适配体电化学传感器在外泌体检测中的研究进展

赵洋; 罗奎; 李建平

doi:10.7536/PC20251007

化学进展 ›› 2026, Vol. 38 ›› Issue (7) :1347-1364 DOI: 10.7536/PC20251007

综述与评论

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适配体电化学传感器在外泌体检测中的研究进展

赵洋 ¹^,^† ,
罗奎 ²^,^† ,
李建平 ¹^,²^,^*

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Research Progress of Aptamer Electrochemical Sensors in the Detection of Exosome

Yang Zhao ¹^,^† ,
Kui Luo ²^,^† ,
Jianping Li ¹^,²^,^*

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摘要

外泌体与肿瘤的发展和转移密切相关，其携带的生物分子（蛋白质、核酸等）可作为肿瘤诊断的信息“指纹”，是研究者们青睐的关键性生物标志物。为此，发展方便快速、灵敏、稳定的方法来检测外泌体是极为重要的。适配体（Aptamer）作为比抗体更有优势的关键性识别元件，可用于识别外泌体上特定生物分子或信号标记。结合适配体与电化学法的优势所构建的适配体电化学传感器，已成为液体活检、早期癌症筛查等场景中更具竞争力的工具，尤其适合现场快速检测和复杂基质样品中外泌体的检测。本文综述了近五年内适配体电化学传感器检测外泌体的模式和应用范围，以及各种信号放大策略，并展望了适配体电化学传感器在外泌体检测领域的未来发展趋势。

Abstract

Exosomes， closely associated with tumor development and metastasis， carry biomolecules （proteins， nucleic acids， etc.） that serve as diagnostic “fingerprints” for tumors， which are favored by researchers as key biomarkers. Therefore， developing convenient， rapid， sensitive， and reliable methods for detecting exosome is of paramount importance. As superior recognition elements compared to antibodies， aptamers can identify specific biomolecules or signaling markers on exosomes. Aptamer electrochemical sensors， combining the advantages of aptamers and electrochemical methods， represent a more competitive tool for applications such as liquid biopsy and early cancer screening. They are particularly well-suited for rapid point-of-care testing and the detection of exosomes in complex matrix samples. In this paper， the detection modes and application scope， along with various signal amplification strategies of aptamer electrochemical sensors for exosome over the past five years were reviewed. This paper also outlines the future trends for these sensors in the field of exosomes detection.

Contents

1 Introduction

2 Aptamer and aptamer electrochemical sensor

2.1 Definition and characteristics of aptamer

2.2 Engineering strategies of aptamer-modified interfaces

2.3 Structure and detection principle of aptamer electrochemical sensors

3 Mode of aptamer electrochemical sensors for detecting exosome

3.1 Direct detection

3.2 Sandwich-type

3.3 Logic gate

4 Signal amplification modes for aptamer electrochemical sensors in detecting exosome

4.1 Signal amplification in DNA walker

4.2 CRISPR-Cas system mediated signal amplification

4.3 Signal amplification in proximity ligation strategy

4.4 Signal amplification in isothermal nucleic acid amplification technology

5 Conclusion and outlook

Graphical abstract

关键词

外泌体 / 适配体 / 电化学传感器 / 肿瘤诊断

Key words

exosomes / aptamer / electrochemical sensor / tumor diagnosis

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赵洋, 罗奎, 李建平. 适配体电化学传感器在外泌体检测中的研究进展[J]. 化学进展, 2026, 38(7): 1347-1364 DOI:10.7536/PC20251007

Yang Zhao, Kui Luo, Jianping Li. Research Progress of Aptamer Electrochemical Sensors in the Detection of Exosome[J]. Progress in Chemistry, 2026, 38(7): 1347-1364 DOI:10.7536/PC20251007

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1 引言

外泌体，是参与细胞通讯的内体衍生的纳米囊状颗粒，其直径为30~150 nm，形态多样，常见为杯状或球形^[1-2]。几乎所有类型细胞均会分泌外泌体，并且外泌体广泛存在于各种生物流体中，如血浆、尿液、唾液、泪液、精液、脑脊液及腹水等^[3-4]。外泌体具有磷脂双分子层结构，因此可稳定携带蛋白质、核酸（如DNA、miRNA、mRNA）、脂质等生物分子，在细胞间通讯、免疫调节、肿瘤发生发展等过程中发挥着重要作用^[5-8]。外泌体是异质性的，其分子组成能够精准反映其来源细胞的细胞类型与生物学属性^[9]。研究表明，源于同一类型细胞的外泌体含有相似的蛋白质、核酸和脂质，这些生物大分子不仅与细胞类型相关，也反映了细胞的起源。基于上述特性，癌症（或肿瘤）来源的外泌体已经被视为一种极有吸引力的液体活检标志物。

人们开发了多种方法来表征和检测外泌体。免疫印迹法（Western blotting，WB）和酶联免疫吸附分析法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）主要用于鉴定外泌体的蛋白质^[10-12]；纳米颗粒跟踪分析（Nanoparticle tracking analysis，NTA）可有效测定外泌体的尺寸分布特征，并能对其纯度进行评估^[13]；透射电子显微镜及原子力显微镜用来表征外泌体的尺寸及形貌特征。近年来，研究者们更聚焦于外泌体的定量分析、外泌体携带生物分子（蛋白质、miRNA等）的精准检测，以及肿瘤来源外泌体的鉴定与对应的肿瘤分期评估。已报道的新型外泌体检测技术包括电化学法^[14-16]、比色测定法^[17]、荧光光谱法^[18-19]、微流控技术^[20]、表面增强拉曼散射法等^[21]，这些方法和技术显著推动了通过解析外泌体与肿瘤的关联来探索肿瘤的发生和发展路径及机理，从而加速疾病诊断和靶向治疗研究的进程。适配体电化学传感器，兼具高灵敏度、低成本、操作简单、抗光学干扰、易微型化等多重优势，尤其适合现场快速检测和复杂基质样品中外泌体的分析需求，还能在液体活检、早期癌症筛查等场景中提供更具竞争力的技术方案。然而，在临床样本的分析过程中，对外泌体及其亚型的筛分、外泌体与对应肿瘤的来源和发展周期的判断，仍是亟待突破的壁垒。基于此，发展高特异性高灵敏度的适配体电化学检测平台用于外泌体的研究和疾病诊断具有重要意义。因此，本文针对适配体对外泌体标志物的特异识别作用，介绍了近年来构建适配体电化学传感器的种类和适用范围，重点论述了提高适配体电化学传感平台对外泌体的检测灵敏度的各种信号放大策略。

2 适配体及其电化学传感器

2.1 适配体的定义及其特性

适配体是一类能够特异性结合目标分子的单链寡核苷酸（DNA或RNA），或短肽序列^[22-23]。其中，核酸适配体由核苷酸组成，具有良好的化学稳定性和可修饰性；肽适配体则由氨基酸组成，通常出现在蛋白质支架上，具有丰富的结构多样性和生物活性^[24-25]。目前，经指数富集的配体系统进化技术（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX）筛选获得的适配体可实现纳摩尔甚至皮摩尔级的结合亲和力。结合作用主要包括氢键、π-π堆积、静电相互作用、疏水效应、范德华力等，作用强度可与抗原-抗体反应相当，因此适配体可精准识别特定外泌体表面蛋白或核酸标记物^[26]。适配体可在体外化学合成，生产成本远低于抗体，更适合大规模应用；同时，与抗体相比，适配体在高温、极端pH、酶解等条件下仍能保持结构和功能，储存寿命长，适合现场或长期监测。适配体分子量小，空间位阻更低，能够更容易渗透到外泌体表面或内部空隙，提高捕获效率^[27]。再者，适配体还具备直接捕获未纯化样本中的外泌体、微升级样本需求、保证外泌体完整性的无痕释放和再利用以及引入信号扩增技术等特点。这些优势属性，使适配体成为外泌体检测领域的关键识别元件，能够显著提高检测特异性和实用性。

2.2 适配体修饰界面的工程化策略

电化学适配体传感器的性能不仅取决于适配体自身的亲和力，更高度依赖于其在电极界面的固定化效果。尽管适配体具有纳摩尔级的结合亲和力，若固定方式不当，实际结合效率可能下降1~2个数量级^[28]。因此，适配体质量验证与界面工程的稳定构建至关重要，本文系统总结了提升传感器可靠性与结合效率的关键策略（表1）。

适配体筛选后，需对其关键参数进行严格验证，为后续界面优化提供可靠基础^[29]，主要包括：（1）亲和力（K_d）应通过等温滴定量热法（Isothermal titration calorimetry，ITC）、表面等离子体共振（Surface plasmon resonance， SPR）或微量热泳动（Microscale thermophoresis， MST）等无标记技术测定溶液中的真实K_d值。电化学方法测得的表观K_d常受固定化影响，不宜作为唯一判定依据；（2）特异性与交叉反应，需验证适配体与结构类似物（如外泌体亚型、血清蛋白）的交叉反应性^[30-31]。对于外泌体检测，还应确认适配体能否区分不同细胞来源的外泌体；（3）批次一致性，化学合成的适配体批次间差异主要源于合成纯度与修饰效率（如巯基、氨基标记），需采用高效液相色谱进行纯化，并在关键实验中注明合成批次与纯化方式^[32-33]。

电极表面的适配体固定化存在两大矛盾：高密度虽可增强信号强度，但易引发拥挤效应，降低结合活性^[34]；随机取向（如通过末端巯基直接吸附）可能导致结合位点被遮蔽或朝向电极表面^[35-36]。在多种策略中，DNA支架因其可编程性与结构刚性，尤其适用于外泌体等大尺寸靶标检测。例如，适配体修饰于DNA四面体的顶点，可使其垂直伸向溶液相，有效避免电极表面的空间位阻与非特异性吸附，同时利用四面体在电极表面的均匀排布实现分子间距调控。定向固定化则通过生物素-链霉亲和素体系或点击化学反应，确保适配体以5′或3′端统一朝向溶液，使结合位点充分暴露，成为提升传感器批次间一致性的关键手段。然而，在实践中，单一策略往往难以同时解决所有问题，多策略联合使用是当前的主流趋势。

2.3 适配体电化学传感器构造与检测原理

在生物大分子，甚至有机物等待测物检测的各种技术中，电化学法是将生化信号转换为可记录电信号定量或定性检测目标物的方法^[37]。相较于外泌体的常规分析方法通常依赖昂贵的设备、繁琐的前处理与标记过程，电化学法具有实时检测、灵敏度高、仪器操作简单、成本低以及良好便携性等优势^[38-40]，因而构建集成系统容易，更便于进行即时检测（Point-of-care testing，POCT）^[41-42]。然而，外泌体几乎无电活性，需借助特异性且高亲和力的识别探针（如抗体、适配体等）进行捕获或信号标记。适配体的作用模式与抗体相似，但具有更优的化学稳定性、设计灵活性以及易于化学修饰^[43-44]。因此，将适配体与电化学检测技术相结合，利用适配体特异性识别外泌体标志物的特性、各类适配体信号放大策略等，使适配体电化学传感器检测外泌体具有高的灵敏度和选择性，更有利于癌症早期筛查时低丰度外泌体的精准定量检测^[45]。目前，适配体电化学传感器的主要构造及检测原理如下：适配体作为识别元件被固定在工作电极表面，能够特异性识别并结合目标物质。当适配体与目标物相互作用后会诱导适配体发生构象变化，进而改变电极-电解质界面的电荷转移总量与电荷传质速率，体系对应的电流、阻抗等电化学信号随之产生特征变化，借助伏安法、电化学阻抗谱即可完成定量检测^[46-47]。将适配体电化学传感器与各种信号放大技术结合以放大信号，部分情况下甚至无需固定适配体，其构象变化也更灵活多样^[48]。适配体电化学传感器有易于小型化、集成化、响应速度快、经济高效等优势^[49]，结合适配体的特异性以及电化学法的优势能够构建相对简便的检测系统，因此在外泌体的分析中广受研究者青睐。

3 适配体电化学传感器检测外泌体的模式

在适配体电化学传感器中，适配体常作为特异性识别元件被集成到电化学传感界面，与目标物作用后反馈可量化评估的电化学信号。根据识别外泌体特征标志物（蛋白质以及miRNA）后产生信号的方式，可将适配体电化学传感器检测外泌体的模式分为直接作用型、夹心型、逻辑门式等（表2）。

3.1 直接作用型

在多数情况下，适配体被直接修饰在电极表面，依靠适配体对外泌体上标志物（蛋白、脂质等）的识别来捕获外泌体，即可简单快捷地实现外泌体的检测。Wang等^[50]将富含鸟嘌呤碱基的SYL3C适配体固定在金电极上，利用鸟嘌呤碱基与亚甲基蓝（Methylene blue，MB）的特异性亲和力来大量吸附MB，从而产生较强的电化学信号。当SYL3C适配体特异性识别上皮细胞黏附分子（Epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）阳性外泌体，既阻碍了MB与鸟嘌呤的结合，又抑制了MB向金电极的电子转移，电化学信号降低（图1Ⅰ）。该方法简化了操作步骤，无需信号放大策略即可超高灵敏检测EpCAM阳性外泌体，检出限为234 particles/mL。除核酸适配体外，肽适配体也被用于外泌体的分析。Xiao等^[51]以肽核酸（Peptide nucleic acid，PNA）探针功能化的锥形纳米通道特异性捕获胰腺癌外泌体miRNA-10b，依据PNA与miRNA杂交后提高纳米通道内壁电荷密度，引起通道离子电流上升，从而实现无需任何信号放大即可灵敏检测外泌体miRNA。此外，PNA的中性特性极大屏蔽了杂交链的静电排斥，提高了miRNA-10b的捕获效率。然而，精准控制适配体在电极表面的取向和排列密度比较困难。适配体核酸序列相互交织，导致自组装层存在非特异性吸附和表面拥挤效应，极大降低了适配体与靶标的结合效率^[52-53]。为解决这个问题，设计结构稳定且机械刚性的多面体纳米结构，可以最大限度地减少相邻适配体间的纠缠和拥挤，提高适配体与靶标的识别自由度^[54-55]。例如，Jiang等^[56]提出一种携带分化簇63（Cluster of differentiation 63，CD63）适配体的四面体DNA（Tetrahedral DNA，TDNA）微电极传感器，辅以具有半导体特性的聚多巴胺（Polydopamine，PDA）涂层，用于A549细胞来源的肿瘤外泌体的超灵敏电化学检测。Apt-TDNA兼具稳定刚性骨架和可控固定取向，确保了悬浮外泌体的有效捕获（图1Ⅱ）。外泌体表面沉降的PDA涂层可进一步放大电化学响应信号，从而实现单颗粒外泌体的检测，采用电化学阻抗谱（Electrochemical impedance spectroscopy，EIS）检测时的检出限约14 particles/mL，差分脉冲伏安法（Differential pulse voltammetry，DPV）可达6 particles/mL。在直接作用型中，适配体可简便快速地捕获外泌体，输出整体信号。然而，该方法无法有效应对外泌体的表型异质性与来源异质性，具体表现为：单一适配体对外泌体识别和捕获的特异性较差，无法区分阳性、不同细胞来源或不同功能的外泌体亚群；同一标志物在不同外泌体上表达量存在显著差异，输出信号为群体平均值，会掩盖外泌体亚群的特征信息；受外泌体异质性的影响，该方法易出现假阳性结果和脱靶现象，且难以消除游离蛋白及复杂基质环境的干扰。因此，直接作用型仅能满足高纯度外泌体的简单定量，不适用于精准分型及临床诊断。

分子印迹技术用于外泌体的检测具有识别捕获效率高、亲和力强、操作简单耗时短等特点^[57]。为了进一步提高该法测定外泌体的特异性，近期本课题组构建了一种利用印迹膜对外泌体特征聚糖Neu5Ac-α-（2，6）-Gal-β-（1-4）-GlcNAc（6′-SLN）的特异性吸附以及适配体对外泌体携带蛋白CD63特异性结合的双重识别策略检测外泌体的电化学发光传感器。该传感器不仅提高了定量分析外泌体的特异性，而且检出限低至641 particles/mL，可精确识别肿瘤患者和健康个体来源的外泌体^[15]。

3.2 夹心型

夹心型测定是免疫学分析中的经典方法。与夹心免疫法类似，夹心型检测模式测定外泌体以“捕获探针-外泌体-检测探针”的三明治构型较为常见。该模式两端的适配体可以特异性结合外泌体的不同位点，如脂质双分子层、膜蛋白等，从而形成稳定三元复合物，可有效降低其他物质的干扰，提高检测的准确性和特异性。Liu等^[58]利用两个片段（即split-a和split-b）组成分裂的适配体，用作特异性识别人肝细胞癌衍生外泌体表面的N-糖蛋白的元件。在4 ℃时，split-a和split-b-MB彼此靠近捕获外泌体，形成三明治识别构型，此时MB因接近电极而产生氧化还原信号，检出限为1.5 × 10⁶ particles/mL（图2Ⅰ）。高温时（37 ℃），分裂适配体失去识别能力，电极在30 s内即可快速洗涤再生利用。然而，该分裂适配体仅在低温才能保证识别特异性，无法用于常温下的快速检测。为进一步提高夹心型测定外泌体的灵敏度，常引入核酸扩增增敏策略。Zhao等^[59]提出以四路连接（DNA four-way junction，4-WJ）触发的双滚环扩增（Rolling circle amplification，RCA）辅助MB/G-四联体策略，开发了检测MCF-7外泌体的夹心型金纳米粒子修饰的电化学适配体传感器。利用适配体/外泌体/适配体夹心型设计包含CD63和MUC1的特异性适配体作用外泌体后，借助MUC1适配体上的4-WJ在RCA反应系统辅助下生成的大量G四链体来富集大量MB，从而放大电化学信号，实现外泌体的高特异性高灵敏检测，其检测限低至20 particles/mL（图2Ⅱ）。除上述夹心结构外，检测探针的识别单元还可替换为其他元件，如抗体、凝集素、肽等，利用不同组分之间的化学键、静电作用、氢键等相互作用与外泌体结合，满足多样化检测分析需求^[60-62]。An等^[63]构建了CD63适配体-外泌体-巯基苯硼酸（Mercaptophenylboronic acid，m-PBA）识别外泌体糖蛋白的夹心型比率型电化学传感器。捕获外泌体的CD63适配体-SiO₂-FcNHSSNH₂探针通过主-客体识别连接在氧化石墨烯-葫芦[7]脲（Graphite oxide-cucurbit[7]uril，GO-CB[7]）修饰的GCE上，作为内参电化学信号。探针m-PBA-SiO₂@Ag作为定量信号，通过硼酸亲和作用结合到外泌体表面糖蛋白的顺式二醇结构上。此时，SiO₂表面携带大量的AgNPs可有效增强电化学信号，其检出限为368 particles/μL。内部参比分子的引入以及信号放大机制，改善了检测信号的灵敏度和准确度。除外泌体膜蛋白检测外，针对外泌体内源miRNA的夹心传感体系也得到开发。外泌体miRNA与肿瘤恶性发生和发展高度相关，其丰度低、尺寸小（18~24 nt），受外泌体磷脂双层保护，导致准确定量超低水平miRNA是巨大的挑战^[64]。通常，研究者们先分离外泌体，再以适配体捕获裂解外泌体所释放miRNA进行检测^[65-66]。然而，Liu等^[67]采用相反的策略，先裂解外泌体释放miRNA-21，利用PNA和球形核酸（Spherical nucleic acid，SNA）协同作用miRNA-21，构建了PNA-miRNA-21-SNA的夹心型电化学微小RNA传感器，检出限为49 amol/L。其中，电荷中性短序列PNA（10 nt）相较于负电荷的DNA具备更优异的结合效率，可快速与miRNA-21（负电荷）的结构域特异性杂交，避免了PNA的分子内自杂交和序列排斥现象。同时，吸附了大量电活性标签[Ru（NH₃）₆]³⁺的SNA纳米探针二次标记miRNA-21，增强了检测的灵敏度和特异性。夹心型策略在一定程度上缓解了异质性干扰问题。依靠两种标志物的共表达，有效排除了仅表达单一标志物的无关颗粒，从而特异性富集特定双阳性外泌体亚群，显著降低正常外泌体的背景干扰。然而，该策略的输出信号仍为群体平均信号，无法解析单个外泌体的标志物组合和表达异质性；对两种标志物呈低共表达的亚群，检测灵敏度不足，漏检问题依然存在；来源不同的外泌体之间存在标志物种类的交叉，导致筛选特异性标志物靶点难度较大，获取的病理信息较少。因此，夹心型检测策略多适用于临床样本中特定外泌体亚群的富集，用于半定量分析与初步分型。

3.3 逻辑门式

逻辑门是通过接收一路或多路布尔输入信号后，输出单一布尔响应来完成布尔逻辑运算，其主要利用功能DNA模块（适配体、DNA i-基序、DNA三链体、DNA酶等）的组合设计，可在分子尺度完成两种及以上靶标信号的协同逻辑运算，通过输出相应的逻辑信号进行目标物的分析检测^[68-69]。逻辑门具有简单可靠的信息处理模式，其分析效率高，检测过程简单、可编程调控、扩展性强、获取病理信息丰富。同时，利用多重标志物的逻辑关系更有利于外泌体类型及亚群的鉴定，还可以有效降低外泌体异质性带来的干扰，在生物医学分析领域具备极大优势，特别是对高异质性外泌体亚群及其生物标志物（蛋白质、miRNA等）的逻辑分析，可实现灵敏且准确地鉴定癌细胞和疾病诊断^[70-71]。Yu等^[72]报道了一种双适配体辅助的AND逻辑门，结合循环酶促信号放大策略实现肿瘤来源外泌体的高灵敏定量检测。仅当两个发夹适配体HP1（靶向蛋白酪氨酸激酶 7（Protein tyrosine kinase 7，PTK7））和HP2（靶向前列腺特异性膜抗原（Prostate-specific membrane antigen，PSMA））同时特异性结合T淋巴细胞外泌体时为信号输入，才能启动限制性核酸内切酶对发夹适配体与连接子DNA形成双链的循环切割，进而形成大量电活性的G-四链体/血红素复合物，输出真正信号“1”，达到920 particles/μL的检出限。这一策略极大提高了表面蛋白识别的准确性和外泌体检测的抗干扰能力。另一方面，在肿瘤的发生和发展中，miRNA存在于不同来源的外泌体内，或者多种miRNA共存于同一来源外泌体中^[73-74]。多信号输入的多逻辑系统对不同miRNA靶标组合的综合分析，能有效降低误诊率和脱靶现象。例如，Yang等^[75]利用碳纤维布/石墨烯壁（Conductive carbon fiber cloths/graphene walls，CFC/GW）组成的柔性传感基板，并与DNA四面体（DNA tetrahedron，DNA-Te）辅助生物平台集成“AND”和“OR”的布尔逻辑门，实现了复杂混合样品中的外泌体miRNA-155和miRNA-21的准确识别和检测，检出限分别为34.5和19.4 amol/L（图3）。然而，这种离散性分析靶标虽然保证了靶标的特异性，却很容易忽略生物分子之间的潜在逻辑联系，从而引发假阳性结果，增加检测耗时，也不利于外泌体的分类分型。为此，构建外泌体多靶标并行协同逻辑分析体系，如“多对一”模式，对研究肿瘤的复杂关联具有重大意义。Sun等^[76]以3种特异性蛋白质（CD63、PTK7和PSMA）作为信号输入，仅当T淋巴细胞外泌体存在时，分别识别上述蛋白质的发夹适配体同时发生构象变化时，特异性序列得到释放，并参与触发酶的循环剪切，导致二茂铁（Ferrocene， Fc）的伏安响应降低，对外泌体的检出限为15 particles/μL。这种“多对一”的AND逻辑分析模式，精确、高效、高选择性，尤其适合复杂环境中异质性外泌体及其标志物的精准分析，能够更系统地掌握和区分外泌体之间的细微差异，在肿瘤类型诊断以及外泌体亚群区分等临床场景中具备广阔应用潜力。综上所述，逻辑门式传感策略是目前应对外泌体异质性干扰极具潜力的检测方案，能实现外泌体亚群的精准识别，甚至可在单颗粒水平通过逻辑判断识别特定组合阳性亚群，大幅削弱异质性干扰，满足外泌体分子分型的需求。然而，存在诸多亟待解决的局限，包括不同靶标的空间分布受细胞膜流动性影响，导致邻近连接反应的重复性不佳；探针设计繁琐，所需核酸探针数量多，提升实验操作难度；多标志物同步识别易造成信噪比衰减，需搭配信号放大策略；对多种外泌体亚群同时检测的兼容性欠佳等。

4 适配体电化学传感器检测外泌体的信号放大模式

外泌体本身基本不具备明显的电化学活性，因此，外泌体检测多采用间接策略，依靠读取识别探针的电化学信号实现定量。在外泌体的检测中，尤其是在肿瘤早期，肿瘤外泌体的浓度极低，产生的特征信号微弱。再者，测量探针产生的信号时，其检测灵敏度也受限于复杂的介质环境^[77]。因此，在低丰度外泌体的分析检测中，在保证特异性识别外泌体的前提下，适当的信号放大策略可以为外泌体的极微量检测提供更好的灵敏度。目前，在外泌体检测中引入的信号放大模式包含DNA步行器信号放大、成簇规律间隔短回文重复序列及其关联蛋白（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR-associated proteins， CRISPR-Cas）系统介导信号放大、邻近杂交连接信号放大、等温核酸扩增以及酶循环扩增等（表3），总览图如图4所示。

4.1 基于DNA步行器的信号放大

DNA步行器是一种创新的分子机器，凭借其独特的货物装卸、自组装和仿生运动能力，在生物传感器领域应用广泛^[78-79]。其工作原理是DNA行走链沿着预先设计的纳米级轨迹自主运动，行进过程中持续切割、释放大量可用于信号放大的功能核酸分子。尤其需要指出的是，由适配体识别靶点后触发的DNA步行器在外泌体分析中已得到应用^[78]。Wu等^[80]构建一种带有四元G-四链体、摆臂空间位置可控的固定式DNA步行器。当外泌体被DNA步行器上的CD63适配体捕获后，激活摆臂链循环与电极表面的G-四链体杂交，形成限制性内切酶的切割位点以连续释放更多Fc标记的DNA片段，导致电化学信号明显降低，对MCF-7外泌体的检出限为1.88 particles/μL。然而，固定化DNA步行器的有限扩散会降低行走过程的效率，延长检测耗时。外泌体膜具有流动性，可以用来提高DNA步行器反应效率。Fang等^[81]利用脂质体纳米探针识别表面表达的人表皮生长因子受体2（Human epidermal growth factor receptor 2，HER2）和表皮生长因子受体（Epidermal growth factor receptor，EGFR），有效地与乳腺癌外泌体融合，从而为DNA步行器创建3D轨迹。随后，通过靶向HER2将行走探针募集到融合囊泡的表面，激活DNA步行器以释放脂质体中的大量电活性标签，从而产生显著增强的电化学信号（图5）。该方法不仅可以精准识别和捕获具有特定亚型特征的乳腺癌外泌体，有效减少对非目标外泌体的干扰，还提高了DNA步行器的反应速率，从而极大提高了检测灵敏度。此外，蛋白酶/脱氧核酶反应常与DNA步行器耦合，利用酶促反应推动链剪切，可显著提升步行效率，其轨道周转速率相较仅依靠杂交驱动的DNA步行器高出约3个数量级^[82]。Zhang等^[83]构建了一种基于脱氧核酶（Deoxyribozyme，DNAzyme）诱导的DNA步行器和酶催化扩增策略的均相便携式电化学传感平台，用于识别乳腺癌中的外泌体。通过双适配体探针（黏蛋白1（Mucin 1，MUC1）和HER2）对外泌体的同时识别诱导酶促裂解，DNA步行器的连续运动促进大量底物链的裂解，以此释放大量含葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase，GOx）的DNA片段，进而催化过量葡萄糖产生大量H₂O₂，产生强氧化还原电化学响应，对HER2阳性乳腺癌外泌体的检出限为3.63 × 10⁴ particles/mL。该方法准确度高、特异性强，避免了电极的复杂修饰过程，极大地简化了实验步骤。

4.2 CRISPR-Cas系统介导信号放大

CRISPR-Cas系统是一种具有核酸靶向能力、生物相容性、可编程性、序列特异性及多功能性等显著优势的尖端检测工具，可用于检测核酸到非核酸（如代谢物、蛋白质、外泌体和金属离子）的不同分析物^[84-85]。该系统以CRISPR相关的Cas蛋白与靶标的核苷酸序列（间隔序列）精确匹配的CRISPR RNA（crRNA）结合，利用酶促过程精准制导到核苷酸序列的原间隔邻近基序（Protospacer adjacent motif，PAM）裂解目标核酸^[86]。根据Cas蛋白类型的不同，其切割的类型和位点也不同，如Cas9对含5′-NGG-3′的序列可以单链向导核糖核酸（Single guide RNA，sgRNA）顺式切割双链脱氧核糖核酸（Double-stranded deoxyribonucleic acid，dsDNA）；Cas12a可识别“TTTN”位点实现顺式切割dsDNA或单链DNA（Single-stranded deoxyribonucleic acid，ssDNA），对于靶激活的Cas12a则可以反式切割非特异性ssDNA；Cas13a作为以crRNA引导的ssDNA靶向切割酶表现出对ssDNA靶标的顺式切割和对附近ssDNA的反式切割^[87-89]。基于此，研究者常借助CRISPR-Cas系统对序列的强大切割性能，作为信号放大的工具来提高分析灵敏度。例如，Sha等^[90]报道了一种可编程的DNA燃料电化学传感器检测程序性死亡配体1（Programmed death-ligand 1，PD-L1）外泌体。利用磁珠捕获PD-L1外泌体后，并用胆固醇修饰的发夹适配体再次与外泌体相互作用。随后，可编程DNA合成从发夹模板触发的引物交换反应，生成大量延伸产物，激活CRISPR-Cas12a的反式切割活性，加速电活性MB标记的信号链的降解。最后，利用修饰CB[7]的电极富集MB后定量测定，其检出限为708 particles/mL。与Cas12a和Cas13a相比，Cas14a识别并切割靶ssDNA实现信号扩增无需依赖PAM序列^[91]。Gao等^[92]将生物素修饰的EpCAM适配体与其互补链P1杂交，并与链霉亲和素（Streptavidin，SA）修饰的磁性纳米颗粒结合。当鼻咽癌衍生外泌体存在时，适配体优先与外泌体EpCAM结合并置换释放P1到上清液中。磁分离后，游离P1在末端脱氧核苷酸转移酶（Terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT）作用下发生延伸，形成poly-T结构。随后，crRNA和Cas14a的引入与长链poly-T结合，激活Cas14a的反式切割活性，使其随机剪切电极表面修饰的MB标记DNA探针，导致电化学信号降低。TdT延伸后，单个P1可以结合并激活多个Cas14a，每个Cas14a可以切割多个报告探针，实现Cas-TdT信号的级联扩增，其检出限低至80 particles/mL。该方法利用TdT和CRISPR/Cas14a的协同作用，实现了“一对多”的扩增效果，由此在极低外泌体丰度下也能完成定量检测。尽管CRISPR-Cas系统在外泌体的分析上取得了一定进步，但实现外泌体多靶标的同时检测仍有挑战，如Cas相关蛋白的无差别侧支切割活性易造成非靶标干扰信号，难以实现各靶标信号有效区分；未扩增CRISPR-Cas系统的灵敏度受Cas蛋白动力学影响；CRISPR-Cas系统与各类等温核酸扩增体系的兼容性问题也亟待解决。

4.3 基于邻近连接策略的信号放大

邻近连接测定（Proximity ligation assay，PLA）是依赖一对邻近探针实现对靶分子/细胞的同步识别技术，具有特异性高、响应速度快的优势^[93-94]。如今，PLA已成功应用于外泌体及其标志物的选择性检测。在外泌体的微小核糖核酸（microRNA，miRNA）的检测中，往往需要先裂解外泌体，再经过miRNA提取、富集以及信号放大等多个步骤，才能实现灵敏检测。为了简化检测步骤，Shi等^[95]利用适配体功能化的二聚体框架核酸（Framework nucleic acid，FNA）纳米平台实现了外泌体的高效捕获以及内部miRNA的灵敏检测。FNA一端的截角四面体框架核酸（Truncated triangular pyramid，TTP）- Apt-CD63用于固定外泌体。裂解外泌体后，邻近的TTP-pro可快速在局部高浓度环境下捕获释放的内部miRNA-21，形成负载氯化血红素共价修饰球形核酸酶的Y形连接结构，以此增强鲁米诺-H₂O₂体系的电化学发光信号，实现外泌体miRNA-21的超灵敏检测，检出限低至4.27 amol/L（图6Ⅰ）。受益于FNA结构的邻近效应，避免了裂解后miRNA的分散稀释，极大提高了捕获miRNA的效率；同时，在检测过程中也不需要额外的外泌体miRNA提取程序或miRNA扩增策略即可在同一界面上完成超灵敏检测。在外泌体的分析中，确定外泌体的种类来源以及肿瘤发展的程度，会提高肿瘤的靶向治疗和预后监测水平。Yang等^[96]通过两个邻近适配体探针对共存于BT474外泌体表面标志物HER2和表皮生长因子受体（Epidermal growth factor receptor，EGFR）的特异性识别，当两组邻近探针共定位结合于同一外泌体表面时，触发无铜点击化学反应进行末端连接形成T结构域，该区域启动DNA机器引发催化发夹组装和CRISPR-Cas12a介导的反式切割，最终产生显著的MB电活性信号（图6Ⅱ）。该方法的线性范围为1.0 × 10³ ~ 1.0 × 10⁷ particles/mL，检出限低至985 particles/mL，还能达到区分特殊亚型的乳腺癌患者和肿瘤分期的目的。然而，外泌体膜具有流动性，膜表面标志物间距动态可变，易导致双探针邻近结合效率不稳定，进而降低检测信号的准确度与重复性。

4.4 基于等温核酸扩增技术的信号放大

为了提高分析外泌体的灵敏度，各种等温核酸扩增技术，包括杂交链式反应、滚环扩增、链置换扩增、催化发夹扩增、熵驱动扩增已被引入电化学传感体系用于信号放大。通常，需要特定序列在适配体结构的上游或下游引入信号触发序列，当目标被识别后，会诱导信号触发序列发生结构或构象变化，暴露信号触发序列并参与后续扩增循环，进而产生或募集更多的信号分子，达到信号放大的目的。

4.4.1 杂交链式反应

杂交链式反应（Hybridization chain reaction，HCR）是一种无酶等温信号放大技术，通过引发链触发两种发夹探针发生自主级联杂交，组装成长链聚合物，在实现信号放大的同时有效避免了交叉污染。Liu等^[97]通过HCR进行信号放大，开发了新型的无标记、无酶纸质生物传感器用于外泌体测定。在纸面修饰的Zr-MOFs通过配位作用捕获外泌体。随后，利用CD63适配体再次识别外泌体，触发DNA探针构象变化启动HCR扩增，产生的更多携带血红素/G-四联体DNAzyme的dsDNA纳米线参与催化氧化3，3′，5，5′-四甲基联苯胺（Tetramethylbenzidine，TMB），降低TMB的电化学信号响应，其检出限为5.0 × 10³ particles/mL。不过，配位识别捕获外泌体的特异性不高，可能存在假阳性结果。尽管HCR因其高效的等温扩增和结构灵活性而成为一种强大的分子工具^[98]，但单一线性HCR扩增能力有限，灵敏度增强不足，反应时间长，制约了其实际应用。随后，一些依靠多线性HCR增强灵敏度的策略被相继开发。Zhang等^[99]开发了一种利用一锅法均相、快速反应的电化学传感器，用于检测肿瘤衍生的外泌体。当外泌体存在时，依靠适配体对肿瘤外泌体上的EpCAM的高亲和力识别，触发随后的三向HCR（Three-directional HCR，tHCR）来调节DNA纳米球（Cu²⁺@DNA-AN）的解聚。以Cu²⁺作为信号探针，在1 h内对肿瘤外泌体进行量化。源于该系统中的tHCR驱动的无酶扩增、DNA纳米球解聚介导的Cu²⁺释放，实现指数级信号放大检测外泌体，检出限低至30 particles/mL。Wang等^[100]基于多方向杂交链反应（Multidirectional HCR，mHCR）进行信号放大实现外泌体的灵敏检测。外泌体被EpCAM适配体捕获后，胆固醇修饰的H型DNA单元1（cH1）能够将胆固醇插入外泌体脂质双层并锚定在外泌体膜上。当存在H形DNA单元1（H1）和H形DNA单元2（cH2）时，在cH1处进行mHCR，以形成较大的DNA纳米结构来募集多个辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase，HRP）进行电化学信号放大。该方法设计的mHCR简单高效，结合胆固醇与外泌体的便捷连接方式即可输出极为灵敏电化学信号，检出限低至285 particles/μL。

4.4.2 滚环扩增

RCA以小型环状寡核苷酸（长度为25~100个核苷酸）充当DNA或RNA聚合酶扩增模板，连续产生长链串联重复的核酸产物，实现环状模板序列的高效线性扩增^[101]。这些含有特殊序列单元的串联重复产物，可与信号报告探针杂交，或直接作为原位检测探针，从而输出可检测的信号变化。Hashkavayi等^[102]以CD63适配体靶向捕获外泌体后，利用与引物序列结合的两种特异性适配体（EpCAM和HER2）分别作为各自触发等温RCA的引发剂，从而生成大量含有金属离子结合序列的多鸟嘌呤和多胸腺嘧啶重复片段。这些片段与Cu²⁺和Pb²⁺复合后会产生强烈的电化学信号，通过DPV测量这些金属离子的信号，即可在约3.75 h内实现外泌体EpCAM和HER2的同时检测。Zhang等^[103]构建了耦合引物交换反应（Primer exchange reaction，PER）和RCA双重信号放大策略的电化学生物传感器，用于外泌体的高灵敏度检测。外泌体被CD63适配体特异性捕获，DNA链（T）通过链置换反应释放。然后，T链引发PER反应，产生了大量短链DNA（P），在电极表面进行RCA反应。结合在电极表面的大量HRP催化邻苯二胺（o-Phenylenediamine，o-PD）氧化，获得灵敏的还原电流信号，实现外泌体的定量检测，其检测限为22 particles/μL。

4.4.3 链置换扩增

链置换扩增（Strand displacement amplification，SDA）是以靶标miRNA为触发启动因子，依托包含与靶标互补的序列和特异性酶切缺口的DNA模板，通过聚合酶链延伸和切口酶切割的循环反应，该反应可产生数倍于目标产物的扩增产物，显示出较高的扩增效率^[104-105]。Cheng等^[106]利用级联立足点介导的链置换反应来激活由靶标miRNA-21触发的分子机器，生成生物素化和巯基修饰的双链DNA，稳定修饰于金电极表面（图7Ⅰ）。随后通过链霉亲和素-生物素结合将预制的生物素化TDNA介导的杂交链式反应探针与电极连接，TDNA吸附大量电活性的[Ru（NH₃）₆]³⁺，产生强大的电化学信号。该方法在无酶情况下即可实现三重扩增的信号放大，传感器对外泌体miRNA-21的检出限低至0.43 fmol/L。Zhang等^[107]构建了耦合链置换扩增SDA和HCR信号放大的电化学适配体传感器，用于肿瘤外泌体的高灵敏检测。通过适配体捕获和磁分离，将外泌体浓度转化为DNA（T）。置换的DNA（T）与另一条DNA链（AP）结合，然后发生SDA反应。反应后将得到的DNA片段（P）捕获在金电极表面，并通过HCR延长dsDNA链。在生物素和链霉亲和素的相互作用下将大量的HRP分子连接到电极表面，催化邻苯二胺的氧化，从而产生还原电流响应，最终达到的检测限为18 particles/μL。该方法具有高灵敏度、高准确度的优点，也可用于特异性检测其他肿瘤标志物，但反应时间长，双扩增结合的操作步骤较为繁琐。

4.4.4 其他扩增方法

催化发夹扩增（Catalytic hairpin assembly，CHA）是基于两个DNA发夹结构，在引发剂探针存在的情况下，发夹打开并通过立足点介导的链位移形成大量DNA双链，从而放大信号。传统的CHA效率低，灵敏度仍有待提高^[108]。Zhu等^[109]报道了一种简单的类涡轮局部催化发夹组件（Turbo-like localized catalytic hairpin assembly，TL-CHA）用于外泌体miRNA-1246的测量。附着在AuNPs表面的引发剂分子通过HCR促进L1和L2链的杂交，形成DNA纳米线-AuNPs复合物。随后，将CHA底物发夹H1和H2结合在DNA纳米线-AuNPs复合物上，从而形成TL-CHA。当外泌体miRNA-1246被识别后，CHA会被激活，随后在发夹上暴露被堵塞的C位点并释放目标。同时，TL-CHA底物为三维分布，还可以激发相邻的CHA系统，极大增加触发CHA底物的概率，加快结合电极表面的捕获探针后富集更多的[Ru（NH₃）₆]³⁺，产生强烈电化学信号。该传感器仅需30 min即可完成检测，对外泌体miRNA-1246的检出限低至5.24 amol/L。同时，因CHA级联扩增提供了丰富的信号捕获位点，显著提高了电化学信号的响应。

熵驱动扩增（Entropy-driven amplification，EDA）是一种无酶等温扩增反应，利用反应体系中额外释放寡核苷酸引起熵增加的热力学推动，促进反馈回路的信号放大，使其非常适合灵敏检测^[110-111]。Deng等^[112]通过熵驱动的自催化DNA电路（Entropy-driven autocatalytic DNA circuit，EADC）构建了灵敏检测卵巢癌衍生外泌体的电化学生物传感器。EADC电路由适配体/输入探针（Aptamer/input DNA probe，AID探针）、辅助探针/核酸酶（Supporting probes/DNAzymes，SPD探针）、输入DNA类似物含有发夹底物（Input DNA-analogue-contained hairpin substrates，ICHS）和靶外泌体组成。当外泌体存在时，AID探针结合外泌体MUC1并释放DNA，这些DNA作为燃料与SPD探针之间发生链置换反应，形成输入DNA/支持探针复合物，并伴随着SPD探针中两个DNAzyme序列的释放。此后，DNA酶切割在电极表面修饰的ICHS并释放输入的DNA类似物。另一方面，释放的DNA作为新的燃料启动新一轮链位移反应并使反馈电路闭合，循环切割ICHS探针，然后产物将反馈给电路。固定在ICHS3′端的MB会随着输入DNA类似物的释放而远离电极表面，引起电化学信号衰减，其检出限低至30 particles/μL（图7Ⅱ）。该方法灵敏度高，却易受游离蛋白的干扰，影响信号的特异性。

靶点触发的酶循环扩增也是提高传感器灵敏度的有效办法。如核酸内切酶可识别dsDNA的短特异性序列，并在固定位置仅切割一条特定链，通过使用模板触发的酶回收切割来提高灵敏度。Sun等^[113]使用循环切口酶切割和HCR进行双信号扩增来检测肿瘤细胞来源的外泌体。在外泌体存在下，发夹适配体探针（Hairpin aptamer probe，HAP）与外泌体膜上靶蛋白PTK7特异性结合，导致HAP构象变化以促进HAP与接头DNA之间的杂交。触发了切口核酸内切酶对接头DNA的循环切割，即使少量外泌体也能产生大量切割DNA片段引发HCR，实现在电极表面形成长的DNA双螺旋来吸附更多的电活性物质[Ru（NH₃）₆]³⁺，产生强的电化学信号，其检出限低至1.1 × 10⁴ particles/mL。相较于天然酶的成本高、耐久性差、易失活等缺陷，模拟酶成本低、易制备、化学稳定性好、可重复使用性高。例如，Li等^[114]利用MIL-88@Pt@MOF-88纳米酶的级联引物交换反应（Primer exchange reaction，PER）的电化学策略，用于超灵敏检测外泌体miRNA-21。仅包含门控发夹，引物和DNA聚合酶的目标触发的PER可以自主和等温扩增的方式产生长单链DNA。然后，新生链释放用于阻断捕获探针的保护子B，导致纳米酶与传感界面结合。以纳米酶的催化过氧化氢分解，从而产生放大的电化学信号。受益于级联PER和多层纳米酶的显著催化活性，该传感器显示出极高的灵敏度，其检测限低至0.29 fmol/L，实现了精准区分单碱基错配的同源miRNA。然而，酶扩增技术的扩增效率受底物的随机扩散、探针浓度变化和潜在的副反应等因素制约，导致反应时间较长。将聚合酶采用合适的局部空间限制或包埋，可加快酶活性释放以及底物接触效率。采用上述信号放大策略虽大幅提高了适配体电化学传感器检测微量外泌体的灵敏度，但扩增后的适配体信号产物在工作电极表面往往存在较大的空间位阻，甚至可能出现团聚或交叉，进而掩盖部分信号，影响信号真实值。同时，繁琐而冗长的扩增步骤会增加分析外泌体的时间成本，不同信号放大模式的优缺点见表4。

5 结论与展望

本文围绕适配体电化学传感模式的构建、信号放大策略，综述了近年来适配体电化学传感器检测外泌体的进展和应用。由于适配体电化学传感器集成了高特异性亲和的适配体与高灵敏的电化学检测技术，为外泌体的定量分析、亚型分类及分期研究提供了有力工具。相较于设备昂贵、操作要求高的传统检测方法，以及灵敏度低、易受环境因素影响的比色分析，适配体电化学检测技术灵敏度高、设备较为简单、操作简便，适合实验室和临床诊断。然而，解析外泌体的异质性仍是分析过程中面临的核心难题。目前，在复杂的实际分析环境中（血清、血浆、尿液等），外泌体的表型异质性以及临床样本的复杂介质，导致混合外泌体亚型的信息模糊，难以准确区分不同来源的外泌体。同时，外泌体的时空异质性也增加了其动态行为和细胞间通信调控的复杂性，内容物种类与丰度呈动态变化，影响定量检测外泌体及其标志物的准确性和时效性。另外，外泌体的检测通常需要复杂的样本预处理步骤，如分离、纯化和富集，这增加了检测的复杂性和成本，也会破坏外泌体的完整性，造成特征标志物泄露，甚至成为潜在干扰。肿瘤早期的外泌体丰度极低，经多步预处理后有效靶标损耗显著。同时，预处理步骤也缺乏统一的标准化方法，导致不同研究之间的结果难以比较。因此，在现阶段，采用适配体电化学法，实现快速、便捷、动态地精准监测外泌体是极具挑战性的。

大量的研究已经表明，仅靠单一或多个适配体所能提供的信息远远不足以准确鉴定外泌体的具体特征，标志物的交叉极易导致假阳性结果；适配体识别外泌体时还可能发生脱靶或者团聚，严重干扰信号反馈的真实值。同时识别多种标志物，是一种更可靠的分析策略，通过整合不同标志物之间的逻辑关系，可有效提高检测的系统性和精准度。因此，筛选结构稳定、靶向特异性强且系统识别多种标志物的适配体显得尤为重要。近年来，人工智能、机器学习、计算建模等新兴技术正在不断改善适配体的设计、结构、功能。例如，机器学习可高效高通量测序筛选高亲和力适配体，分子对接和分子动力学模拟可以预测适配体-靶标结合构象，确定其亲和力和热力学稳定性等，从而加速适配体的筛选和创造。然而，随着疾病的不断演变，外泌体也在动态变化，基于大数据结合人工智能的靶位预测同样至关重要。

适配体电化学传感器的临床转化得益于多种技术的协同支持。例如，微流控技术结合电化学检测，可实现外泌体的自动化、高通量分析；适配体电化学传感器与电化学发光等光学方法联用，则能提高在复杂样品中检测低丰度外泌体的性能。然而，适配体电化学传感器的临床转化，仍面临标准化生产、质量控制及规模化制备等挑战。尽管如此，该技术在临床外泌体分析中的发展态势依然积极，有望在未来成为外泌体检测和临床诊断的重要工具。

适配体电化学传感器检测外泌体的最终目标是服务于临床需求。然而，不同临床场景对传感器性能的要求差异显著，“通用型”传感器往往无法同时满足所有应用场景。根据临床任务的实际需求及现有研究进展，可将检测性能指标与以下三类典型应用场景相关联：（1）早期筛查：需优先保障低假阳性率和高特异性，避免交叉反应，同时兼顾批次一致性与可规模化能力。早期筛查面向无症状或高风险人群，其核心诉求是排除假阳性，避免因误诊引发不必要的侵入性检查与患者焦虑。此场景下的技术瓶颈包括：临床样本（如血清、尿液）中非特异性干扰严重，易产生假阳性信号；大规模应用要求传感器制备工艺可标准化与可放大性。因此，可在适配体传感器中引入抗污染界面（两性离子材料或PEG共修饰）、内参校正（双通道检测）、免扩增直接检测策略，以降低操作复杂性与成本；（2）肿瘤分型与伴随诊断：需突出多种标志物并行检测能力、特异性证据链与独立队列验证。肿瘤分型（如区分不同来源的外泌体）和伴随诊断（如检测与靶向治疗相关的突变蛋白），要求传感器不仅能识别外泌体是否存在，更要明确其细胞来源及携带的特征分子标志物。此场景下的优先性能指标包括多种标志物并行检测能力、高特异性（区分同源蛋白的细微差异）、临床验证强度（如独立队列与盲法测试）。针对单一适配体难以区分高度同源膜蛋白标志物、多靶标同时检测存在交叉干扰，以及肿瘤异质性导致单一标志物不足以准确分型等挑战，可尝试利用多通道电极阵列（集成针对不同标志物的适配体）、逻辑门传感（如“AND”逻辑门，仅当两个标志物同时存在时输出信号）、正交验证（结合质谱或Western blot进行平行验证）；（3）疗效监测与复发预警：需覆盖足够宽的动态范围（从治疗响应到进展的全范围浓度变化），保证重复采样一致性（批内/批间变异系数CV < 10%）与时间序列稳定性（传感器在多次使用或长期储存后性能不显著衰减）。然而，同一患者的样本间可能存在生理波动，传感器在多次检测或再生后易出现性能漂移，外泌体浓度在治疗过程中可能发生数量级级别的变化，对动态范围提出严苛要求。此时，提高传感器的长期稳定性和测量可重复性优先于极限灵敏度。

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国家自然科学基金项目(22264010)

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Received	Published	Revised
2025-10-20	2026-07-24	2026-04-02
Online Date
2026-07-15

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