单病毒示踪

王志刚; 刘书琳; 刘安安; 张利娟; 余聪; 庞代文

doi:10.7536/PC201045

化学进展 ›› 2021, Vol. 33 ›› Issue (1) :13-24 DOI: 10.7536/PC201045

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单病毒示踪

王志刚 ¹ ,
刘书琳 ¹ ,
刘安安 ¹ ,
张利娟 ² ,
余聪 ² ,
庞代文 ¹^,^*

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Single-Virus Tracking

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摘要

病毒是对人类健康威胁最大的病原之一,由其引发的病毒性疾病对人民健康、国家安全和社会经济构成重大威胁。病毒感染机制研究对病毒性疾病的防控及治疗具有重大意义。病毒侵染宿主细胞的动态过程涉及病毒组分与多种细胞组分或细胞器间复杂的相互作用,但是传统手段无法对该动态过程进行实时跟踪研究。单病毒示踪技术作为一种可以实时原位示踪单颗病毒侵染过程的技术,在病毒感染机制研究方面起着愈来愈重要的作用。借助于该技术,能够获取病毒侵染过程中病毒入胞途径、胞内转运过程、病毒核酸释放及其与细胞间的相互作用等动态过程信息,从而对病毒的感染机制进行分子水平的深入研究。本文就单病毒示踪技术所涉及的测量技术、标记技术和信息获取进行阐述,总结归纳了单病毒示踪在病毒感染机制研究中的最新进展,并探讨了该技术目前存在的挑战性问题以及未来发展的方向。

Abstract

Viruses are one of the biggest threats to human health, and the outbreak of viral diseases not only poses a great threat to human health and national security, but also causes great losses to the social economy. Uncovering the mechanisms of virus infection is crucial for preventing the spread of viruses and treating viral diseases. The dynamic process of virus infection in host cells involves intricate interactions between viral components and cellular structures or organelles, but conventional methods lack the ability to acquire dynamic information on individual viruses during the infection process. Single-virus tracking(SVT) technique is a powerful approach for studying the real-time and in-situ dynamics of viral processes in live cells and it plays an increasingly important role in the study of viral infection mechanism. SVT allows researchers to obtain the dynamic information on individual viruses during the infection process, including viral entry, trafficking, and genome release, which is meaningful to study the infection mechanisms on the molecular level. In this article, we first discuss the measurement techniques, viral labeling strategies and data analysis methods for SVT, then summarize a couple of applications of SVT and finally propose the challenges and future possibilities of the SVT technique.

Contents

1 Introduction

2 Single-virus tracking technique

2.1 Measurement techniques

2.2 Viral labeling strategies

2.3 Data acquisition

3 Applications of single-virus tracking in virological research

3.1 Virus internalization

3.2 Virus transport

3.3 Genome release of viruses

3.4 Assembly and egress of viruses

4 Challenges and solutions

4.1 Viral labeling strategies

4.2 Measurement techniques

5 Conclusion and outlooks

Graphical abstract

关键词

病毒 / 示踪 / 测量 / 标记 / 感染 / 机制

Key words

virus / tracking / measurement / labeling / infection / mechanism

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王志刚, 刘书琳, 刘安安, 张利娟, 余聪, 庞代文. 单病毒示踪[J]. 化学进展, 2021, 33(1): 13-24 DOI:10.7536/PC201045

Zhi-Gang Wang, Shu-Lin Liu, An-An Liu, Li-Juan Zhang, Cong Yu, Dai-Wen Pang. Single-Virus Tracking[J]. Progress in Chemistry, 2021, 33(1): 13-24 DOI:10.7536/PC201045

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1 引言

2020年10月5日,2020年诺贝尔生理学或医学奖颁给了发现丙型肝炎病毒的三位科学家Harvey J Alter、Michael Houghton以及Charles M Rice,以表彰他们为对抗血源性肝炎、降低肝硬化和肝癌的发病率作出的决定性贡献。然而,此时全世界人民正在与另一种病毒——严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2(简称新型冠状病毒,SARS-CoV-2)进行着殊死搏斗。SARS-CoV-2导致的新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019,COVID-19)具有很强的传染性、致病性和致死性^[1,2],从2019年12月COVID-19爆发,到席卷全球,仅用了2个月时间。根据世卫组织统计,截至2020年10月25日,全球COVID-19确诊感染病例超过4251万人,导致至少114万人死亡,然而实际感染和死亡人数可能远不止于此。除了对全球人民生命安全造成严重威胁,COVID-19的爆发也引起了经济停滞,导致全球近1亿人陷入赤贫。除此之外,艾滋病(AIDS)、重症急性呼吸综合征(也称非典型性肺炎,SARS)、手足口病、埃博拉出血热、流感等严重威胁人类健康、社会经济和国家安全的疾病均由病毒引起^[3]。由此可见,全面深入解析病毒的感染过程,对理解其致病机制、建立诊疗方法、制定防控措施至关重要!

病毒形态多种多样,主要有球状(如艾滋病毒,图1A ^[4])、杆状(如杆状病毒,图1B ^[5])、丝状(如埃博拉病毒,图1C ^[6])、弹状(如狂犬病毒,图1D ^[7,8])、砖状(如正痘病毒属,图1E ^[9])、冠状(如新型冠状病毒,图1F ^[10])、星状(如星状病毒,图1G ^[11])、正二十面体(如腺病毒,图1H ^[12])等,通常由携带遗传信息的核酸和保护核酸的蛋白质衣壳组成。根据病毒的衣壳外是否有包膜,又可将病毒分为有包膜病毒(如疱疹病毒、杆状病毒、埃博拉病毒、狂犬病毒、痘病毒、新型冠状病毒、流感病毒等)和无包膜病毒(如星状病毒、腺病毒等)。病毒依赖宿主细胞完成增殖,其感染过程是在时空动态变化过程中依次发生的大量瞬时分子事件的集成,包括受体识别、内吞、胞内转运、核酸释放、复制、包装和子代病毒释放等一系列步骤,每个步骤又涉及多样的途径和复杂机制。病毒的多样性及复杂多变的感染过程使得病毒致病机制的研究一直以来都是生物医学研究中亟待解决且尚未很好解决的关键科学问题。传统的静态检测技术(如生化实验和透射电镜成像等)可以获取病毒结构,从而解析病毒在某个特定时间、空间、平均化的感染信息。例如,SARS-CoV-2病毒借助表面刺突蛋白和细胞表面受体结合是病毒感染细胞的第一步,

决定着病毒的感染能力。研究者发现,与SARS病毒不同,SARS-CoV-2病毒表面刺突蛋白数量较少(SARS病毒50~100个,SARS-CoV-2病毒平均不到30个),且在病毒表面可自由旋转。由于这种特征,病毒感染细胞时,可以自由调整刺突蛋白的方位,便于与细胞表面受体结合。而对SARS-CoV-2病毒内部结构的解析揭示其核糖核蛋白复合物是局部有序排列的,有大量核糖核蛋白以六聚体的“鸟巢”方式紧贴病毒包膜排布,而在病毒中心则以正四面体的方式排布,这种规则排列的方式可能有助于核糖核蛋白与核酸相互作用。通过高分辨冷冻电镜对SARS-CoV-2病毒结构进行解析,展示其“真面目”,是认识病毒、研究其感染机制的基础,为精准开发疫苗和中和性抗体奠定了基础。然而,病毒感染过程是时间、空间、结构、活性不断变化的生物事件,仅仅依赖静态技术,难以获得病毒侵染动态过程真实详细的信息,则更难以揭示其感染机制。

随着显微技术的发展,研究非均匀体系实时动态变化的单病毒示踪技术得以建立并快速发展,成为研究病毒感染机制的有力手段。单病毒示踪技术不仅可以对多个病毒侵染过程进行群体化示踪,也可以对单个病毒在细胞内的侵染行为进行个性化分析,已成为研究病毒感染机制的热门技术。借助该技术,研究者能够获取病毒侵染过程中病毒入胞途径、胞内转运过程、病毒核酸释放及其与细胞间的相互作用等动态信息,弥补了静态研究手段的不足,从而获得更精细复杂的信息并真实诠释病毒侵染的时空动态过程,这对全面解析病毒的感染机制,设计新的抗病毒药物等具有重大意义。

本文将就单病毒示踪涉及的测量技术、标记技术、信息获取等进行评述,总结单病毒示踪技术在病毒感染机制研究方面取得的成果,并对该领域存在的问题进行深入分析,对未来的发展趋势和研究重点进行展望。

2 单病毒示踪方法

单病毒示踪方法需利用实时、原位、动态测量技术对荧光标记的病毒颗粒进行示踪,获取信息并通过进一步的处理分析以解析病毒感染细胞的过程,进而对其感染机制进行诠释。有一点需要重点强调:由于单病毒示踪的研究对象通常是“活病毒”(即结构完整的病毒颗粒),因此,必须在相应的生物安全等级的实验室进行相关操作。以下将基于本课题组十五年来的研究工作,从测量技术、标记技术和信息获取三方面对单病毒示踪方法进行介绍和评述。

2.1 测量技术

早期研究者主要利用透射电镜和生化实验来研究病毒在细胞中的感染机制,但这种传统的方法只能从细胞中获得病毒侵染的静态信息,无法对病毒侵染活细胞过程所发生的动态生物事件进行实时准确解析。随着荧光显微镜技术的发展,单颗粒和单分子技术在生命科学研究领域得到蓬勃发展,成功地解决了许多基本的生物学问题,并极大地提升了关于蛋白质折叠、生物分子识别、细胞信号转导等方面的研究水平,成为一类生物学研究非常强大的工具^{[13 ⇓~15]}。其中,单病毒示踪(single-virus tracking, SVT)是一种利用荧光显微镜实时示踪荧光标记的单个病毒、可视化病毒的侵染行为、解析病毒与宿主细胞的动态互作的技术,在病毒感染机制研究方面起着愈来愈重要的作用。目前,单病毒示踪技术对成像装置和标记技术要求比较高,检测的单病毒荧光信号需要足够强,以满足单病毒动态行为精细分析的需求。同时,在进行单病毒示踪时,样品往往需要被多次激发以实时获取足够的数据,以便对病毒动态行为进行统计分析,所以对病毒或宿主细胞的光损伤也是选择仪器的一个限定因素,成像时也需尽量减少曝光时间及激发光强度。当示踪活细胞内的病毒颗粒时,细胞的自发荧光往往会严重干扰荧光信号比较弱的目标物,所以为了确保获得较高信噪比的图像,应尽量减小激发体积以减少背景吸收而降低背景荧光。因此,一般用于单病毒示踪的成像系统要具备检测器灵敏度高、成像速度快、激发体积小等特点。目前,用于单病毒示踪领域的显微装置主要包括:倒置荧光显微镜、全内反射显微镜及共聚焦显微镜等。上述成像模式应用在单病毒示踪方面各有利弊,如倒置荧光显微镜具有较大的成像深度、操作简便等优势,但成像背景噪音较大,受细胞自发荧光干扰很严重,不适于荧光标记信号较低的单病毒示踪;全内反射显微镜技术是利用全内反射产生的消逝波来激发荧光样品,可大大消除来自非焦平面的潜在荧光的干扰,具有优异的信噪比及对比度,但通常只适用于距离界面200 nm深度范围内荧光样品的成像;共聚焦显微镜是利用光源针孔与探测针孔相对于物镜焦平面共轭聚焦的技术,对样品的光学断面进行成像,可有效地将焦平面以外的杂散光去除以增加图像的信噪比及纵向的分辨率,但其装置一般较为昂贵。以上三种常见的显微镜测量技术在单病毒示踪领域均有广泛应用,研究者可根据研究对象和研究目的选择最适宜的测量技术。

2.2 标记技术

实施单病毒示踪的前提是在尽可能不影响病毒功能的条件下对病毒颗粒的多种特定组分进行荧光标记。由于病毒颗粒小且结构复杂,因此,温和高效的标记往往是实现单病毒示踪的关键。在单病毒示踪领域常用于标记病毒的荧光团,包括有机荧光染料、荧光蛋白和量子点等。研究者主要利用荧光蛋白与目标组分融合表达的生物学方法和利用有机荧光染料或量子点等标记物与病毒组分进行直接或间接偶联的化学方法进行荧光标记,每种荧光团各有优缺点,研究者可根据单病毒示踪实验的具体要求进行平衡选择。

2.2.1 有机荧光染料

有机荧光染料的尺寸非常小且种类繁多,很容易通过共价或非共价的方式与标记对象结合,在荧光成像领域具有多种用途,已被证明在生物体系的荧光标记中不可或缺。有机荧光染料的荧光性质受荧光团结构和化学环境决定,可以通过精细的设计进行微调。除了尺寸小之外,大多数有机荧光染料具有较好的光物理性质、多种可选的反应活性基团可用于各种标记策略以及较宽的光谱选择范围。有机荧光染料是最早用于病毒标记和示踪的一类荧光标记物,早在2001年,Seisenberger等通过示踪单个Cy5染料分子标记的腺病毒相关病毒(adeno-associated virus),详细地阐述了该病毒在活细胞内的侵染路径,该报道首次将单病毒示踪技术引入到病毒研究中而引起了极大的关注^[16]。其后,Zhuang等利用脂溶性染料DiD标记病毒,对单个流感病毒侵染过程及胞吞机制进行了研究,揭示了流感病毒侵染动态过程和网格蛋白介导的流感病毒胞吞过程等^[17,18]。但由于有机荧光染料存在荧光亮度低和光稳定性差等缺点,不利于长时间的实时示踪,限制了其在单病毒示踪领域的进一步应用。

2.2.2 荧光蛋白

荧光蛋白是20世纪60年代由日本科学家Shimomura等首先在水母中发现的,经过半个多世纪的发展,已经在生物学领域得到了广泛的应用。目前,荧光蛋白已经衍生出多种颜色,光谱几乎覆盖整个可见光区,从而极大地扩展了荧光蛋白在多色成像方面的应用。特别是近十几年来,光转换与光活化荧光蛋白被巧妙地用于高分辨成像领域,从而实现了几十纳米的光学分辨,突破了光学衍射极限的限制^[19,20]。由于研究者可以通过常规的基因操作手段实现对相关细胞结构组分和病毒成分的标记,特别是病毒内部成分的特异标记,因此基于荧光蛋白的分子标记方法已成为动态可视地研究病毒侵染过程的常用手段。例如,Miyauchi等利用绿色荧光蛋白(GFP)标记了艾滋病毒(human immunodeficiency virus,HIV)的内部结构,揭示了HIV是通过受体介导的胞吞作用进入宿主细胞,在细胞内部发生病毒与内涵体的融合,从而实现基因组的释放^[21]。然而,荧光蛋白标记后的荧光强度不仅与其分子本身的亮度有关,还与其数量有关。对于GFP等荧光蛋白,只有在多肽链折叠、发色团成熟后才能观察到荧光,其表达水平还与多种因素有关,如转录和转染效率、蛋白质的稳定性和折叠等^[22]。实际上,单个荧光蛋白的光强很弱且光稳定性较差,往往需要多个荧光蛋白分子对目标物同时标记,才可以满足单病毒示踪的需求,这样可能会对病毒的结构和功能产生影响。荧光蛋白也易光漂白,难以满足长时间动态示踪的需要。再者,荧光蛋白与目标组分融合的操作相对比较繁琐。

2.2.3 量子点

采用量子点(quantum dots, QDs)等荧光纳米材料标记研究病毒侵染细胞的动态过程,能够克服荧光蛋白和有机荧光染料标记技术的不足,极大地推进单病毒示踪研究。量子点是一类半导体荧光纳米晶体,具有高亮度(因强吸收和高荧光量子产率)、稳定性好(耐光漂白)、荧光发射波长可调、单色激发多色发射等独特性能,是活体示踪及生物分子高灵敏检测等的理想标记材料^{[23 ⇓~25]}。在单病毒示踪领域,QDs的高亮度(比有机荧光染料或荧光蛋白高10~100倍)提高了检测灵敏度,并能获得高对比度的图像。此外,QDs优异的光稳定性(比有机荧光染料或荧光蛋白高100~1000倍)使其能够在高时间分辨率下对单个病毒进行数小时的示踪^[26]。基于上述优势,目前基于量子点标记的单病毒示踪技术在病毒感染机制研究方面取得了长足的发展,如本课题组利用量子点单病毒示踪技术系统地研究了流感病毒在活细胞内的转运、酸化及膜融合的过程,解析了流感病毒在感染不同阶段的转运机制^{[27 ⇓ ⇓~30]}。Cui等利用量子点标记了HIV病毒并研究了HIV病毒在人巨噬细胞内的侵染过程,在整合有HIV前病毒DNA的潜伏感染细胞中,对HIV前病毒进行实时动态示踪和三维定位分析^[31,32]。然而,量子点等荧光纳米材料也存在性能难以精确控制且通常尺寸较大易影响生物体的结构和生物活性等缺点。

此外,标记策略对标记技术影响也很大。如何建立温和、高效、特异、定点、定量的原位标记方法,并尽可能减少对病毒活性的影响,从而获取真实可靠的测量信号是目前单病毒示踪领域需要解决的关键问题之一。因此,迫切需要发展对病毒不同结构和组分的特异、原位标记方法,并实现对特定组分的定点定量标记,以实现对病毒侵染宿主细胞动态过程的准确诠释。

2.3 信息获取

通过显微成像装置获取荧光标记的病毒运动的序列图像之后,需要对图像中所包含的病毒颗粒运动的信息进行提取,以获得和病毒侵染过程相关的速度、运动轨迹、相互作用等信息(图2)。相关信息获取主要包括病毒颗粒定位、轨迹重建、轨迹分析及病毒或病毒组分与宿主细胞组分相互作用分析等过程。

2.3.1 病毒颗粒定位

对单个病毒颗粒的运动轨迹进行重建的首要条件就是精确地确定病毒颗粒的位置。在普通光学显微镜下,由于分辨率受衍射极限的限制,点状颗粒在图像上形成的光斑宽度是与波长(λ)及数值孔径(numerical aperture,NA)有关的,大约等于λ/NA。例如,对于可见光来说,点状颗粒的光斑直径大约为200 nm。因此,需要特定的方法来确定光斑的中心位置以满足单病毒示踪实验的需求。目前已经发展起来几种高精度的定位算法。它们大多基于显微镜下点状光源的光强分布符合点扩散函数(Point spread function,PSF)(式1)这一点进行定位。

(1) $PSF(r)=(\frac{2J_{1}(\frac{2\pi NAr}{λ})}{r})^2$

其中,r是到PSF中心的距离,J ₁是一级贝塞尔函数(Bessel function),NA是数值孔径,λ是波长。首先,可以通过反卷积技术高精度地恢复病毒颗粒的位置,它是利用PSF分布公式对病毒颗粒图像拟合来实现的。再者,由于单个荧光病毒颗粒光强分布符合二维高斯函数,因此可通过二维高斯公式对单颗粒图像拟合,实现对单个病毒颗粒的高精度定位^[34]。二维高斯拟合法虽具有定位精度高的优势,但也存在计算速度慢和步骤繁琐等缺点。此外,质心法也是一种对光斑进行定位的算法,该方法具有计算速度快、无复杂的拟合及迭代过程、不需要考虑光斑分布的理论模型等优势,但该算法定位受背景干扰严重,容易产生计算偏差,定位精度低。为了克服上述两种算法在光斑定位方面特别是三维定位方面的缺陷,本课题组开发了一种新型的基于径向对称的三维示踪算法,该算法具有定位精度高(定位精度可以达到 ~ 5 nm)、计算速度快(比高斯拟合法快约两个数量级)等优势,特别适合于在快速高精度三维单病毒示踪方面的应用^[35]。

2.3.2 轨迹重建

轨迹重建就是将同一个病毒颗粒在每一帧图片中的位置连接起来。虽然在视频图像中许多病毒颗粒能够被精确定位,但是由于病毒在活细胞内的运动非常复杂,例如在示踪的过程中采集光斑图像的帧与帧之间会发生光斑消失、光斑合并和光斑分裂等情况,因此对病毒的运动轨迹进行重建的步骤非常复杂。在低病毒颗粒浓度下,最近邻算法通常被用于识别来自不同帧中同一粒子的位置。而针对高病毒颗粒浓度,粒子之间相互作用的发生大大增加了光斑连接的难度,研究者通常采用手动重建的方法,以解决上述问题。但是,手动重建方法非常耗时,且缺乏操作的客观性。研究者往往需要通过有效的自动化算法对轨迹进行重建,再通过手动的方法对最终获得的轨迹进行验证。自动化的重建算法通常利用光斑大小、距离和光强等标准实现对同一光斑的连接,并且它们还必须拥有舍弃不确定轨迹的能力。针对上述问题已经发展起来一系列的算法,如解决光斑闪烁、自动化检测以及示踪的算法等。值得一提的是Jaqaman等针对颗粒交叉、融合、分裂、相互作用、光闪烁和光漂白等问题,建立了一套非常强大的多假设示踪算法,能够非常有效地用于高浓度单颗粒运动行为的研究^[36]。该算法首先将连续帧之间的颗粒位置连接起来,然后再将得到的轨迹片段连接成完整的轨迹。这两个步骤都被表述为全局组合优化问题,其解决方案确定了整个视频图像中最可能的粒子轨迹集合。

2.3.3 轨迹分析

一旦收集到了病毒的运动轨迹,就可以定量地获取和病毒侵染相关的一系列运动参数。平均平方位移(Mean square displacement,MSD)与时间间隔(Δt)的依赖关系是确定病毒颗粒运动模式的主要方法,从中可以进一步获得病毒运动的扩散系数及拟合速度等参数。在这里,我们简单介绍MSD与时间间隔的依赖关系(式2),以及其用于轨迹分析的规则及方法。

(2) $MSD(n\Delta t)=\frac{1}{N-n}\sum_{i=1}^{N-n}[r((i+n)\Delta t)-r(i \Delta t)]^2$

其中,r(Δt)是在Δt时间点处的粒子位置,Δt是时间间隔,N是总帧数,n和i都是整数。

通过分析MSD与时间间隔的关系曲线,通常单个颗粒的运动轨迹主要可被分为如下四种运动模式:1)定向扩散运动模式(directed motion with diffusion);2)正常扩散运动模式(normal diffusion)3)非正常扩散运动模式(anomalous diffusion);4)围栏式扩散运动模式(corralled diffusion)。通过相应的轨迹分析、数据拟合,可以对病毒在细胞内的运动行为以及与宿主细胞组分的相互作用进行分析,从而诠释病毒感染的动态机制。

3 单病毒示踪在病毒研究领域已取得的进展

病毒感染宿主细胞的过程大致如下:病毒进入细胞、转运至细胞特定位置、释放基因组、复制子代病毒组分、组装并释放子代病毒。子代病毒可继续感染新的宿主细胞,进入下一轮复制周期。对大多数病毒来说,完成一轮感染只需4~16 h。在如此短暂的时间里,发生着一系列病毒与宿主细胞不同结构的精细、复杂的相互作用,单病毒示踪技术正是研究这些相互作用的。

3.1 病毒入胞

为感染宿主细胞,病毒需先跨过细胞质膜屏障,进入细胞内部。根据质膜参与形式的不同,病毒进胞的方式一般可分为两种:与质膜融合和被细胞内吞。除HIV、伪狂犬病毒等主要通过与质膜融合进入细胞外^[37],大部分病毒通过胞吞作用进入细胞,如登革热病毒、乙型肝炎病毒和牛痘病毒等^{[38 ⇓~40]}。单病毒示踪技术的发展为全面认识病毒的入胞机制提供了有力的工具。Zhuang等通过单病毒示踪发现,甲型流感病毒(influenza A virus,IAV)结合到细胞上以后,极少数会利用质膜上现成的网格蛋白包被小窝进胞,绝大部分的病毒会在其结合的位置募集网格蛋白形成新的包被小窝,从而进入细胞^[41]。随后,本课题组利用量子点标记的单病毒示踪技术进行三色示踪研究发现,IAV与质膜结合后先募集网格蛋白,待募集量达到平台后立即募集能使质膜分裂的发动蛋白,发动蛋白一旦募集完成就立即从包裹病毒的囊泡上解离下来,网格蛋白紧随其后进行解离,几秒钟后包裹在囊泡内的病毒迅速向细胞内部转运(图3)^[29]。但是,并不是所有募集了网格蛋白和发动蛋白的病毒都能进入细胞^[29]。粗略估计,只有10%左右的IAV病毒能结合到宿主细胞表面,而结合到细胞上的病毒中也只有不到20%能启动募集网格蛋白,这其中又只有30%左右的病毒能募集到足够的相关蛋白进入细胞。可见,1000颗病毒中最终仅几颗能成功进入细胞。此外,病毒进胞是不同步的,同时结合到细胞膜上的病毒,有的1~2 min内就可进入细胞,有的则需要30 min甚至更长时间才能进胞。对IAV和乙型脑炎病毒而言,绝大部分病毒粒子在结合细胞膜30 min内进入细胞^[27,42]。

3.2 病毒在细胞内转运

通过胞吞作用进入细胞的病毒被包裹在胞吞泡中沿细胞骨架向细胞核或核附近转运。Rab5和Rab7是负责调控胞吞泡转运和成熟的蛋白,随着囊泡逐渐成熟,囊泡腔内pH值逐渐下降^[43],为不同病毒释放基因组提供适宜的环境^[37]。几乎所有通过胞吞作用进胞的病毒都依赖Rab5调控的内体进行转运^{[44 ⇓~46]},需要更低pH值释放基因组的病毒还依赖Rab7调控的内体进一步转运^[38,47]。另外,病毒的转运过程主要是沿微丝和微管骨架定向地进行的^[27,48,49]。以IAV为例,进入细胞的病毒大部分被包裹在含Rab5的早期内体中,在肌球蛋白VI驱动下沿微丝进行短距离转运,而后在动力蛋白驱动下沿微管向细胞核转运(图4),到达细胞核附近后,在微管支撑下,含Rab5的内体募集Rab7或与含Rab7的内体融合,使病毒被包裹在同时含Rab5和Rab7的过渡内体中,过渡内体进一步成熟为只含Rab7且pH值更低的晚期内体,为IAV提供释放基因组的酸性条件^{[27,43,50 ⇓ ~52]}。除了这种被不同病毒广泛采用的内吞转运路径外,IAV还会利用细胞的自噬过程进行转运,进入细胞的病毒中约有20%会被包裹在不含Rab5的自噬体中沿微管向细胞核定向转运(图5)^[53]。登革热病毒在感染细胞的过程中也会利用自噬体进行转运^[54]。考虑到很多种类病毒都有不依赖Rab5转运的情况,推测自噬过程极有可能是一种被不同病毒广泛采用的转运路径。另外,与超低的进胞效率不同,病毒在胞内的转运效率极其高,几乎所有进入细胞的病毒最终都能转运到细胞核附近。

3.3 病毒释放基因组

病毒到达细胞内部区域后,要将基因组从致密的包裹中释放到细胞质或细胞核中,才能进行后续复制过程。内吞进胞的病毒大多通过包膜与内体膜在低pH值下融合释放基因组。基于此,单病毒示踪研究病毒核酸释放的方法有两类:监测病毒包膜与内体膜融合和监测病毒核酸与包膜分离^[55]。Zhuang等用较高浓度的DiD染料标记病毒包膜,利用染料荧光在高浓度时自猝灭、浓度降低后去自猝灭监测了登革热病毒与内体膜融合的过程,发现该病毒有80%与仅含Rab7的晚期内体融合,15%与含Rab5和Rab7的过渡内体融合,另有5%与仅含Rab5的早期内体融合^[38]。但传统病毒学的研究结果表明,登革热等黄病毒科病毒感染宿主细胞是不依赖Rab7蛋白的^[56,57]。因此,还需要进行大量的研究来进一步验证。本课题组用核酸染料、荧光蛋白和量子点分别标记杆状病毒的核酸、衣壳和包膜,通过监测核酸染料和荧光蛋白与量子点信号的分离,观察到杆状病毒将核衣壳释放到昆虫细胞核内的过程^[58]。Cui等用三种颜色的量子点分别标记IAV的核酸和包膜,通过观察不同颜色量子点在细胞核附近的分离情况,发现进入细胞的病毒中约有30%在细胞核附近释放了基因组(图6)^[59]。综合前文结果可知,对IAV而言,能进入细胞并成功释放基因组的病毒只有千分之一左右,这给药物治疗提供了很大的空间。

3.4 病毒组装和出胞

病毒将基因组从内部释放出去后,还需复制子代核酸、合成子代蛋白并将关键组分组装成子代病毒粒子、释放到细胞外。由于缺乏相应的标记方法,单病毒示踪技术在研究这些过程时面临巨大挑战,但在子代病毒关键组分转运和组装动力学以及作用机制方面仍取得一些重要进展。借助基因编辑技术,Chen等实现了对HIV病毒RNA翻译过程的可视化研究,发现细胞质内约有一半的RNA会进行翻译,另一半则不翻译,翻译和不翻译的RNA都会积极地向细胞质膜转运,但只有不翻译的RNA会被病毒的Gag蛋白包裹,组装子代病毒(图7)^[60]。子代HIV组装完成后,Gag蛋白会募集宿主细胞的ESCRT复合物和VPS4蛋白推动病毒包膜与质膜分离,将病毒释放到细胞外^[61]。虽然病毒粒子内部含有大量肌动蛋白,但肌动蛋白丝(微丝)并不参与HIV病毒在质膜上的组装过程^[62]。另外,对伪狂犬病毒的示踪研究发现,子代衣壳蛋白在细胞质合成后进入细胞核与子代DNA组装成子代病毒核衣壳(图8),随后,核衣壳与含有病毒包膜蛋白的细胞膜系统在高尔基体组装成为子代病毒,子代病毒被含有Rab6、Rab8和Rab11的偏酸性分泌小泡包裹,沿微管骨架向细胞质膜转运,最终从微管在质膜上的锚定位置附近通过胞吐途径出胞^{[63, 64,65]}。而对IAV的示踪研究表明,子代病毒的核糖核蛋白复合物(virus ribonucleoprotein complexes, vRNP)在细胞微管组织中心附近通过PB2蛋白与宿主的Rab11蛋白结合,在内质网出口位置形成没有膜结构的病毒包含物,这种包含物之间相互融合和分裂,促使病毒不同的vRNP相互作用,最后在微管和微丝运输系统的转运下抵达细胞质膜,组装子代病毒^{[66, 67,68]}。

综上可见,单病毒示踪方法正在病毒学研究中发挥着越来越重要的作用。

4 目前存在的问题和对策

虽然单病毒示踪技术在病毒研究中已取得了很大进展,但作为一种发展中的新兴技术仍存在一些问题需要克服。

4.1 标记技术

通常,标记技术涉及两方面,即标记物和标记策略。从前述讨论可知,用于单病毒示踪的荧光标记物必须具备优异的性能,具体来说,要求标记物的示踪信号(荧光)强、稳定性高、非特异性吸附尽可能小、生物相容性好、尺寸尽可能小等。有机荧光染料和荧光蛋白的荧光强度都较弱,光化学稳定性大多也不太好,易光漂白,有些有机荧光染料非特异性吸附较强,荧光蛋白体积较大等。光化学稳定性不好的标记物往往在光照时会产生自由基,对病毒的正常感染过程甚至病毒结构都可能产生破坏。与此同时,量子点作为病毒标记物也存在一定的问题,如尺寸较大、生物相容性不太好、有非特异性吸附等。

解决上述标记物存在问题的对策应从两方面考虑,一方面,从设计和合成控制的角度,进一步改进标记物的结构,提高目前所用标记物的性能;另一方面,寻找和发现性能更优异的新标记物。例如,通过本课题组提出的准生物合成法,可以合成出尺寸超小(1.5~1.8 nm)、生物相容、荧光量子产率高的多功能近红外荧光量子点^[69,70]。

有了性能优异的标记物,还需针对病毒的结构和动态侵染过程特征,建立特异、高效、定点、定量的原位标记方法,并尽可能减少对病毒活性的影响,从而获取真实可靠、高灵敏的测量信号。目前,病毒组分的常规标记方法主要包括:(1)直接利用标记物与病毒特定组分的差异性亲合作用;(2)通过生物化学反应将标记物直接与病毒特定组分偶联;(3)将荧光蛋白与病毒特定蛋白融合表达。然而上述方法都存在一定的局限性,如亲合标记在复杂体系中易受干扰物及基质影响,导致结合能力和特异性较低,结合量也不太好控制;生物化学标记方法难以实现定量控制,而大量标记物的结合易破坏病毒的结构与功能,影响其活性及正常感染过程;荧光蛋白的可标记组分有限,且荧光蛋白的大量表达也会影响病毒的感染活性。此外,为了准确详细地获取病毒感染全过程的多元信息,需要对病毒的包膜、衣壳、核酸等不同结构和组分同时分别进行标记,而已有的病毒双重标记或多重标记方法普遍存在繁琐、低效的问题。所以,病毒标记仍是制约其感染过程研究的关键,也是目前亟待解决的难题。

为解决上述标记方法存在的问题,迫切需要发展针对病毒不同结构和组分的温和、特异、高效的原位标记方法,并实现对特定组分的定点定量标记,确保其天然感染能力。可能的对策是活细胞合成与原位标记一体化融合、无机-生物体系融合、细胞内生化反应途径与基因操纵策略相融合。例如,本课题组通过精心设计,使活细胞自动合成量子点并直接对其所产生的微囊泡进行原位标记^[71],实现了对结构非常脆弱易损的细胞源性微囊泡效率高达94%的标记。当然,这还仅仅处于该类策略的启蒙阶段,但其前景非常可期。另外,由于感染过程中病毒的结构和与宿主细胞发生相互作用的关键组分都在不断变化,还亟待发展与之相适应的动态标记技术,这非常具有挑战性。

4.2 测量技术

近年来,显微技术的快速发展特别是全内反射荧光显微镜、转盘式共聚焦显微镜等高速荧光显微技术的出现,促进了单病毒示踪研究的快速发展。尤其是随着超分辨成像技术的发展,出现了基于转盘式共聚焦显微镜的超分辨活细胞成像技术,使快速、超分辨、长时程、深层单病毒成像示踪成为可能。但是,如何提取并精准转换病毒在复杂宿主细胞中感染的瞬时、动态、小概率事件信息,发展微弱信号原位转换与放大、动态多元信号整合等新策略,并通过大量信息的处理与统计分析以正确认识和诠释病毒感染机制仍面临一些瓶颈,亟待系统性的突破。

5 结论与展望

综上所述,病毒感染过程其实非常复杂,随着时间和空间的变化,病毒的结构和生物活性以及病毒或病毒组分与宿主细胞组分的相互作用等也都在不断变化。虽然目前的单病毒示踪方法已经取得了可喜的研究进展,并且也在病毒学研究中得到了一些应用,甚至有一些新的发现,但是,方法本身还需进一步完善,特别是亟待发展温和高效的动态标记技术和海量数据的快速获取与分析技术。

作为一种强有力的工具,单病毒示踪应该尽可能应用于研究和诠释诸如流感病毒、艾滋病毒、新冠病毒等重要病毒的感染机理、细胞与细胞之间的传播机理、活体感染及致病机理等,为建立诊疗方案、药物研发以及制订防控措施等奠定必需的基础。选择频发感染的病毒如流感病毒为对象,详细地研究和记录其感染的动态全过程,作为病毒学入门的实况教材,便于更直观和牢固地掌握病毒学基本知识,也具有更普适性的意义。

活体水平病毒感染过程的示踪测量可为认识病毒的感染和致病机理提供最真实可靠的信息,但由于情况更复杂、难度更大,目前还没有能满足病毒活体三维长时间动态示踪要求的方法。关键是,首先需要发展适用于病毒活体示踪的标记物,近红外II区量子点可能是目前最值得考虑的一类。近红外量子点作为病毒活体示踪的标记物,除了具有前面提到的亮度高、稳定性好(耐光漂白)、荧光发射波长可调、单色激发多色发射等独特性质外,还具有对活体示踪非常关键的性质——荧光穿透深。当然,同时还需要建立合适的标记策略。有了理想的标记物和相应的标记策略后,还需发展相适应的测量技术。活体内高时空分辨三维单病毒示踪新技术新方法已开始引起研究者的重视。

总之,随着荧光性能优异的量子点等新型标记材料的出现和高时空分辨测量技术的发展而不断完善的单病毒示踪方法,将会在病毒学研究甚至重大病毒性传染病的防控中发挥越来越重要的作用。

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基金资助

国家自然科学基金项目资助,纪念南开大学化学学科创建100周年(21877102)

国家自然科学基金项目资助,纪念南开大学化学学科创建100周年(21977054)

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2020-10-27	2021-01-24	2020-11-18
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2020-12-09

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