镜像蛋白质药物的开发：化学合成、镜像噬菌体展示和计算设计

任宇祥; 韩东阳; 石威巍

doi:10.7536/PC20250315

化学进展 ›› 2025, Vol. 37 ›› Issue (9) :1261-1273 DOI: 10.7536/PC20250315

综述与评论

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镜像蛋白质药物的开发：化学合成、镜像噬菌体展示和计算设计

任宇祥 ¹ ,
韩东阳 ¹ ,
石威巍 ²^,^*

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Development of Mirror-Image Protein Drugs： Advances in Chemical Synthesis， Mirror-Image Phage Display， and Computational Design

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摘要

完全由D-氨基酸组成的镜像肽和蛋白质因其抗蛋白酶水解和低免疫原性，已成为有潜力的治疗候选物。镜像噬菌体展示是目前识别靶向疾病相关蛋白的镜像肽配体的主要实验方法。然而，镜像噬菌体展示的成功依赖于合成的镜像靶蛋白，而传统的重组表达方法受限于生物体系的内在手性，无法生产镜像蛋白。近年来，化学蛋白质合成方法取得显著进展，如酶可切割增溶标签、骨架安装的分裂内含肽辅助连接以及可移除糖基化修饰辅助折叠策略，这些方法有效解决了镜像蛋白质制备中的关键问题。此外，以人工智能驱动的蛋白质设计为代表的计算方法也逐渐成为有力的互补手段，加速了镜像蛋白药物候选物的发现与优化。尽管镜像蛋白药物尚未进入临床应用阶段，但化学合成和配体筛选方法的持续创新，正稳步推动其治疗潜力的临床转化。

Abstract

Mirror-image peptides and proteins composed entirely of D-amino acids have emerged as promising therapeutic candidates owing to their resistance to proteolysis and reduced immunogenicity. Mirror-image phage display （MIPD） is currently the main experimental technique for identifying mirror-image peptide ligands targeting disease-related proteins. However， the success of MIPD critically depends on synthetic mirror-image target proteins， which cannot be produced by traditional recombinant methods due to the intrinsic chirality of biological systems. Recent advances in chemical protein synthesis， such as enzyme-cleavable solubilizing tags， backbone-installed split intein-assisted ligation， and removable glycosylation modification-assisted folding strategies， have effectively addressed key challenges in preparing these complex mirror-image proteins. In addition， computational approaches， exemplified by AI-driven protein design， have become powerful complementary tools， accelerating the discovery and optimization of mirror-image protein drug candidates. Although mirror-image protein drugs have not yet reached clinical use， ongoing innovations in chemical synthesis and ligand screening methods are steadily advancing their therapeutic potential toward clinical translation.

Contents

1 Introduction

2 Mirror-image phage display

3 Chemical protein synthesis

3.1 Solid-phase peptide synthesis

3.2 Native chemical ligation

3.3 Peptide hydrazide ligation

3.4 Multiple-segment ligation

3.5 The ligation-desulfurization strategy

3.6 Solubilizing tags for hydrophobic segment

3.7 Chemoenzymatic D-peptide ligation

3.8 The folding of D-protein

4 Applications of mirror-image phage display

5 Computationally assisted discovery of mirror-image protein drugs

6 Conclusion and outlook

Graphical abstract

关键词

镜像蛋白 / 蛋白质化学合成 / 镜像噬菌体展示 / 蛋白质从头设计

Key words

mirror-image protein / chemical protein synthesis / mirror-image phage display / protein de novo design

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任宇祥, 韩东阳, 石威巍. 镜像蛋白质药物的开发：化学合成、镜像噬菌体展示和计算设计[J]. 化学进展, 2025, 37(9): 1261-1273 DOI:10.7536/PC20250315

Ren Yuxiang, Han Dongyang, Shi Weiwei. Development of Mirror-Image Protein Drugs： Advances in Chemical Synthesis， Mirror-Image Phage Display， and Computational Design[J]. Progress in Chemistry, 2025, 37(9): 1261-1273 DOI:10.7536/PC20250315

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1 引言

蛋白质是生命过程所必需的基本生物分子，是各种疾病的关键治疗靶标^[1-5]。能够特异性结合靶标蛋白的肽已经成为有前途的治疗分子，近年来在临床上取得了显著的成功，特别是在代谢紊乱疾病和肿瘤治疗等领域^[6-9]。过去10年中，已有100多种多肽疗法上市，约占美国食品药品监督管理局（FDA）批准药物的8%^[10]。与传统的小分子药物相比，多肽能够以更高的特异性和亲和力与靶标结合^[11-12]。然而，多肽药物也存在固有的局限性：易受蛋白酶降解导致血浆半衰期缩短^[6]；跨膜转运效率低导致的口服生物利用度低（约90%的多肽和蛋白质药物都需要通过注射递送，这大大限制了治疗的便利性）^[13-15]，以及潜在的免疫原性，可能导致过度的免疫激活，产生细胞因子风暴等较为严重的不良反应^[16-17]。

为解决这些限制，一种有前途的策略是开发天然蛋白的对映体或“镜像”版本，称为镜像蛋白。和其他生物大分子一样，多肽和蛋白质具有同手性，天然存在的蛋白质仅由L-氨基酸（甘氨酸除外）构成。而完全由D-氨基酸构成的对映体被称为镜像蛋白（图1）^[18]。这些镜像蛋白具有与L-对映体相同的物理化学性质，但表现出相反的旋光性。镜像蛋白独特的结构和理化特性为药物开发提供了重要的机会^[19]。由于其相反的D-手性，镜像蛋白不能被蛋白酶识别，故能够抵抗蛋白酶的水解，从而显著提高其在生物系统中的稳定性和血清半衰期^[20-21]。此外，它们不易被免疫系统识别^[22-23]，不容易引发免疫反应，因此非常适合用于口服治疗应用^[24-25]。这些特性使镜像蛋白成为开发新的治疗手段时特别有潜力的候选药物形式。

目前，筛选和发现镜像蛋白药物中应用最广泛的方法是镜像噬菌体展示（Mirror-image phage display， MIPD）技术，而进行MIPD首先需要获取镜像版本的靶蛋白。镜像蛋白无法像天然蛋白一样通过重组表达制备，因此，化学合成是获取镜像靶蛋白的唯一途径^[26]。镜像蛋白化学合成方法的进步使得靶向更多种类靶蛋白的镜像蛋白药物前体被成功开发。在这篇综述中，我们系统地讨论了镜像蛋白质合成方法，镜像噬菌体展示技术的最新方法和进展。此外，新兴的人工智能（Artificial intelligence， AI）设计策略为发现和优化镜像蛋白开辟了新的途径，进一步扩宽了它们的治疗潜力。综上，镜像蛋白为解决当前肽疗法面临的一些最具挑战性的限制提供了有希望的解决方案，在提高药物稳定性、减少副作用和扩大口服等治疗方式提供了前所未有的机会。本文回顾了镜像蛋白药物的发展情况，包括通过MIPD技术筛选镜像蛋白药物前体的基本原理、工作流程和应用实例、镜像蛋白化学合成方法的最新进展，以及近期新发展的计算辅助镜像蛋白药物发现的研究。这些研究案例体现了镜像多肽和蛋白质作为有望用于新型疗法开发的候选药物的发展前景。

2 镜像噬菌体展示

最早的镜像蛋白药物是通过直接制备已有的天然蛋白药物的镜像版本得到的，所获得的镜像蛋白药物由于手性改变，与靶蛋白的结合力严重下降，导致其活性远不如相应的天然蛋白药物母体^[21,27]。另一种获得镜像蛋白药物的方式是逆向倒置（Retro-inversion， RI）。RI是将母体天然多肽序列的顺序反转，并以D-氨基酸取代L-氨基酸得到镜像多肽药物^[28]。其侧链拓扑结构与其母体天然多肽相似，但具有与母体顺序相反的氨基酸序列。RI策略在非结构化多肽对象上取得了一些成功^[29-32]，然而对于具有二级结构的多肽对象，RI策略通常会失败。这主要是由于α-螺旋的拓扑特性，由D-氨基酸构成的镜像多肽总是采用左旋螺旋，而L-氨基酸构成的天然多肽螺旋则是右旋，由此产生的拓扑差异会破坏多肽与靶蛋白的结合^[33]。这意味着需要其他的方法来发现并鉴定出对天然靶蛋白具有高亲和力的镜像蛋白药物前体。

麻省理工学院的Kim等^[34]于1996年报道了MIPD技术，这一开创性的工作至今仍是筛选与靶蛋白具有高特异性亲和力的镜像多肽的重要方法，并且已经鉴定出了一系列的镜像蛋白药物前体（图2）^[18]。噬菌体展示（Phage display）是一种常见的体外筛选技术，用于发现和鉴定能够与靶蛋白结合的多肽配体^[35-37]。该方法通过基因编码将噬菌体外壳蛋白与外源多肽序列融合表达，使得每个噬菌体在其表面呈递一种独特的多肽。将噬菌体呈递多肽文库与固定在固相载体上的靶蛋白一起孵育，随后洗去与靶蛋白亲和力低的游离噬菌体。再将与靶蛋白结合的噬菌体洗脱，使其感染宿主细胞后繁殖扩增，再进行下一轮“吸附-洗脱-扩增”。经过多轮循环后，对靶蛋白表现出高度特异性结合力的噬菌体即可高度富集。噬菌体展示可以从>10⁹大小的多肽文库中筛选出具有最强结合力的不同多肽序列，并根据其基因型和表型之间的对应关系解码出这些候选多肽的氨基酸序列^[38-40]。在MIPD中，天然靶蛋白被替换成化学合成的镜像版本靶蛋白，如此筛选出的候选噬菌体多肽对镜像版本的靶蛋白具有强结合力。随后合成这些多肽的镜像版本，出于镜像对称的原则，合成的镜像多肽就会对天然的靶蛋白具有强结合力，可以作为镜像蛋白药物前体。

因此，获取镜像靶蛋白是MIPD筛选镜像蛋白药物前体的基础^[41]。由于重组表达方法依赖于生物体的转录翻译等机制，获得的蛋白仅限于L-氨基酸构成的天然手性的蛋白质。最近遗传密码子扩展（Genetic code expansion， GCE）等技术的发展能够将D-氨基酸等非天然氨基酸整合到重组表达系统中^[42-44]。然而，完全由D-氨基酸构成的镜像蛋白仍无法通过重组表达获得，蛋白质化学合成是获得镜像蛋白的唯一手段。近年来蛋白质化学合成相关技术的发展不仅为解决一系列生物机制问题提供了新的视角^[45-48]，而且在制备MIPD所需的镜像靶蛋白上发挥了至关重要的作用^[49]。

3 镜像蛋白质化学合成

3.1 固相多肽合成

Merrifield于1963年首次提出的固相多肽合成（Solid-phase peptide synthesis， SPPS）是合成镜像多肽的重要方法^[50]。目前最常用的是使用9-芴基甲基氧羰基（9-Fluorenylmethyloxy-carbonyl， Fmoc）保护的氨基酸作为合成原料的Fmoc-SPPS^[51-52]。将缩合或脱保护反应液加入带有活性接头的固相树脂中，反应结束后将废液过滤。经过缩合-脱保护的循环，即得到负载在树脂上的多肽链。随后用三氟乙酸（Trifluoroacetic acid， TFA）混合液将多肽从树脂上切割，再经过高效液相色谱（High performance liquid chromatography， HPLC）纯化即可获得多肽纯品。近期，自动快速流式多肽合成（Automated fast-flow peptide synthesis， AFPS）等技术的发展能够更快速、更高效地完成镜像多肽和蛋白质的合成，并已成功用于后续的MIPD筛选^[53-55]。

3.2 自然化学连接

尽管多肽合成技术的发展将单次合成的多肽长度显著提升，但更长的镜像蛋白对象的直接固相合成仍然存在问题。因为当树脂上负载的多肽链过长时，缩合、脱保护等反应的效率会逐渐下降，杂质也更难从产物中纯化除去。克服这个问题的方法是将几段经纯化的单次合成的多肽片段拼接成全长镜像蛋白^[56]。最常用的拼接方法是芝加哥大学Kent团队于1994年首次报道的天然化学连接（Native chemical ligation， NCL）^[57]。

NCL反应首先是多肽硫酯片段和另一氨基末端为半胱氨酸（Cysteine， Cys）的多肽片段之间发生可逆的硫醇-硫酯交换，形成硫酯键连接的中间体。随后该中间体通过不可逆的分子内N-S酰基转移重排，得到由酰胺键连接的拼接产物（图3）。NCL通常在含有6 mol/L盐酸胍变性剂的中性缓冲溶液中进行，经HPLC纯化后获得连接产物纯品^[58-59]。

3.3 多肽酰肼法

NCL反应依赖于多肽硫酯，其难以通过Fmoc-SPPS直接获取。因为多肽硫酯在脱除Fmoc保护时加入哌啶的条件下不稳定。近年来，已有几种多肽硫酯前体策略被用于多肽硫酯的获取，其中清华大学刘磊团队^[60]开发的多肽酰肼法已经得到了广泛应用（图4）。多肽酰肼可以容易地使用Fmoc-SPPS获取，然后使用NaNO₂（或乙酰丙酮）活化形成酰基叠氮化物（或酰基吡唑）中间体，随后发生原位硫解产生多肽硫酯。此时也可直接加入氨基末端为Cys的另一多肽片段进行原位NCL反应^[61-71]。

3.4 多片段连接方法

部分目标镜像蛋白需要通过多个多肽片段的连接才能获得。收敛法连接是一种用于多个多肽片段组装的有效蛋白质化学合成方法，但在合成过程中需要将中间多肽片段羧基末端的反应活性硫酯和氨基末端的Cys残基暂时掩蔽，来防止寡聚化或自环化等副反应（图5a）。镜像多肽酰肼、N-酰脲（N-acylurea， Nbz），以及带有可激活的N-S酰基转移基团的多种镜像多肽硫酯前体已被成功应用，这些镜像多肽硫酯前体都可以根据需要在温和条件下被选择性活化为镜像多肽硫脂（图5b）^[72-77]。另一方面，为了临时掩蔽镜像多肽片段氨基末端的反应活性Cys，包括乙酰氨基甲基（Acetamidomethyl， Acm）^[78-79]、噻唑烷（1，3-Thiazolidine-4-carbonyl， Thz）^[80-81]，及Fmoc等多种保护基已被开发并成功用于镜像蛋白的多片段合成（图5c）^[82]。

3.5 连接-脱硫策略

NCL反应依赖多肽片段中的Cys残基，其天然丰度较低（约1.4%）。连接-脱硫策略是解决这个问题的一种方法，首先将目标蛋白中的丙氨酸（Alanine， Ala）暂时突变为Cys以进行NCL，反应后再通过脱硫试剂处理连接产物，将Cys转化回Ala（图6a）。斯克里普斯研究所的Dawson团队^[83]于2001年报道的Pd/Al₂O₃金属催化是最初被使用的脱硫条件。斯隆凯特琳癌症研究所的Danishefsky团队于2007年报道的脱硫反应使用的试剂条件三（2-羧乙基）膦（Tris（2-carboxyethyl）phosphine， TCEP）、2，2′-偶氮双[2-（2-咪唑啉-2-基）丙烷]（2，2′- azobis[2-（2-imidazolin-2-yl）propane]， VA-044）和叔丁基硫醇（t-Butyl mercaptan， tBuSH）则是目前最常用的脱硫方法^[84]。近期，更多包括基于NaBH₄、NaBEt₄、铁催化、超声辅助和低能量可见光催化的脱硫方法也被报道^[85-93]。

同样的原理也可应用到Ala之外的其他氨基酸残基以扩展更多的连接位点，相应的巯基化氨基酸单体可以通过化学合成得到，并通过SPPS整合到多肽片段中（图6b）^[87]。例如，北京大学董甦伟团队^[94]报道了一种简洁高效的酶促硫代赖氨酸合成方法，并成功的应用于干扰素γ（Interferon γ）的化学合成。

此外，其他不依赖于Cys的连接方法也被报道，如丝氨酸/苏氨酸连接（Serine/Threonine ligation， STL）、酮酸-羟胺连接（Ketoacid-hydroxylamine ligation， KAHA）和二硒化物-硒酯连接（Diselenide-selenoester ligation， DSL）等^[95-101]。辅基介导的蛋白连接（Auxiliary-mediated ligation）方法在制备侧链带有泛素化修饰的天然蛋白对象中取得了广泛成功，也有望用于制备具有更加多样化结构的镜像蛋白^[102-106]。

3.6 用于疏水镜像多肽片段的增溶标签

镜像靶蛋白的化学合成常因镜像多肽片段的强疏水性和低溶解度而遇到困难。在疏水性多肽片段上添加增溶标签，可以增加其溶解度并促进在镜像靶蛋白合成中的纯化和连接等过程（图7）^[107-108]。例如，Danishefsky等^[107]在鼠类肉瘤病毒癌基因（Kirsten rat sarcoma viral oncogene， Kras）表达的蛋白的致癌突变体KRas（G12V）的镜像版本的化学合成中，向其中的疏水性镜像多肽片段中掺入了2-羟基-4-甲氧基苄基（2-Hydroxy-4-methoxybenzyl， Hmb），改善了其溶解度和合成效率。

清华大学刘磊团队^[109-111]开发出了一种可移除的主链骨架修饰（Removable backbone modification， RBM）策略，通过将增溶标签（如聚赖氨酸、聚精氨酸）安装到主链的酰胺上来破坏多肽和蛋白质的聚集，从而提高难溶多肽片段及蛋白质的溶解度。安装的增溶标签在合成完毕后可以用酸（TFA或盐酸）将其从镜像靶蛋白上切割移除^[82,100]。该策略被用于几种膜相关镜像蛋白的化学合成，如程序性死亡配体 1（Programmed death ligand 1，PD-L1）和T细胞免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸抑制性基序结构域（T-cell immunoglobulin and immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif domain，TIGIT）^[112-113]。

犹他大学Kay等^[114]报道了另一种增溶标签安装方法，使用Ddae接头将增溶标签临时安装到难溶多肽片段中赖氨酸的侧链ω-氨基上，随后加入肼切割掉Ddae接头以及增溶标签。该方法成功应用于合成分子伴侣GroES的镜像版本。

此外，本研究组开发了酶可切割增溶标签策略，将增溶标签安装在D-赖氨酸/D-丝氨酸/D-苏氨酸以及使用单个L-赖氨酸作为接头的末端α-氨基。在变性条件下，Lys-C蛋白酶仍然可以保持活性并移除这些标签，得到不带标签的靶蛋白产物。程序性细胞死亡蛋白1（Programmed cell death protein 1， PD-1）和严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2（SARS-CoV-2）包膜蛋白的免疫球蛋白V（Immunoglobulin V， IgV）结构域的镜像版本的成功合成验证了该策略的有效性^[115]。

3.7 化学酶法连接镜像多肽片段

化学酶法是连接多肽片段的另一种常用方法。使用天然来源的连接酶，如Sortase A、Butelase-1和分裂内含肽（Split Intein）等可以在温和的条件下实现选择性多肽连接^[116-119]，但天然酶固有的手性选择性使得它们无法有效催化镜像多肽之间的连接。为了克服这一限制，本课题组开发了镜像版本的Sortase介导的连接和骨架安装的分裂内含肽辅助连接（Backbone-installed split intein-assisted ligation， BISIAL）方法^[120-121]。

通过基于多肽酰肼法的片段连接获得的镜像Sortase，可以作为催化镜像多肽片段拼接的镜像多肽连接酶（图8a）^[120]。BISIAL法则是将天然手性的分裂内含肽Cfa通过RBM策略分别安装到待连接的两个镜像多肽片段上，利用Cfa固有的高亲和力促进镜像多肽的NCL反应更快、更高效地进行。BISIAL方法的一个关键优势是能够在强变性条件（如8.0 mol/L尿素）下连接微摩尔浓度的镜像多肽片段。得到连接产物后再移除RBM修饰，即可得到没有任何“连接疤痕”的目标镜像蛋白（图8b）^[121]。

3.8 镜像蛋白质的折叠

镜像靶蛋白合成完毕后需要经过折叠使其恢复天然结构，可以使用重组表达的天然版本靶蛋白预先确定镜像靶蛋白的折叠条件。通过梯度透析或直接稀释降低蛋白质溶液中的盐酸胍或尿素等变性剂浓度，完成蛋白折叠并恢复其天然结构。这些常规策略足以折叠多数人工合成的镜像靶蛋白。尽管如此，已有几种难以折叠的镜像蛋白被报道，特别是一些具有二硫键的镜像蛋白易发生寡聚化或形成二硫键错误配对的折叠产物^[122]。

已有促进镜像蛋白体外折叠的策略被开发。Kay等^[123]报道天然的GroEL/ES分子伴侣既可以促进天然手性蛋白的折叠，还可以促进镜像蛋白的折叠（图9a）。该策略的有效性在促进镜像DapA蛋白的成功折叠中得到了验证。

蛋白质糖基化被证明在蛋白质体外折叠过程中能够起到抑制蛋白聚沉的作用^[124-126]，例如董甦伟团队^[127]完成的均质糖基化修饰的人白细胞介素17A（Interleukin-17A， IL-17A）的化学合成和体外折叠；上海交通大学王平团队^[128]完成的新型冠状病毒刺突蛋白的受体结合域（SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain）的均质糖基化形式的合成。本课题组^[129]报道了一种用于折叠含二硫键蛋白质的可移除糖基化修饰（Removable glycosylation modification， RGM）辅助折叠策略，在蛋白质化学合成过程中将N-乙酰氨基葡萄糖（N-acetylglucosamine， GlcNAc）暂时安装在待折叠的天然蛋白质上，折叠完成后使用O-GlcNAc糖苷酶（（O-GlcNAcase， OGA）移除蛋白质上的O-GlcNAc修饰。后续本课题组将这一策略扩展到了促进含二硫键的镜像蛋白的折叠，我们证明安装在镜像蛋白上的O-GlcNAc修饰同样可以促进折叠，且天然的OGA可以从镜像蛋白底物中完全地移除O-GlcNAc，获得正确折叠的不含糖基化修饰的镜像靶蛋白（图9b）。RGM辅助镜像蛋白折叠策略的有效性通过合成和折叠镜像肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factor alpha， D-TNFα）的同源三聚体和镜像Omicro刺突蛋白的受体结合域（Receptor-binding domain of omicron spike protein， D-RBD）等难折叠的镜像蛋白得到了证明^[122]。RGM与RBM等通过在蛋白质化学合成过程中引入临时结构支撑的策略，有望促进更多镜像靶蛋白的化学合成^[130]。

4 镜像噬菌体展示的应用

得益于镜像蛋白化学合成方法的发展，利用MIPD技术筛选出了多种靶蛋白的镜像多肽抑制剂，包括癌蛋白、免疫检查点和细胞生长因子等肿瘤相关蛋白^{[112-113,131-133]}，以及HIV蛋白酶、淀粉样蛋白等其他疾病相关蛋白^[134-135]。这展现了以MIPD为代表的筛选技术在镜像蛋白药物前体发现中的广泛用途以及应用前景。

以靶向肿瘤相关蛋白的镜像多肽抑制剂为例，癌蛋白MDM2可抑制肿瘤抑制蛋白p53的活性和功能，使其成为有吸引力的抗癌治疗靶标^[136]。马里兰大学的陆五元团队^[131-132]利用镜像蛋白化学合成和MIPD发现了靶向p53-MDM2相互作用的镜像多肽抑制剂^DPMI-α、^DPMI-β和^DPMI-γ，它们与MDM2的结合力（K_D）分别为219、38和35 nmol/L。后续通过结构优化设计出了一种称为^DPMI-δ的镜像多肽抑制剂，K_D高达220 pmol/L，有望成为抗癌治疗开发的先导候选药物^[133]。

PD-1/PD-L1以及TIGIT/PVR等免疫检查点的蛋白-蛋白相互作用可介导肿瘤免疫逃逸，阻断其互作是癌症免疫治疗有前途的途径。本课题组^[112]首先合成了共124个残基的PD-L1 IgV结构域镜像靶蛋白，命名为^DIgV^PD-L1。通过多肽酰肼连接、脱硫和脱Acm保护三步工艺，在毫克级水平获得了^DIgV^PD-L1。随后通过梯度透析完成折叠，折叠后的^DIgV^PD-L1表现出反平行的D-构型β折叠，其手性与天然PD-L1 IgV结构域的手性相反。随后利用合成的镜像PD-L1通过MIPD筛选出了第一个阻断PD-1/PD-L1通路的镜像多肽抑制剂^DPPA-1。优化后的^DPPA-1在细胞水平和癌症小鼠模型中有效地阻断了PD-1/PD-L1相互作用。

在大多数适应症中，对PD-1/PD-L1阻断的有效率低于30%，这表明癌症免疫治疗需要新的有效靶点。免疫检查点TIGIT在许多对PD-1治疗耐药的肿瘤细胞中表达，被认为是癌症免疫治疗的新兴靶点。本课题组^[113]合成了TIGIT免疫球蛋白可变结构域的镜像版本，并利用MIPD鉴定出了首个靶向TIGIT的镜像多肽抑制剂^DTBP-3。^DTBP-3占据TIGIT/PVR相互作用的结合区域，并抑制抗PD-1治疗的耐药模型肿瘤生长。^DTBP-3具有高蛋白酶水解稳定性、更长的半衰期和强大的组织渗透能力，可作为TIGIT靶向癌症免疫治疗的潜在候选药物。

血管内皮生长因子蛋白（Vascular endothelial growth factor VEGF-A）和表皮生长因子（Epidermal growth factor， EGF）等生长因子蛋白的过表达在多种癌症中很常见，开发其抑制剂有可能抑制肿瘤生长。Kent等^[137]通过一锅法NCL方法成功合成了镜像VEGF-A。随后通过MIPD鉴定出了VEGF-A的镜像多肽抑制剂D-RFX001，其对天然VEGF-A的结合力K_D为85 nmol/L。在后续的研究中，他们对D-RFX001进行了修饰，得到了RFX037.D。与D-RFX001相比，它表现出更好的热稳定性和更高的VEGF-A结合力（K_D = 6 nmol/L）^[138]。

镜像多肽抑制剂对天然蛋白靶标的亲和力通常不如对应的抗体。然而近期多伦多大学的Sidhu研究组^[139]针对VEGF-A开发出的一种异二聚体镜像蛋白抑制剂有望突破这一局限性。他们合成了镜像VEGF-A，与两个不同的噬菌体展示文库进行正交筛选，发现了两种镜像多肽RFX-V1和RFX-V2，它们与VEGF-A的结合力K_D分别为43和200 nmol/L，随后通过点击化学反应将它们共价连接，得到异二聚体RFX-V1a2a，其与VEGF-A的结合力K_D = 0.08 nmol/L，比对应的抗体贝伐珠单抗（结合力K_D = 0.16 nmol/L）高出两倍。

5 计算辅助的镜像蛋白药物发现

尽管MIPD是目前鉴定出镜像蛋白药物前体的最有效和最常用的技术，但计算方法可能提供更先进的策略来发现更多新的镜像蛋白药物前体^[140-142]。Kim等^[33]创建了蛋白质数据库（Protein Data Bank， PDB）中所有111867种天然蛋白质结构的镜像，并从该存储库中提取出了约280万种镜像多肽螺旋结构，得到被称为（D）-PDB的新数据库。对于那些已被报道与疾病治疗相关的天然多肽，首先通过实验或已有研究确定其中的“热点残基”，即对靶标识别、结合和受体激活有显著贡献的氨基酸残基。然后使用结构比对扫描（D）-PDB，寻找与天然多肽对象中的热点残基构型相匹配的镜像多肽螺旋。他们使用胰高血糖素样肽（Glucagon-like-peptide， GLP1）和甲状旁腺激素（Parathyroid hormone， PTH）作为概念验证的测试实例，在（D）-PDB中成功发现了可特异性结合GLP1受体和PTH1受体的镜像多肽螺旋。

MIPD等筛选方法能够鉴定出与靶蛋白结合的镜像多肽，然而初始文库中是否存在能够有效结合靶蛋白的潜在候选多肽分子是随机的。而且筛选出的多肽分子是否能够精确靶向靶蛋白与其互作蛋白结合的特定表面区域也是未知的^[143]。

AI辅助的蛋白质从头设计（De novo design）正好能够解决这一问题^[144-147]。蛋白质从头设计首先就要选定靶蛋白表面的特定区域，再将氨基酸残基与该表面对接，找出可与该表面结合的离散的氨基酸残基。随后将这些氨基酸残基套入蛋白框架中并不断利用深度学习优化，从而设计出可特异性结合靶蛋白特定表面的多肽结合物（Binder）^[148]。蛋白质从头设计已经在天然蛋白质中得到了广泛应用，许多天然靶蛋白的Binder被设计并合成^[149-153]。由华盛顿大学的Baker等^[155]基于Rosetta框架^[154]开发的RosettaFold是用于蛋白质结构预测的核心模块，RosettaFold以能量函数评估设计出的蛋白质的构象稳定性，通过能量最小化找到最稳定的结构。基于RosettaFold的RFdiffusion是一种扩散模型（Diffusion model）蛋白质从头设计工具，通过逐步添加噪声并深度学习去噪过程，最终生成符合生物物理规律且具有特定功能的全新蛋白质结构。

然而，靶向天然蛋白的镜像蛋白结合物（D-binder）的从头设计面临一个重大挑战，即PDB中只有少数高分辨率结构可用作异手性蛋白复合物从头设计的深度学习数据库^[137-138]。本课题组与卢培龙团队^[156]合作开发了一种计算和实验集成的方法，能够为给定的天然靶蛋白从头设计出D-binder，并完成合成与表征。D-binder的计算设计、高通量测试、表征和定向进化最初在镜像空间中进行。首先通过蛋白质化学合成获取天然靶蛋白的镜像版本，随后使用RifDock^[157]将9606个具有5种不同拓扑结构的天然微型蛋白支架对接到镜像靶蛋白结构的特定表面区域来生异手性蛋白相互作用对，并使用MotifGraft算法^[158]对设计的Binder的支架几何形状和互作界面组进行优化。随后使用酵母展示（Yeast display）^[36,159]高通量筛选出与靶蛋白结合力最强的Binder突变体序列，并通过重组表达获取筛选出的Binder进行结合力测试等表征。对于表征结果良好的Binder，其镜像对映体D-binder将会被化学合成并折叠，然后进行后续结合力测试等表征以确定其是否能够作为镜像蛋白药物前体（图10）。

我们首先在人工合成的螺旋多肽（L-Pep-1）上对这一策略进行概念验证，成功设计并筛选出了靶向L-Pep-1的D-binder，命名为D-19437_l-PEP-1（K_D = 59 nmol/L）。完成概念验证后，原肌球蛋白受体激酶A（Tropomyosin receptor kinase A， TrkA）和白细胞介素6（Interleukin-6， IL-6）两个人源靶蛋白，被选为对象来设计并筛选D-binder，成功鉴定出了D-57445-EVO_l-TrkA和D-25367-EVO_l-IL-6两个D-binder，K_D分别为1和89 nmol/L。我们随后解析了D-19437_l-PEP-1与L-Pep-1的异手性蛋白复合物的晶体结构，与设计模型几乎一致。

这项研究首次提出并实现了D-binder的从头设计，丰富了镜像蛋白药物前体的获取途径，并且对天然蛋白和镜像蛋白之间的相互作用的提供了新的见解。

6 结论与展望

镜像蛋白药物因其对蛋白酶水解的抵抗性、低免疫原性和口服生物利用度等优势而被认为是有应用前景的治疗手段。MIPD是筛选和发现镜像蛋白药物最常用的方法，获取镜像版本的靶蛋白是MIPD的基础。镜像蛋白目前无法通过重组表达得到，蛋白质化学合成是获取镜像蛋白的唯一方法。

蛋白质化学合成的进步推动了镜像蛋白药物前体的发现。近期AFPS等镜像多肽合成新技术的出现使得更快速地获取用于MIPD的镜像蛋白成为可能。同时，其他蛋白质化学合成策略，如多肽酰肼法驱动的镜像蛋白多片段连接和 RBM、脱硫等辅助合成策略，极大地拓展了可获取的镜像靶蛋白的范围。成功实现了如PD-L1和TIGIT等具有挑战性和治疗意义的镜像靶蛋白的获取，并成功筛选出了对应的镜像蛋白药物前体，为疾病靶向治疗的发展铺平了道路。

尽管取得了一定进展，但镜像蛋白质化学合成中的挑战仍然存在。例如一些镜像靶蛋白的片段即使在强变性条件下仍然溶解度较差或容易聚集和沉淀；更大（例如超过800~1000个氨基酸残基）的镜像靶蛋白片段也需要在低浓度下进行多肽片段的连接。NCL等经典连接方法通常需要以毫摩尔浓度进行，难以满足这些蛋白质对象的合成需求。此外，部分镜像靶蛋白即使能够被成功合成，其后续的折叠也存在一定的困难。最近解决这些问题的新方法包括邻近促进的连接技术，如BISIAL等，以及天然O-GlcNAc基团的临时安装等辅助折叠方法。随着靶向更多疾病相关靶点的镜像蛋白药物的需求增长，仍然迫切需要开发更多蛋白质化学合成新策略来获取许多更大、更复杂、合成更困难的镜像靶蛋白。

MIPD是目前鉴定镜像蛋白候选药物最常用的技术，更多新的技术近期也被成功地应用于发现镜像蛋白药物前体。AI辅助的蛋白质从头设计已经在天然蛋白领域取得了一系列的成功，然而在镜像蛋白上的应用仍处于探索阶段。AI辅助的蛋白质从头设计的更多成功应用可能会更高效地推动镜像蛋白药物前体的直接发现。此外，D-氨基酸编码的单珠一化合物（One-bead one-compound）等技术也被报道用于镜像蛋白药物的开发^[160]。为筛选大环肽设计的随机非标准肽整合发现（Random nonstandard peptide-integrated discovery， RaPID）等其他新近发展的高通量筛选技术，也有望用于鉴定具有较强亲和力的镜像蛋白药物前体^[161]。

最后，要将镜像蛋白药物实际应用于诊断和疾病治疗，仍然需要克服许多长期存在的困难。例如需要发展实用的药物递送技术。最近，镜像蛋白质已利用反式转录激活因子（Trans-activator of transcription， TAT）衍生的肽和D-Arg₉等细胞渗透肽成功运输到细胞内。天然存在的运输机制，例如保护性抗原（Protective antigen， PA）和致死因子氨基末端结构域（Lethal factor， LF_N）等也被成功开发为镜像蛋白的细胞内递送平台^[162]。这些新策略的出现，使得镜蛋白药物能够靶向细胞内的相互作用。获取镜像蛋白的成本过高是将其推向实际应用的另一个限制因素。一些简单的策略，例如用结构相似的镜像单体代替那些更昂贵的单体，也可能发挥关键作用。这一策略的可行性已经在D-Pfu等镜像酶的合成中得到证明，用D-缬氨酸（Valine， Val）或D-亮氨酸（Leucine， Leu）取代昂贵的D-异亮氨酸（Isoleucine， Ile），能够降低总成本且几乎不会影响合成的酶的活性^[163]。总之，尽管目前仍然没有获批上市的镜像蛋白药物，但越来越多镜像蛋白合成和药物前体筛选方法的出现，为镜像蛋白这一新兴的潜在药物疗法开辟了令人兴奋的应用机会。

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