荧光纳米材料在病原微生物检测中的应用

赵丹; 王昌涛; 苏磊; 张学记

doi:10.7536/PC201104

化学进展 ›› 2021, Vol. 33 ›› Issue (9) :1482-1495 DOI: 10.7536/PC201104

综述

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荧光纳米材料在病原微生物检测中的应用

赵丹 ¹^,² ,
王昌涛 ¹^,²^,^* ,
苏磊 ¹^,³^,^* ,
张学记 ³

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Application of Fluorescence Nanomaterials in Pathogenic Bacteria Detection

Dan Zhao ¹^,² ,
Changtao Wang ¹^,²^,^* ,
Lei Su ¹^,³^,^* ,
Xueji Zhang ³

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摘要

病原菌污染给人类的健康带来极大的安全隐患,对病原菌快速、准确和灵敏的检测是减少污染的重要手段。传统检测病原菌的方法存在耗时长和操作繁琐等缺点。荧光纳米材料具有荧光强度高、稳定性好以及良好的生物相容性等优势,为应用其构造传感器用于病原菌检测提供了新的研究途径。本文对近年来常见荧光纳米材料,包括半导体量子点、金属纳米簇、碳纳米材料、上转换纳米粒子和荧光硅纳米颗粒,在病原菌检测方面的应用进行了概述,着重将不同类别荧光纳米材料的光学性质和检测机理进行了分析和比较。纳米材料的生物修饰是实现病原菌特异性识别的重要环节,本文对抗体、适配体、噬菌体和抗生素等病原菌识别方式的特点及其与纳米材料的连接方式进行了介绍。最后对不同荧光纳米材料在检测病原菌中具有的优势和局限性进行了总结,并对其在未来的应用与研究重点进行了展望。

Abstract

Pathogenic bacteria contamination brings severe safety problems to human health. Fast, accurate and sensitive detection of pathogenic bacteria is an important way to reduce pathogenic bacteria pollution. Traditional methods for detecting pathogenic bacteria have the disadvantages of being time-consuming and laborious. Fluorescent nanomaterials have the advantages of high fluorescence intensity, good stability and excellent biocompatibility, which provide a new research approach for the application of fluorescent nanomaterials as biosensors for pathogenic bacteria detection. This review summarizes the applications of various fluorescent nanomaterials in pathogenic bacteria detection in recent years, including semiconductor quantum dots, fluorescent metal nanoclusters, carbon nanomaterials, upconversion nanoparticles and fluorescent silicon nanoparticles. It mainly focuses on the analysis and comparison of the optical properties and detection mechanisms of different types of fluorescent nanomaterials. The bioconjugation of nanomaterials plays an important role in the whole process of pathogenic bacteria detection, which is closely related to the detection specificity. This article introduces the characteristics of different recognition elements, including antibodies, aptamers, phages and antibiotics. The conjunction methods between different recognition elements and nanomaterials are also discussed. Finally, the advantages and limitations of different nanomaterials for detecting pathogenic bacteria are reviewed and the development prospects in practical application and research priorities in the future are addressed.

Contents

1 Introduction

2 Application of fluorescent nanomaterials in detection of pathogenic bacteria

2.1 Quantum dots

2.2 Metal nanoclusters

2.3 Fluorescent carbon nanomaterials

2.4 Up-conversion nanomaterials

2.5 Fluorescent silica nanomaterials

3 Recognition methods

3.1 Specific recognition

3.2 Non-specific recognition

4 Conclusion and outlook

Graphical abstract

关键词

荧光 / 纳米材料 / 病原菌 / 检测 / 识别

Key words

fluorescence / nanomaterial / pathogenic bacteria / detection / recognition

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赵丹, 王昌涛, 苏磊, 张学记. 荧光纳米材料在病原微生物检测中的应用[J]. 化学进展, 2021, 33(9): 1482-1495 DOI:10.7536/PC201104

Dan Zhao, Changtao Wang, Lei Su, Xueji Zhang. Application of Fluorescence Nanomaterials in Pathogenic Bacteria Detection[J]. Progress in Chemistry, 2021, 33(9): 1482-1495 DOI:10.7536/PC201104

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1 引言

病原菌检测与人类的健康息息相关。世界上有250多种疾病是由不同食源性病原菌引起的。这些疾病主要是由链球菌(Streptococcal)、鼠寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、大肠杆菌(Escherichia coli)O157:H7、单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)和结核菌(Mycobacterium tuberculosis)等细菌的感染导致的^[1]。对病原微生物进行早期迅速的检测是预防感染的关键。传统的定量和检测病原菌的方法有平板计数法和聚合酶链式反应(PCR,Polymerase Chain Reaction)。平板计数能够估计样品中活菌的数量,PCR方法能够实现对目标细菌中特定DNA和RNA的检测。这些方法具有高的特异性和灵敏度,但是往往需要复杂的样品准备过程且检测时间较长^[2]。

缩短病原菌检测所需的时间,同时降低检测限,是当前食品检测领域长期存在的重大挑战。基于生物传感器的检测策略是当前克服上述挑战的一种非常有前景的方法。生物传感器是将抗体和适配体等生物材料作为识别元件修饰在传感器表面,通过生化反应将识别信号转换为可测量的物理或化学信号。由于生物成分对某些特殊分子具有较高的选择性和灵敏度,因此,生物传感器检测准确度更高^[3]。当前可用于检测样品的传感器由响应时间、检测范围、检测限、信噪比以及特异性这些因素限制^[4]。纳米材料所具有的独特的物理化学性质能够提高生物传感器的性能,特别是具有识别位点的功能化纳米材料在整个传感检测过程中具有更高效的捕获分析物的能力^[5,6]。

荧光分析法是指某些物质在特定波长的光照射下产生荧光,利用其强度进行物质的定性或定量分析的一种分析方法。该方法具有诸多优势,如选择性好、荧光强度高、灵敏度高、具有多种检测技术和方法等^[7]。由于荧光分析技术优点众多,可根据实际检测条件,选择最合适的检测技术和方案。荧光分析必须要有荧光探针。早期,研究者们普遍采用传统的荧光染料作荧光剂,但荧光染料具有背景高、激发光谱较窄、荧光发射光谱宽且分布不对称、易被光漂白等缺陷,极大限制了其在生物医学领域中的应用^[8]。随着纳米材料和纳米技术的飞速发展,新型的荧光纳米材料由于具有较高的荧光量子产率和优越的光稳定性等优点,有望逐渐取代传统发光材料。将荧光纳米材料用于细菌检测的优势主要在于其尺寸微小且吸附能力强、表面反应活性高,一个病原菌可同时与多个纳米粒子结合,使得标记目标菌具有更高的荧光强度^[9]。利用其较高的荧光稳定性,可以在几分钟到数小时内对目标物进行实时跟踪。此外,使用多色的荧光纳米粒子能够对不同菌株进行同时检测,在荧光纳米颗粒表面包裹了惰性物质外壳后使其毒性大大降低,远低于有机染料的毒性^[10]。

目前广泛应用于检测的荧光纳米材料有无机荧光纳米材料,如量子点、金属纳米团簇、碳点和石墨烯量子点等为主的碳基材料;稀土上转换纳米材料、荧光硅纳米颗粒和有机荧光纳米材料等^[11]。为使这些材料能够对目标物进行识别,通常要进行功能化以便能够识别并连接到细菌表面。识别元件在纳米材料表面的固定化是生物传感器功能实现的重要步骤。本文从不同荧光材料在检测病原菌方面的应用进行了归纳总结,并对荧光纳米材料与致病菌的识别方式进行了概述,为荧光纳米材料在此方面的应用提供参考。

2 荧光纳米材料在病原菌检测方面的应用

2.1 半导体量子点

量子点又称半导体纳米粒子或半导体纳米晶体,是一种由Ⅱ~Ⅵ或Ⅲ~Ⅴ族元素组成的三维尺寸在纳米量级的原子团簇。根据量子限域效应,通过控制量子点的大小和材料组成可以对其带隙进行调节。当前研究最广泛的是镉元素量子点CdX(X=S,Se,Te)。与有机荧光材料相比,量子点具有更好的光稳定性、更高的量子产率和宽的吸收谱带,用一种激发光源对多种量子点进行同时激发,可以发射出不同的荧光。由于具有良好的荧光发光性质,量子点已在基于荧光的传感器中用作荧光探针和荧光供体^[12]。

磁性纳米颗粒具有良好的可操作性以及很强的分离能力。基于抗体特异性识别的免疫磁分离技术能够保证对目标细菌的特异性识别,使得分离富集准确有效且处理方法简单、快速。Dogan等^[13]利用壳聚糖修饰CdTe量子点与Fe₃O₄磁性纳米颗粒相组合的方式对大肠杆菌进行分离和检测。首先分别在两种纳米颗粒表面修饰有大肠杆菌的特异性抗体,磁性纳米颗粒用于将大肠杆菌吸附并与其他杂质分离,接着用荧光量子点对目标菌进行标记,通过检测量子点的荧光强度对目标菌的浓度进行定量。此检测体系对大肠杆菌的最低检测限为30 cfu/mL(图1)。

Xue等^[14]利用高梯度磁选装置(High Gradient Magnetic Separation Device)对大肠杆菌进行分离和检测。在磁场存在下,修饰有大肠杆菌O157:H7单克隆抗体的磁性纳米颗粒固定在通道内,能够对目标菌进行特异性捕获,待测液中的其他物质流出通道,随即将修饰有大肠杆菌抗体的量子点注射到通道与大肠杆菌结合,去除磁场后,磁性纳米颗粒-目标菌-量子点的复合物随通道流出,使用荧光检测装置对量子点进行荧光检测,以此对目标菌含量进行定量。这种高梯度磁选装置可有效分离86%的大肠杆菌O157:H7,检测限低至14 cfu/mL,且能够在2 h内完成病原菌的检测(图2)。值得注意的是在免疫磁分选过程中,总会有小部分的分析物流失,从而影响检测结果准确性^[15]。

此外,如果不将病原菌与荧光标记物进行分离,直接通过观测反应体系的荧光强度变化也可进行细菌检测。由于刀豆蛋白表面含有脂多糖的结合位点,Ebrahim等^[16]利用刀豆蛋白A修饰的CdTe量子点对细菌细胞壁含有脂多糖的沙雷氏菌进行特异性识别。随着沙雷氏菌浓度的增加,CdTe的荧光强度逐渐降低,其荧光猝灭的原理可能与内滤效应、电子转移以及非辐射重组有关^[16]。

据验证,相比仅有核的量子点,核壳量子点荧光性质更佳,单独的量子点颗粒由于易受外界杂质和晶格缺陷的影响,荧光量子产率较低。当其作为核/心,用另一种半导体材料进行包裹形成核壳结构后,可以有效消除非辐射弛豫途径,防止光化学褪色,促使荧光发射强度得到提高^[4]。

Yu 等^[17]利用核壳结构的CdTe/CdS作为荧光标记物与大肠杆菌O157:H7的抗体进行连接,将大肠杆菌多克隆抗体和羊抗兔抗体分别作为检测线和控制线修饰在玻璃纤维素膜上,当目标菌和混有抗体量子点复合物的混合液在加样板上通过毛细作用移动到检测区时,检测线上的大肠杆菌多克隆抗体对目标菌进行捕获,同时抗体量子点复合物与检测线上目标菌特异性结合,此外抗体量子点复合物与控制线抗体结合,从而在检测线和控制线上分别呈现荧光条带,由此对样品中的大肠杆菌O157:H7进行检测。这种利用试纸条对目标物进行分离检测的方法已在日常生活中应用,如早孕筛查试纸和幽门螺杆菌检测试纸,具有简单、快速和便捷等优点。

由于量子点发光性能与尺寸大小密切相关,在同一光源激发下,不同大小的量子点能够产生不同的发射光,基于这种性质,可用于几种不同病原菌的同时检测。Wang等^[18]使用504 nm、557 nm 和604 nm三种不同发射波长的量子点分别与沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抗体连接,通过与目标菌的免疫识别作用可对9种食品中的目标菌进行检测,此方法简易可行,具有良好的抗干扰能力。

量子点在病原菌检测方面体现了良好的光学和电学性质,然而较高的合成费用以及所用金属元素的高毒性成为限制其应用的主要问题^[19]。此外,随着对其进一步的表面修饰或生物连接,量子点的稳定性和荧光强度也随之下降^[20]。

2.2 金属纳米簇

由于荧光金属纳米簇(FM NCs,Fluorescent Metal Nano Clusters)合成方法较为简单、荧光强度较强、生物相容性良好且稳定性较好,其在环境监测、生物成像、疾病监测、催化和光电学等多个领域具有广阔的前景^[21]。当前已有多种荧光金属纳米簇被研究发现,例如铂纳米簇、金纳米簇、银纳米簇、铜纳米簇以及各种合金纳米簇等。荧光金属纳米簇是由保护剂同几个、数十个或者上百个金属原子(如Cu、Ag、Au、Pt))结合而成的核粒径小于2 nm的荧光纳米材料。当FM NCs的尺寸小于金属的费米波长时,电子的连续能级将被分裂成各种离散能级,从而使FM NCs具有独特的较强荧光性能。金属纳米簇由于其光学性质独特以及毒副作用小等优点,使其在生物传感检测领域的应用得到不断拓展^[22]。

由于金属纳米簇合成方法简易,同时具有良好的发光性质,越来越多的人使用其用于病原菌的检测。Cheng等^[23]用壳聚糖包裹金纳米簇后,在其表面修饰有捕获大肠杆菌O157:H7的抗体,同时在磁性纳米颗粒表面修饰有捕获目标菌株的抗体,当目标菌株与此两种纳米颗粒结合后利用磁分离技术将大肠杆菌O157:H7进行分离,通过对检测体系的荧光进行测定从而对目标菌株进行定量测量。由于大量荧光金纳米簇被壳聚糖包裹,其检测体系的荧光大幅度增加,检测限为1 cfu/mL,相比传统的直接使用金纳米簇对病原菌进行定量,金纳米簇微囊体系检测灵敏度提高了67.6倍。

除了将金属纳米簇直接用于标记的检测信号外,还可在捕获目标细菌后在其表面原位合成荧光金纳米簇,从而实现对病原菌的定量。Hossein-Nejad-Ariani等^[24]利用原位合成金纳米簇的方法对单核细胞增生李斯特菌进行检测。Leu A作为捕获单生李斯特菌的特异性多肽被固定在玻璃表面,在其捕获目标菌株后与3-巯基丙酸和氯金酸反应合成荧光金纳米簇,通过检测荧光强度实现菌浓度的定量。此种方法不需要对细菌进行分离,操作简便,使用10 μL样品在50 min内即可完成检测,检测限为2000 cfu/mL(图3)。这种原位合成金纳米簇的方法为病原菌检测提供了新的方向。

通过将金属纳米簇独特的发光性质与待测病原菌本身的特性结合进行细菌检测,省去了识别元件的修饰工作,使检测过程更加简化。众所周知,Cu²⁺能够猝灭金纳米簇的荧光,而大肠杆菌具有的还原性酶NDH-2可将二价铜离子还原为一价铜离子,导致其不再具有猝灭金纳米簇荧光的性质。根据该原理Yan等^[25]开发了一种On-Off-On检测大肠杆菌的模式。金纳米簇的荧光在二价铜离子存在时猝灭,当向体系中加入大肠杆菌反应后,金纳米簇的荧光恢复。荧光恢复程度与检测体系中的大肠杆菌浓度有着良好的线性关系,使用该方法可在0.5 h内完成大肠杆菌的检测,最低检测限为89 cfu/mL(图4)。但是其他细菌如鼠伤寒沙门氏菌对铜离子有相同的作用,因此该法特异性有待考证^[26]。

Zheng等^[27]利用硫酸盐还原菌(Sulfate-reducing bacteria)能够将

SO 4 2 -

还原为S^2-的原理,向Pb²⁺诱导的GSH-Au(Ⅰ)聚集诱导发光体系中加入硫酸盐还原菌,产生的S^2-与Pb²⁺反应生成PbS沉淀,导致聚集诱导发光体系中的荧光减弱,通过检测荧光信号的降低程度对硫酸盐还原菌进行定量,此检测体系对硫酸盐还原菌的最低检测限为10 cfu/mL,检测时间为4 d。利用Pb²⁺诱导的金纳米簇聚集发光体系对病原菌检测在1×10~10⁷ cfu/mL浓度内有良好的线性,但是检测时间较长,此外重金属铅离子处理不当会对环境造成污染。

银纳米簇在病原菌检测方面也有一定的应用。Zheng等^[28]利用DNA为模板的银纳米簇对大肠杆菌进行检测。他们首先制备了含有磁性纳米颗粒-DNA酶-乙酰胆碱酯酶(MNP-DNAzyme-AChE)的复合体系,大肠杆菌裂解物中的目标分子与DNAzyme结合的同时能够将其切割,从而使连接有乙酰胆碱酯酶(AChE)的DNA链被释放到溶液中,在电场中将磁纳米颗粒分离后,向体系中加入DNA-AgNCs与硫代乙酰胆碱(ATCh),AChE能够催化ATCh水解为硫代胆碱(TCh),其可以显著增强DNA-AgNCs的荧光强度。通过检测反应体系的荧光强度变化实现对大肠杆菌的定量,检测限为60 cfu/mL(图5)。以DNA为模板的荧光银纳米簇可作为潜在的通用检测体系,通过改变相应的DNA酶识别探针,实现对不同病原菌及小分子物质的检测。

2.3 荧光碳纳米材料

荧光碳纳米材料包含有碳点(CDs,Carbon Dots)、石墨烯量子点(GQDs,Graphene Quantum Dots)、氧化石墨烯(GO,graphene oxide)和碳纳米管(CNT,Carbon Nanotube)等材料。尽管荧光碳纳米材料的发光机制尚未被研究透彻,但得益于碳纳米材料的低毒、生物兼容性好的特性,其已经在生物检测方面有了广泛的应用^[29,30]。CDs和GQDs的光致发光与量子点相当,具有高稳定性和可调性,具体取决于尺寸、表面官能团、化学成分、掺杂和激发波长,其发光原理可能是由激子在表面上的辐射复合和量子限制引起的。在红外线激发的条件下,CDs和GQDs具有上转换光致发光的性质^[31,32]。因为碳基材料通常具有低毒性,CDs和GQDs比金属量子点更环保,碳水化合物、果皮和甘蔗渣等可再生资源均可用于合成碳点。此外,基于碳的纳米材料通常是可生物降解的。基于以上这些性质,CDs和GQDs可用于生物传感器中的荧光探针或者荧光供体,为病原菌的成像和检测提供了新的手段^[33]。

2.3.1 碳点

碳点是非晶态或者晶态的准球形碳纳米颗粒,直径小于10 nm。利用碳点进行病原菌检测可分为两种模式,直接型和间接型。直接检测需要碳点表面具有某些基团或特定的电荷,可用于病原菌的标记和检测。如两亲性碳点表面与细菌细胞膜具有较高的亲和性,可作为病原菌检测的荧光标记物^[34]。间接检测则需要在碳点表面修饰抗体和适配体等小分子或基团,实现与目标菌的识别和标记。

Yang等^[35]利用有机硅纳米材料对碳点进行包裹,获得CDs@BONs,在其表面修饰金黄色葡萄球菌抗体后可对目标菌进行特异性捕获,同时利用修饰有抗体的磁性纳米粒子对细菌进行分离。利用NaBH₄对有机硅纳米微囊的破坏作用将其中的碳点释放出来,进行荧光检测,此种方法对金黄色葡萄球菌的检测限低至1 cfu/mL。由于纳米微囊中包裹了数百个碳点,这种体系的荧光信号比仅使用碳点进行检测的方式大幅增加,灵敏度是传统检测方式的108倍,以上信号放大策略为高灵敏度检测病原菌提供了新的途径(图6)。

Bhaisare 等^[36]利用FeCl₂·4H₂O和FeCl₃·6H₂O合成磁性纳米颗粒,接着与壳聚糖反应合成磁性碳点(Mag-CDs),由于壳聚糖含有大量的氨基,所合成的磁性碳点带有正电,通过静电作用与带有负电的病原菌结合后经过磁分离技术收集,检测的荧光强度与病原菌浓度呈线性关系。使用此方法检测金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的检测限分别为3×10² cfu/mL和3.5×10² cfu/mL。他们采用MALDI-MS技术对分离得到的菌株进行成分分析即可进行菌株鉴定。以上基于碳点表面电荷性质对菌株进行识别的方法虽然简单,但是特异性差,只能识别某一类菌,而无法针对某一种目标物进行识别。

除此之外,为避免碳点表面复杂的修饰工作,还可针对目标菌表面的特殊性质进行碳点的合成。Zheng等^[37]利用硼酸、多黏菌素、万古霉素三种能识别不同细菌表面的分子分别与柠檬酸二胺合成碳点。根据碳点表面受体与目标细菌的结合致使碳点荧光发生降低的原理,通过对目标菌与三种碳点结合的荧光变化情况,利用线性判别分析(liner discriminant analysis)可对菌株进行分类判别。利用此种方法,能够将大肠杆菌、脱硫弧菌(Desulfovibrio desulfuricans)、松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)、单核细胞增多性李斯特菌、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)6种具有不同表面吸附性质的菌株进行鉴别,准确率达91.6%,另外此种方法还可用于未知菌株的分类以及混合菌液中细菌的鉴定(图7)。这种通过多种识别信号叠加的方法使得细菌的特异性识别得到增强。

以上方法均为直接利用碳点作为荧光标记物对目标菌进行识别检测的方法。此外,利用其本身的光学性质,与其他纳米材料如量子点组合使用,通过在量子点表面进行修饰实现对目标菌的识别,从而回避了碳点表面不易修饰的问题。Duan等^[38]合成了能够发出两种不同颜色荧光的CdTe量子点:绿色荧光量子点gQDs和红色荧光量子点rQDs,在其表面分别修饰有副溶血性弧菌(Vibrio Parahemolyticus)和鼠寒沙门氏菌的适配体。在没有目标菌株的体系中,适配体核酸和碳点表面形成的π-π堆积作用将gQDs、rQDs和碳点距离拉近,发生荧光共振能量转移致使量子点荧光猝灭。当体系中混入目标菌株时,由于适配体与细菌结合后发生构象改变从而与碳点解离,相应量子点荧光恢复。荧光强度与目标细菌的浓度成正比,另外由于两种量子点的发光峰不存在重叠,可以实现对两种目标物的同时检测(图8)。

2.3.2 石墨烯量子点

由于GQDs所具有的独特性质,其逐渐成为理想化的碳纳米材料。GQDs具有石墨烯的晶格结构,原子层数少,横向尺寸在3~20 nm范围内^[12]。根据其发光性质,可利用荧光法或电化学发光法对病原菌进行检测。

Safardoust-Hojaghan等^[39]利用柠檬酸和乙二胺通过水热法合成了一种在500 nm左右发蓝光的石墨烯量子点。将大肠杆菌或金黄色葡萄球菌与其混合后,荧光发生猝灭,且荧光猝灭程度与反应体系中目标细菌的浓度成正比。这是由于石墨烯量子点的发光性质与其尺寸、表面缺陷、含有的功能化基团以及含氧基团密切相关^[40]。大肠杆菌和金黄色葡萄球菌与石墨烯量子点混合后引起表面功能基团的变化导致荧光猝灭。该法可在2 h内完成对病原菌的检测,检测过程快速简便,但是由于对检测菌株没有特异性,在混有多种菌的体系中无法确定某种细菌的浓度。

Chen等^[41]利用电化学发光法通过氮掺杂的石墨烯(N-GQDs)进行大肠杆菌的检测。首先基于表面印迹聚合物(SIP,Surface Imprinted Polymer)技术通过电聚合的方法将大肠杆菌O157:H7与多巴胺固定在基底上,利用柠檬酸和十二烷基硫酸钠将其中的大肠杆菌去除后,聚多巴胺中留有的细菌空位用于大肠杆菌的捕获。将修饰有大肠杆菌多克隆抗体的N-GQDs对捕获得到的大肠杆菌进行识别定量,向体系中加入过硫酸钾后,整个SIP-E.coli O157:H7/PAb-N-GQDs能够产生更强的电化学发光。在最优条件下,电化学发光强度与待测物的浓度呈良好的线性关系,检测范围在10~10⁷cfu/mL,最低检测限为8 cfu/mL(图9)。这种通过电化学发光法检测大肠杆菌的方法有良好的特异性和灵敏度,改变相应的抗体,还可用于其他病原菌的检测。病原菌检测需要高度的选择性、灵敏度,GQDs良好的光稳定性以及快速的光致发光响应使其成为具有前景的检测材料^[42]。

2.4 上转换纳米粒子

上转换纳米粒子(UCNPs,Upconversion Nanoparticles)作为一种新型的荧光纳米材料,是镧系元素离子与适合的无机纳米颗粒掺杂后形成的直径小于100 nm的材料。与量子点和传统的有机荧光材料不同的是,上转换纳米粒子在近红外光的激发下能够发射可见光^[43]。通过调节掺杂物与基质材料的参数,如掺杂浓度、颗粒大小以及形态能够改变上转换材料的发射光谱。上转换粒子出色的光稳定性、窄的发射波长以及低荧光背景等特点,使其作为荧光探针和荧光供体,在生物传感方面得到了广泛应用^[44,45]。

由于上转换纳米粒子可以被红外光激发,而红外光具有更强的渗透能力和更弱的光损伤,可以减轻对机体的伤害,Wu等^[46]在上转换纳米材料表面连接有能够特异识别病原菌的适配体,在与适配体互补的RNA序列的一端连接有磁性纳米颗粒,将二者混合制备出检测探针。当探针遇到目标细菌后,带有磁性纳米颗粒的RNA序列与上转换纳米材料解离,在磁场下将磁性纳米颗粒及其连接物分离出来进行荧光强度检测。荧光强度与病原菌的浓度存在负线性关系。他们将三种不同发射波长的上转换纳米粒子连有不同细菌的适配体,实现了金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)和鼠伤寒沙门氏菌的同时检测(图10)。由于适配体具有特异性,因此该方法可实现特定菌的识别和定量,检测方法便捷,灵敏且特异性强。

Kurt等^[47]使用上转换粒子和量子点两种荧光发光材料对沙门氏菌和金黄色葡萄球菌同时进行检测。由于两种材料的发光性质不同,需分别使用相应的光谱检测,可有效避免信号干扰。首先,将具有不同发射波长的CdTe量子点和上转换材料NaYF₄:Yb,Tm分别与两种待检测目标菌的适配体连接,随即将与两种适配体互补的核酸DNA链与磁性纳米颗粒连接。当目标菌与含有相应适配体的纳米材料混合孵育一段时间后,未与目标菌结合的多余适配体会与其磁纳米颗粒结合,利用磁分离技术将其分离进行荧光检测。目标菌的浓度与测得荧光强度成反比。使用此种方法对金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的检测限分别为16 cfu/mL和28 cfu/mL。此检测体系同时使用了下转化材料CdTe量子点和上转换材料NaYF₄:Yb,Tm,因此需要两次荧光测试,避免了信号干扰。通过变换适配体,此体系可用于更多的物质检测。

Jin等^[48]利用上转换纳米粒子NaYF4:Yb/Er与金纳米颗粒之间的荧光共振能量转移现象对大肠杆菌进行了检测。金纳米颗粒修饰有大肠杆菌ATCC8739的适配体,UCNPs上修饰有与大肠杆菌适配体互补的cDNA核苷酸链,在体系无目标菌株的情况下,cDNA核苷酸链与大肠杆菌适配体互补配对,将UCNPs与GNPs距离拉近,GNPs将UCNPs发出的荧光猝灭,当体系中出现目标菌株时,适配体与cDNA解离,与大肠杆菌结合,导致UCNPs与GNPs的解离,荧光恢复。利用此法对水中、食品中的大肠杆菌检测,检测限低至3 cfu/mL,20 min内即可完成(图11)。上转换纳米粒子具有稳定性好、生物毒性低和荧光寿命长等优势,在荧光生物检测和成像等领域具有重要的应用前景。

2.5 荧光硅纳米颗粒

在众多纳米材料中,硅纳米结构由于其光/电性能良好、生物相容性优良、表面易被修饰及易与传统硅平面工艺兼容等优异性能,被广泛应用于生物传感、生物成像、肿瘤诊断及治疗等诸多领域^[49,50]。硅纳米材料具有生物可降解性,在生物体内降解产物为硅酸盐,并通过肾代谢清除出体外,对人体不产生炎症和毒副作用^[51]。

大尺寸硅光学性质不佳,但当其平均粒径小于等于5 nm时,便由间接带隙转换到直接带隙产生量子限域效应,产生荧光^[52]。硅纳米材料有多种,包括硅纳米颗粒、介孔硅纳米颗粒、硅纳米晶体和硅纳米针等,荧光硅纳米颗粒由于其具有良好的生物相容性以及表面易于修饰的特点,在生物传感和成像方面有着广泛的应用^[53]。得益于大量的生物识别元件以及染料分子可以被整合到硅纳米颗粒的表面及其内部,荧光染料掺杂的硅纳米颗粒表现出较高的检测灵敏度,同时硅的包裹使得荧光分子稳定性更好,不易被猝灭^[54]。当前的荧光硅纳米颗粒主要分为有机荧光染料掺杂和无机荧光材料掺杂^[55]。其中有机荧光染料的发光效率高使得其掺杂的荧光硅纳米颗粒应用更多。例如,利用反微乳法合成的四甲基罗丹明掺杂的硅纳米颗粒,具有高效稳定发光性质、优异的信号放大功能,可用于物质的痕量检测^[56]。

Borsa等^[57]利用装载荧光染料的介孔纳米硅检测金黄色葡萄球菌。连接有待测菌适配体的磁性纳米颗粒对血液中的菌株进行分离,加热后可将其中的微球菌核酸酶释放,随后向体系中加入使用核苷酸链封堵的介孔硅颗粒,核酸酶与此核苷酸链特异性结合失去封堵作用致使介孔硅中的荧光染料释放,通过检测荧光强度的强弱对目标菌进行定量,对血液中金黄色葡萄球菌的检测限为682 cfu/mL(图12)。使用核酸适配体封堵的荧光硅纳米颗粒的检测方法能够实现对目标致病菌的特异性检测,但是存在封堵不严,有机染料外漏产生背景荧光的问题,导致检测限较高。

Wang等^[58]利用钌联吡啶(RuBpy)掺杂的荧光硅纳米颗粒检测鼠寒沙门氏菌。首先利用生物素修饰的适配体对鼠寒沙门氏菌进行捕获,离心后与亲和素修饰的荧光硅纳米颗粒结合,检测体系中的荧光强度与待测菌的浓度成正比。相比于传统的荧光染料,这种染料掺杂的硅荧光纳米颗粒具有良好的光稳定性以及生物相容性,是当前检测领域中必不可少的优异材料,具有良好的应用前景。

此外,Chen等^[59]利用W/O 微乳法合成了异硫氰酸荧光素掺杂的硅纳米颗粒FITC-doped silica NPs (FSiNPs)。通过在其表面修饰有大肠杆菌O157:H7的抗体,从而实现对目标菌的捕获,使用荧光显微镜或者流式细胞术对产生的荧光信号检测从而获得菌株的定量。

Na等^[60]使用镧系金属离子铕掺杂的荧光硅纳米颗粒(Eu@SiNPs)对炭疽芽孢杆菌孢子中的吡啶二羧酸(dipicolinic acid,DPA)进行检测。这种荧光硅纳米颗粒能够在470 nm 和617 nm处发射两种荧光。DPA的加入促使Eu@SiNPs发生天线效应导致617 nm处荧光增强,而470 nm的荧光基本无变化。通过两处波长的荧光比例变化可实现对DPA的检测,从而进一步对炭疽芽孢杆菌含量提供参照。这是首次使用比例型荧光方法检测炭疽芽孢杆菌孢子,避免了背景荧光产生的干扰,方法简单且快速。为未来的荧光硅纳米颗粒的研究提供了新思路。

3 纳米材料与病原菌的识别方式介绍

生物传感器是含有生物识别元件的整合装置,含有物理化学方式的检测器元件或转换器,能够将识别信号转化为定量或半定量的分析信息^[61]。为获得良好的检测效果,识别元件所具有的特异性和灵敏性极为重要,因此在生物传感器中扮演着关键角色。

3.1 特异性识别

3.1.1 抗体连接

抗体(IgG)是体型较大的Y型蛋白质,由于其用途广泛,具有很高的灵敏度和选择性,因此是病原菌识别中最常用的元件^[62]。基于抗体的免疫检测常用抗体有三类,多克隆抗体、单克隆抗体和基因工程抗体^[1]。通常利用小分子上的活性部位与蛋白质上的氨基、羧基、巯基或羟基的标记物进行化学反应。常用的偶联方法有碳二亚胺缩合法、戊二醛法、过碘酸盐氧化法、N-羟基琥珀亚酰胺活化法^[63,64]。除了直接的化学连接,还可将荧光纳米材料上先偶联有生物素/亲和素,再与抗体进行结合。抗体识别具有良好的特异性,如何将抗体与纳米材料进行连接同时保持其活性成为检测中的难点,此外抗体的稳定性差、价格昂贵,尤其是单克隆抗体,因此成为限制其应用的原因之一^[65]。

3.1.2 适配体

适配体是利用指数富集的配体系统进化技术(SELEX, System Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)从随机单链核酸序列库中筛选出的一段单链的DNA或RNA核苷酸序列,与靶物质高度亲和^[66]。这类核酸物质生物识别元素能够与一系列的配体物质结合,包括小分子物质如离子、药物、有机染料或霉菌毒素,大到整个细胞如细菌均具有高的特异性识别功能^[67]。适配体技术具有高亲和性、高稳定性、低毒、对变性环境低敏感、易合成、易修饰以及低花费等优点,基于适配体的传感器受到越来越多的关注^[68]。目前适配体已用于检测大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌等多种致病菌^[69,70]。

由于荧光纳米材料狭窄且可调的发射光谱,将不同发射波长的荧光纳米颗粒修饰有多种识别元件后可用于同时检测多种细菌。研究者已经实现了在一个检测体系中使用多个适配体纳米探针的组合物同时检测多种细菌。Duan等^[71]报道使用两种颜色的适配体连接的荧光纳米探针同时对沙门氏菌和金黄色葡萄球菌进行检测。当目标细菌出现时,荧光探针能够吸附目标菌,在980 nm激发光下产生荧光。此种方法检测范围是10~10⁵ cfu/mL,对沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的检测限分别为5 cfu/mL和8 cfu/mL。此外,Duan等^[72]使用适配体连接的双颜色量子点能够同时对副溶血性弧菌和鼠伤寒沙门氏菌进行检测。应用含有适配体的荧光标记纳米探针在细菌的多重检测和灵敏度检测方面具有很好的前景,然而在复杂的矩阵应用中可能会导致荧光的猝灭^[73]。

3.1.3 噬菌体

噬菌体是细菌天然的敌人,可从土壤、自然废水等地方分离出来。噬菌体自身缺乏代谢机制,需要从宿主细胞吸取营养进行繁殖。自然界中噬菌体对宿主细菌具有很强的特异性^[74]。噬菌体在不同pH以及温度中的稳定性使其成为微生物检测领域中极具优势的探针^[75]。由于它们只能特异性地与某些活的宿主细菌相互作用,噬菌体可用于检测存活但不可培养的细菌,抗体和核苷酸却无法用于此方面研究^[55]。由于噬菌体具有特别的宿主识别系统,因此需要对噬菌体库进行仔细筛选^[76]。

工程噬菌体利用基因工程技术将感兴趣的基因导入噬菌体,通过表达基因产物,对目标致病菌进行检测。Edgar等^[77]制备了可以表达生物素酰化肽的T7噬菌体,当其感染宿主细菌大肠杆菌后繁殖并产生生物素酰化肽的T7噬菌体,大肠杆菌的量与增殖产生的噬菌体成正比,此时利用亲和素修饰的量子点与生物素酰化肽结合,通过检测荧光强度实现对大肠杆菌的定量,检测限为10 cfu/mL。Chen等^[78]利用表达生物素的T7噬菌体与亲和素修饰的FeCo磁性纳米颗粒结合,用于病原菌的分离,其分离效率与抗体标记的致病菌分离效率不相上下。但是噬菌体在感染大肠杆菌过程中可能会引起细菌的裂解,从而影响分离。此外通过基因工程手段对噬菌体改造,使其表达绿色荧光蛋白^[79]、萤光素酶^[80]等报告分子,噬菌体感染目标细菌后复制繁殖,通过检测报告分子的信号实现细菌的定量。利用噬菌体能够进行病原菌的活菌检测,并且检测限低,为生物检测提供了新的平台。但是这项技术只针对可作为噬菌体宿主的细菌进行检测,限制了其广泛应用。

3.2 非特异性识别

3.2.1 病原菌带电性质

当纳米材料表面电荷与细菌表面电荷相异时,通过静电吸附方式结合,从而对病原菌进行识别检测^[81]。作为一种非特异性识别方式,静电作用的检测方法可检测某一类性质的细菌,也可根据某一种属细菌的特殊性质进行识别,这取决于所使用纳米材料与目标菌的带电性质。

通常细菌表面带负电荷,因此与表面带正电的纳米材料相互结合进行检测,具体可分为间接法和直接法^[82]。间接法指不直接将发光材料与病原菌发生作用。金纳米颗粒、碳纳米管、氧化石墨烯等材料可以和某些酶发生相互作用,抑制酶的活力。基于可逆的相互作用,酶活力的恢复可被用来指示细菌浓度。Li等^[83]合成了带有正电荷的氧化石墨烯,具有抑制β-半乳糖苷酶活性的作用。向检测体系中混入大肠杆菌后,由于细菌与氧化石墨烯静电结合,降低了其对β-半乳糖苷酶的吸附,导致β-半乳糖苷酶活性恢复,通过酶活性的测定间接地对大肠杆菌实现定量。此外,Rotello等^[84]报道了使用带正电的金纳米颗粒检测细菌。由于静电作用,β-半乳糖苷酶(β-gal)的活性被金纳米颗粒抑制,当待测细菌出现时,金纳米颗粒从AuNPs/β-gal复合体中释放出来并与细菌结合,从而使酶活力得到恢复。细菌浓度的不同致使酶活力恢复程度不同,从而呈现不同的颜色变化,此方法对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的检测限为100 cfu/mL,在10 min内能够完成检测。

直接法是将纳米材料表面修饰有带正电荷的基团,如壳聚糖或带有氨基的化合物,在与带负电的微生物结合后,通过检测荧光或吸收光的变化,对微生物浓度进行检测。Raj等^[85]将含有氨基端的半胱氨酸修饰在金纳米颗粒表面使其呈正电荷,与大肠O157:H7通过静电作用结合后,破坏了胶体金的稳定性,发生聚集,随着大肠杆菌O157:H7数量的增加,溶液聚集程度加剧,颜色从红色逐渐变为蓝色,同时紫外吸收光谱发生红移,作为一种可肉眼检测方法,对大肠杆菌O157:H7的检测限为100 cfu/mL。Bhaisare 等^[36]利用壳聚糖修饰的磁性碳点对肠杆菌进行吸附、分离以及荧光检测。这种通过静电作用检测病原菌的方法不具有特异性,但是在不区分细菌种类只对总体进行定量的应用中具有便捷和快速的优势。

3.2.2 病原菌结构特点

病原菌根据其细胞外壁成分不同分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。检测中可根据细菌外壁成分的差异制定相应的检测策略,目前广泛应用于病原菌识别的化合物包括抗菌类化合物、硼酸以及碳水化合物等。

由于很多抗菌药物具有和细菌细胞壁特异性结合的作用,越来越多的抗菌药物当前被用来进行某一类细菌的识别与检测^[86,87]。万古霉素是糖肽家族的一种抗生素,可与革兰氏阳性菌肽聚糖上的(D)-Ala-(D)-Ala肽链结合。利用此性质,将金纳米颗粒^[88]或碳点^[89]用万古霉素修饰后,可对革兰氏阳性菌进行识别。溶菌酶是专门作用于细菌细胞壁的水解酶,又称细胞壁溶解酶。该酶对革兰氏阳性菌、枯草杆菌、耐辐射微球菌有很强分解作用;对大肠杆菌、普通变形菌和副溶血弧菌等革兰氏阴性菌等也有一定的杀灭作用^[87]。Liu等^[90]利用溶菌酶合成金纳米簇,可对大肠杆菌进行识别及浓度检测,检测限为2×10⁴ cfu/mL。硫酸粘菌素可与革兰氏阴性菌细胞外膜的脂多糖和磷脂相互作用,导致细胞质泄漏从而使细菌死亡,对革兰氏阳性菌(除金黄葡萄球菌和溶血性链球菌外)和真菌无作用。此菌不仅可以用作抗菌药物,还可以用于细菌的检测。Chandra等^[91]利用硫酸粘菌素合成碳点,能够对大肠杆菌进行荧光检测,检测限为460 cfu/mL。Chandra等^[92]还利用抗菌素阿米卡星合成碳点,Cooper等^[93]将凝集素与磁性纳米颗粒连接用于微生物从血液样品中进行分离。

硼酸可与细胞壁含有顺式二醇分子的细菌结合。由于革兰氏阴性细菌分布有脂多糖(包含顺式二醇分子),Zheng等^[37]利用硼酸合成碳点,用于对细胞壁上含有顺式二醇分子的细菌的鉴定。碳水化合物也可用于致病菌的识别,这是由于碳水化合物与蛋白质和脂质连接后,形成的糖蛋白和糖脂能够与细菌进行识别和连接。El-Boubbou等^[94]使用甘露糖和半乳糖修饰的磁性纳米颗粒用于区分大肠杆菌系列。根据细胞壁成分的差异对细菌进行识别的方式简单、高效,但是只能对一类细菌进行区分,特异性较低。

4 结论与展望

为保障食品和人类健康,病原菌的快速检测至关重要,荧光纳米材料生物传感器的应用为病原菌检测提供了更多的可能性。本文通过对量子点、金属纳米簇、荧光碳纳米材料等荧光纳米材料与病原菌的结合方式以及检测方法进行了综述,并对检测所具有的优势和缺点进行了对比。

量子点和荧光硅纳米颗粒具有强的荧光发射效率,已在小分子检测上有较多的应用。量子点的核壳结构易于生物分子如抗体和适配体的修饰,大大提高了检测的灵敏度。由于量子点毒性影响,在商业化的应用上有待改进。镧系金属掺杂的上转换材料具有低毒和发光性质独特等优点,在病原菌多重检测中占据优势。为提高上转换纳米材料在生物传感器方面的应用,亟需改善亲水性上转换纳米材料量子产率较低这一问题^[95]。荧光金属纳米簇具有尺寸小、生物相容性好、光致发光耐光漂白性强、易于合成和可作能量供体等优点,在最近几年的应用逐渐增多,因其所具有独特的发光性质如FRET、AIE,为检测提供了更多模式。荧光碳纳米材料易于制备,高量子产率,良好的生物相容性为其在检测上的应用提供了更多的可能。但是表面不易修饰成为限制其应用的主要因素^[96]。

随着纳米技术的不断发展,利用荧光纳米探针独特的结构和性能优势,对病原菌进行检测可突破传统方法的局限性,在缩短检测时间、提高细菌检测灵敏度和准确性、减少样品和试剂消耗方面具有明显的优势和潜力。当前基于荧光纳米材料的病原菌检测尚处于实验室研究阶段,如何将其转化为像胶体金试纸条和血糖检测仪一样的便携式检测仪,成为研究者们越来越关注的焦点,也是未来研究荧光纳米颗粒的热点。

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Received	Published	Revised
2020-11-04	2021-09-20	2020-12-12
Online Date
2020-12-28

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