纳米载体在共负载siRNA及化疗药物对逆转肿瘤多药耐药性方面的应用

杨强强; 李川; 于淑娴; 范书华; 王月霞; 洪敏

doi:10.7536/PC200956

化学进展 ›› 2021, Vol. 33 ›› Issue (10) :1900-1916 DOI: 10.7536/PC200956

综述

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纳米载体在共负载siRNA及化疗药物对逆转肿瘤多药耐药性方面的应用

杨强强 ¹ ,
李川 ¹ ,
于淑娴 ¹ ,
范书华 ¹ ,
王月霞 ² ,
洪敏 ¹^,^*

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Application of Nanocarriers in Co-Loading siRNA and Chemotherapeutic Drugs to Reverse Multidrug Resistance of Tumor

Qiangqiang Yang ¹ ,
Chuan Li ¹ ,
Shuxian Yu ¹ ,
Shuhua Fan ¹ ,
Yuexia Wang ² ,
Min Hong ¹^,^*

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摘要

近年来,基于小干扰RNA(siRNA)的基因干扰技术从基因水平上调节与肿瘤产生多药耐药性相关的各种蛋白进而逆转化疗多药耐药性方面表现出了巨大的应用潜力。鉴于此,研究者们在RNA干扰与化疗药物的协同抗癌方面做了大量工作。但游离的siRNA在无载体的情况下不易被细胞吸收,而且会被血浆和组织中内源性的核糖核酸酶降解,因此必须将siRNA负载在载体上才能有效应用于肿瘤治疗。鉴于纳米载体的安全、高效及靶向性等优点,人们已经发展出大量能同时负载siRNA及化疗药物的纳米复合体系。本文主要评述了近年来报道的一些纳米材料在共负载siRNA及化疗药物对逆转肿瘤多药耐药性方面的应用,以及研究中经常用到的一些逆转多药耐药的作用靶点。

Abstract

In recent years, gene interference technology based on small interfering RNA(siRNA) has shown great potential in reversing multidrug resistance of chemotherapy by regulating various proteins related to multidrug resistance of tumor at the gene level. In view of this, the researchers have done a lot of work in the area of RNA interference and chemotherapy drugs. But the free siRNA is not easy to be absorbed by cells without carrier, and it will be degraded by endogenous ribonuclease in plasma and tissues. Therefore, it is necessary to load siRNA on the carrier in order to effectively apply it to tumor treatment. In view of the safety, high efficiency and targeting of nanocarriers, a large number of nanocomposite systems have been developed which can simultaneously load siRNA and chemotherapy drugs. In this paper, the application of nanomaterials in co-loading siRNA and reversing multidrug resistance of chemotherapy drugs are reviewed. In addition, in order to have a better understanding of the related work, some targets which are often used in the study to reverse multidrug resistance are also briefly described.

Contents

1 Introduction

2 Main targets of siRNA regulation

2.1 ATP-binding cassette transporters

2.2 Apoptosis related proteins

2.3 Other targets

3 Nanocarriers for co-delivery of siRNA and chemotherapeutic drugs

3.1 Mesoporous silica nanoparticles

3.2 Metal-organic frameworks

3.3 Polymeric micelles

3.4 Liposome/Niosome

3.5 Dendrimer

3.6 layer-by-Layer nanoparticles

3.7 Hyaluronic acid nanosystem

3.8 Summary

4 Expansion

5 Conclusion and outlook

Graphical abstract

关键词

RNA干扰技术 / 基因调控 / 逆转多药耐药性 / 纳米载体

Key words

RNA interference technology / gene regulation / reversal of multidrug resistance / nanocarrier

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杨强强, 李川, 于淑娴, 范书华, 王月霞, 洪敏. 纳米载体在共负载siRNA及化疗药物对逆转肿瘤多药耐药性方面的应用[J]. 化学进展, 2021, 33(10): 1900-1916 DOI:10.7536/PC200956

Qiangqiang Yang, Chuan Li, Shuxian Yu, Shuhua Fan, Yuexia Wang, Min Hong. Application of Nanocarriers in Co-Loading siRNA and Chemotherapeutic Drugs to Reverse Multidrug Resistance of Tumor[J]. Progress in Chemistry, 2021, 33(10): 1900-1916 DOI:10.7536/PC200956

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1 引言

根据2018年国际癌症研究所的报告,自2010年以来,恶性肿瘤患者占世界人口的比例逐年上升。美国癌症协会估计,90%以上肿瘤患者的死亡在不同程度上受到耐药影响。多药耐药(multi-drug resistence,MDR)是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物产生抗药性的同时,对结构和作用机制不同的其他抗肿瘤药物产生交叉耐药性,又称多向性耐药^[1]。

通常,药物发挥作用时,肿瘤组织本身复杂的微环境会对无载体的化疗药物或者基因药物带来很大的障碍。例如,肿瘤组织异常的血管结构、刚性的细胞外基质等微环境,会对药物在肿瘤组织中的传递造成困难;缺氧的肿瘤特定生理参数,会减弱肿瘤细胞对药物的反应;酸性pH生理参数会上调血管生成因子和蛋白酶,促进耐药性产生;肿瘤细胞附近的基质细胞会分泌多种因子对肿瘤基质改造,从而促进肿瘤的发生、发展、转移以及耐药性的发生;肿瘤干细胞高表达ABC转运蛋白,又具有自我更新能力,而它的存在是肿瘤产生耐药性和复发的主要原因之一^[2]。

总之,以上都是导致在肿瘤组织水平上肿瘤药物疗效差,耐药性的原因,而在细胞水平上研究肿瘤耐药性,耐药性的产生又与细胞内多种因素有关,例如:(1)在肿瘤细胞中高表达具有外排泵作用的ATP结合盒式(ATP-binding cassette,ABC)转运蛋白,这类蛋白与减少化疗药物摄取、促进药物外排、降低细胞内药物含量有关,比如高表达的P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)、多药耐药相关蛋白(multidrug resistance-associated protein 1,MRP1)、乳腺癌耐药蛋白(breast cancer resistance protein, BCRP)等^[3⇓⇓~6];(2)肿瘤细胞对凋亡的耐受,多数化疗药物通过诱导凋亡来杀伤肿瘤细胞,而细胞凋亡相关蛋白如Bcl-2、Mcl-1、PLK1等的过度表达与肿瘤激活抗凋亡有关^[7⇓~9];(3)药物代谢增强,如谷胱甘肽巯基转移酶(GST)表达增高,活性增强,会提高化疗药物的代谢,并降低药物在细胞内的浓度^[10]。除此之外,近来研究表明,肿瘤的化疗多药耐药性还与DNA修复和复制相关的酶如O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶(MGMT)、核糖核酸还原酶M2(RRM2)的高表达有一定关系^[11]。

基因疗法被证明是临床上非常有前景的抗癌方法。基因治疗中,通常以基因干扰(gene interference)的形式关闭或抑制致病基因的表达,以达到治疗癌症的目的。目前报道的基因干扰手段主要有反义寡核苷酸技术、核酶与脱氧核酶技术、RNA干扰技术、microRNA技术等。其中RNA干扰技术(RNA interference,RNAi),是指由短片段双链小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)介导的同源mRNA分子降解,从而抑制相关基因表达的一种基因调控方法。近些年来基于siRNA的RNA干扰技术在癌症治疗方面发展十分迅速^{[12⇓⇓⇓~16]},siRNA类药物的抗癌效果除了在癌症动物模型中得到证实之外,有些已进入到临床试验阶段,被用于实体肿瘤的治疗^[17]。但静脉注射无载体游离的siRNA,用于治疗肿瘤并不理想。游离的siRNA是一种亲水性阴离子siRNA,在无载体的情况下不易被细胞吸收^[18],而且在血浆和组织中存在内源性核糖核酸酶(RNase),使得游离的siRNA半衰期极短^[19,20],同时肾脏清除和吞噬细胞的摄取会导致游离的siRNA在体内含量更低^[21,22]。因此必须将siRNA负载在载体上才能有效应用于肿瘤治疗。纳米载体具有安全、高效及靶向性等优点,目前临床上也都是将siRNA封装在纳米材料上后再给药^[23]。

化疗作为临床上主要的癌症治疗方法,游离的化疗药物面临的问题主要有这几方面:(1)大多数化疗药物水溶性较差^[24];(2)给药后会在全身非特异性分布,而在肿瘤部位的渗透率不足^[25];(3)因其对正常组织的毒性,限制了其治疗剂量和给药频率;(4)易产生耐药性等。针对上述问题,研究者考虑将化疗药物负载在纳米载体上,从而增加药物的溶解度,同时利用肿瘤的EPR效应提高化疗药物在肿瘤组织的渗透率和滞留量,减少对正常组织的伤害,还可以突破原有的给药剂量,并改变细胞器内药物分布(如核靶向),增加靶细胞器药物浓度。当肿瘤细胞反复暴露于化疗药物的环境中,会在细胞质中产生防御蛋白,使药物失活,但应用纳米载体负载化疗药物,可以绕过在细胞膜以及核膜高度表达的具有外排药物功能的P-gp等蛋白,以及在细胞质产生的防御蛋白,原因可能是通过绕过细胞的细胞视界防御系统,产生特洛伊木马式给药效果,克服耐药性^[26,27]。由此可见,纳米载体对化疗药物的负载对于克服化疗药物耐药颇具意义^[28⇓~30]。常用的化疗药物有紫杉醇(Paclitaxel,PTX)、顺铂、吉西他滨(Gemcitabine,Gem)、阿霉素(Doxorubicin,DOX)、多西他赛(Docetaxel,DTX)等,耐药问题的存在,推动着治疗从一种药物到多线药物化疗方向进行。例如在治疗卵巢癌时一般会选择铂类药物作为首次化疗药物,除了本身就对铂类耐药的患者,即使对铂类敏感的患者在治疗过程中随着药物使用量增加、DNA修复受损和凋亡过程改变等多种因素,患者不可避免地产生耐药^[31],后续会采用多种化疗药物共同治疗,比如铂类联合Gem、铂类联合PTX^[32],但是随着治疗的进行,会存在对铂类和PTX都耐药的患者,因此还需继续探索治疗方案,采用其他的化疗药物联合治疗,如伊立替康联合阿帕替尼治疗对铂类及紫杉类药物均有耐药性的晚期卵巢癌^[33],或者联用耐药相关蛋白抑制剂进行治疗^[34]。目前,对于耐药机制的研究越来越多,但是特异性治疗这些靶点的药物毕竟有限,因此有必要寻找更有效的治疗方法。

以纳米材料为载体共同递送siRNA和化疗药物,既可以产生特洛伊木马式给药效果^[35,36],提高化疗药物的抗癌效果,同时负载的siRNA通过降解耐药细胞异常表达的基因,阻断与多药耐药相关的蛋白表达,破坏耐药细胞的细胞通路,逆转肿瘤细胞产生的耐药环境。可以看出,共负载siRNA和化疗药物,可以发挥不同药物之间的协同作用,产生更好的抗肿瘤效果,在逆转耐药性方面具有巨大的应用前景。除了在纳米载体上共负载siRNA和化疗药物,进一步在纳米载体上结合靶分子,实现主动靶向给药,也是克服耐药性的研究热点,如在纳米表面修饰细胞穿透肽(cell penetrating peptide,CPPs),由于CPPs可逃逸 P-gp 介导的 MDR,使得纳米药物增强细胞穿透性,增加胞内药物积累^[37,38]。

目前克服耐药方面,已经出现了基于纳米载体共负载化疗药物和相关抑制剂,或者化疗药物联合促凋亡制剂用于该领域的研究,比如化疗药物联合P-gp抑制剂环孢素和维拉帕米,但这类抑制剂存在中毒剂量与治疗剂量相近的问题,容易引起不良反应。虽然纳米载体具有靶向性但是不可避免地会被体内的肝、肾、脾等网状内皮系统(RES系统)吞噬,由此可见,共递送相关抑制剂或者促凋亡制剂相比于共递送siRNA来说具有更高的毒性^[39]。此外,不同种类癌细胞产生耐药性机制并不完全一致,耐药相关蛋白多样,药物种类有限,不一定能特异地抑制蛋白,但随着基因科学的发展,siRNA在针对不同耐药蛋白抑制上具有通用性,可以特异性地下调耐药基因,具有非常广阔的应用前景。

若要实现在纳米载体基础上的siRNA和化疗药物的联合治疗,可以通过分开给药和共递送siRNA和化疗药物,但是明显后者更具有优势。比如,共递送给药纳米系统具有实现逐级给药的潜力,先释放出来siRNA下调相关耐药相关蛋白,使肿瘤细胞处于对化疗药物敏感的状态,继而化疗药物发挥作用,达到最好的治疗效果;除此之外,共递送给药只通过单次给药就能达到联合治疗的目的,无论在用药时间还是用药次数方面,都可以提高患者用药的依从性。

纳米载体共负载siRNA和化疗药物的相关工作中,研究者们基本上选择一些常规的化疗药物(如DOX、PTX、DTX、顺铂或Gem等),但应用的纳米载体和siRNA选择的靶点种类多样,因此接下来,为了更好地论述研究者们在纳米载体共负载siRNA和化疗药物方面的工作,我们首先归纳并简单介绍近些年来相关工作中研究者们进行RNA干扰所选择的靶点,继而依据不同的纳米载体概括近些年来科研人员们依据纳米载体共负载理念取得的成果。

2 基于siRNA的RNA干扰调控靶点

在癌症治疗过程中常常由于耐药性的产生导致化疗失败,人们也一直努力地探索耐药产生的机制,逐渐发现耐药与癌细胞内异常表达的一些基因及蛋白密切相关,依据这些蛋白发挥的作用不同进行分类,主要有具有外排功能的ATP结合盒转运蛋白,产生抗凋亡作用的蛋白,以及一些细胞通路中的蛋白及酶类。于是人们选择这些蛋白对应的mRNA为靶点,用基于siRNA的RNA干扰技术下调这些靶点在癌细胞中的表达,进而抑制相关蛋白的表达,逆转细胞耐药性。接下来我们分别对作用靶点进行逐一叙述。

2.1 ATP结合盒转运体

随着对癌症生物学认识的提高,对肿瘤多药耐药的产生已经提出了不同的机制。传统机制之一是跨膜ATP结合盒转运体的过度表达,这类蛋白利用 ATP 酶水解释放的能量,主动转运化疗药物跨过细胞膜,降低肿瘤细胞中药物浓度,减少细胞内药物积累,导致化疗药物治疗的失败^[4]。

P-gp,是由MDR1基因编码的分子量为170 kDa的跨膜糖蛋白,也称ABCB1/MDR1蛋白,是ABC转运体非常具有代表性的一员,能转运多种疏水底物和抗癌药物,包括依托泊苷、阿霉素和长春新碱等。ABC转运体家族中的另外一员——MRP1,也叫ABCC1蛋白,其既可以转运谷胱甘肽结合物和环核苷酸,又可以输送多种其他底物,如有机阴离子以及多种化疗药物,像阿霉素、长春新碱和秋水仙碱等^{[40⇓⇓~43]}。1998年,Doyle等从乳腺癌耐药细胞株(drug-resistant breast cancer cell)MCF/AdrVp细胞株分离得到新的依赖ATP的转运蛋白,其被命名为BCRP,也叫ABCG2蛋白,与P-gp和MRP1一起构成三大外排转运蛋白^{[44⇓⇓~47]}。

2.2 与凋亡相关的蛋白

肿瘤细胞会采取多种策略去抵抗化疗药物引起的细胞凋亡,除了上述的外排泵机制外,还有激活抗凋亡途径等。细胞凋亡是最常见的程序性细胞死亡类型,是细胞周期的重要组成部分,许多蛋白质都参与到细胞凋亡的级联信号激活中。癌细胞通过高表达抗凋亡的Bcl-2家族相关蛋白(如Bcl-2、Mcl-1)、凋亡抑制蛋白-生存素(Survivin)以及与细胞分裂相关的PLK1蛋白,从而激活抗凋亡途径,使凋亡过程调控异常,抑制药物诱导产生的凋亡,导致该癌细胞产生耐药性^{[48⇓⇓~51]}。

2.3 其他靶点

胞质Ca²⁺是细胞增殖、肿瘤发生和迁移在内的各种癌症过程的关键信号转导调节因子。在癌细胞中,许多负责Ca²⁺转运的跨膜Ca²⁺通道或者泵表达异常,使得Ca²⁺内流,促进癌细胞的增殖和产生药物作用后的新的生存途径,从而产生抗药性^[52]。在不同的Ca²⁺通道中,跨膜低压激活的T型Ca²⁺通道在多种癌细胞中高度表达,它们通过上调胞质中Ca²⁺的浓度来促进癌细胞的增殖^[53]。因此,靶向相关通道蛋白,调节胞质Ca²⁺浓度,可能是潜在的逆转耐药的治疗靶点。除此之外,还有相关工作靶向了蛋白激酶B(AKt)^[54]、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)^[55]、缺氧诱导因子1(HIF-1)^[56]、F组着色性干皮病偶联因子重组蛋白(XPF)^[57]、AURKA(极光激酶A)等位点来逆转化疗耐药性。近年来,随着对耐药机制研究的逐步深入,人们发现某些长链非编码RNA(long noncoding RNA)也与耐药密切相关,例如Liu等^[58]指出癌症易感11长链非编码RNA通过上调miRNA-21介导肝癌对卡铂耐药。

3 共负载siRNA和化疗药物的纳米载体

通常,化疗药物和siRNA可以通过物理或者化学相互作用负载在不同的纳米载体上,接下来我们就根据用到的纳米载体的种类,分别介绍共同负载化疗药物和siRNA的纳米体系在逆转肿瘤耐药性方面的一些最新研究进展。

3.1 介孔二氧化硅纳米载体

近年来,介孔二氧化硅(mesoporous silica nanoparticles,MSN),由于其特有的高孔隙率以及生物稳定性和无毒的特点,正在逐渐被广泛应用于siRNA和小分子化疗药物的细胞递送^[59]。MSN在结构上有大孔和小孔之分。小孔径的MSN只能包裹小分子化疗药物,不能将尺寸较大的siRNA包裹进去,但能通过静电作用将siRNA吸附在改造过的表面。

近些年在通过改造MSN表面实现siRNA和化疗药物共负载方面有大量的研究报道。Meng等^[60]用聚乙烯亚胺-聚乙二醇(PEI-PEG)包裹在MSNs上形成阳离子表面,进而结合上带负电荷的P-gp siRNA,另一方面DOX通过静电作用吸附在磷酸盐包覆的孔隙上,因此只有在肿瘤独有的酸性微环境下才释放出DOX,探究了在MSN共负载P-gp siRNA和DOX,克服乳腺癌对DOX的耐药。除此之外他们继续采用同样策略,探究在耐药鳞状细胞方面的效果,而在这篇工作中比较突出的是将与耐药相关的不同类型的siRNA与DOX配伍,确定了最佳药物组合,指出负载与耐药相关的P-gp、Bcl-2、c-Myc、PXR 的siRNA中,P-gp siRNA和DOX的组合,在体外筛选中展现了最佳的协同作用,极大地提高了肿瘤细胞对DOX的敏感性,该体系在体内展现出了极其难得的克服肿瘤异质性的效果,并且具有较好的隐身效果,减少了药物被RES系统摄取,使肿瘤部位的药物积累量达到注射剂量的8%。

楚霞等^[61]首先将DOX装载在空隙里,然后通过优化MSN表面的官能团、反应时间和反应温度,在MSN 表面原位合成了一种超薄的MOFs材料ZIF-8膜(沸石咪唑骨架-8),使得羧基化的MSN的负电荷表面逆转为正电荷表面,从而将靶向Bcl-2的 siRNA通过静电作用吸附在上面,并且可以起到包封空隙的作用(图1)。DOX-MSN-COOH@ZIF-8/siRNA进入细胞后,超薄的ZIF-8膜可以在酸性的溶酶体中分解,释放出siRNA和化疗药物。在细胞毒性实验中,对于野生型乳腺癌细胞MCF-7来说,Dox-MSN-COOH@ZIF-8/siRNA相对于Dox-MSN-COOH@ZIF-8和游离的DOX,IC₅₀值只是略微下降,但是对于对DOX有耐药性的乳腺癌细胞MCF-7/ADR而言,IC₅₀值则显著下降,另外,在人卵巢耐药癌细胞SKOV3/ADR中也观察到了类似的现象,这充分证明了该体系在逆转耐药方面有明显的效果。

李琳琳等^[62]采用两步碱选择性刻蚀方法合成了MSN纳米胶囊(MSNC_S),为了提高纳米粒子的稳定性,将有机硅残留的部分氨基与PEG结合形成pMSNC_S,然后将DOX装载到pMSNC_S中去,由于结合PEG之后的MSNCs上还残留一部分氨基,具有正电荷表面,进一步结合负电荷的siRNA,最终将靶向T型Ca²⁺通道的siRNA通过静电相互作用负载在pMSNC/DOX上。在不同pH值下,DOX与二氧化硅之间的氢键和静电相互作用发生变化,当pMSNC/DOX/siRNA处于弱酸性肿瘤细胞微环境中时,促使DOX在细胞内释放,从而实现了pH 敏感的DOX释放。该工作中,通过体外CCK-8试验,对pMSNC/DOX/siRNA的抗肿瘤作用进行了评价,并指出靶向T型Ca²⁺通道的siRNA和DOX只有在耐药细胞中展现出来协同作用具有逆转DOX耐药的效果,在非耐药细胞中只具有叠加效果,究其原因可能是由于siRNA的细胞内释放导致了MCF-7/MDR细胞周期的G0/G1阻滞,从而增加了细胞内药物的积累和协同杀伤作用。小鼠的体内抗肿瘤实验进一步表明,pMSNC/DOX/siRNA有比较明显的抑瘤效果,抑制率高达76%。

除了利用静电相互作用实现对siRNA的共负载之外,为了进一步解决siRNA暴露在表面容易被降解的问题^[63],逐渐开始应用大尺寸的介孔有机二氧化硅(mesoporous organosilica nanoparticles,MONs)作为共负载的载体,将siRNA和化疗药物都包裹进去^[64]。如施剑林等^[65]研制了一种大孔中空介孔有机二氧化硅纳米粒子(HMONs),虽然是大孔但并没有将siRNA包裹在里面。他们在有机硅的表面修饰二硫键和聚β-氨基酯(PAE)形成新的纳米粒子(HMONs-ss-PAE),PAE是一种由氨基段和可降解酯键组成的聚阳离子分子,可用于结合siRNA,而DOX封装在孔内,HMONs-ss-PAE由此共负载DOX和P-gp siRNA。在这项研究中包封的靶向P-gp的siRNA下调了90%的P-gp表达,同时HMONs-ss-PAE明显降低了ATP水平,切断了P-gp药物外排的能量供应,在两方面提高了耐药细胞对DOX的摄取,在探究肿瘤抑制效果方面工作也表明,siRNA/DOX@HMONs-ss-PAE对耐药细胞具有很强的杀伤作用。

在利用MON作为载体方面,除了共负载之外,施剑林等^[36]还进一步做到了siRNA和化疗药物的逐级释放,这在共负载方面是比较新也是必须考虑的一个发展方向。他们设计了一个在空间上具有层次的核-壳的MSN(核)/MON(壳)纳米系统(称为H-MSNs),H-MSNs的核和壳具有不同尺寸的介孔,H-MSNs的MSN核心的部分是小孔,用于储存小分子DOX,而包裹在外面的MON充当壳的部分是相对较大的孔隙,通过在表面接枝上聚乙烯亚胺(PEI),既优化了该纳米载体药物的生物相容性,又可以结合大尺寸的靶向P-gp的siRNA。MON壳部分具有复杂的二硫键杂化骨架,在肿瘤细胞的较高的还原型微环境中,骨架会碎裂,使壳层中的siRNA首先被释放出来,先下调P-gp,随后核中的DOX再被逐渐释放出来。这种独特的设计可以先通过siRNA的作用逆转耐药状态,减少药物外排,增加细胞内化疗药物含量,提高细胞对化疗药物的敏感度,进而发挥化疗药物的细胞毒性作用杀伤细胞,用最少的化疗药物达到最好的杀伤耐药细胞的效果,可以尽量避免再次刺激细胞产生更强耐药性。

无机纳米材料中除了MSN外,还有其他一些类似的材料也被用于siRNA与化疗药物的共负载。如Chowdhury等^[66]利用pH依赖性的碳酸盐磷灰石(CA)纳米粒子实现了PTX和siRNA的共负载。硒是对人类和动物至关重要的微量元素,临床试验证明硒化合物可以用于癌症治疗^[67],刘杰等^[68]利用层状双氢氧纳米粒子(LDHs)协同传递硒(Se)和siRNA,他们先将Se嵌入到LDHs的层间形成Se@LDH,然后通过静电吸附作用络合上siRNA,指出Se@LDH可能是一种微管稳定剂,通过阻断G2/M的细胞周期来抑制细胞增殖,破坏正常有丝分裂中纺锤体的形成,诱导细胞凋亡,而siRNA极易吸附在Se@LDH上,siRNA从另一方面逆转肿瘤耐药性。Zhang等^[69]则报道了一个Ca/P纳米系统,其制备方法是,首先利用Ca²⁺与siRNA形成复合物,进而与磷酸离子作用形成Ca/P/siRNA核,为了稳定,在外层涂上脂质并将DTX装载在脂质层中,该工作突出的特点在于脂质层由DOPA/RGD-PEG-DSPE构成,其中的RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)可以靶向肿瘤,在血液循环中增加该纳米药物在肿瘤部位的富集,提高肿瘤细胞对药物的摄取量,细胞凋亡率高达66%,在体内肿瘤抑制方面,很好地抑制了肿瘤组织的生长。

3.2 金属有机框架

金属有机框架(metal-organic frameworks,MOFs)具有自组装、多孔、性能容易改造的特点,近些年来逐渐发展到纳米尺寸,得到纳米金属有机框架(nanoscale metal organic frameworks,nanoMOFs),这种纳米体系一般具有结构多样、承载能力优良和生物降解性好等特点,已经被用作传递化疗药物的载体^[70,71]。MOF材料中的UiO系列,是由Zr₆(μ₃-O)₄(μ₃-OH)₄作为次级构筑单元(SBU),二羧酸盐作为桥联配体,具有六方板状形貌。林文斌等^[72]利用包封作用使UiO负载顺铂前药,并通过siRNA骨架上磷酸残基与MOF表面的Zr形成多重配位键,将靶向多个耐药基因(P-gp、Bcl-2、Survivin)的siRNA结合到MOF上,构建出来逆转卵巢癌耐药状况的nanoMOFs药物。这个工作与之前的许多报道存在一些不同之处,其中最突出的一点就是他们将与逆转耐药相关的多种siRNA(包括Survivin、Bcl-2、P-gp siRNA)同时负载在同一个载体上,而且负载在UiO NMOFs 材料上的siRNA很容易从细胞内涵体或溶酶体中逃逸出来,为了进一步探究UiO NMOFs 材料在该领域的应用,接下来可以比较装载一种等量的siRNA与装载多种siRNA在逆转耐药性方面有效性的差异。MOF材料中MIL-101也是一种具有应用前景的纳米载体材料,较窄的介孔腔可以用来负载小分子药物而外部表面的金属离子可结合生物大分子如siRNA。刘杰等^[73]合成了一种硒&钌纳米粒子修饰的MIL-101(Fe),利用硒、钌本身具有的抗肿瘤作用,同时传递靶向P-gp的siRNA逆转耐药性。霍甲等^[74]开发了一种对偶氮还原酶有响应的多功能金属有机框架(AMOFS),该材料可以将DOX包封在里面,另外,通过静电和配位相互作用能够在其表面结合上靶向HIF-1α的siRNA和CPPs。(图2中的DRHC是指DNA/RNA杂交复合物,在本文指siRNA)。AMOFS是由Fe(Ⅲ)和偶氮苯-4,4'-二羧酸链接剂配位而成。在缺氧肿瘤微环境中,偶氮还原酶高度表达,偶氮苯在偶氮还原酶的作用下被降解,促进DOX和siRNA释放出来,构建了基于MOF的缺氧响应纳米药物。在实体瘤增长迅速的情况下,缺氧是其典型的生理特性,而该纳米探针依据实体瘤的生理特性设计,具有高度特异性,并且在探针上结合CPPs作为靶分子,能够使纳米颗粒以不消耗能量的方式直接进入细胞质,将化疗药物递送进入细胞,通过特洛伊木马式给药克服耐药性,具有靶向和特异性响应的双重特点。在肿瘤细胞中HIF-1α可以增强P-gp的表达,HIF-1α的siRNA既沉默了HIF-1α也相继下调了P-gp的表达,从基因水平上逆转肿瘤耐药。MCF-7经该纳米药物处理后细胞存活率仅有29%,活体实验中,在对照组具有肿瘤的小鼠死亡一个月后,纳米药物组小鼠存活率达到100%,达到了比较理想的治疗效果。

3.3 聚合物胶束

聚合物胶束是由两亲性聚合物组成的,可在水环境中自组装形成具有核-壳结构的纳米球。通常,共聚物包含与siRNA络合的阳离子亲水部分,以及驱动自组装和封装药物的疏水部分。目前,由二嵌段共聚物或三嵌段共聚物形成的胶束,是研究最广泛的siRNA和化疗药物的共负载载体。阳离子聚合物胶束是最常见的共负载siRNA和化疗药物的载体,但由于对siRNA及化疗药物吸附作用太强,使其在细胞内难以释放,从而限制了它们在该领域的直接应用。因此,随着响应型胶束的研究越来越广泛,作为药物释放的响应条件也受到更多的关注,其中应用最多的是肿瘤细胞内外的具有梯度性差别表达的GSH,以及癌细胞内偏酸性的环境,下面我们通过张学农及周建平等的工作对响应性胶束在药物缓释方面的应用做详细阐述。

张学农等^[75]合成了一种由低密度脂蛋白(LDL)和N-琥珀酰壳聚糖-胱胺-尿酸(NSC-SS-UA)两部分组成的二元聚合物。其中NSC-SS-UA本身就可以作为一个三嵌段胶束单元,NSC具有亲水性,而SS-UA作为一个疏水核驱动自组装并负载PTX。SS-UA中的SS部分含有二硫键,可以在细胞内GSH作用下断裂,表现出氧化还原敏感性,而UA表现出pH敏感性,于是NSC-SS-UA成为了一个具有氧化还原和pH敏感的负载PTX的三嵌段胶束单元。但由于NSC-SS-UA无法装载BCRP siRNA,于是他们首先将siRNA结合在胆固醇(CHOL)上,构建了一个亲脂性的siRNA,然后将其装载到LDL亲脂内部,形成了负载siRNA的LDL单元。最后,再通过酰胺键将LDL部分与NSC-SS-UA部分结合,构成一个含有胶束的二元聚合物。与其他常规的纳米载体相比,该二元聚合胶束有许多优点。例如,体系中的LDL除了充当siRNA的载体,还能够靶向肿瘤细胞膜表面高表达的LDL受体,与普通纳米载体药物相比,提高了细胞对药物的摄取率;而且LDL作为一种从血清中提取的物质,具有无毒性,无特异性,减少RES系统的摄取,增加在体内循环时间,提高在肿瘤部位滞留量;除此之外,酸性是肿瘤微环境的特征性生理参数,LDL-NSC-SS-UA具有pH和氧化还原双重敏感性,当到达细胞后,在GSH和肿瘤细胞较高的酸性环境下,药物被释放出来。体外验证实验表明,未负载任何药物的胶束具有较好的生物安全性,而孵育12 h和24 h后,siRNA-PTX/LDL-NSC-SS-UA组的细胞存活率仅有30.47%和15.59%,该结果与体内抗肿瘤结果一致,表明在siRNA 降低BCRP的表达后,可以维持较高的细胞内药物浓度,增强细胞毒性,逆转乳腺癌耐药细胞MCF-7/Taxol的耐药性。

除了利用上面提到的LDL作为载体本身的靶向性,一些研究者为了进一步增强胶束载体药物的靶向作用,会在表面修饰特定的具有靶向肿瘤细胞作用的物质,如以下冯思慎等、周建平等的工作。冯思慎等^[76]开发了一种集靶向和共负载两种优点于一体的胶束系统(图3)。首先通过二硫键将靶向PLK1的siRNA与维生素E (TPGS)结合形成二嵌段聚合物(siPLK1-ss-TPGS),再与抗癌药物DTX混合,组合得到新的胶束,随后将赫塞汀(Herceptin,抗体药物)与上一步合成的共负载胶束结合,赋予其对过表达HER2的癌细胞的靶向性。而通过调节DTX和siPLK1-SS-TPGS∶TPGS的给药比,可精确控制DTX和siRNA负载量。此外,细胞毒性实验表明,共给药胶束制剂(TPGS-DTX-siPLK1, micSD)的治疗效果优于游离的DTX和负载DTX的胶束商用制剂(TPGS-DTX, micD),与乳腺癌细胞SK-BR-3共孵育24 h后,micSD中负载的DTX的IC₅₀值比单独DTX低537倍。周建平等^[77]合成了一种基于透明质酸(HA)的两亲性偶联物,HA-ss-(OA-g-bPEI)(HSOP),可实现对PTX和靶向AURKA的siRNA共递送。该聚合物胶束的特点在于其具有靶向性和氧化还原敏感性,利用细胞内外GSH含量具有梯度性差别及胞内具有较高的还原性电位的特点,使得胶束中的二硫键断裂,将药物释放出来;除此之外该胶束另一个可取之处在于具有亲水性的HA外壳对于肿瘤细胞膜高表达的CD44、RHAMM等受体具有靶向性。

张欣等^[78]通过交联剂N-甲基二乙醇胺(N)将Dox偶联到硬脂酰氯(C18),形成 C18-N-Dox,它本身就可以自组装成胶束,但为了保持稳定性,再与DSPE-PEG2000混合制备胶束。C18-N-Dox的叔胺依赖于酸性条件下(pH = 3)提供的正电荷能够络合靶向PLK1 的siRNA,因此实现了siRNA和DOX的共负载。活体实验表明,该聚合物胶束药物能够完全抑制了18 d内HeLa雌性BALB/c裸鼠肿瘤的生长。Li等^[79]合成了一种对pH敏感的两亲性聚合物,其中疏水嵌段含有DPA基团的重复单元,亲水嵌段为低分子量PEI 通过自组装形成胶束, 在中性pH处负载PTX,再通过PEI的阳离子电荷将靶向Akt的siRNA凝聚在胶束中。Sun等^[80]合成了具有核壳结构的三嵌段共聚物胶束:mPEG₄₅-b-PCL₈₀-b-PPEEA[聚(乙二醇)-b-聚(ε-己内酯)-b-聚(2-磷酸氨乙基乙烯酯)],可以共负载靶向PLK1的siRNA和PTX(图4)。在注射32 d后,负载两种药物的胶束完全抑制肿瘤生长,但负载单一药物胶束处理的异种移植瘤生长到原来体积的3倍左右。

3.4 脂质体/囊泡

自从FDA批准Doxil^®(阿霉素脂质体注射液)应用于癌症治疗^[81]以来,将脂质体作为基因和化疗药物载体的研究变得更加广泛。脂质体具有亲水性的核心区,可以装载亲水性药物如siRNA、DOX等,而双分子层之间是疏水区域,可以用来装载亲脂性药物如PTX,也可以通过对脂质体表面进行合理改造,负载siRNA。脂质体最大的优点是其生物相容性,能够绕过体内的“清除卫兵”,增加在体内的循环时间以及在肿瘤部位的滞留量。应用的脂质体包括阳离子脂质体、固态脂质体。阳离子脂质体对略带负电荷的细胞膜具有高亲合力,并且能够以胞吞或融合的形式进入细胞,且能高效率地从内小体中逃逸出来。

脂质体被用作共负载载体的研究非常多,构成脂质体时,可以先形成类似于磷脂双分子层的内层,在核心中装载疏水药物,再利用脂质之间疏水作用自组装进而构建双分子层的外层,同时可以将亲脂药物装载在双分子层中间的疏水区域。如何仲贵等^[82]先用DOTAP、DPPC以及CHOL构成双分子层的内层,并将siRNA包裹在亲水的核心,再利用DSPE-mPEG和DPPC,通过疏水作用自组装构成双分子层的外层,并将亲脂的PTX包裹在疏水的两层之间,形成了不对称膜的包封低剂量PTX和靶向GAPDH的 siRNA脂质体。朱光宇等^[83]用DOTAP将siRNA和琥珀酸顺铂(一种顺铂前药)包封在亲水核心,形成双分子层的内层部分,之后在之前的基础上,DOPE和DSPE-mPEG利用疏水作用形成相当于磷脂双分子层的外层部分,其中PEG的修饰会改善生物相容性并提高体内循环时间,最后在两层之间的疏水区域插入CHOL用来稳定结构(图5)。该体系在300 nmol·L^-1 siRNA浓度下,A549细胞存活率仅有20%,并且其IC₅₀值与小分子前药相比提高了85倍。崔京南等^[84]制备了一种阳离子脂质体,在制备共负载系统时,首先选择鱼精蛋白(PRTM)将siRNA浓缩成一个紧密的“核心”,再使用氨基甲酸酯(DDCTMA)连接的阳离子脂质包裹紧密的“核心”,并在脂质双分子层中的疏水层之间负载亲脂的PTX。Wang等^[85]使用DOTAP、CHOL和PRTM制作阳离子脂质体纳米颗粒,首先在静电作用下PRTM结合siRNA,然后与Gem包裹在脂质体的磷脂双分子层疏水部位形成 LP-Gem-siMcl-1。当将LP-Gem-siMcl-1与两种胰腺癌细胞PANC-1与BxPC-3孵育72 h,抑制率可以分别达到78%和79%。活体实验也进一步表明,基于LP-Gem-siMcl-1的联合治疗比单用LP-siMcl-1或LP-Gem显示出更好的协同抗肿瘤效果。

大部分的脂质体作为载体,都会将siRNA作为一种亲水物质包裹在核心,所用的脂质不同情况也有差别,有的会将siRNA吸附在脂质体的表面。如郝继辉等^[86]使用生物相容性脂质-聚合物杂化纳米粒子共同传递靶向HIF-1α的siRNA和Gem。他们首先使用mPEG-PLGA(乳酸-乙醇酸)构建脂质体,其中心是亲水核心,负载Gem,在疏水外层结合上ε-聚赖氨酸(EPL),EPL是阳离子型,用来吸附带负电荷的siRNA,形成ENP,最后在最外层包裹上PEG改造的脂质双层形成LENP,研究了其在皮下和原位肿瘤模型中的治疗效果。脂质双层可以保护siRNA免受降解,以及血清中其他负电荷的物质替代siRNA,防止药物的泄漏,甚至提供一种“隐身”的功能,免受血清中蛋白的结合。该工作最可取之处在于他们所使用的任何材料都经过FDA的批准,具有极高的安全性和生物相容性。张灿等^[87]用氧化还原敏感的阳离子寡肽脂质体(LHSSG2C14)和天然大豆磷脂酰胆碱(SPC)构成基于脂质体的新型纳米系统用来共负载PTX和靶向Survivin的siRNA,将PTX插入在疏水层之间而siRNA既包裹在核心也吸附在正电荷的表面。

如上述胶束、MSN等纳米载体一样,当结合上具有靶向性的分子之后,纳米载体药物除了会通过EPR效应滞留在肿瘤组织中,靶分子还会促使纳米载体药物具有更高的细胞摄取率。因此,研究者们也考虑在脂质体载体上结合上靶分子,以提高其细胞摄取率。Gao等^[88]通过先形成含DOX多层组装的脂质体,然后挤出单层脂质体,将PRTM和亲水的siRNA装载到疏水核心中,最后将已经结合靶分子Fab'(靶向在肝癌细胞膜高表达表皮生长因子(EGFR))的脂质体与已经负载siRNA和DOX的脂质体融合,形成具有靶向性的共负载RRM2 siRNA和DOX的脂质体复合物,与非靶向或者单药加药对照组相比,其治疗效果大大增强。

脂质体当中的固体脂质纳米载体是由体温下保持固态的脂质构成,适用于疏水药物的递送,再修饰上阳离子表面活性剂形成正电荷表面,可以用来传递核酸^[89]。Yu等^[90]用阳离子固体脂质纳米粒实现了共负载PTX和Mcl-1 siRNA,其中阳离子脂质1,2-二油酰-sn-甘油-3-乙基膦胆碱(EDOPC)作为表面活性剂络合siRNA,再用溶剂乳化法将PTX包裹在疏水核中。Nam等^[91]通过重组LDL,合成具有稳定核壳结构的类似LDL的SLNs,内核可用于包封疏水性抗癌药物PTX和具有光学活性纳米晶CdSe/ZnS量子点,阳离子表面通过静电作用则可与siRNA、DNA等多离子大分子复合,得到同时负载靶向Bcl-2的siRNA和PTX及量子点的纳米复合体系(PQSLN/Bcl-2 siRNA)。该纳米复合物体系进入癌细胞后,显著下调Bcl-2蛋白的表达,大大提高了人肺癌细胞A549对PTX的敏感性,对A549细胞的抑制率高达70%,而没有同时负载siRNA的纳米体系(PQSLN)对该细胞的抑制率只有30%。PQSLN/Bcl-2 siRNA对A549细胞的IC₅₀值为225 ng·mL^-1,比PTX制剂的IC₅₀值(4.6 μg/mL)低约20倍。另外,利用量子点的荧光信号,还可以实现原位成像功能。

囊泡的结构与脂质体相似,但比脂质体稳定,并且相比于胶束,囊泡可以同时包裹疏水性和亲水性物质。囊泡也能够有效地增加药物在体内的滞留,减少体内药物的清除。但是由于它表面呈中性,无法通过静电相互作用吸附siRNA,针对这个问题研究者们通常对其表面进行改造,使其具有基因传递的功能。

Sun等^[92]设计了一种非离子表面活性剂囊泡共负载系统,它通过负载两种siRNA下调耐药基因BCRP和Bcl-2的表达,逆转肿瘤干细胞231-CSCs对于DOX的敏感性。在这个共负载系统中,他们将DOTAP阳离子脂质掺入到无法直接用于基因传递的Span80囊泡中,使DOX的包封和siRNA的络合得以同时实现。该共负载系统靶向BCRP mRNA的siRNA作为外排泵抑制剂,而以Bcl-2 mRNA为靶点的siRNA作为抗凋亡防御的抑制因子,协同DOX的凋亡作用,达到了较好的抗癌效果。普通的囊泡一般呈中性无法直接成为共负载的纳米载体,但聚合物囊泡是公认的协同传递的良好的纳米载体。Kim等^[93]设计了聚合物囊泡,他们将靶向Bcl-xL的siRNA和DOX封装到由甲氧基聚乙二醇-b-聚D,L-乳酸(mPEG-b-PLA)构成的囊泡中,实现了共负载(图6),对胃癌细胞的增殖有很好的抑制作用,展现了聚合物囊泡作为纳米载体的潜力。

3.5 树状大分子

树状大分子是具有树状结构、窄尺寸、多分散性的纳米级大分子,可以通过改变树枝的层数来控制树状大分子的大小以满足不同的应用需要,其末端结构可以被修改用来负载核酸、蛋白质等各类药物,而内部的空隙还可以通过相互作用包裹药物。聚酰胺-胺[poly(amido amine),PAMAM]是一种很有前景的共负载纳米载体,小分子量疏水药物主要与PAMAM分子作用,带负电荷的核酸与由表面大量伯胺基构成的空腔作用^[94]。基于该设计理念,国外一些研究者们^[95]合成了一种三嵌段的第四代PAMAM树枝状大分子,可用于siRNA的传递,并在此基础上进一步设计了一个混合胶束系统,实现了对化疗药物和siRNA的共负载。

Mohammed等在以树状大分子为载体负载药物进行抗癌研究方面也做了一些工作。他们最早报道的一项工作,合成了一种叶酸-聚乙二醇-应用树状大分子与葡萄糖醛酸葡萄糖基-β-环糊精的结合物(Fol-PEG-GUG-β-CDE)(第3代),该物质可用于靶向PLK1的siRNA的载体。在该载药体系中,GUG-β-CyD部分能与内小体膜相互作用,导致其被破坏,使得负载siRNA的复合物更容易从内小体中逃逸出来发挥其基因调控作用。另外,体系中结合的叶酸更是增加了载药体系在癌细胞中的摄取,并增强了siRNA的RNA干扰效果。而他们最近的一项工作中则是利用之前合成的载体实现了DOX与siPLK1的共负载^[96]。研究表明,Fol-PEG-GUG-β-CDE/siPLK1/DOX三元复合物在体外的细胞实验显示很好的抑癌效果,对人口腔表皮样癌细胞KB的抑制效果高达94%,而通过对荷瘤小鼠的实验也进一步证明该三元复合物明显抑制肿瘤的生长,展现了较强的体内抗肿瘤活性。

3.6 层层组装纳米粒子

层层组装(layer-by-layer,LbL)纳米颗粒利用顺序沉积带相反电荷的聚合物的过程,在纳米核心上构建高RNA含量的高稳定性薄膜,是一种新型药物递送平台。LbL纳米颗粒平台的模块化设计,使其核心和周围层都具备引入治疗药物的能力,从而创造出可调谐多药输送系统,比如在负载化疗药物的核心上构建含RNA 的层层组装薄膜(图7)^[97]。按照上述思路,Venuganti等^[98]构建了一个层层组装的金纳米粒子(LbL-AuNP),包含了靶向STAT3的siRNA和甲磺酸伊马替尼(IM)用来治疗黑色素瘤的耐药。而Hammond等^[97]则是在DOX脂质体上包覆聚L-精氨酸(PLA)/siRNA/PLA/HA膜制备了DOX和靶向MRP1的 siRNA的逐层纳米粒子。合成的LbL脂质体制剂中,DOX的负载百分含量达到5.5% w/w,每个PLA/siRNA双层中含有3500个siRNA分子,从而使其具有较高的抑瘤效率,72 h内siRNA的释放比DOX快,由于siRNA使肿瘤内MRP1 mRNA水平显著降低,由此促使DOX表现出更强的细胞抑制率。实验表明,MRP1siRNA和Dox联合应用不但使DOX在体外的杀伤率提高了4倍,而且可使体内平均肿瘤体积比对照组降低了8倍。

3.7 透明质酸纳米系统

透明质酸(HA),是一种存在于人体细胞外基质的天然高分子量的阴离子生物聚合物。HA聚合物具有丰富的结合位点,如:—COOH和—OH,可以合成出来人工设计的多种衍生物。HA另一个突出的优势是可以与癌细胞表面高表达的CD44受体特异性结合,通过内吞作用进入细胞。另外,HA作为纳米载体还具有生物可降解性、非免疫原性以及无毒性等优点。

通常,利用HA的阴离子特性,可以通过静电相互作用同带正电荷的物质组装成带正电荷的纳米载体,进而用于siRNA的细胞递送。例如Yang 等^[99]设计出了HA-PEI/HA-PEG衍生物,可用于传递靶向P-gp的siRNA。Chen等^[100]设计了用于靶向P-gp的siRNA和DOX共转运的CaP包被的DPA/Zn标记的HA-NP(CaP-HDZ)的纳米传递系统。该纳米传递系统主要由三部分构成:首先由透明质酸-5β胆酸结合物(HA-CA)自组装得到具有肿瘤靶向性的透明质酸纳米粒子(HA-NPs),其核内可以包裹疏水的小分子药物;随后组装上能与siRNA结合的Zn(Ⅱ)-二吡啶钼酸(DPA/Zn);最外层再包裹上CaP涂层,有效避免生理环境对该纳米体系的破坏。通过该方法构建的CaP-HDz/Drug/RNA-NFs纳米体系中靶向P-gp的siRNA对P-gp mRNA的调控,使OVCAR 8/ADR细胞对DOX的敏感性恢复甚至增强,从而表现出很好的体外、体内抗癌活性。

武敬亮等^[101]合成了一种能同时负载DOX和靶向Bcl-2 的siRNA,且具有肝靶向性的纳米粒子(GH-DPP),该纳米粒子包括1,2-二甲酰-甘油-3-磷酸乙醇胺-聚乙二醇-聚醚酰亚胺(DSPE-PEG-PEI)和甘草次酸修饰透明质酸(GA-HA)两部分。首先将DOX装载到DPP的核心中,然后DPP通过静电相互作用负载 siRNA,最后GH-HA结合物包裹在DPP纳米粒上(图8)。体外细胞毒性试验表明,由于DOX 和Bcl-2 siRNA的协同抗肿瘤作用,在利用RNA干扰下调Bcl-2表达的情况下,siRNA/DOX/GH-DPP纳米粒子比单独递送DOX或Bcl-2 siRNA对肝癌细胞HepG2具有更好的抑制效果。此外,对比没有包覆GA-HA的siRNA/DOX/DPP纳米粒子而言,由于其靶向性,siRNA/DOX/GH-DPP对GA受体高表达的HepG2细胞表现了更明显的细胞毒活性。

3.8 小结

为了更清楚地说明各种共负载纳米药物之间的不同、在细胞内药物释放的机制以及各种纳米载体之间的优势与不足,特将其汇总在表1中。另外,将文章中出现的缩略词汇集在了表2中。

4 拓展

在逆转肿瘤多药耐药方面,利用纳米载体的共负载实现多种治疗策略协同作用的研究越来越多。在siRNA和化疗药物共负载方面,除了利用siRNA对mRNA表达的干扰,从而实现对一些经典的位点的调控外,有研究者还利用基于siRNA的RNA干扰技术靶向一些非mRNA靶点,例如microRNA等。鞠熀先等^[102]用PEI、聚4-苯乙烯磺酸钠(PSS)和氧化石墨烯(GO)合成了多功能纳米复合物(PPG),再通过物理混合将DOX吸附在PPG上,然后利用电吸附将靶向microRNA-21 的siRNA固定在PPG上,从而增加了DOX在耐药细胞内的积累。另外,除了负载siRNA下调相关的mRNA逆转细胞对化疗药物的敏感性外,有研究者利用microRNA可以调控相应mRNA的性质,考虑将microRNA与化疗药物细胞内共同输送,研究其协同抗癌效果。例如,Kim等^[103]制备了一种microRNA 和化疗药物共负载的纳米系统。该系统是以硅支撑的介孔二氧化钛为核心(MTNst),然后用聚L-赖氨酸(PLL)和聚乙二醇-b-聚L-天冬氨酸(PEG-b-PLD)通过相反电荷的作用构建类似光晕一样的逐层结构。在MTNst中负载PTX,而microRNA通过电荷作用吸附在PLL层上,实现了化疗和基因治疗的协同作用,对于大肠癌展现了较好的治疗潜力。类似地,赵秋等^[104]的研究试图通过上调细胞中作为抑癌基因的microRNA的含量来逆转其耐药性。他们利用涂脂碳酸钙纳米颗粒负载化疗药物5-氟尿嘧啶以及microRNA-375-3p逆转耐药。利用纳米载体综合不同治疗策略理念的研究不仅仅局限于基因治疗同化疗的结合,随着研究的深入,有研究者在逆转肿瘤耐药方面甚至做到了将基因治疗、光疗和化疗三种策略统一到一个纳米载体上,展现了极好的抗肿瘤效果^[105]。

5 结论与展望

在抗肿瘤药物研究中,纳米载体平台的应用对于抗癌药物的靶向递送具有明显的促进作用。其不仅有利于提高药物的稳定性,保护药物免受降解,减少不良反应,还可以通过EPR效应增加药物在肿瘤部位的积累。但更重要的一点是可以实现siRNA和化疗药物等多种药物的共同传递,能够将不同治疗机制融合在一起,克服耐药,并且实现特洛伊木马式给药,在逆转肿瘤耐药性方面有重要的意义。

纳米载体共负载的研究逐渐广泛起来,但想达到更好的治疗效果,仍存在许多问题有待解决。(1)找到更好的基因调控靶点,如最近报道的与铁死亡相关的谷胱甘肽过氧化物酶(GPX4)^[106,107]。(2)针对不同类型肿瘤,在构建复合体系时到底何种化疗药物和何种siRNA配伍能达到最好的治疗效果,以及各自的最佳负载量是多少,当治疗效果达不到时,是否应该考虑负载量和配伍方面的问题。(3)除此之外,逐级释放是在共负载方面十分重要的发展方向,siRNA首先从多方面改善耐药状态,比如使外排蛋白的表达量降低,抗凋亡路径的中断,能够使接下来释放的有限的化疗药物发挥出最大的细胞毒性作用,越少用量的化疗药物,对细胞处于敏感状态越有利。(4)在制剂研究时应考虑更多问题,如siRNA只通过静电吸附在载体表面是否不够稳定,考虑选用如HA这种本身具有靶向性的材料构建保护层或者选用更稳定的结合方法,比如对RNA进行基团修饰,利用化学键连接到载体上;若要实现siRNA和化疗药物的逐级释放,需将siRNA和化疗药物负载在载体上后,整个复合体系进行冻干保存,但在该过程是否能保证复合体系的稳定性,是否会发生泄漏;除此之外制备的药物要保证均一性,尽量简化制备步骤,降低生产成本。综上所述具有靶向、缓释、逐级释放和最佳药物含量和配伍是共负载纳米载体药物的发展方向。

正如前面所述,耐药的产生除了与细胞水平上相关组分的含量变化有关,肿瘤组织复杂的微环境也会影响药物的作用,且消除这方面的影响是纳米载体药物走向临床中非常重要的环节。因此,探索如何使共负载纳米体系在缺氧、酸性、刚性细胞外基质及血管异常这样的微环境中更好地发挥治疗作用,进一步改造或优化共负载纳米体系是未来非常必须且有价值的工作。从纳米体系的构建方面来说,材料及化学研究人员还应在提高纳米载体的稳定性、可重复性、生物安全性及运载之后体内的代谢等方面做更深入研究,开发出来一种能在血液中循环、不被免疫系统识别、能够识别出肿瘤组织的靶点的纳米载体药物,进行有效的药物输送或者基因沉默,以进一步推进其真正走进临床的研究进程。总之,基于纳米载体的基因干扰及化疗协同作用,为解决肿瘤耐药性,彻底治愈癌症提供了新方法、新手段,随着研究的不断深入,希望能够在实际的应用上取得更大的突破。

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基金资助

国家自然科学基金项目(91543206)

山东省自然科学基金项目(ZR2015BM024)

山东省“泰山学者” 研究经费和聊城大学研究基金(318012026)

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Received	Published	Revised
2020-09-28	2021-10-20	2020-12-02
Online Date
2020-12-22

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