核酸检测与基于CRISPR生物传感的微流控即时检测技术的研究及应用

赵梓豪; 赵亮; 汪夏燕

doi:10.7536/PC20250303

化学进展 ›› 2025, Vol. 37 ›› Issue (10) :1397-1409 DOI: 10.7536/PC20250303

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核酸检测与基于CRISPR生物传感的微流控即时检测技术的研究及应用

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The Nucleic Acid Detection and CRISPR-Based Microfluidic Point-of-Care Biosensing： Research and Applications

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摘要

核酸检测是当代病原体感染诊断的金标准和技术基石。随着现代医疗需求的不断变化，现场快速检测（Point-of-care testing， POCT）技术在传染病防控、个性化精准医疗以及资源有限的医疗场景中展现出极为重要的价值。基于POCT技术的核酸检测能够快速提供诊断信息，显著改善患者治疗结果，并优化医疗资源分配。微流控芯片作为一种新兴技术，凭借其低试剂消耗、高度集成化和自动化的特点，成为核酸POCT领域的关键组成部分。微流控芯片通过将复杂的实验室功能集成到单一芯片上，实现了样本处理、信号放大和检测的全流程自动化，极大地提高了检测效率和准确性。此外，微流控芯片结合等温扩增技术（如LAMP）、CRISPR-Cas技术等，能够快速、灵敏地检测病原体，适用于多种传染病的现场筛查。基于微流控芯片的POCT设备已成功应用于新型冠状病毒等多种病原体的检测，展现出快速、便携和高灵敏度的优势。本综述旨在总结核酸检测的简要发展以及利用CRISPR-Cas技术与微流控芯片技术结合的研究进展，探讨其在POCT领域的应用现状和未来发展方向。

Abstract

Nucleic acid testing is the gold standard and technological cornerstone for the modern diagnosis of pathogenic infections. As a deployable public health surveillance technology， Point-of-Care Testing （POCT） has demonstrated significant value in infectious disease prevention and control， personalized precision medicine， and medical scenarios with limited resources. POCT technology can rapidly provide diagnostic information， significantly improve patient outcomes， and optimize the allocation of medical resources. As an emerging technology， microfluidic chips have become a key component in POCT due to their low reagent consumption， high integration， and automation. By integrating laboratory functions onto a single chip， microfluidic devices have achieved full-process automation of sample processing， signal amplification， and detection， greatly enhancing the efficiency and accuracy of testing. Moreover， when combined with isothermal amplification techniques （such as LAMP） and CRISPR-Cas technology， microfluidic chips can rapidly and sensitively detect pathogens， making them suitable for on-site screening of various infectious diseases. Currently， POCT devices based on microfluidic chips have been successfully applied in the detection of pathogens such as SARS-CoV-2， demonstrating the advantages of speed， portability， and high sensitivity. This review aims to summarize the development of nucleic acid detection and the research progress on the combination of CRISPR-Cas technology and microfluidic chips to explore their current applications and future prospects for POCT.

Contents

1 Introduction

2 Significance of point-of-care nucleic acid testing for pathogens

3 Conventional nucleic acid testing

3.1 PCR-Based nucleic acid testing

3.2 Isothermal-amplification-based pathogen nucleic acid testing

3.3 Other methods

4 CRISPR-Cas biosensor-based nucleic acid testing

4.1 Cas12a-Based nucleic acid detection

4.2 Cas13a-Based nucleic acid detection

4.3 Other CRISPR systems

5 CRISPR-Cas nucleic acid detection on microfluidic chips

5.1 Multiplexed detection on microfluidic chips

5.2 Amplification-free detection on microfluidic chips

5.3 Equipment-free microfluidic POCT for rapid detection

6 Conclusion and prospects

Graphical abstract

关键词

核酸检测 / 现场快速检测（POCT）技术 / 微流控芯片 / 生物传感

Key words

nucleic acid detection / point-of-care testing （POCT） technology / microfluidic chips / CRISRP-cas biosensing

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赵梓豪, 赵亮, 汪夏燕. 核酸检测与基于CRISPR生物传感的微流控即时检测技术的研究及应用[J]. 化学进展, 2025, 37(10): 1397-1409 DOI:10.7536/PC20250303

Zihao Zhao, Liang Zhao, Xiayan Wang. The Nucleic Acid Detection and CRISPR-Based Microfluidic Point-of-Care Biosensing： Research and Applications[J]. Progress in Chemistry, 2025, 37(10): 1397-1409 DOI:10.7536/PC20250303

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1 引言

自21世纪以来，全球公共卫生事件的频发态势促使病原体快速精准检测技术发展成为疫情防控体系的核心技术指标。对于病原体的检测和诊断，核酸检测技术是业内公认的“金标准”。当前，基于微流控芯片与CRISPR-Cas系统联用的病原体核酸现场即时检测（Point-of-care testing， POCT）技术，凭借其亚飞摩尔级检测限、单碱基分辨特异性及短时间内完成检测的技术优势，已成为分子诊断领域的前沿研究方向^[1]。微流控技术通过微尺度流体操控实现了核酸提取、等温扩增与光学检测模块的集成化，构建了全封闭式“样本进-结果出”（Sample-to-answer）检测体系^[2]。CRISPR生物传感器则依托Cas效应蛋白的核酸分子识别功能及反式切割活性，建立了基于荧光/侧向层析双模态信号的级联放大检测机制，进一步通过微流控芯片突破了传统分子诊断对专业设备及技术人员的依赖^[3-4]。这两种技术的集成与有机整合为病原体核酸检测开辟了全新的技术路径。两者的融合为资源匮乏地区提供了符合ASSURED原则（Affordable， Sensitive， Specific， User-friendly， Rapid， Equipment-free， Deliverable）的新型诊断范式，在突发传染病应急响应中具有重要应用价值^[1,5]。

本文简要回顾了核酸检测的基本发展路径（图1），综述了基于微流控装置与CRISPR生物传感的病原体核酸现场即时检测技术的最新研究进展，重点探讨了其在病原体核酸检测中的应用，并分析了当前技术面临的挑战和未来发展方向。通过深入探讨这些技术的原理、优势和应用案例，旨在为相关领域的研究人员提供一个全面的参考框架。

2 病原体核酸现场即时检测的意义

在新型冠状疫情暴发期间，核酸检测作为判断病毒感染的“金标准”^[6-7]，其及时性不仅为患者争取了宝贵的治疗时间，而且对于阻断疫情传播链具有至关重要的作用^[8-9]。传统的病原体核酸检测方法主要依赖于PCR（聚合酶链式反应）或实时qPCR（荧光定量PCR）技术^[10]。尽管这些方法在病原体鉴定方面具有较高的灵敏度和特异性，同时也存在一些显著的局限性。一方面，传统PCR和qPCR检测过程耗时较长，通常需要40 min以上才能获得检测结果^[11]，难以满足快速诊断的临床需求。另一方面，这两种检测方法需要专业的技术人员进行操作，操作流程较为复杂，且对实验设备要求较高，通常需要在具备专业实验室条件的环境中进行^[12]。这些因素限制了其在基层医疗机构或现场环境中的应用，无法实现随时随地的快速检测，难以满足临床快速诊断和公共卫生应急响应部署的迫切需求^[13]。

相比之下，病原体核酸现场即时检测技术的出现为病原体检测带来了突破性进展^[14]。POCT，也称为近患者检测（Near-patient testing）、床边检测（Bedside testing）或实验室外检测（Extra-laboratory testing），是一种在患者附近或现场进行的快速检测方法。其核心理念是快速生成检测结果，以便及时实施适当的治疗，从而改善临床或经济结果^[15]。与传统PCR和qPCR方法相比，POCT技术具有显著的优势：能够在短时间内（通常在数分钟到数十分钟内）完成检测，极大地缩短了诊断时间。此外，POCT设备通常具有便携性，操作简便，无需专业培训即可使用，且能够在非实验室环境中运行^[16]。这些特点使得POCT技术能够突破传统核酸检测方法的限制，为临床诊断、疾病监测和公共卫生应急响应提供了有力支持^[17-18]。

3 传统的核酸检测

传统的核酸检测技术为分子生物学和遗传学研究奠定了基础，其中最具代表性的技术包括印迹杂交技术和桑格测序法。印迹杂交技术最早是由Southern^[19]在1975年在琼脂糖凝胶电泳技术的基础上发明而来，被称为Southern Blot，用于检测特定DNA片段是否存在于样品中。该技术将经过内切酶切割过的变性DNA片段通过凝胶电泳分离，然后通过毛细作用将DNA片段转移到如尼龙或硝酸纤维素膜上。最后再用标记的探针与目标DNA序列进行杂交来鉴定。Southern Blot技术可用于DNA的基因组结构分析^[20]、基因突变检测^[21]、限制性片段长度多态性（Restriction fragment length polymorphism， RFLP）分析^[22]等。且该技术在在长片段（>1 kb）分析和未测序物种的基因组研究中仍具有不可替代性。在Southern Blot的基础上，Alwine团队^[23]对该技术进行了创新性改进，成功开发了专门用于RNA检测的Northern Blot技术。除了印迹技术（如Southern Blot和Northern Blot），在核酸分析中应用最为广泛的就是桑格测序技术。这一开创性的方法为DNA序列的精准解析提供了强大的工具。桑格测序技术由Sanger及其团队^[24]于1977年开发，其技术原理是利用DNA聚合酶在DNA模板上合成新的DNA链，并通过加入特殊的双脱氧核苷酸三磷酸（ddNTPs）来终止DNA链延伸，从而产生一系列不同长度的DNA片段。这些片段的长度对应于DNA序列中的碱基类型，通过电泳分离和荧光标记读取序列信息，最终确定DNA序列。桑格测序技术的发明为基因组学研究奠定了基础，是人类基因组计划的奠基性技术。

3.1 基于PCR的核酸检测

利用聚合酶特异性地合成目标DNA之后再进行检测是当前核酸检测的主流技术。聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction， PCR）技术由Mullis^[25]于1985年提出，其核心原理是通过DNA聚合酶的体外酶促合成反应，配合热循环仪（Thermocycler）控制的温度循环，实现靶DNA序列的指数级扩增。这种分子级的热力学控制机制使得目标DNA片段可在2 h内实现10⁶~10⁹倍的扩增效率。凭借其高灵敏度、高特异性和高效率的特点，PCR技术在基础生命科学研究、分子医学诊断、农业、法医学以及环境监测等领域得到了广泛应用，极大地推动了相关领域的技术进步^[26]。在PCR技术的基础上，研究者们又相继开发了多种衍生技术。例如，将逆转录酶（RT）与PCR技术相结合，形成逆转录PCR（RT-PCR），从而拓展了PCR在RNA病毒检测、生物医学研究和临床诊断中的应用范围。此外，20世纪90年代，Vogelstein和Kinzler^[27]提出了数字PCR（Digital PCR， dPCR）的概念。dPCR通过分隔反应体系为微单元，结合荧光信号检测，实现核酸绝对定量。相比传统PCR，dPCR具有更高的灵敏度、特异性和精确性，尤其在低丰度靶标检测和拷贝数变异分析中展现出显著优势^[28-29]。

3.2 基于等温扩增的病原体核酸检测

PCR技术的实现依赖于能够耐受高温的Taq DNA聚合酶，其热稳定性使得在高温条件下进行高效的DNA扩增成为可能。相比之下，等温扩增技术因操作简便、快速高效的特点逐渐受到关注。该方法无需复杂的温度循环设备，可在恒定温度下实现核酸快速扩增，适合在资源受限的环境中应用。核酸序列依赖性扩增（Nucleic acid sequence-based amplification， NASBA）技术主要通过AMV逆转录酶、T7 RNA聚合酶和核糖核酸酶H（RNase H）的协同作用。通过一对特异性引物在42 ℃恒温条件下进行RNA的扩增^[30]。滚环扩增（Rolling circle amplification， RCA）是一种等温DNA扩增技术，通过短引物和具有链置换能力的DNA聚合酶（如φ29 DNA聚合酶）在恒定温度下以环状DNA为模板生成长链单链DNA^[31]。RCA技术具有高效性和等温性，能够快速扩增目标DNA^[32]，然而其在扩增较大环状DNA模板时效率较低，且依赖于单引物结合和延伸。多重引物滚环扩增（MP-RCA）技术，通过随机引物和φ29 DNA聚合酶实现高效扩增，提高了扩增效率和选择性^[33]。基于MP-RCA原理，单细胞测序领域又发展出多重置换扩增（MDA）技术，利用随机引物和φ29 DNA聚合酶在温和条件下对单细胞基因组进行全基因组扩增，进一步提高了扩增均匀性和覆盖度^[34]。该技术推动了单细胞测序技术的发展，为研究细胞异质性、发育生物学以及疾病发生机制等领域提供了强有力的技术支持^[35]。除此之外，环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）^[36-39]和重组酶聚合酶扩增（RPA）技术广泛应用于病原体检测、基因分型等领域，特别适合于POCT检测^[40-43]。

3.3 其他方法

另外，还有其他多种创新检测手段通过独特的技术实现了病原体核酸的精准解析。核酸质谱技术是一种结合了多重PCR、高通量芯片和飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）的先进核酸检测手段，通过精确测量核酸分子的质量差异，能够快速、高效地检测基因变异、多态性、甲基化等特征^[44-45]。该技术具有高通量、高灵敏度、操作简便和成本效益高等优势^[46-47]。原位杂交（ISH）或荧光原位杂交（FISH）法是一种用于检测细胞或组织切片中特定核酸序列的技术，通过将标记的核酸探针与目标核酸序列进行特异性杂交，从而实现对目标基因或转录本的定位和检测^[48-49]。这些技术突破与等温扩增体系形成多维互补：等温扩增侧重核酸的快速富集，质谱技术强于精细变异解析，而原位杂交则实现空间定位检测。

4 基于CRISPR-Cas生物传感的核酸检测技术

在构建多模态检测平台的技术演进中，分子诊断领域正经历着由基因编辑技术驱动的范式革新。CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，规律成簇间隔短回文重复序列）结构在细菌和古菌中被发现，其功能与细菌的免疫防御机制相关^[50-51]。Charpentier和Doudna等^[52]揭示了CRISPR-Cas9系统可以作为一种可编程的基因编辑工具，极大地推动了基因编辑技术的发展。CRISPR-Cas技术以其高度的特异性和灵敏度，极大地提升了病原体核酸检测的速度，能够在短时间内完成精准检测，为快速诊断提供了有力支持^[53-54]。CRISPR-Cas核酸检测技术的核心原理基于Cas蛋白（如Cas12/13/14）的双重功能：一方面通过crRNA与靶标核酸序列的精准互补配对实现特异性识别，另一方面通过激活非特异性核酸酶活性（Trans-cleavage activity）切割报告分子（如荧光探针），从而将靶标结合事件转化为可检测的光学或电化学等其他信号（图2）。该技术通过与等温扩增技术（如RPA或LAMP）联用，可在30~60 min内实现单分子级别的检测灵敏度^[43,55]。基于CRISPR-Cas系统的生物传感技术，通过将基因识别与信号转导机制创新性结合，为病原体核酸检测开辟了全新维度。

4.1 利用Cas12a的核酸检测

基于CRISPR-Cas12系统的即时核酸检测技术近年来得到了广泛关注。CRISPR-Cas12a（原名Cpf1）作为II型CRISPR-Cas系统的一个独特成员，其在核酸检测领域展现出显著优势^[56]（图2）。与其他Cas蛋白相比，Cas12a不仅能在crRNA引导下准确识别并切割双链DNA靶标序列，更具备在靶标结合后激活其非特异性单链DNA切割活性的特点。这种独特的侧切（Trans-cleavage）特性为开发高灵敏度的核酸检测方法提供了理想的分子工具^[57]。

DETECTR（DNA endonuclease-targeted CRISPR trans reporter）技术由Doudna团队^[58]于2018年开发，其原理是利用Cas12a蛋白在gRNA引导下识别并切割目标双链DNA后，激活其非特异性单链DNA切割活性，从而切割荧光标记的单链DNA报告分子，产生可检测的信号^[59]。这一方法检测速度快、灵敏度和特异性高，且结果直观可视，但局限于仅检测DNA样本，并需设计特定的引导序列。HOLMES（One-hour low-cost multipurpose highly efficient system）技术是由Li等^[60]于2018年提出，同样利用Cas12a蛋白在gRNA引导下的双重切割活性，具有快速、灵敏度和特异性高的特点，但同样也是局限于DNA样本的检测^[61]。HOLMESv2进一步升级，采用热稳定型Cas12b蛋白，能够特异性区分单核苷酸多态性（SNP），精准检测病毒RNA、人类细胞mRNA及环状RNA。结合LAMP扩增技术，HOLMESv2可在恒温条件下实现核酸的一步定量检测，有效避免样本间交叉污染。此外，它还可与亚硫酸氢盐处理相结合，精准定量DNA甲基化程度，展现出在分子诊断和表观遗传学研究中极为广阔的应用前景^[62]。Lu等^[63]开发的sPAMC（Suboptimal PAM of Cas12a-based test with enhanced flexibility， speed， sensitivity and reproducibility）技术利用非典型原间隔相邻基序（Suboptimal PAM），通过将等温扩增（RPA）与Cas12a介导的检测相结合，实现了对SARS-CoV-2 RNA的快速、高灵敏度和特异性检测。此外，Shi等^[64]开发了一种名为CONAN（CRISPR-Cas-only amplification network）的DNA诊断技术。该方法利用通过将Cas12a的严格靶标识别、解旋酶活性和反式切割活性整合到一个正反馈回路中，实现了对基因组DNA的等温扩增检测。该方法具有单酶、单步操作、实时检测、灵敏度高、单碱基特异性等优点。在优化传统Cas12a检测系统方面，Yue等^[65]通过优化反应条件，利用双crRNA靶向的液滴Cas12a检测技术，相较于单一crRNA方法显著提高了检测灵敏度、定量分析能力和特异性，为分子诊断提供了更为精确的工具。而Ding等^[66]开发的全集成双CRISPR-Cas12a（AIOD-CRISPR）检测技术利用双crRNA设计，突破了传统Cas12a检测中PAM序列的限制，配合“一锅法”策略，显著提高了检测灵敏度，能够检测到极低拷贝数的SARS-CoV-2核酸。

尽管Cas12a酶传统上用于检测DNA，然而，SAHARA（Split activator for highly accessible RNA analysis）技术巧妙地利用Cas12a酶实现了对RNA的检测。其核心原理在于：当短链DNA结合到PAM序列的近端时，PAM序列的远端可以与RNA结合，从而激活Cas12a的反式切割活性，进而实现对RNA的高效检测。该技术不仅可以利用Cas12a酶进行RNA底物的检测，还提高了特定位置突变的灵敏度^[67]。

4.2 利用Cas13a的核酸检测

继Cas12a技术之后，CRISPR-Cas13a作为VI型CRISPR-Cas系统的代表成员，以其针对RNA的精准识别和切割能力，在即时核酸检测领域展现出巨大潜力^[68-70]。Cas13a在crRNA引导下可专一识别目标RNA，并在激活后产生非特异性切割周围单链RNA的能力，为信号放大提供了理想机制。张锋团队^[71]于2017年首次提出的SHERLOCK技术便是利用这一“附带切割”特性，通过设计荧光标记的RNA报告分子，实现高灵敏度的目标RNA检测，从而极大地促进了POCT应用的发展。随后，Liu等^[72]开发的FIND-IT技术则通过串联使用Cas13a和Csm6核酸酶，在无扩增条件下，结合化学稳定激活剂，实现了对SARS-CoV-2病毒RNA的快速检测，其灵敏度可达每微升约30个分子，并在20 min内完成检测。此外，Fozouni等^[4]提出的无扩增CRISPR-Cas13a检测技术结合移动手机显微镜，实现了高灵敏度、低成本的现场检测。

4.3 其他CRISPR系统

除了基于Cas12a和Cas13a的检测技术外，其他CRISPR系统同样在核酸检测中展现出独特优势。CRISDA（CRISPR-Cas9-triggered nicking endonuclease-mediated strand displacement amplification）技术由Zhou等^[73]于2018年发明，基于Cas9切口酶（Cas9n）的精确识别和切割功能，通过产生目标DNA非靶标链的单链切口，并借助DNA聚合酶的链置换扩增，实现了高灵敏度、高特异性的目标DNA检测。LEOPARD（Leveraging engineered tracrRNAs and on-target DNAs for parallel RNA detection）技术由Jiao等^[74]于2021年提出，通过重编程tracrRNA（Rptr）使其与目标RNA特异性杂交，形成非典型crRNA，从而引导Cas9核酸酶识别并切割互补DNA序列。另一项利用Rptr特异性结合目标RNA进而激活Cas9蛋白的技术是AGATHA（Atypical gRNA-activated transcription halting alarm）。该方法激活后的Cas9与特定AGATHA DNA结合，阻断其3’端二级结构的转录，同时持续生成Broccoli RNA aptamer，使其与荧光底物结合产生信号。通过设计多种Rptr，AGATHA技术实现了高特异性、强信号放大的多目标RNA检测，展现出快速、精准的检测能力^[75]。

5 微流控芯片上的CRISPR-Cas核酸检测

在核酸检测技术中，实现高灵敏度、高特异性以及快速便捷的检测一直是研究热点。由于自身具有反应空间小、腔室内扩散距离短、反应速度快、设计灵活多变等特点，微流控芯片与CRISPR-Cas系统结合的方案展示了极大的应用潜力。

Yu等^[76]开发的PAMDA SlipChip技术利用两层微流控芯片设计，通过“珍珠链”结构实现液滴的自分区和精准分配，有效支持了SARS-CoV-2数字化LAMP-CRISPR检测；而Park等^[77]开发的deCOViD技术则将CRISPR/Cas12a辅助的RT-RPA检测体系微缩后集成于芯片中，使得定性和定量检测分别在15和30 min内完成，为POCT场景下的现场检测提供了可靠方案。

此外，一系列集成化方法进一步推动了微流控平台上全流程、自动化检测技术的发展。Chandrasekaran等^[78]的DISCoVER技术将唾液样本的前处理、LAMP扩增与CRISPR-Cas13检测集成于一块芯片上，实现了60 min内的现场病毒RNA检测。Zhou等^[79]于2023年开发的M3-CRISPR平台实现了多重、低成本且高特异性的核酸检测。该系统通过引入加热膜以精确控制芯片上的反应温度，确保了RPA和CRISPR反应的高效进行（图3a）。Shen团队^[80]开发了LOC-CRISPR技术，实现了在微流控芯片上集成病毒核酸提取、重组聚合酶扩增以及基于CRISPR/Cas12a的切割反应检测，完成全流程无污染检测。He等^[81]开发了一种基于CRISPR-Cas12a的高通量、全液相非洲猪瘟病毒（ASFV）检测技术，结合荧光信号读出和便携式检测系统，实现了ASFV的快速、精准检测。而Qin等开发了一种名为CRISPR-Cas13a的全微流控核酸检测技术，用于快速检测埃博拉病毒RNA（图3b）。样品在微流控芯片中自动完成混合和杂交，随后Cas13a的非特异性切割产物通过定制的集成荧光仪进行即时测量。这种等温、全溶液相的诊断方法无需扩增，操作简单，灵敏度高，为现场快速诊断提供了一种高效、低成本的解决方案，尤其适用于较偏远地区的传染病检测^[82]（图3b）。

Chen等^[83]开发了一种名为“CASMEAN”（Cas12a辅助的微流控核酸分析设备）的自动化、POCT技术（图3c）。该技术通过整合重组酶辅助扩增（RAA）和CRISPR-Cas12a系统，利用离心微流控芯片实现了核酸的高灵敏度和高特异性检测。CASMEAN平台通过预加载RAA-Cas12a试剂，避免了传统扩增与检测分离步骤中的气溶胶污染和定量难题，同时显著提高了检测效率和灵敏度。随后，Chen等^[84]在此基础上开发了一种双CRISPR/Cas12a辅助的RT-RAA检测技术，结合离心微流控平台该技术将检测时间大幅缩短至30 min。Ramachandran等^[85]开发了一种基于电场驱动微流控技术的CRISPR-Cas12核酸检测方法。该方法通过在微流控芯片上利用电场梯度控制和加速CRISPR反应，实现了对SARS-CoV-2病毒RNA的快速、高灵敏度检测。这种方法不仅提高了检测速度，还显著降低了试剂消耗量，尤其适用于资源有限的环境。另外，研究者们还探索了将CRISPR核酸检测与电化学方法相结合的策略。Najjar等^[86]设计的一款3D打印微流控芯片整合了核酸提取、浓缩、扩增与电化学传感器检测，不仅能够通过切割生物素化ssDNA探针降低电流信号，从而实现RNA检测，还能同步检测唾液中的抗体水平。整个检测过程仅需约2 h，展示出在COVID-19快速诊断和免疫评估中的巨大应用潜力。

5.1 微流控芯片上的多靶标检测

在前文所述的众多检测技术中，多数仅局限于单一靶标的检测，难以满足复杂生物体系中多靶标同步分析的需求。多靶标检测技术旨在克服传统检测方法仅能针对单一靶标的局限，从而满足复杂生物体系中同时分析多种指标的需求。基于微流控芯片的技术通过精准控制超微体积反应液，实现了多个靶标的检测组合与分步反应，为高通量、多重检测提供了理想平台。

CARMEN（Combinatorial arrayed reactions for multiplexed evaluation of nucleic acids）技术由Blainey团队于2020年开发。通过将纳升体积的反应体系以液滴形式在微孔阵列中自组织配对，并以荧光显微镜读取液滴颜色编码，确定样本和检测对（图4a）。在电场作用下合并液滴以启动反应，CARMEN能同时检测数千个样本与crRNA靶标对，既保证了高灵敏度和高特异性，又有效降低了检测成本^[87]。在CARMEN技术的基础上，mCARMEN进一步升级，通过在商业化微流控芯片上实现多样本多病原体核酸检测，显著简化了临床工作流程，使其在POCT领域具备更大的应用潜力^[88]（图4b）。Xu等^[89]开发了一种名为MiCaR（Microfluidic space coding for multiplexed nucleic acid detection via CRISPR-Cas12a and recombinase polymerase amplification）的多靶标核酸检测技术（图4c）。该技术融合微流控空间编码技术，通过单一荧光探针，可同时检测30种核酸靶标，40 min内完成高灵敏、高特异的快速检测。此外，MiCaR技术还展现了其在病原体快速诊断中的广泛应用前景。该技术操作简便、成本低，适合POCT，为资源有限环境中的多重核酸检测提供了高效解决方案。另一项名为微流控双滴平台（Microfluidic dual-droplet device， M-D3）的技术将CRISPR-Cas12a与RPA技术结合，利用压力/真空驱动生成微滴，分别封装Cas12a/crRNA、荧光报告分子及样本，从而实现对HPV16和HPV18的快速、灵敏、同时检测（图4d）。该技术凭借其高灵敏度、快速检测能力以及极低的样本消耗，在多重核酸POCT领域展现出巨大应用潜力，尤其适用于临床管理和大规模人群筛查^[90]。

5.2 微流控芯片上的无扩增检测

在临床样本检测中，病原体含量往往极其稀少，传统核酸检测方法通常需要先进行扩增再检测。然而，基于微流控芯片的无扩增核酸检测技术通过创新设计，实现了对低浓度样本的直接检测，为临床诊断提供了新的解决方案。

Tian等^[91]开发的“超局域Cas13a检测”技术通过将RNA触发的Cas13a催化体系限制在类细胞大小的反应器中，利用微滴技术同时提升目标RNA和报告分子的局部浓度，实现了多种RNA分子的绝对数字单分子定量。该技术因其高灵敏度、特异性和无需核酸扩增的特点，展现出在临床诊断、病原体检测和液体活检等领域的广泛应用前景。特别是该技术的简便性和低成本使其成为一种理想的病毒载量检测工具。类似地，Yue等^[65]的“微滴Cas12a检测技术”通过优化Cas12a反应参数并将反应限制在微滴中，成功实现了DNA的单分子水平绝对定量检测，避免了传统扩增方法带来的交叉污染风险（图5a）。

STAMP（Self-digitization through automated membrane-based partitioning）技术则采用了不同的策略^[92]。该技术利用自动化膜分区技术，通过将样品与检测试剂混合后加载到聚碳酸酯膜上，将反应体系分隔成一个个微小的独立反应单元，从而实现对HIV-1病毒RNA的无扩增、高灵敏度和特异性的绝对定量检测（图5b）。而Mou等^[93]开发的“数字微流控杂交检测技术”结合飞升级液滴技术和磁性微珠，在无需扩增的情况下实现了HPV核酸的高灵敏度检测。该技术操作简便、成本低，检测速度快，适合POCT，为资源有限环境中的病毒载量检测提供了一种高效解决方案（图5c）。特别值得一提的是，Wang等^[94]开发的无扩增数字CRISPR/Cas13a检测技术通过创新性地结合磁珠捕获富集和微孔分散检测，确保每个微孔仅容纳一个磁珠，显著提高了检测灵敏度。该方法仅需50 min即可完成检测，避免了传统扩增方法的复杂操作和偏差，为低浓度样本检测提供了一种高效可靠的解决方案（图5d）。这些无扩增检测技术不仅简化了操作流程，降低了成本，还为POCT提供了新的可能。

5.3 无需专门检测设备的微流控POCT快速检测

在上述提及的检测方法中，大多都离不开外部设备的辅助，以完成检测流程。在微流控POCT领域，减少对专业设备的依赖是提升检测便携性和实用性的重要方向。

MAV芯片技术创新性地设计了磁珠-单链DNA-铂纳米颗粒（BDNP）复合物作为报告分子。该系统利用生物素-链霉素强结合力和硫醇-铂纳米颗粒稳定配位键，实现了无需荧光检测的可视化定量（图6）。当Cas12a酶被激活后，其反式切割活性会释放铂纳米颗粒，继而催化过氧化氢分解产生氧气，推动芯片管道中红色墨水移动，通过观察墨水移动距离即可直观判读结果^[95]。这种技术不仅实现了对目标核酸的可视化定量检测，还避免了传统Cas12a检测中对荧光标记的依赖，大大提高了检测的便捷性和实用性。

6 总结与展望

微流控芯片与CRISPR-Cas技术的结合为POCT领域带来了革命性突破，尤其在病原体核酸的即时检测方面展现出独特优势。目前，多家企业已推动此类技术商业化落地：例如Mammoth Biosciences推出的CRISPR检测卡可在15 min内完成诊断；Sherlock Biosciences基于SHERLOCKv2平台开发了多重病原体检测试剂盒；国内为真生物则推出全球首款结核病CRISPR自测产品NuRapid-Dx^®等。这些商业化案例验证了该技术的临床可行性与市场潜力（表1）。

在未来技术转化中需要重点应对的关键性挑战主要有：首先，对微流控芯片进行标准化的工业制成，提高芯片操作的集成化和自动化，使得复杂的核酸检测流程得以简化，能够在资源有限的环境中实现快速、准确的检测。这种能力在面对突发公共卫生事件（如新型冠状疫情）时显得尤为重要，能够为疫情防控提供有力支持。其次，将CRISPR-Cas系统中的关键试剂和酶反应进行高度特异化的定制，如针对特定病原体基因的冻干化试剂在芯片中预包埋等定制策略，确保了便携性和操作简便性的同时，也提高了检测结果的可靠性和现场应用的可行性。第三，进一步发展多指标检测技术，利用微流控芯片与CRISPR-Cas技术的结合可实现多靶标的同步检测的优势，在不影响检测准确性的前提下对多种病原体进行筛查，可以极大地提高检测效率和临床诊断价值。

近年来，POCT技术正经历从“小型化”向“智能化”的范式转变。传统的基于微流控芯片的检测方法主要实验操作人员对结果进行主观的判读。这种依赖主观视觉判读的结果表征方式不可避免地会引入操作者依赖性误差，从而影响检测结果的准确性和可重复性。AI技术的引入通过深度学习算法对实验结果进行客观量化的分析，有效消除了传统人工判读中的主观误差，显著提高了检测结果的准确性和可重复性^[96-97]。类似地，在基于CRISPR的生物传感系统中，人工智能技术同样展现出强大的优化能力。CRISPR脱靶效应是指CRISPR/Cas系统在基因编辑过程中，由于向导RNA（gRNA）与目标DNA序列的结合不够特异，导致Cas酶切割非目标位点的现象，是CRISPR技术应用中的一个主要挑战。在基因编辑方面，这种效应可能引发插入、缺失或转位等基因组突变，从而影响基因功能或造成基因组不稳定性。而在核酸检测方面，CRISPR脱靶效应可能导致假阳性或假阴性的检测结果^[98-99]。Liu等^[100]开发的DeepCRISPR是首个将AI应用于sgRNA靶向效率与脱靶效应预测的计算平台。该技术的应用显著提升了CRISPR系统的检测效能和结果可靠性，同时大幅降低了非特异性结合的脱靶效应。展望未来，AI技术与基于CRISPR生物传感的微流控核酸检测技术的深度融合将带来革命性的进步。通过深度学习算法对海量检测数据的持续学习，系统可以不断优化反应条件参数，动态调整信号阈值，显著提高弱阳性样本的检出率并降低假阳性风险。另一方面，有可能通过AI技术设计新型的可以比肩天然Cas蛋白的新型核酸酶，从而显著降低甚至完全避免CRISPR技术的脱靶效应^[101]。这种智能化的核酸检测平台不仅适用于临床诊断，在环境监测、食品安全和生物安全等领域也将展现出广阔的应用前景，为精准医疗和公共卫生防控提供强有力的技术支持。

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基金资助

国家自然科学基金项目(22174007)

北京工业大学杰出学子（起航）计划和北京工业大学本科生星火基金项目

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Received	Published	Revised
2025-03-04	2025-10-24	2025-05-16
Online Date
2025-09-03

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