNA-碳点杂化水凝胶。Eguchi等^[45]使金纳米粒子和聚合酶链反应合成一种杂化DNA水凝胶。在该水凝胶中,DNA参与蛋白质表达,金纳米颗粒起到交联的作用。2014年,Zhou等^[46]合成了一种智能化的介孔二氧化硅纳米颗粒-DNA/聚合物杂化水凝胶,该水凝胶可以同时封装多个适配体。2018年,Geng等^[47]通过将超长线状DNA链和银纳米簇(AgNCs)结合,制作出了一种多功能杂化DNA水凝胶。AgNCs使得该水凝胶同时具有荧光和抗菌功能。与纯DNA水凝胶相比,杂化DNA水凝胶具有更好的性能和相对较低的成本,因此DNA杂化水凝胶越来越受到材料科学家的青睐。

3 生物传感机制

DNA水凝胶的“溶胀行为”(吸收和保留一定量的水分)以及化学和物理性质是传感器材料所需要的重要特性。DNA水凝胶具有高含水量、孔隙率、稠度以及优秀的生物相容性,这些特性使得它们在传感领域中应用十分广泛。DNA水凝胶最大的特征是它们对外部刺激做出的反应,通过在聚合物骨架中插入适当的官能团,就可以使得水凝胶对特定的化学、物理或生物刺激做出反应。网孔尺寸、交联度甚至骨架离子电荷都是可以影响水凝胶的刺激响应的元素。

Buenger等^[48]在2012年提出了很多关于水凝胶在传感领域应用的重要理化机制。水凝胶可以对多种外界环境刺激做出各种各样的响应如网络结构,光学、机械、电特性的变化。这些外界环境可以是温度的变化、光的刺激、某些生物分子或者游离的抗原^[49]。其中,水凝胶对温度的刺激的响应激烈:将水凝胶响应的温度称为临界温度(T_c),如果聚合物和溶剂在临界温度之上发生相分离,则其临界温度称为低临界溶解温度(LCST),相反则称为高临界溶解温度(UCST)^[50]。相似地,pH响应水凝胶也有这样的现象:在阴离子网络中,如果电离发生在酸性基团特性pK_a以上环境的pH值时,水凝胶的响应对应着网络具有更高的亲水性、更多的电荷固定数量以及更强的DNA链间的结点斥力。相反,网络具有更高疏水性和较高的紧凑结构。

3.1 包埋封装法

3.1.1 基于酶的包埋释放

酶是高度特异性的分子,其作用就是类似于生物催化剂用来加速化学反应,降低活化能^[51]。1912年,Michaelis和Menten^[52]提出了酶的作用模型,该模型将酶的反应分为:形成反应过渡状态的酶-底物复合物和释放化学反应产物并还原酶。他们强调了酶催化速率取决于酶和底物的浓度,当底物的浓度足够高,酶就会饱和,而反应速率仅仅取决于从底物到产物的转化率。很多DNA水凝胶传感器是利用酶-底物相互作用来检测分析物。相对于其他的固化技术,DNA水凝胶的基质结构中存在着大量的羟基,可以给酶提供一个良好的微环境以保持酶的自然结构,所以DNA水凝胶作为酶的封装材料具有更高的灵敏性。

3.1.2 基于抗原-抗体的包埋释放

抗原-抗体相互作用的基本原理是识别分析物上的抗原(或抗体)的抗体(或抗原),其产生的信号强度与分析物的浓度成正比。抗体(或抗原)可以被包埋在DNA水凝胶基质中,它们也可以结合在网络中,或者抗原抗体结合片段和DNA水凝胶之间发生共聚反应。Ishii-Mizuno等^[53]利用壳聚糖与sDNA水凝胶混合构建了一种可以诱导更高水平的抗原卵清蛋白特异性IgG的物理凝胶。

3.1.3 基于纳米材料的包埋释放

通过在水凝胶中包埋纳米材料,靶标分子刺激下DNA水凝胶逐渐瓦解,释放出纳米材料作为信号源。这种新型的检测方法不需要专门仪器来放大信号或提高精度,提高了检测的便携性同时降低了检测的成本。在2017年,Mao等^[54]提出一种基于功能性的DNA水凝胶针对不同目标的便携式视觉检测方法,将DNA水凝胶作为目标响应单元,金纳米棒(AuNRs)当作多色信号读出电路。AuNRs的颜色变化与靶标的浓度有关,在对整个系统进行调节后可以检测不同的分子。Lin等^[55]在2019年合成一种DNA水凝胶。如图2所示,首先将金纳米颗粒均匀涂在具有氧化物酶活性性质的铜基金属有机骨架上得到Au@HKUST-1,然后将丙烯酸酯修饰的腺苷适体(Acry-A-Apt)溶液和单链DNA(Acry-ssDNA)溶液与Au@HKUST-1溶液在三羟甲基氨基甲烷缓冲液中混合,在50 ℃下孵育两次后再在溶液中加入血红素适体(hemin aptamer)在50 ℃下孵育三次。最后冷却至室温得到腺苷反应性DNA水凝胶。Au@HKUST-1被包裹在丙烯酸酯修饰的腺苷适体和丙烯酸酯修饰的单链DNA 的交联体中,当腺苷与该水凝胶接触时,水凝胶的G-四链体结构被破坏,并且腺苷和腺苷适体之间优先相互作用导致DNA水凝胶完全溶解。G-四链体/血红素和Au@HKUST-1同时释放实现了信号双重放大,该DNA水凝胶生物传感器可检测低至1.04×10^-4 nmol·L^-1的腺苷。

3.2 非包埋封装法

利用水凝胶的三维网孔结构包埋信号分子,可实现靶标的精准测量,同时提高了便携性。不过这类方法大多需要将包埋物质完全释放,才能产生测量信号,这就需要很多靶标分子刺激水凝胶材料。光学信号的引入摆脱了需要大量靶标分子来裂解DNA水凝胶的困境,不过此类方法需要大型设备对光信号进行检测分析,便携性不佳。水凝胶在靶标作用下会逐渐瓦解,不依赖DNA水凝胶的完全降解,通过检测瓦解过程中产生的信号,可以便携地检测各种靶标分子。Bai等^[56]开发出了一种生物印迹DNA水凝胶,用体积的变化作为输出信号。将两种不同的甲基丙烯酰胺修饰的适体与靶标结合产生复合物,通过共聚反应将络合物插入到水凝胶中。适体和蛋白质的分离导致了水凝胶发生溶胀,从而增加了水凝胶的长度。重新添加的蛋白质与适体结合,使得水凝胶的长度缩短。2005年,Okumura等^[57]研发了一种诊断多种靶标的平台,其中利用微流体集成了DNA的纸质分析仪(μPAD)。该平台可以诊断多种靶标如:腺苷、可卡因和Pd²⁺等。根据不同检测的目标构建不同的DNA水凝胶,结合靶标使得DNA水凝胶结构裂解,从而带有彩色染料分子的溶液开始流动。Li等^[58]在2019年利用改变水凝胶膜的渗透率的方法构建了一种可以定量检测可卡因的平台。当溶液中存在可卡因时,DNA水凝胶膜内部结构会被可卡因分子破坏,从而导致了薄膜渗透性增加和毛细管中溶剂的流速加快,可卡因分子浓度越高,流速越快。

4 DNA水凝胶生物传感装置的应用

水凝胶网络中的DNA交联结构被靶标触发后被打开,凝胶网络结构就会解体释放出之前封装的信号物质,从而产生可以捕捉的信号。在2008年,Tan等^[59]首次证明了响应型DNA水凝胶从凝胶到溶胶的转变是可行的。他们将释放出的金纳米颗粒作为信号,以此来检测腺苷。良好的抓捕能力使得DNA水凝胶成为了包埋、封装催化剂物质的良好平台,当催化剂被释放后它们可以进一步催化其他物质产生更大、更明显的信号。很多学者使用DNA水凝胶来包裹酶、DNA酶或者催化纳米金属颗粒等用作催化剂,针对各种生物目标开发了各种比色视觉传感器^{[60⇓⇓⇓⇓~65]}。对于共价键的水凝胶,水凝胶网络的3D支架可以提供丰富的缀合位点,这些缀合位点成为高效的固定基质,可以在上面连接功能性DNA单元来设计生物传感系统。通过引入纳米酶、银纳米团簇和光子晶体,可以设计出对周围环境十分敏感的DNA水凝胶生物传感系统^[66⇓~68]。

4.1 环境领域的应用

4.1.1 重金属离子的检测

重金属离子难以在自然中生物降解,会在生物体内积累引起慢性中毒。因此,检测水中的重金属离子一直是不可忽视的研究方向。DNA水凝胶的选择性、结合性、多孔性、渗透性、安全性以及自支撑性十分适合于重金属离子检测^[69]。靶标分子或者离子会导致DNA水凝胶的流变性质发生转变^[70]。利用这种性质制作的传感系统,可以代替基于电化学、免疫传感等传统生物传感器。

在2020年,Wang等^[71]利用DNA水凝胶当作阀门控制毛细管中溶液的流速来检测Pb²⁺。如图3所示,将纯化过的5'末端丙烯酸酯修饰的DNA链A链(SA)和T链(ST)的溶液分别与丙烯酰胺单体水溶液混合制得聚丙烯酰胺-DNA缀合物P-SA和P-ST。然将P-SA和P-ST与DNAzyme在三羟甲基氨基甲烷-乙酸溶液混合加热制得DNA水凝胶。将毛细管末端放在加热的DNA水凝胶表面约2 s,让DNA水凝胶堵塞住毛细管。当含有Pb²⁺的溶液接触到DNA水凝胶时,Pb²⁺会分解DNA水凝胶的3D结构从而改变了DNA水凝胶对溶液的阻挡效果,Pb²⁺浓度高时溶液流速快,反之,溶液流速慢。

考虑到体积和负载以及靶点与适体之间的一一对应修饰等因素,使用DNA酶可以大大提高性能,减少DNA水凝胶的用量。很多金属阳离子可以触发DNA酶,如Pb^2+[72]、Hg^2+[73]、Cr^6+[74]、Cu^2+[75]、Ca^2+[76]、Zn^2+[77]等。

Liu等^[78,79]合成了一种富含胸腺嘧啶的DNA功能化聚丙烯酰胺水凝胶用于检测Hg²⁺。Hg²⁺可以选择性地插入到两个胸腺嘧啶碱基中,水凝胶通过使用染色剂使其发出黄色荧光。当存在Hg²⁺时,在DNA水凝胶中添加染色剂会产生绿色荧光。同时由于丙烯酰胺-DNA杂交水凝胶具有良好的吸附Hg²⁺的能力,在检测Hg²⁺的同时去除了重金属离子污染。Yang等^[80]利用DNA酶作为DNA水凝胶的交联剂,制备了一种DNA水凝胶传感器。将金纳米颗粒(AuNPs)包裹在水凝胶中当作指示剂,Pb²⁺接触到该DNA水凝胶时激活DNAzyme裂解底物,导致AuNPs从水凝胶中释放到了上清液中。根据上清液的比色分析就可以检测出是否有Pb²⁺,其检测极限达到10 nM。为了可以实现定量的视觉分析,引入了体积条形图芯片,当H₂O₂催化分解产生大量O₂时,气压推动V型芯片中的墨水移动,从而可以实现视觉定量检测如图4、5所示。

4.1.2 环境中其他污染物的检测

环境中的抗生素、毒素等都对人类身体健康产生极大的威胁。抗生素的滥用增加了耐药细菌或病毒出现的概率。并且抗生素可以在环境中进行积累。因此急需一种快速、便携地检测抗生素的方法。在2016年,Tan等^[81]开发了一种基于氧化石墨烯(GO)的DNA水凝胶,该水凝胶可以灵敏地检测出水中的土霉素(OTC)。使用腺苷和土霉素结合适体充当GO片的交联剂,当适配体与土霉素结合后形成靶标-适体复合物,大大削弱了荧光素亚酰胺(FAM)和GO之间的结合力,FAM和GO之间距离的增加阻止发生荧光共振能量转移,从而产生荧光现象。食物和河流中存在的赭曲霉毒素具有很强的毒性。Liu等^[82]采用DNA水凝胶和金纳米颗粒通过体积条形图芯片(V-chip)实现视觉定量分析,成功地检测出了溶液中的赭曲霉毒素,其检测下限达到1.27 nM。同样利用体积条形图芯片可以检测黄曲霉毒素B₁,检测限为1.77 nM^[83]。微囊藻毒素-LR(MC-LR)对人体健康和水生生物具有极大的危害。如图6所示,Wu等^[84]制作了一种将Cu/Au/Pt合金纳米颗粒包埋在DNA水凝胶中的检测装置。通过将MC-LR适体和聚丙烯酰胺链上的两条互补DNA链进行杂交获得DNA水凝胶,将Cu/Au/Pt合金纳米颗粒包埋于DNA水凝胶中。当存在MC-LR时,DNA水凝胶的3D网络结构被破坏,释放出合金纳米颗粒催化H₂O₂和四甲基联苯胺(TMB)反应,从而产生颜色变化,该水凝胶检测范围为4.0~10 000 ng·L^-1。

4.2 医学领域的应用

4.2.1 核酸检测

使用酶、荧光团或者放射性同位素标记来检测核酸分子,这些方法最终还得通过专用仪器来捕获信号并提高灵敏度。相比这些方法,使用DNA水凝胶来检测核酸突出了简单、便捷的特点。Liu等^[85]制备出DNA功能化的聚丙烯酰胺水凝胶,该水凝胶与目标DNA混合后显红色,同时指出水凝胶的含量将会极大地影响AuNPs(金纳米颗粒)的吸附效果。Weng等^[86]在2014年使用氧化石墨烯和鲑鱼精子DNA制备了水凝胶电极,使用阻抗法检测线粒体DNA,当目标DNA与固定在水凝胶电极上的探针DNA杂交时就会降低阻抗,通过测量阻抗的变化就可以将干扰序列与匹配序列cDNA区别开。DNA水凝胶与目标分子结合后会产生结构变化从而引起机械性质的变化。因此当制作成水凝胶薄膜后,便可以利用其渗透率的改变来进行目标分子的检测^[87,88]。Weng等^[86]将DNA水凝胶膜固定在毛细管末端,开发出一种利用毛细作用驱动DNA水凝胶传感器。该传感器通过miRNA与DNA水凝胶中的DNA探针之间杂交来检测靶miRNA。如图7所示,通过将传感器浸入到样品溶液中,DNA探针和靶miRNA杂交会增加水凝胶膜的渗透性,溶液便会在毛细作用下流入毛细管,因此通过测量样品溶液在毛细管中的流通距离便可以定量检测miRNA。

4.2.2 蛋白质检测

在临床检测的过程中蛋白质的种类和含量都是影响诊断的重要生理指标。靶向反应DNA水凝胶可以检测离子、毒素^[88,89]、蛋白质^[90]等。因此,DNA水凝胶在医学和临床诊断等方面有着巨大的发展前景^[91,92]。Lei等^[88]构建了一种适体功能化DNA水凝胶,该DNA水凝胶通过结构基序和接头DNA之间进行碱基互补交联构成。凝血酶作为靶标分子可以与接头DNA结合,导致DNA水凝胶结构被破坏,释放出带有负电荷的金纳米颗粒,带有正电荷的聚乙烯亚胺量子点同带有负电荷的金纳米颗粒发生静电相互作用并且发生荧光共振能量转移导致荧光信号减弱。该DNA水凝胶对凝血酶具有良好的识别能力,其检测极限为67 nM。Sun等^[89]将T-2毒素的适体作为水凝胶的交联剂,DNA水凝胶将辣根过氧化物酶包裹在内,当靶标T-2毒素与适体结合,就会使水凝胶塌陷释放出辣根过氧化物酶,辣根过氧化物酶催化H₂O₂与KI反应生产I₂,从而腐蚀金纳米颗粒。如图8所示,金纳米颗粒被腐蚀后,其紫外光谱发生蓝移。蓝移的程度与T-2毒素含量成正比,检测下限到达0.87 pg·mL^-1,定量下限为2.90 pg·mL^-1。

Lai等^[93]将带有可聚合甲基丙烯酰胺基团的适体与双功能适体-蛋白质复合物(作为小的交联剂)同时形成,当存在靶蛋白质时,该水凝胶会发生肉眼可见的体积收缩,将凝血过程中释放的凝血酶和PDGF-ββ蛋白质结合在DNA水凝胶上,这两种物质是血管生产和动脉粥样硬化时的生物标记。该方法制备的DNA水凝胶克服了半定量分析、灵敏度低的缺点。

4.2.3 代谢小分子检测

代谢小分子是临床诊断的重要生理指标。其异常表达往往与疾病密切相关。因此,便携快速地检测代谢小分子对临床诊断具有重要意义。

Zhong等^[94]通过将葡萄糖氧化酶作为DNA的催化基质装载到DNA水凝胶中用于葡萄糖的检测,并且可以将该生物传感器直接印刷到柔性电化学电极中。加入了电极使得该系统具有良好的电化学性能可以与3D打印相兼容。2016年,Huang等^[95]使用末端脱氧核苷酸转移酶来使DNA链发生聚合反应,并将X-DNA作为嵌入片段制备了DNA水凝胶,X-DNA会在发生聚合反应时被拉长,通过与“粘性”端基的杂交形成了水凝胶的构件,该水凝胶进行有效的级联反应实现了葡萄糖的可视化检测。Ma等^[96]将两条短的互补DNA链作为交联剂嫁接到了线性聚丙烯酰胺链,将修饰过的金纳米颗粒封装在水凝胶中作为可见的检测信号。如图9所示,当存在相应的靶标葡萄糖时,葡萄糖及其硼酸的衍生物配体的复合物就会破坏水凝胶结构,使得水凝胶塌陷并释放出金纳米颗粒,金纳米颗粒聚集在上清液中会显示为明显的红色,可通过肉眼直接观察到,当借助紫外可见光度法进行分析后,缓冲液中检测极限为0.44 mM。

三磷酸腺苷(ATP)具有细胞外信号传导功能,是一种重要的多功能分子,在细胞代谢中起重要作用。因为荧光素酶的方法灵敏度、分辨率和准确率都需要提高,所以最近基于DNA水凝胶的生物传感器已经被用于体内ATP的测量,通过使用生物传感器检测细胞ATP^[97,98]、二磷酸腺苷(ADP)和尿苷三磷酸(UTP)来判断细胞活性,包括细胞增殖、迁移、分化、凋亡、细胞因子释放和坏死等。Liao等^[97]使用预先设计好的核酸发夹单元和单链束缚物修饰过的聚丙烯酰胺链合成DNA-丙烯酰胺基水凝胶,并将CaCO₃结合到核酸启动子单元上,形成DNA-丙烯酰胺基水凝胶微胶囊。如图10所示,当ATP或可卡因适体存在时,双链体适体分离,微胶囊部分分解将负载荧光释放,实现ATP的检测。

4.2.4 细胞检测

当进行人体组织检查和修复时,需要精准定位不同细胞类型的空间位置来复制组织结构。因为水凝胶与软组织以及细胞外基质(ECM)的结构组成相似,所以水凝胶一直被作为软基质。寡核苷酸水凝胶表面互补结合的特性使它具有分辨单个细胞的能力,可以选择性地识别不同种类的细胞。然而,水凝胶表面适体结合位点的数量将直接影响一次检测中可以识别的细胞数。Richards等^[99]报道了一种可以对细胞表面进行修饰的DNA水凝胶。将单链寡核苷酸的杂交链反应合成的聚合物作为DNA的支架,然后将适体杂交到水凝胶表面。从而形成了具有表面修饰的DNA水凝胶。该水凝胶中的每个DNA支架为适体提供了更多的位点,直接实现了多价适体的表面功能化。相比于特异性适体,多价配体官能化的DNA水凝胶表面具有更强的配体-适体结合能力,在90 min后即可观察到40%以上的目标细胞与DNA水凝胶结合。

DNA水凝胶与细胞的特异性相互作用经常被用于细胞和生物组织检测。在组织工程学中,ECM模拟物可以在组织培养过程中精确识别、定位生物信号或者细胞。在一种材料中定位大量具有不同功能的细胞是组织工程的一个艰巨的挑战。在多细胞生物体内,细胞重要活动(增殖和分化)都受到ECM信号的影响。因此,如果可以模拟ECM信号便可以控制细胞活动以此来识别细胞种类。如图11所示,Finke等^[100]使用聚合酶链反应(Polymerase chain reaction, PCR)来延伸了DNA水凝胶网络结构,使其作为人工设计的ECM。首先使用氨基功能化引物同两个具有不同分支的引物进行PCR,将得到的产物与活化玻璃结合。然后在引物延伸的反应中,不参与第一次PCR的引物被拉长且支链引物将它们并入表面结合网络中。利用功能化引物与细胞表面标记物的特异性结合来让靶细胞附着在网络上,达到识别细胞的效果。通过类似的方法可以调整功能化引物的种类来识别不同的靶细胞。

5 结论与展望

本文详细介绍了DNA水凝胶的合成方法,理化性质等以及列举了一些传感领域应用的实例。与传统水凝胶相比,DNA水凝胶具有传感应用中所需要的一系列独特的性质:结构可设计性,精确识别性以及智能响应性和良好的生物相容性。从基础研究的方面来看,DNA水凝胶作为一种独特的生物聚合物为纳米级分子的研究提供了平台。从实际传感应用来看,通过合理的设计将DNA纳米结构整合到水凝胶中可以实现独特的作用。但是,DNA水凝胶在传感领域的应用依然存在不少的挑战:

(1)DNA水凝胶在检测靶标分子时依赖适配体对靶标的识别效率,而现有的适配体并不是全部可以高效快速地识别靶标,这在一定程度上限制了DNA水凝胶的灵敏性,开发更多快速、有效的核酸适配体将是我们努力的一个方向。

(2)DNA水凝胶储能模量低,储能模量最高也只有几千帕,远远低于其他常规聚合物水凝胶。这对转移和储存DNA水凝胶传感装置有一定的影响。

(3)高成本和大规模制备的困难仍然是DNA水凝胶实际应用的主要障碍。应该考虑开发更有效的合成方法以降低制备成本或探索从生物质中提取更多DNA的技术,亦或开发新型的基于微量DNA水凝胶的传感体系。

(4)现有的DNA水凝胶传感方法的实施依赖专业技术人员和大型设备,操作复杂,便携性不佳。

希望在今后的研究中可以攻克上述挑战,充分发挥DNA水凝胶刺激响应的优势,开发便携、灵敏、不依赖专业技术人员和大型设备的检测装置将是智能水凝胶在传感领域的发展趋势。

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基金资助

中国科学院仿生材料与界面科学重点实验室开放课题和国家自然科学基金项目(61901042)

中国科学院仿生材料与界面科学重点实验室开放课题和国家自然科学基金项目(21975019)

中国科学院仿生材料与界面科学重点实验室开放课题和国家自然科学基金项目(31870816)

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2020-09-10	2021-10-20	2020-11-05
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2020-12-22

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