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循环肿瘤细胞及细胞外囊泡的纳米检测技术

王嘉莉 ,  朱凌 ,  王琛 ,  雷圣宾 ,  杨延莲

化学进展 ›› 2022, Vol. 34 ›› Issue (1) :178-197

PDF (6341KB)
化学进展 ›› 2022, Vol. 34 ›› Issue (1) :178-197 DOI: 10.7536/PC210346
综述
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循环肿瘤细胞及细胞外囊泡的纳米检测技术

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Nanotechnology for Detection of Circulating Tumor Cells and Extracellular Vesicles

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摘要

肿瘤液体活检通过对体液中生物标志物的检测实现疾病的精准诊断,对于恶性肿瘤的早期诊断和动态监测至关重要。循环肿瘤细胞(CTC)是肿瘤组织释放到血液中的肿瘤细胞,细胞外囊泡(EV)是由细胞分泌的膜囊泡,二者都携带肿瘤分子信息,并与肿瘤进展和转移密切相关,是重要的液体活检生物标志物,并且在检测方法和临床意义方面也有很多共性。纳米材料由于其高比表面积、独特的光、电、磁等物理化学特性以及易于功能化修饰等特点,被广泛用于CTC和EV的检测,以提高检测灵敏度和特异性,提供肿瘤形成、进展、转移和治疗反应的信息,具有很好的应用前景。本文回顾了在CTC和EV的特异性识别、高效捕获或分离、目标CTC或EV的鉴定等三方面的纳米技术进展,包括提高分子识别特异性的纳米材料表面识别探针功能化修饰以及捕获、鉴定的纳米材料和纳米技术的最新进展,总结了基于功能化纳米材料的液体活检技术的优势及挑战,为液体活检纳米技术的发展提供信息。

Abstract

Tumor liquid biopsy achieves accurate diagnosis of disease by detecting biomarkers in the body fluids which are of great importance for early diagnosis and dynamic monitoring of malignant tumors and are essential biomarkers for liquid biopsies. Circulating tumor cells (CTC) are tumor cells released into the blood from tumor tissue, and extracellular vesicles (EV) are membrane vesicles secreted by cells. Both of them carry tumor molecular information and are closely related to tumor progression and metastasis. Nanomaterials are widely used to detect CTCs and EVs due to their high specific surface area, unique optical, electrical, magnetic and other physical and chemical characteristics that can improve the detection sensitivity and specificity. Nanomaterial-based detection of CTCs and EVs has provided important information for tumor formation, progression, metastasis, and treatment response, and holds great potential in the clinical application. This article reviewes the progress of nanotechnology in three aspects: specific recognition, efficient capture or isolation, and identification of CTC and EV. It includes the functionalization of recognition probes on the surface of nanomaterials to improve the detection specificity and the latest advances in capture and identification of nanomaterials and nanotechnology. It may provide information for the development of liquid biopsy nanotechnology by discussing the advantages and challenges of liquid biopsy technology based on functionalized nanomaterials.

Contents

1 Introduction

2 Functionalized modification of CTC and EV recognition probes

3 Efficient capture of CTC and EV by nanomaterials

4 Identification and detection of CTC and EV

4.1 Signal amplification technology based on functional nanomaterials

4.2 Signal conversion technology based on functional nanomaterials

5 Integration technology of capture and detection of nanomaterials and microchips

6 POCT

7 Conclusion and prospect

Graphical abstract

关键词

液体活检 / 细胞外囊泡 / 循环肿瘤细胞 / 功能化纳米材料 / 肿瘤体外诊断

Key words

liquid biopsy / extracellular vesicles / circulating tumor cells / functionalized nanomaterials / in vitro diagnosis of tumor

引用本文

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王嘉莉, 朱凌, 王琛, 雷圣宾, 杨延莲. 循环肿瘤细胞及细胞外囊泡的纳米检测技术[J]. 化学进展, 2022, 34(1): 178-197 DOI:10.7536/PC210346
Jiali Wang, Ling Zhu, Chen Wang, Shengbin Lei, Yanlian Yang. Nanotechnology for Detection of Circulating Tumor Cells and Extracellular Vesicles[J]. Progress in Chemistry, 2022, 34(1): 178-197 DOI:10.7536/PC210346

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1 引言

“液体活检”(Liquid Biopsy)一词在2010年被首次提出,是指通过分析血液中的循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cell, CTC)和循环肿瘤DNA(Circulating Tumor DNA, ctDNA)进而获取患者肿瘤病变信息相关的新诊断概念[1]。之后,该术语被扩大到包括几乎所有肿瘤来源的循环生物标志物在内的分析,包括CTC、ctDNA、细胞外囊泡(Extracellular Vesicle, EV)、血液循环中的microRNA(Cell Free microRNA, cfmiRNA)、mRNA、长非编码 RNA、小RNA、蛋白标志物以及最近的肿瘤血小板(Tumor-educated Platelets, TEPs)等[2],并逐渐成为癌症检测可行的辅助方案。与液体活检相对应的是组织活检,是通过从患者体内切取、钳取或穿刺等取出病变组织进行病理学检查的技术,是目前进行肿瘤诊断和治疗决策的金标准。但是,组织活检也有一些不足之处:(1)组织活检需要通过手术或者穿刺获取样本,检测过程是侵入性的;(2)某些肿瘤部位很难取到标本(例如,肺、胰腺或大脑),或者手术之后的病人出现复发转移,也很难再取得转移灶的组织。(3)在临床实践中,无法对患者进行连续的组织活检以达到实时监测治疗情况的目的;(4)由于肿瘤的异质性,在进行肿瘤诊断时仅进行一次组织活检可能会遗漏与临床指征相关的重要肿瘤克隆亚群,或者仅对切除的原发肿瘤进行分析(当前肿瘤学的标准做法)所得到的信息可能与肿瘤转移灶的分子特征(基因组、蛋白组、转录组、代谢组等)存在巨大偏差,甚至在检查原发肿瘤时肿瘤转移灶还未形成可检测的肿块。此外,转移灶通常同时存在于不同器官中,并且具有很强的器官特异性和异质性。(5)该过程耗时长[3]。这些都造成组织活检的巨大挑战性以及不可及性,而正是这些诊断难题促进了“液体活检”的迅速发展[4⇓⇓~7]。相反,液体活检在这个过程中具有明显的优势:(1)非侵入性,对病人的损伤可以忽略,病人依从性高;(2)可以反复多次取样,克服由于肿瘤异质性带来的信息丢失或者偏差;(3)可以快速完成检测;(4)可以一定程度上克服同一肿瘤的异质性以及原发灶和不同转移灶的器官特异性的肿瘤异质性;(5)能够实现对疾病进展和药物反应的实时监测;(6)可以提供肿瘤治疗过程可能的药物耐药机制信息。当然液体活检也存在检测技术难度高等难点,成为临床诊断标准仍需很长的路要走。液体活检和组织活检是互补的,全面的检测可以提供不同侧面的数据信息,有望实现对癌症进行全面评估[8,9]。

循环肿瘤细胞是指由肿瘤原发灶或者转移灶脱落进入外周血液循环中的肿瘤细胞。肿瘤转移过程中,实体瘤上的上皮型肿瘤细胞通过上皮-间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)过程获得侵袭表型,摆脱原有组织的束缚,从肿瘤原发灶或者转移灶脱落,然后游离的肿瘤细胞侵袭周边基质并通过内渗作用进入血管,在血液循环中以CTC的形式存在,绝大部分CTC细胞会发生凋亡或被免疫系统清除,其中很少一部分会休眠,逃避免疫系统的监视或者化疗药物的杀灭,再经过间质-上皮转化(Mesenchymal-Epithelial Transition, MET)过程适应新的环境,形成新的肿瘤(转移灶),如图1a。大量研究表明,能够从转移性肿瘤患者血液中获得更多的CTC[10],但它们的浓度通常很低,通常为每毫升全血含有1~10个CTCs,但是却有7×106白细胞和5×109个红细胞,极易掩蔽CTC的信号[11]。因此,需要发展能够从血液中高效地分离和检测CTC的技术。到目前为止已经发展出了基于细胞尺寸、密度、介电性质、表面生物标志物等物理、化学和生物学特征的多种CTC捕获和检测技术。由于CTC的捕获和检测涉及表面、界面物理化学过程,纳米材料由于其高比表面积、独特的光、电、磁等物理化学特性以及易于功能化修饰等特点,提供了丰富的CTC高效捕获技术、检测过程中的信号放大以及转换技术,因此研究者们正在研发基于新型纳米材料或者纳米技术的CTC高效捕获和检测技术,用于CTC的临床研究。也有一些研究者认为直接在体内检测CTC,灵敏度更高,并且能实时监控体内CTC水平的变化,不需要多余的处理步骤等优势,因此也有综述介绍了CTC体内检测技术的研究进展,感兴趣的可以参考相关综述文章[12]。

细胞外囊泡(EV)是一类由细胞分泌的膜囊泡,广泛存在于各种体液中,包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁等,是液体活检的重要生物标志物[13]。不同类型的EV的分泌途径各不相同。微囊泡(Microvesicle)是由细胞直接胞吐形成,而外泌体(Exosome)的分泌是先由细胞膜内陷,形成早期内涵体,然后将细胞内的蛋白质、DNA、RNA和脂质等生物分子包裹在囊泡中形成多泡体,部分多泡体与细胞膜融合,将外泌体释放到细胞外,如图1b。根据Joural of Extracellular Vesicles的标准,将微囊泡、外泌体等统称为细胞外囊泡(Extracellular Vesicles, EV)[14,15]。在EV形成过程中,携带有来自源细胞的蛋白质、磷脂、核酸以及氨基酸和代谢物等生物信息分子[16,17],还包括一些目前被认为是EV标志物的跨膜蛋白,如CD9、CD63和CD81等[18⇓~20]。由于EV的直径在纳米尺寸范围(外泌体30~150 nm、微囊泡100~1000 nm),因此纳米技术对提高EV的捕获、分离和检测都至关重要,研究者也发展了丰富的功能化纳米材料以及新型的纳米检测技术对EV进行高效的捕获与检测。

纳米材料的生物传感器在CTC和EV检测中的应用[21⇓⇓~24],纳米材料或者微流控技术的设计以及检测原理[25,26]等可以参考相关综述和文献。纳米材料和纳米技术在CTC和EV分离以及检测方面既有共性,也有个性,在分离方面,对于生物方法来说,都是利用探针分子进行特异性识别。但也因为CTC在外周血中个数稀少且尺寸较大,需要更高灵敏度的技术,一般是先对CTC进行分离以后再进行下游分析。而EV广泛存在于各种体液中,是由细胞分泌的纳米级的膜囊泡,所以常常会采用各种技术实现放大信号的目的。另外除了利用一些金标准方法(如超速离心分离)分离以外,多数情况下会将分离和捕获同时进行,所以两者也存在明显的差别。而在检测方面,都可以对其进行表面蛋白和基因等生物信息的分析。因此本文从CTC和EV的特异性识别、捕获/分离、鉴定三个层次,分别介绍特异性识别CTC和EV表面分子标志物的识别探针的功能化修饰,功能化纳米材料或者纳米器件用于CTC或者EV的高效捕获和分离,纳米材料用于目标CTC或者EV的鉴定、分析、表征、检测等的信号增强或者信号转导,纳米材料与微流控芯片的集成化检测方法以及即时检测技术。图1c~f代表本文提到的液体活检纳米检测技术,其中图1c为表面增强拉曼技术,图1d为微流控芯片技术,图1e为纳米颗粒捕获技术,图1f为荧光纳米技术。另外本文将主要介绍功能化纳米材料用于EV以及CTC分离和分析的最新进展,而其他液体活检标志物不在本文讨论范围内,其他传统生物学方法和特殊的微流控器件设计等相关详细内容可以参考其他相关文献[27,28]。

2 CTC和EV识别探针的功能化修饰

用于CTC和EV捕获和检测的纳米材料主要有磁性纳米颗粒(Magnetic Nanoparticles,MNPs)、金属纳米颗粒、量子点(Quantum Dot,QDs)、纳米棒等。用于纳米材料功能化的识别分子主要有抗体、核酸适配体和多肽。这些分子通常会偶联到纳米颗粒或者器件的微阵列表面,以便能特异性识别CTC与EV。修饰的方法有物理吸附、共价结合或使用特定的偶联分子[29],物理吸附与离子结合的方法通常因为缺乏稳定性、需要大量的识别分子以及高成本等缺点而使其应用有限,而比较常用的方法就是利用共价偶联的方法将识别探针修饰到纳米材料或者芯片的表面。

将探针分子与纳米材料共价结合的最常见方法之一就是使用探针分子中的氨基通过酰胺化反应与材料进行偶联[29,30]。纳米材料表面的羧基在水溶性缩合剂1-乙基-3-(-3-二甲氨基丙基)碳二酰亚胺(EDC)的作用下与氨基发生缩合反应产生稳定的酰胺键——便是经典的缩合反应“碳二亚胺化学”。在该反应中EDC能够活化羧基形成一个中间体活化酯O-酰基脲,然后这个中间体再与氨基反应,使得氨基和羧基反应形成稳定的酰胺键。但是前面说到的这个中间体不稳定,会有副反应的发生,而N-羟基丁二酰亚胺(NHS)和羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)可以与中间体进一步反应,减少副反应的发生。因此单独使用EDC的单步反应特别适用于存在氨基基团而没有羧基的生物分子。而两步活化修饰方法避免了包含氨基和羧基的抗体分子内和分子间的偶联,偶联的效率更高,因此适合将抗体修饰到纳米材料上。

值得注意的是,这些氨基可能位于抗原结合区域,它们的使用可能会降低抗体的识别功效。所以一些研究者也发展了抗体的位点修饰通过高活性反应进行偶联的策略来改善抗体的取向。例如,Puertas等[31] 通过抗体多糖中的醛基(位于Fc区)与修饰在纳米颗粒的氨基相互反应形成席夫碱,将抗体修饰在纳米颗粒表面。点击化学反应,是另外一种修饰抗体的反应,例如利用1,2,4,5-四嗪(Tz)与反式环辛烯(TCO)之间的环加成反应将抗体修饰在纳米颗粒上,该类反应具有活性高、反应速率非常高和产物选择性高的优点[32]。

因为上述方法修饰的探针分子在纳米材料上的取向和结合位点具有随机性,研究者们发展了马来酰亚胺化学修饰方法实现位点特异性偶联。由于很多识别探针中都含有—SH基和—S—S—基,且极易通过Au—S键在金表面自组装成单分子层,因此可直接将连接有巯基的探针分子组装于金表面,也可先在金表面修饰末端带有功能基团的含硫化合物,再利用末端的功能基团直接或在活化剂(或偶联剂)的作用下偶联上探针分子,从而实现探针分子与纳米材料的稳定结合[33]。该种方法能够保证探针分子具有良好的取向性,但同时也存在马来酰亚胺对半胱氨酸的非选择性允许与血清中的硫醇发生反应,以及该反应需要对探针进行还原或者硫醇化,可能存在会改变抗体构象,在利用多肽中半胱氨酸通过Au—S键作用将多肽定向组装到纳米材料或者芯片表面,也会因为多肽其他位置上半胱氨酸的存在导致与多肽序列中间的半胱氨酸反应,导致取向随机等缺点[30]。

也有研究者通过生物素-链霉亲和素(Biotin-Streptavidin)的非共价方法可以在纳米材料表面定向偶联探针分子。使用生物素-亲和素相互作用最常见的方法是用生物素修饰探针分子和用亲和素或其衍生物修饰纳米材料。生物素通过以下方式定向修饰抗体的Fc区域:二硫键还原后获得的游离巯基,与马来酰亚胺-生物素反应。亲和素在pH值低于等电点(pI)时带正电,通过静电吸附可以将带负电荷的纳米材料进行功能化,获得亲和素修饰的纳米材料。然后通过生物素-链霉亲和素的高亲合力相互作用可以将多肽或抗体定向组装在纳米材料表面[30]。本课题组利用Biotin-Streptavidin方法将设计的多肽定向偶联到磁性纳米颗粒表面,多肽分别靶向上皮细胞黏附分子(EpCAM)和人类表皮生长因子受体2(HER2),可以用于高效CTC捕获,回收率最多可达90%[34,35]。

3 功能化纳米材料用于CTC和EV的高效捕获

目前根据CTC尺寸、密度、电荷、介电泳迁移率等物理学性质和CTC表面特异性生物标志物等生物学性质,建立了一些商业化的CTC分离富集方法。基于物理方法的CTC分离检测技术在本文不做详细论述,感兴趣的读者可以参照[36]。

CTC研究面临的最大障碍在于CTC在外周血中的数目极为稀少,并且具有高度异质性。抗体修饰的免疫磁珠用来分离CTC具有较好的可靠性和重现性,是目前应用最广泛的CTC分离方法。具有超顺磁性特质的磁性纳米颗粒,因为具有更高的比表面积可以偶联更多肿瘤相关生物标记物亲和配体而用于CTC捕获。CellSearch系统(Veridex)使用EpCAM抗体修饰的磁性纳米颗粒在磁场作用下捕获EpCAM阳性的CTC,然后通过免疫染色进一步将上皮细胞标志物细胞角蛋白CK 8、18、19高表达和白细胞共同抗原CD45不表达的细胞确定为目标CTC。这种循环上皮细胞体外诊断(IVD)试剂盒,在2004年获得了美国食品药品监督管理局(FDA)的批准,并在2011年获得中国食品药品监督管理局(CFDA)的批准进入中国临床应用市场,在2020年获得国家市场监督管理总局(NMPA)的延续性批准[37]。CellSearch平台已广泛用于监测转移性乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌或前列腺癌患者的预后和疾病进展情况[38]。

AdnaTest(AdnaGen AG,Langenhagen,Germany)是另外一个利用抗体功能化修饰磁性纳米颗粒进行CTC捕获的商业化技术,该技术通过在免疫磁珠上修饰多种捕获抗体来增强在乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌和结肠癌中CTC的捕获和富集。AdnaTest技术可以通过检测CTC中特定肿瘤标志物的基因和蛋白表达,并将其与临床中原发性和转移性的肿瘤进行比较,来发现CTC分子分析与临床结果的相关性,评估CTC的分子分析中的诊断和预后价值。在一项评估CTC在转移性前列腺癌中预后有效性的临床研究中,利用AdnaTest在62%(34/47)的患者样本中检测到了CTC,而CellSearch(23/47)仅为45%。造成这种差异的原因可能有两方面:一是CTC捕获抗体差异,AdnaTest是多种捕获抗体,而CellSearch是单一抗体,所以前者可能会捕获到更多种类的CTC;二是检测技术的差异,前者是通过KLK3、PSMA和EGFR的基因表达进行CTC鉴定,而CellSearch是利用免疫荧光技术进行CTC鉴定[39]。还有很多技术依赖免疫磁珠对CTC进行富集,例如磁珠细胞分选(Magnetic-Activated Cell Sorting, MACS)系统(Miltenyi Biotec)[40⇓~42],而这种技术也是基于EpCAM修饰的磁珠完成对CTC的分选。

此外,本课题组基于De Novo设计了靶向EpCAM的特异性识别多肽,并命名为Pep 10,该多肽和目标蛋白的结合力可与抗体相比(1.98×10-9 mol/L vs 2.69×10-10 mol/L),磁性纳米颗粒借助生物素-链霉亲和素偶联方法将多肽功能化修饰于表面被用于CTC捕获,研究表明Pep10@MNPs对添加到人血液中的乳腺癌、前列腺癌和肝癌细胞具有与anti-EpCAM@MNPs相当的捕获效率(达到90%以上)和纯度(达到93%以上)。另外通过设计靶向HER2的特异性识别多肽H13,与靶分子HER2的亲合力为6.5 kal/mol。研究表明对乳腺细胞(SK-BR-3、MCF-7)、宫颈癌细胞(SKOV3)的捕获效率高达分别为68.56%、20.04%和79.26%(图2)。特异性识别多肽具有价格低廉、性能稳定和易于操作等优点,表明多肽功能化修饰磁性纳米颗粒的技术在临床CTC检测中的潜在应用价值[34,35]。

基于该多肽纳米磁珠捕获CTC技术(肿瘤捕手,TumorFisher),北京大学肿瘤医院在2014年3月至2016年10月期间进行了300多例转移性乳腺癌患者(MBC)的CTC检测,其中接受一线治疗的102例乳腺癌患者纳入了该研究[43]。在患者治疗基线(n = 102)和首次评效(n = 72)两个时间节点上采集血液样本并进行CTC计数。基线外周血中CTC检出率为69.6%。基线CTC计数≤ 2 CTC/2 mL的患者与>2 CTC/2 mL的患者相比,拥有更长的无进展生存期(PFS)的中位值(17.0个月vs 8.0个月;P = 0.002)。在基线和首次评效两个节点中,CTC计数均为 ≤ 2个CTC/2 mL的患者具有最长的PFS(18.2个月;P = 0.004)。在影像学评估为SD的患者中,TumorFisher技术可将这部分人群的PFS做进一步分层分析(P <0.001),为指导治疗方案提供更多信息。此外,基线CTC计数为≥2 CTC/2mL与患者发生肝转移密切相关(P = 0.010)。总体上,这项研究证实了该技术检测对于接受一线化疗的MBC患者具有一定预后价值,并且对肝转移更敏感,可能有助于肝转移相关的监测,并为指导乳腺癌临床实践提供了重要信息。

最近几年,免疫检查点抑制剂是临床肿瘤治疗领域的热点。其基本原理就是T细胞表面高表达的PD-1蛋白与肿瘤细胞表面PD-L1配体之间结合会造成T细胞免疫的刹车,如果利用PD-1抗体或者PD-L1抗体将二者的结合进行抑制,则T细胞就会启动免疫程序杀死肿瘤细胞,因此肿瘤细胞表面PD-L1的表达量是此免疫治疗的预测指标之一。Yue等[44]利用TumorFisher技术,对接受PD-1单抗IBI308治疗的36名晚期消化道肿瘤患者外周血中CTC进行捕获并检测,发现35名都可以检测到1~70个(中位数是8)CTC,并对CTC上PD-L1蛋白表达水平进行评估。结果发现,用药前高表达PDL1 CTCs的比例(PD-L1high)可预测PD-1药物疗效:ratio(PD-L1high CTCs/总CTCs)≥20%的患者免疫检查点抑制剂治疗响应率(客观响应率,Objective Response Rate, ORR)高达64%,而ratio <20%的患者的响应率只有14%,即外周血中有PD-L1高表达CTCs的患者更容易从PD-1药物中获益,而且这类细胞比例越高,响应率越高;另外PD-L1high ratio≥20%的患者的中位PFS为4.27个月,而<20%的患者仅为2.07个月,表明PD-L1 high CTCs比例高的患者有着更好的预后。同样将该技术应用于解放军307医院徐建明等开展的一项研究中。这是一项开放标签、剂量递增和扩展临床研究(NCT03463876),主要用于评估PD-1免疫检查点抑制剂SHR-1210联合阿帕替尼在治疗晚期肝癌、胃癌和胃食管交界处癌的疗效及安全性[45]。结果发现:在基线用药前,CTC检出率为95.1%,并且CTC中PD-L1高表达的细胞比例超过20%时,47.8%的病人会获益,而那些高表达PD-L1的细胞比例低于20%的病人没有客观缓解(ORR为0)。

为了验证Tumorfisher技术是否可以用于早期肺癌的检测,Liang等[46]选择了两种非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系A549和NCI-H1975进行试验,发现多肽与A549和NCI-H1975的结合亲合力同抗EpCAM抗体相似,多肽纳米磁珠对A549和NCI-H1975的捕获效率略高于抗EpCAM抗体。在临床应用方面,通过入组7例早期NSCLC患者,可以明显看出TumorFisher的检出率为5/7(71.4%),而CellSearch 7个病人都没有CTC的检出(0%),这一结果表明TumorFisher在早期肺癌中具有极强的潜在临床价值。

而新一代的检测技术结合了免疫磁珠和微流控技术的优势,通过修饰有抗体或者核酸适配体的免疫磁珠将目标CTC捕获并固定在表面上,从全血中分离出来,然后通过微流控平台根据细胞大小或惯性聚焦等方式将磁性标记的细胞进一步分离出来,进而提高CTC的检测灵敏度。该平台包括两部分:首先使用EpCAM抗体修饰或CD44/CD66b抗体修饰的磁珠进行阳性富集(CTC iChippos)或者CD45抗体修饰的磁珠进行阴性富集(CTC-iChipneg),然后依次使细胞通过三个孔道,第一个是确定性的横向位移,它根据细胞大小从全血样本中去除红细胞、血小板和未结合的磁珠;第二个是惯性聚焦,以排除白细胞;第三个是磁泳,将磁性标记的细胞从未标记的细胞通过磁性偏转到单独的通道中[47]。与CellSearch(7.5 mL < 30 CTC)对比,CTC-iChippos分离的CTC数量明显增高(22/36;P < 0.001)。然后通过反转录PCR(RT-PCR)对分离的CTC进行分子分析,其中4个为EML4-ALK阳性(4/22)[48]。另一个免疫磁珠和微流控技术结合的例子是Ephesia技术,该技术最初用于捕获白血病患者血液中的B细胞,之后进行了改进用来捕获CTC。由EpCAM抗体修饰的磁珠在强磁场下自组装成周期性阵列,形成密集的网络结构来捕获EpCAM阳性的CTC。这项技术避免了昂贵和复杂的微细加工技术,并且可使其具有不同的尺寸、不同的几何形状以及不同的流速等特点,已被证明可应用于临床样本的检测,同时具有很高的特异性[49]。在一项将Ephesia技术与CellSearch技术进行比较的研究中,从转移性乳腺癌(4/5)或转移性前列腺癌(6/8)患者的临床样本中检测到了CTC,比CellSearch的CTC捕获数量特异性更高[50]。

杨朝勇等[51]设计了仿生章鱼微流控芯片来捕获CTC。该芯片由微柱阵列构成,每个微柱上都修饰有能够特异识别CTC的核酸适配体和金纳米颗粒,金纳米颗粒上又偶联修饰有多条核酸适配体。相比于单个核酸适配体,多条核酸适配体能够产生多价效应,提高了适配体与CTC的亲合力,使得CTC的捕获效率提高了3倍。此外,捕获后的CTC可以通过谷胱甘肽分子的配体交换反应,破坏核酸适配体和金纳米颗粒连接的Au—S键,从而实现CTC的无损释放。且可以用来实现下游的细胞培养及基因突变检测。然后通过盲测41例正常、前列腺癌、结肠癌患者的外周血样本,肿瘤患者中CTC的检出率可以达到100%,其中包括T1N0M0分期的早期肿瘤患者样本。样本中CTC释放率可达到75%以上。

Qasaimeh等[52]采用人字形微流控探针技术捕获CTC与CTC簇,该工作采用微流控芯片基底与探针分离的方法实现了对CTC的多靶点检测。通过对前列腺病人外周血中CTC进行检测发现,可以从局部转移患者中捕获6 CTC/mL,从远端转移性患者中捕获280 CTC/mL,更成功捕获了高达50个细胞的CTC簇。

除此之外,王树涛等[53]也利用硅纳米线捕获CTC。通过在商业磨砂载玻片上原位生长二氧化硅纳米线并修饰EpCAM抗体制成生物芯片用于CTC的捕获检测。该生物芯片对前列腺癌细胞系(PC-3)特异性高,捕获效率为85.4% ± 8.3%。捕获效率高的原因是微尺寸的二氧化硅纳米线可以特异性识别CTC。该纳米芯片已成功应用于前列腺癌患者全血标本的CTC检测。此外还制备了还原氧化石墨烯膜[54]实现了以高灵敏度静态捕获CTC,而不需要复杂的微流体操作。极高的CTC捕获效率是由于制备的还原氧化石墨烯薄膜具有负电荷和超亲水性,这些性质可以减少非特异性吸附,提高灵敏度。Tang等[55]也利用EpCAM和HCC细胞特异性脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)修饰的双靶功能化氧化石墨烯薄膜(DTFGF)来特异性识别HCC-CTC。该方法的LOD为每毫升5个细胞。

Zhao等[56]采用叶酸(FA)功能化的杂化光子晶体条形码(Hybrid Photonic Barcodes)捕获和释放CTC。杂化光子晶体条形码由两部分形成,一个是用于维持完整性的聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)反蛋白石结构,另一部分是用于结合特异性识别FA分子和保持细胞活力的甲基丙烯酸明胶(GelMA)凝胶填充剂。通过四种癌细胞HeLa(上皮组织,叶酸受体阳性,FR+),A02(骨髓,FR+)、Raji(淋巴组织,FR+)和A549(上皮组织,叶酸受体阴性,FR-)证明可以进行有效的捕获,且可以通过胰蛋白酶快速消化可控地释放CTC。

Dong等[57]设计了一种近红外(NIR)光响应性底物,是将金纳米棒的近红外光热效应与热敏水凝胶底物的热敏效应相结合,实现了高效捕获和原位释放CTC。基底是通过将靶细胞印迹在金纳米棒预嵌的明胶水凝胶上制备的。细胞印迹产生的微/纳米结构可以作为癌细胞的人工受体,以提高捕获效率。当将CTC从患者外周血中捕获后,可通过将温度敏感的明胶放在37 ℃中迅速溶解,达到释放CTC的目的,或者也可通过NIR介导的嵌入式金纳米棒的光热活化来释放CTC。该方法已应用于从患者外周血中捕获CTC,单独释放CTC以及对CTC进行基因分析。

根据EV的尺寸和生物性质,将分离EV的技术分为三类:密度分离、尺寸分离和免疫分离。其中密度分离的方法,如超速离心法或尺寸分离法,尺寸排阻方法应用较多且比较成熟,本文不再赘述。在大多数纳米材料的免疫分离方法中,将EV的分离与检测分析同时进行,所以也不再在这一部分详细描述捕获,将在下一章节中详细描述。

4 CTC和EV的鉴定和检测

4.1 基于功能化纳米材料的检测信号放大技术

由于CTC在转移中起到“种子”作用,而EV则起到了靶器官和靶组织及其周围微环境的“土壤”改造作用,并且二者携带来源肿瘤组织的核酸和蛋白质等分子标志物,因此,CTC和EV作为恶性肿瘤预后、疾病进展动态跟踪、甚至肿瘤的早期检测等的生物标志物具有重要临床应用前景。但到目前为止,检测分离稀有的CTC与将血液中的肿瘤与非肿瘤来源EV区分开仍然是一项挑战。

通常CTC的鉴定方法是免疫荧光方法:首先通过4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染核来确定目标细胞为有核细胞,然后通过免疫染色进一步将上皮细胞标志物细胞角蛋白CK 8、18、19高表达和白细胞共同抗原CD45不表达的细胞确定为目标CTC,这是目前学术界和产业界最常用的CTC鉴定方法。另外利用荧光原位杂交技术(Fluorescence In Situ Hybridization, FISH)也可以对CTC的细胞染色体异常进行检测,从而对CTC细胞进行鉴定。由于这两种方法是目前常用的CTC鉴定方法,本文不再赘述,下面重点讨论通过纳米材料或者纳米技术提高CTC检测灵敏度的研究。

拉曼光谱通常用于分析生物分子的结构,具有高的空间分辨率。基于拉曼光谱的生物传感器可用于检测CTC[58]。但通常拉曼散射效应非常弱,而目前发现金属的存在可以将信号增强多达1015倍,这种技术被称为表面增强拉曼散射(SERS)[59]。SERS纳米探针主要由三个部分组成:具有各种形状和大小的金属核、拉曼报告分子和识别部分。Wu等[60]设计了被拉曼探针分子4-巯基苯甲酸(4-MBA)包裹、还原性牛血清白蛋白(rBSA)编码的金纳米颗粒(AuNP-MBA-rBSA),再将叶酸(FA)配体修饰在复合物上,形成AuNP-MBA-rBSA-FA SERS生物探针。AuNP-MBA-rBSA-FA表面上的FA可以识别多种癌细胞(例如脑癌、肾癌、乳腺癌、肺癌、宫颈癌和鼻咽癌)。AuNP-MBA-rBSA-FA SERS生物探针对混合在2.3×106个HepG2细胞中的10~10000 HeLa细胞进行检测,检出限(LOD)为每毫升10个细胞。Ruan等[61]选择将超顺磁氧化铁纳米颗粒(SPION)与三角银纳米棱镜(AgNPR)结合,形成超灵敏的CTC捕获、检测与分析系统(图 3)。同样还将4-MBA用作拉曼信号报告分子,rBSA用来增加探针稳定性以及减少非特异性吸附,FA作为识别探针形成了MBA-AgNPR-rBSA- FA SERS生物探针。此外,还用rBSA和FA包裹了SPION纳米颗粒,从而获得了SPION-rBSA-FA的SERS生物探针。然后利用MBA-AgNPR-rBSA-FA和SPION-rBSA-FA的复合物设计了一种超敏SERS生物探针系统,该系统可以高特异性和高灵敏度地完成血液中CTC捕获(通过FA)、CTC富集(通过磁性SPION)和血液中CTC痕量检测(通过超灵敏SERS生物探针)。该方法的LOD可达到每毫升1个细胞。另外Xue等[62]合成了SPION与聚(乙烯亚胺)(PEI)的SPION-PEI@AuNP MBA-rBSA-FA磁性SERS探针。该SERS生物探针可用于CTC富集(磁性SPION)和CTC检测(生物探针)。该方法的LOD可以达到单细胞水平。

金属纳米颗粒应用于电化学生物传感器中也具有显著的优势,例如检测限低、稳定性高、实时响应、可重现性好以及高比表面积有利于电子转移和生物分子的结合等,是一种电化学发光(Electrochemiluminescence,ECL)性能优异的纳米材料[63]。例如Shen等[64]用EpCAM抗体修饰的磁性纳米颗粒捕获MCF-7细胞,将捕获的MCF-7细胞分布在电极表面,通过滚环扩增(Rolling Circle DNA Amplification, RCA)反应放大电化学电流信号,LOD可以达到每毫升1个细胞。Zhao等[65]利用BSA@Ag@Ir金属有机纳米簇(BSA@Ag@Ir MONs)双重识别和捕获CTC,利用Orion carbon black 40(Ocb40)//AuNPs修饰电极增强导电性;利用含有特异性识别适配体EpCAM 和 MUCIN 1的CP1和CP2 DNA链作为识别探针,其中CP1链与磁性纳米颗粒连接,当同时表达EpCAM和MUC1的CTC出现时,识别探针CP1和CP2产生邻近效应并能够捕捉信号探针SP (HS-BSA@Ag@Ir MONs),进而形成CTC/CP1/CP2/SP 复合物。然后通过磁场将复合物固定在电极上,利用差分脉冲法测定电流。该方法的LOD可达到每毫升1个细胞,也可用于从病人外周血中捕获CTC,证明其在临床中的作用。

Liu和Zhao等[66]采用适配体修饰的磁性纳米颗粒和碳量子点/羟基氧化钴纳米片系统(CDs/CoOOH)捕获检测CTC,将FA偶联到CDs上,然后将CDs进一步组装到CoOOH上以获得荧光猝灭FA @CDs/CoOOH,当CTC被适配体修饰的磁性纳米颗粒捕获后加入抗坏血酸AA,AA能够还原CoOOH,使得CDs的荧光恢复,信号可通过荧光光谱仪检测。该方法LOD为每毫升5个细胞。

传统检测EV的技术主要有纳米颗粒跟踪分析(Nanoparticle tracking analasis, NTA)、动态光散射(Dynamic Light Scattering, DLS)、免疫印迹(Western Blotting, WB)或酶联免疫吸附(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA)、流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)等[67]。这些技术可以提供关于EV的大小、浓度或特定性蛋白的表达等信息。其中流式细胞术是一种对液流中排成单列的细胞或其他生物微粒逐个进行快速分析的技术。但单个EV的尺寸太小,不能被传统的流式细胞术检测到。需要把EV连接至被抗体功能化的微球表面或者直接连在微球表面,实现信号的放大,然后再用特异性识别抗体对EV进行标记,便可被FCM成功检测到,该方法可用于胰腺癌患者EV中GPC1蛋白的检测[68]。本课题组Li等[69]也利用该方法检测了患者血清样本中EV EpCAM和HER2的表达量,用于乳腺癌诊断和分子分型。实验中,借助醛基化修饰的微球,通过醛基与EV表面氨基的相互作用将其捕获至微球表面,然后利用特异性识别抗体对捕获在微球表面EV上EpCAM和HER2的表达量进行检测。在乳腺癌细胞系中证明了EV中EpCAM和HER2的表达可以很好地反应源细胞蛋白的表达状态,验证了该方法的可行性。临床方面,通过对健康人(n=7)、HER2阴性乳腺癌患者(n=12)及HER2阳性乳腺癌患者(n=19)血清中EV的检测,证明了EpCAM和HER2阳性EV可对乳腺癌进行有效的诊断和HER2分子分型,受试者工作特征曲线(Receiver Operating Characteristic Curve, ROC)显示曲线下面积(Area Under Curve,AUC)高达0.972,证明了该方法的高灵敏度性和高特异性。此外,该方法对乳腺癌进行HER2分子分型的结果与临床“金标准”免疫组化的结果呈现出高度的一致性,进一步验证了该方法准确性。Wang等[70]也利用该方法对脑部肿瘤进行诊断。检测了12名健康对照者和23名脑胶质瘤患者的血清来源EV中EGFR蛋白的表达,发现EV中EGFR的表达量能够以高灵敏度和高特异性(AUC 0.900,P<0.0001)诊断脑胶质瘤。并且EGFR的表达与肿瘤组织中的Ki-67表达量呈现正相关,表明EV的EGFR表达量也是一种胶质瘤恶性程度的指标。另外一个工作是利用该方法证明EpCAM和叶酸受体FOLR1可以有效区分侵袭性和非侵袭性的无功能垂体瘤(NFPA)(AUC:FOLR1∶0.94,EpCAM:0.88),实现了基于血清EV的NFPA的侵袭性判定[70,71],还测定了血清来源EV和组织中上皮标志物(EpCAM和E-钙粘蛋白)和间质标志物(波形蛋白和N-钙粘蛋白)的表达,发现与非侵袭性NFPA相比,侵袭性NFPA血清EV和肿瘤组织中的间质标志物表达高于上皮标志物表达,证明肿瘤中的上皮间质转化趋势与血清EV具有一致性(图4)。Koliha等[72]描述了一种基于荧光编码微球的流式技术,用于分析EV的不同亚群。使用39种荧光微球分别修饰不同捕获抗体去捕获EV形成微球-EVs复合物,从而使流式细胞术多靶点分析成为可能。捕获抗体和荧光标记的检测抗体的组合可同时对存在两种表面标记物的EV进行分析,可以实现EV的亚群检测。通过检测自然杀伤细胞或血小板来源的EV,发现自然杀伤细胞来源EV不表达CD9,而血小板来源EV不表达CD81。

拉曼技术也可用来检测EV。Kong等[73]使用自聚合反应制备了SERS纳米探针。该纳米探针由拉曼报告分子4-邻氨基硫酚(pATP)和特异性识别抗体(CD9、CD63、迁移抑制因子MIF和人磷脂酰肌醇蛋白聚糖GPC1)包被的金核银壳核壳复合颗粒组成。他们用聚多巴胺(Polydopamine, PDA)修饰载玻片基板,以提供足够的空间来偶联抗体,用来捕获EV,当EV出现时,SERS纳米探针可以与EV结合,并由拉曼光谱仪测定。该测定法在2 mL样品溶液中的LOD为(~9×10-19 moL/L)。此外,通过分析2 mL临床血清样本,EV中MIF的表达不仅可以用来区分胰腺癌患者(n=71)与健康对照组(n=32),还可以将转移性肿瘤与无转移的肿瘤,以及从P3期到P1-2期的肿瘤淋巴结转移(TNM)进行区分(诊断灵敏度为95.7%)。Kwizera等[74]基于金纳米棒(AuNRs)制造了SERS纳米探针。在他们的设计中,在玻璃基板上修饰金膜,利用3D打印阵列模板将能与EV特异性结合的抗体修饰在金膜表面用来捕获EV,然后利用包被有机染料羧酸琥珀酰亚胺酯(QSY21)的AuNR进一步靶向EV(AuNRs和EV通过静电吸附相结合),最后使用便携式拉曼光谱仪(TSI ProRaman光谱仪)检测EV。这种方法可以结合EV而不是某些蛋白质进而可提高灵敏度,LOD为2×106 EV/mL,通过该方法还证明,HER2阳性乳腺癌患者血浆来源的EV中HER2和EpCAM水平的表达显著高于健康对照组(P ≤ 0.01)。

Tian等[75]用二价胆固醇(B-Chol)标记的DNA核酸适配体修饰金纳米星@4-巯基苯甲酸@金纳米壳复合物(AuNS@4MBA@Au)制备SERS纳米探针。首先使用CD9抗体功能化的磁珠捕获EV,然后加入SERS探针,胆固醇可以与EV脂质膜之间通过疏水相互作用形成三明治复合物。该复合物可以通过磁性捕获将EV富集并沉积在二氧化硅载玻片上,最后使用拉曼光谱仪进行检测。该方法的LOD为2.7×104 EV/mL,并测试了健康和肝癌患者的血清样本,证明癌症患者的EV数量有所增加,其结果与使用最新技术(使用ExoEasy试剂盒进行纯化以及使用以可调电阻脉冲感应技术为核心的纳米粒子分析设备qNano进行定量分析)获得的结果相当。此外,Pang等[76]报道了一步法测定EV中的小RNA。在他们的实验中,使用Fe3O4 @Ag磁性纳米颗粒连接DNA核酸适配体和带有Raman报告基因的Au核@Ag壳复合物制备SERS探针。基于双重SERS生物传感技术在血样中精确检测了EV microRNA-10b(LOD=1.0 nmol·L-1),并增强检测信号,这对于早期癌症诊断具有重要意义。Wang等[77]使用CD63核酸适配体修饰的金壳纳米磁珠(MB@SiO2@Au)和拉曼报告分子和靶向EV的核酸适配体包被的金纳米颗粒制备了三种类型的SERS探针,可同时与SK-BR-3、T84和LNCaPEV特异性结合。将该检测方法用来检测从癌症患者获得的真实血液样本,表明该方法是基于EV临床癌症筛查的一个有前途的工具。

比色传感技术因操作简单被广泛应用于EV与CTC的检测。为了增加比色传感技术的灵敏度,可采用信号放大步骤。Wu等[78]报道了使用两种不同抗体修饰的AuNPs组成的复合物。AuNPs先用CD9抗体修饰用作EV的捕获,当抗体修饰的AuNPs识别EV后,便可以保留在固定CD9多克隆抗体的测试线(Test Line)处。然后再添加由BSA抗体修饰的AuNPs进一步与捕获的EV形成三明治复合物,以增强染色效果。这种设计提高了测试线上的AuNP形成的红色谱带的光强度。该系统用于检测从MCF-7人乳腺癌细胞分离的EV,LOD为1.3×106个/mL,与传统的层析免疫吸附法相比灵敏度提高了两个数量级。该传感技术还成功用于检测将MCF-7细胞的EV稀释在超速离心去除血清EV的胎牛血清中,证明其在实际诊断中的潜在应用。Liu等[79]将AuNPs的聚集与其他步骤组合以放大信号。他们设计了一对带DNA标记的抗体,可以与EV上存在的表面蛋白结合,DNA链进行杂交,产生独特的DNA信号。该双链DNA信号通过重组聚合酶扩增与转录介导的扩增相结合被扩增两次,以产生RNA链。RNA产物与EV的初始浓度成正比,可以通过使用与RNA互补的寡核苷酸包被的AuNPs进行检测,通过RNA的相互识别促进了AuNPs的聚集以及红色到蓝色的颜色变化,可以通过吸收光谱法测量。

Sun等[80]利用热泳富集与荧光标记的核酸适配体结合的技术,实现了EV表面7种蛋白组测定和癌症分类。在此基础上进一步开发了热泳与纳米耀斑(nanoflare)相互结合的新检测方法,实现了0.5 μL血清来源的EV中microRNA的高灵敏检测。纳米耀斑进入EV中,可以特异性识别microRNA并产生荧光信号。通过激光照射产生温度进而引发热泳,EV在热泳作用下快速汇聚,有效放大纳米耀斑产生的荧光信号,提高EV中microRNA的检测灵敏度。通过检测临床血清来源EV中肿瘤相关microRNA表达情况可以用于ER+乳腺癌的早期诊断。

Zhang等[81]提出了一种基于光子晶体的高灵敏度和特异性诊断生物芯片,用于检测肿瘤来源的EV。利用生物素-亲和素反应将量子点与GPC1抗体偶联,用来识别捕获EV,然后利用光子晶体形成的仿生周期纳米结构实现信号放大,产生的信号强度与EV浓度呈正相关。该方法可以用来区分胰腺癌患者的模拟血清样本与正常血清样本,表明该方法在临床检测中具有很大的潜力。

4.2 基于功能化纳米材料的检测信号转换技术

近几年来,纳米技术在检测中具有很大的应用前景。纳米材料因其高比表面积可用于高效捕获,或因其良好的ECL性能或者金属材料本身的荧光性能应用于信号转换技术中,显示了纳米材料在诊断应用中的潜力,进一步提高了捕获、检测CTC以及EV的特异性和灵敏度。

4.2.1 电化学发光技术

电化学发光技术是一种广泛使用的检测分析方法,包括电化学和化学发光两个过程。在电化学发光技术中,由于分析物和电极表面之间的电化学相互作用(氧化还原反应)而产生信号,并在信号转换器的帮助下生成电流信号。Zhang等[82]使用抗体修饰的磁性纳米颗粒捕获CTC,然后将捕获CTC的磁性纳米颗粒沉积在电极上,再利用金纳米颗粒修饰的LiFePO4偶联核酸适配体与捕获的CTC结合,LiFePO4中的磷酸盐与钼酸盐通过氧化还原反应生成磷钼酸盐,产生电化学信号。该方法的LOD为每毫升1个细胞。

Li等[83]报道了一种基于光电化学(Photoelectrochemical,PEC)检测CTC的方法,以低毒性的三巯基丙酸(MPA)包封AgInS2纳米颗粒作为基底,当被红光激发后,显示出高的光电转换效率,并产生强的光电流。在纳米颗粒上修饰能与细胞表面tyrosine kinase-7蛋白相结合的sgc8c核酸适配体,当急性淋巴细胞白血病细胞CCRF-CEM细胞出现后,光电流显著降低,便可对细胞进行检测,其LOD为每毫升16个细胞。为了进一步提高检测灵敏度,Liu等[84]将核酸适配体修饰的Au@CDs固定在金电极上,加入K2S2O8后,Au@CDs显示出很强的电化学发光。当细胞出现时,电化学发光的强度会降低。该方法的LOD为每毫升34个细胞。Yang等[85]将引物/环状DNA复合物修饰在电极上并进行滚环扩增,扩增出具有许多核酸适配体片段的长ssDNA链,从而以多价的方式高效捕获罕见的CTCs,再用修饰有EpCAM和辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)的AuNP对捕获的CTC识别,催化H2O2生成电信号进行检测,LOD为每毫升5个细胞(图5)。

用于EV检测的ECL生物传感器主要使用玻碳电极或金电极。Boriachek等[86]使用溶解的CdSe QDs作为ECL信号标签。将HER2、FAM134B抗体通过链霉亲和素-生物素反应连在CdSe QDs上,用CD9或CD63修饰的磁性纳米颗粒捕获EV。当EV存在时,可以形成三明治夹心复合物。最后,将CdSe QDs复合物溶解在HNO3中可获得Cd2+,使用方波阳极溶出伏安法测定乳腺癌和结肠癌细胞以及血清样品来源的EV,产生的峰值电流与EV的浓度有关。

4.2.2 荧光信号探针转化技术

荧光是指原子或分子在经过先前的激发光激发过程后,回到基态时所发出的光。可以通过分析荧光强度或波长的变化与目标分析物初始浓度的关系来特异性地定量目标分析物。在这里,将主要介绍以具有荧光特性的纳米颗粒作为转导元件的生物传感技术。荧光无机纳米颗粒主要有量子点、金属纳米颗粒、上转换发光纳米颗粒(Upconversion Luminescent Nanoparticles,UCNPs)和聚合物等。因为荧光纳米颗粒具有良好的光学性能,例如高的光稳定性、极宽的激发范围和窄的发射(允许大的斯托克斯位移),可以克服很多传统荧光基团的局限性[87]。

4.2.2.1 上转换发光纳米颗粒

掺杂镧系元素的UCNP经历非线性光物理过程具有反斯托克斯效应,由此通常在近红外(Near Infrared, NIR)波长范围内将低能辐射转换为高能辐射,例如可见光(反斯托克斯位移),因此UCNPs的荧光发射所需的波长比吸收光的波长短。此功能使它们特别适用于生物应用和纳米生物传感器的开发,因为避免了使用紫外激光,从而最大程度地减少了生物样品的自发荧光[88,89]。发光共振能量转移(LRET)和荧光共振能量转移(FRET)是由于两个发光/荧光分子的能级之间非常短的距离相互作用而发生的,其中供体分子的发射波长与受体分子的激发波长一致,这样当它们的距离足够相近时(7~10 nm),供体分子的激发将诱导受体发出荧光[90],所以与识别分子偶联的UCNP在与其他荧光团或NP受体结合的传感器的开发中用作能量供体。Wang等[91]使用四甲基罗丹明(TAMRA)和UCNPs分别修饰靶向细胞系来源EV膜上存在的EpCAM的DNA核酸适配体EpCAM-1和EpCAM-2(EpCAM-1-TAMRA, EpCAM-2-UCNPs)。核酸适配体-EV结合后,两条DNA链靠近,能量供体(UCNPs)和受体(TAMRA)距离减小,从而促进了LRET过程。由于供体的发射波长和受体的激发波长一致,红外光激发UCNPs产生紫外光,该紫外光进而激发了TAMRA分子(585 nm)。并且该发射波长与EV的浓度存在线性关系。若无EV存在时,则无黄色发射光检测到。利用该方法成功地验证不同恶性程度的乳腺癌细胞系(MDA-MB-231、MCF-7、MCF-10A)来源的EV的EpCAM表达不同,并验证该LRET传感技术的LOD为8×104 EV/mL。与上篇设计的思路一致,该课题组使用金纳米棒作为受体,并将UCNPs固定在氧化改性后的滤纸支持体上作为供体。Paper-UCNP和AuNRs上分别修饰有用来靶向EV的CD63核酸适配体的两个片段(捕获探针CP.5'-NH2-CACCCCACCTCGC-3')和检测探针(DP, 5'-TCCCGTGACACTAATGCTA-HS-3')。在EV的存在下,靶向CD63蛋白分别与AuNR和UCNP-paper上结合的核酸适配体的两条链结合,缩短了受体与供体之间的距离,从而使LRET得以发生。因此,UCNPs的绿色发光在980 nm激发下被猝灭。当没有EV时,没有CD63蛋白,因此捕获探针CP无法与检测探针DP结合,LRET也不会发生,绿色发光的成像也不会改变,这一过程可以通过光学成像系统的电荷耦合器件(Charge Coupled Device,CCD)清楚地捕获到发光的变化。因此利用上转换发光的猝灭速率与EV浓度之间的关系,可以准确实现肝癌细胞系来源EV的高灵敏度检测,其LOD为1.1×106 EV/mL[92]。

4.2.2.2 量子点

由于量子点的高量子产率、对称的荧光光谱峰型、较窄的发射光谱和独特的光物理特性,量子点也被广泛应用于基于荧光的生物传感器中[93,94]。

Zhang等[95]采用量子点编码磁性微球系统(iFMNS)捕获检测CTC。通过微乳液和溶剂蒸发法将CdSe/ZnS QDs量子点和磁性纳米颗粒引入到聚(苯乙烯-马来酸酐)微球中,然后利用生物素-亲和素反应将EpCAM抗体偶联到微球上用来识别CTC,最后通过磁性作用分离CTC,可以获得70%~95%的捕获效率。利用该方法分离出的CTC可以用来继续培养或者进行下游分析(RT-PCR、IHC)。Chen等[96]利用多光子显微镜和偶联量子点的抗体在活体动物血液中进行实时CTC和CSC亚群成像的研究。将表达荧光蛋白的胰腺癌细胞经过皮下注射到小鼠耳垂,然后形成实体肿瘤,在肿瘤发生转移流经血液时便可通过显微镜观察到,同时用CD133和CD24抗体标记的QD525量子点进行对特定亚群CTC的成像研究,可以在动物体内鉴定出具有更高转移潜能的CTC,如CD24+和CD133+ CTC,实现CTC的体内检测。

Bai等[97]使用CD9抗体修饰的羧基化聚苯乙烯微球分离富集EV,同时使用三种抗体分别标记的QDs(癌胚抗原(CEA),激发:490 nm,发射:625 nm;细胞角蛋白CK19的片段(Cyfra21-1),激发:490 nm,发射:525 nm;前胃泌素释放肽(proGRP),激发:490 nm,发射:585 nm)对肿瘤来源的EV进行多靶点检测。利用该方法分析了肺癌和内皮细胞系来源的EV,肺癌来源的荧光强度比内皮细胞的高约6~10倍,并且不同恶性程度的肺癌细胞来源的EV的相关蛋白表达量不同。此外,使用该方法检测癌症患者的临床血浆样本也显示出良好的诊断能力,在倒置荧光显微镜下,可以区分肺癌患者血浆和健康对照组来源的EV,并且与临床常用的血清标记物的测试具有良好的一致性(ROC曲线的CEA、Cyfra21-1和ProGRP的AUC分别是0.84,0.85,和0.84)。这些结果为EV生物标志物检测和早期癌症诊断提供了一种有前途的方法。

4.2.2.3 金属纳米颗粒

金属纳米颗粒由于其本身固有的荧光性质可以用作荧光标记。而很多金属纳米颗粒也可通过合成过程在其表面偶联荧光基团或者配体。例如,Zhai等[94]基于金纳米颗粒构建了检测血浆来源EV中microRNA-1246的生物传感平台[98]。AuNP探针由AuNP、Cy5标记的DNA和捕获DNA(Cy5标记的互补DNA序列)组成,荧光信号最开始被抑制(捕获DNA序列一开始互补成对)。该探针可以进入EV中,然后捕获探针DNA与EV中的microRNA-1246相互结合,进而将Cy5标记的DNA片段释放出来,游离的Cy5标记的DNA荧光信号恢复就可以被荧光显微镜检测到。整个实验过程需要4 h 并且仅需40 μL的血浆,具有足够高的灵敏度。利用本方法检测血浆中的miR-124,成功将46例乳腺癌患者与28例健康对照者区分开(P < 0.0001,灵敏度:100%,特异性:92.9%)。He等[99]使用CD63核酸适配体修饰的氧化铜纳米颗粒(CuO NPs)与用胆固醇修饰的磁性纳米颗粒捕获EV并形成三明治复合物结构。随后将形成的复合物溶解在酸性溶液中(HNO3)可将CuO纳米颗粒溶解获得铜(Ⅱ)离子,在抗坏血酸钠和聚胸腺嘧啶存在时,铜离子可被还原为具有荧光特性的铜纳米颗粒(CuNPs)(图 6)。CuNPs的荧光强度与EV的含量成正比,该方法的LOD为4.8×107个EV/mL。Gao等[100]使用滚环DNA扩增(RCA)反应来检测EV,利用滚动环扩增(RCA)反应产生长链DNA发夹结构,该发夹结构包含多个功能域,如CD63核酸适配体序列、AuNPs修饰的连接子序列、间隔序列等具有互补碱基对,形成发夹结构。在EV存在的情况下,CD63核酸适配体序列与EV结合,发夹结构改变了其构象,暴露了连接序列。然后,荧光的AuNP互补生物共轭物(AuNP-L/cL)可以通过链置换与该连接序列配对,从而释放荧光cL探针。cL荧光探针的荧光信号与EV的浓度成正比,并且可同时形成DNA缠绕复合物,可以通过离心的方法将捕获到的EV回收,回收率达到80%,LOD的水平为1×108 EV/mL。

De la Zerda 等[101]选用金纳米棒作为造影剂,标记肿瘤细胞,增强肿瘤细胞的对比度,首次将可调制散斑噪音的OCT(speckle-modulating OCT,SM-OCT)技术应用于动物模型血液循环系统的单细胞检测。

4.2.2.4 其他

Peng等[102]此前设计了一种名为MLP的小分子NIR荧光染料,与肿瘤细胞高表达的酶氨基肽酶N(APN)有很高的亲和力。在此基础上提出来一种利用EpCAM和MLP修饰在Fe3O4磁性纳米颗粒(MB-MLP-EpCAM)上,实现同时分离和检测CTC。实验证明,MB-MLP-EpCAM具有85%以上的CTC的捕获效率。最重要的是利用其荧光成像的特点,可以在临床上实现体内实时识别和监测CTCs。

4.2.3 表面等离激元共振技术

基于表面等离激元共振(Surface Plasmon Resonance, SPR)技术由于能够实现无标记和实时检测的目的,在生物标志物检测中引起了广泛的关注[103]。金纳米颗粒可以通过局域表面等离激元共振与金纳米颗粒表面等离激元共振电磁波的电子耦合相互作用来提高灵敏度[104]。Wang等[105]报道了一种基于SPR的AuNPs核酸适配体传感技术用于EV的检测,具有高灵敏度和超强的特异性。首先,乳腺癌细胞系MCF-7来源的EV通过在金膜中修饰的DNA核酸适配体捕获;将核酸适配体(T30)包被的AuNPs与捕获到的EV特异性结合,在另外一个AuNPs的表面上修饰A30核酸适配体,通过碱基互补配对原理,可以与捕获T30包被的AuNPs配对,这样便构建了双重AuNPs扩增信号的SPR生物传感器。该传感技术的LOD为5×103 EV/mL,与ELISA相比,提高了104倍。Im等[106]设计了纳米等离激元外泌体(Nano-Plasmonic Exosome, nPLEX)传感器阵列。主要设计思路是在金膜上刻蚀周期性纳米孔阵列,每个纳米孔尺寸为200 nm,与EV的尺寸相匹配,进而提高检测的灵敏度。使用聚乙二醇(PEG)修饰金表面,并将CD63抗体连接到PEG链上,当EV出现并与传感器相结合时,其局部折射率发生变化,从而使光谱峰移动,光谱移动的幅度与覆盖传感器表面的分子质量密度相关,因此可以对EV蛋白进行定量分析。更重要的是,通过使用AuNPs可以显著增强信号,10 nm球形AuNPs可以增加20%,而在使用50 nm Au纳米星时,信号可以增强300%。该方法的LOD是大约3000个EV,比传统的ELISA高100倍。使用该传感器对卵巢癌患者和健康患者的腹水样本进行检测,发现在卵巢癌患者样本中EpCAM和CD24的水平升高,诊断准确性可达97%。另外,该实验只需要30 min便可完成,并且可以使用病人腹水样本。Liang等[107]开发了纳米等离激元增强散射(Nanolasmon-Enhanced Scattering, nPES)技术捕获检测EV。通过使用CD81抗体修饰微阵列,捕获EV,然后分别用AuNP和AuNR偶联的CD63和CD9抗体进一步靶向捕获的EV。这种结合可以增强局部表面等离激元效应,从而增强了EV检测的灵敏度和特异性。仅利用1 μL的样品和5 h的分析时间,便成功区分来自健康人、胰腺癌病人与胰腺炎病人来源的EV,从而实现胰腺癌的原位诊断,其性能优于ELISA,特异性和灵敏度都大大提高,进而使该设备成为有前途的诊断工具。

5 纳米材料与芯片集成化的捕获和检测一体化技术

微流控芯片一般具有样品消耗少、检测速度快、操作简便、多功能集成、体积小和便于携带等优点,可以同时实现检测与捕获的目的。杨朝勇等[108]开发了流体力学分离与特异性识别结合CTC的捕获富集芯片(SDI-Chip)。该芯片由微柱阵列构成,微柱阵列表面修饰有特异性识别抗体。微柱阵列排布方式根据确定性侧向位移(Deterministic lateral displacement, DLD)分离原理设计[51],可在微米尺度上实现细胞尺寸选择性流体力学调控。CTC因尺寸较大将沿微柱偏移方向运动并不断与微柱碰撞而实现特异性识别捕获,而血细胞因尺寸较小沿液流方向运动且很少与微柱碰撞而避免非特异性吸附。该设计有效地结合CTC在物理性质及表面标志物与背景细胞的差异,实现了CTC的高效和高纯度协同捕获。通过对大量临床肿瘤病人外周血样品的测试,他们验证了所发展的芯片技术在肿瘤分期诊断、疗效监控等方面的潜在应用价值。Zhang等[109]基于微流体芯片构建了体外循环系统实现检测和监测体内CTC。该系统是将微流控芯片和EpCAM修饰的磁性免疫纳米颗粒结合,无需任何预处理即可捕获和监测血液中的CTC,并且具有更高的捕获效率,对活体动物没有任何不可逆转的损害。

微流控芯片在EV的检测中也广受关注。He等[110]首次报道了一种集成的微流控方法,该方法可以从细胞培养上清液或血清样本中直接分离EV,无需进行超速离心或者其他方法分离便可以对EV进行表面蛋白表达量的分析。芯片的设计思路如下:在聚二甲基硅氧烷((Polydimethylsiloxane,PDMS)芯片上分为三个串联的通道,首先利用EpCAM抗体修饰的免疫磁珠进行EV的捕获和富集(第一阶段捕获);然后裂解EV内目标蛋白(IGF-1R和P-IGF-1R)和利用免疫磁珠捕获裂解的蛋白(第二阶段捕获)以及最后使用化学发光辅助的免疫夹心分析(第三阶段分析)。简而言之,将血浆样品与EV特异性抗体标记的磁珠混合并注射到入口#1引入第一区域;然后通过入口#2注入裂解缓冲液,然后停止流动与捕获的EV共孵育。裂解EV的产物流入蛇形通道,与通过两个侧通道注入的EV内蛋白特异性抗体标记的磁珠共孵育,以捕获释放的囊内蛋白;最后将捕获蛋白的磁珠保留在第二个腔室中,在该腔室中依次引入检测抗体和化学发光试剂,用于对蛋白质标记物进行夹心免疫检测。通过该方法可以将早期非小细胞肺癌患者(stageⅡ)与健康对照组区分开(微流控:P = 0.0001, CV = 11.2%;ELISA: P = 0.0097, CV = 56.4%.)。本实验所需血浆体积仅为常规方法的1/100左右,并节省大量实验时间,说明本方法具有高效的EV免疫捕获和高灵敏度特异性蛋白分析的特点。Zhao等[111]开发了一种简单的微流控技术(ExoSearch),可通过用抗CD9抗体修饰的磁珠原位捕获卵巢癌患者血清来源的EV(EV),然后用荧光标记的EpCAM、CA125和CD24进行表面蛋白的多靶点检测。最后利用该方法可以将15位卵巢癌患者与健康者区分开(AUC = 1.0, P = 0.0009)。

6 即时检验技术

即时检验(Point-of-care testing,POCT)也称现场快速检验,是一种可以在患者床边进行的临床检测方法,不需要复杂的设备和专业的实验室检查人员。目前最常用的POCT方法是比色传感技术。比色传感技术因其易于操作对于实际POCT的应用非常重要。通常,比色传感技术可以通过肉眼轻松、即时地观察到颜色变化,而无需任何其他分析仪器即可产生“是/否”答案或半定量结果。

Jiang等[112]利用CD63的核酸适配体来识别EV并保护AuNPs免于在高盐溶液中聚集实现EV的检测。当EV存在时,EV表面蛋白与相应的核酸适配体之间发生特异性结合,AuNPs表面上的核酸适配体减少进而导致AuNPs的聚集,导致红色到蓝色的颜色变化,可以通过紫外可见光谱法进行测量。该传感器用于区分来自不同癌细胞系的EV。此外,该技术能够通过使用能与人急性淋巴细胞白血病细胞中过表达的酪氨酸激酶-7蛋白结合的核酸适配体来检测特定细胞系来源EV蛋白的表达。He等[113]使用了带有CD9抗体的免疫磁珠从HepG2细胞中捕获EV。随后,将二价胆固醇BChol标记的DNA插入到EV膜中,该膜上DNA单链可以促进连接HRP的DNA短链进行杂交链反应,在H2O2存在下,3,3',5,5'-四甲基联苯胺(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine,TMB)被氧化催化产生蓝色信号。获得的LOD为2.2×106 EV/mL,比常规ELISA高100倍。但是,使用天然酶作为信号标签有许多缺点,例如需要复杂的纯化过程和谨慎的存储条件。近来,由于各种纳米酶具有低成本、批量制备能力以及对pH和温度变化的高耐受性等优点而受到广泛关注。Chen等[114]通过阴离子交换磁性纳米颗粒分离EV,然后添加核酸适配体修饰的氧化铁纳米颗粒(MNP),用于检测EV。该实验的基本原理是,核酸适配体修饰的MNPs具有较弱的内在HRP酶活性,当存在过氧化物酶的底物TMB和H2O2时,催化颜色发生变化。与裸露的MNPs相比,MNPs表面核酸适配体的存在增加了HRP酶活性,当EV存在时,这些核酸适配体可以通过分子识别与EV结合,并从MNPs表面解吸,适配体解吸后,这些MNPs的催化活性就会降低,然后当存在TMB和H2O2时颜色变化也会降低。该颜色变化可以通过紫外-可见光谱法检测,并且吸光度与EV浓度之间存在线性关系。该技术的LOD为7×106 EV/mL,对于从模拟前列腺癌血浆样品中分离出来的EV,其检出限LOD为3.5×106 EV/mL。Song等[115]利用聚合物分子印迹法制备出一种sEV人工磁性胶体抗体(artificial magnetic colloid antibodies,MCAs),可以用于细胞培养上清液及血清来源sEV的快速识别及分离。以磁性纳米颗粒(Fe3O4@SiO2)为载体内核,以sEV为模板,通过有机硅烷单体缩聚形成有机硅识别壳层。MCAs表面具有sEV三维印迹凹槽,可通过形状和大小高效识别及结合sEV。可用于细胞培养上清液和血清来源sEV的测定。与超速离心法相比,MCAs在20 min可完成sEV的捕获,且获得的sEV的量是超速离心法的三倍。此外,通过将MCAs分离技术与体积条形图芯片技术(MV-chip)结合,用于表面的蛋白标志物的分析。通过研究卵巢癌患者和健康对照组来源血浆中sEV表面蛋白标志物的表达,发现卵巢癌患者血浆样本中sEV表面EpCAM和CD24水平显著高于健康对照组。ROC分析结果显示,使用MV-chip检测多个特异性sEV标志物可有效区分OvCa患者,为促进卵巢癌的POCT诊断发展提供有力的支持。

基于丝网印刷电极的ECL生物传感器由于其成本低、操作简单和设计灵活在近年来受到了广泛关注,有望实现POCT。Jeong等[116]利用磁珠分离富集EV,抗体识别和酶促信号放大与丝网印刷电极相结合,设计了一种便携式八通道设备,该设备用于筛查卵巢癌患者血浆样品中的EV。

由于CTC在外周血中的稀有性,很容易被正常细胞掩蔽,再加上CTC的异质性以及缺少CTC特异性识别生物标记物,对POCT技术的灵敏度和特异性提出挑战。最近,Yang等[117]利用核酸适配体修饰的纳米颗粒(氧)使红墨水移动,移动距离与细胞浓度成线性关系。LOD可低至每毫升1个细胞。Gan与Xiang等[118]使用了两种抗体分别作为捕获探针和信号探针,实现了基于POCT的CTC检测。具体过程是用SK-BR-3细胞模拟血液中的CTCs,用EpCAM抗体功能化的磁珠作为捕获探针富集分离肿瘤细胞,然后用HER2抗体和转化酶共修饰的聚苯乙烯微球作为信号探针。底物蔗糖在转化酶的作用下可以转化为葡萄糖。然后利用普通的血糖仪传感器,就能实现CTC检测。该方法的LOD为每毫升7个细胞。基于硼酸酯的相互作用,Liu等[119]报道了电化学和比色法检测CTCs。适配体修饰磁珠用来捕获CTC,然后通过形成硼酸酯键来使二茂铁硼酸(FcBA)或4-巯基苯基硼酸(MPBA)分子减少,进而导致FcBA的电化学信号降低或阻止MPBA诱导AuNPs的聚集和颜色变化。FcBA可以用差分脉冲伏安法检测,MPBA诱导AuNPs的聚集和颜色变化可直接读出。该方法LOD可以达到每毫升50个细胞。

7 结论与展望

肿瘤的异质性是恶性实体瘤的特征之一,对癌症的分型、诊断和治疗都非常重要。CTC以及EV不同亚群的研究为研究肿瘤异质性提供一些见解,可用于研究癌症患者内和患者间的肿瘤异质性,不过对于代表异质性来源的检测信号的组织来源的溯源、对于信号临床诊断意义的确认等仍然充满挑战。

CTC检测在临床的应用积累了很多经验,也有产品通过了NMPA的产品注册,尽管已经取得了很大的进展,但在基于CTC的液体活检还有很长的路要走。由于CTC的稀少性对于检测技术的灵敏度和稳定性的提升仍然有很大的挑战性,纳米科技将持续为CTC检测技术的提升带来源源不断的技术输入,利用磁性核壳纳米颗粒等双功能纳米材料富集和检测CTC的方法来降低假阴性是非常有前途的;多靶点检测是另一种通过捕获和分析CTC亚群来提高检测灵敏度的方法,纳米材料是开发多靶点检测方法的理想材料,因为每个纳米颗粒可以与不同的特异性识别探针偶联;此外,将纳米材料与微流控装置结合也是CTC分离和检测方面的积极策略。这些技术都通过不断的临床实践给更多的癌症病人带来临床获益。

CTC检测的另一个未来方向将是CTC的分子分析,这可能更好地为临床决策提供信息。但是可靠和有效地描述CTC基因和蛋白表达谱的能力仍然有限。SERS NPs可能在单细胞水平上对蛋白质分析产生革命性的影响。SERS NPs可以高通量分析CTC蛋白标记物。在不改变纳米结构尺寸和形状的情况下,可以制备出多色SERS NPs(>10色)。因此,多色SERS NPs将为CTC表面蛋白的分析带来希望。

而EV的基础研究如火如荼,临床应用方面还处在起步阶段。尽管在该领域取得了进步,但样本异质性会影响EV的有效分析。许多因素,包括年龄、性别和体重指数等已知或怀疑会影响EV的分泌。因此,需要更多技术来检验样本异质性对EV的数量、功能和生物发生的影响。基于EV的标记应该通过一些简单的处理步骤进行检测,优先在无细胞的生物液体中直接检测。此外,还需要进一步的技术进步,以特异性地检测复杂混合物中肿瘤衍生的EV亚群,因为人类生物液体中含有来自不同细胞类型的EV的混合物。

灵敏度和特异性是EV检测中的重要问题,同样多靶点检测是提高灵敏度和特异性的首要选择。NPs上的取向可以极大地提高其灵敏度,通过控制功能化过程,可以帮助许多检测平台提高其性能。将EV的分离和检测集成到同一设备中的系统非常有希望成为自动化的POCT设备。产量很高EV的分离、高纯度回收方法也应得到重视。

最后,分离CTC的方法各种各样,没有统一的标准也导致最后分析结果的不同,使用纳米材料分析EV的大多数设备仍需要使用传统方法来提取细胞以及样本来源的EV。例如超速离心、密度梯度离心或尺寸排阻色谱等方法。这些传统的提取方法通常很耗时,需要熟练的技术人员执行,并且可能导致样品的损失以及污染。因此,如果没有标准的提取方法,很难建立详细的标准来比较评估这些检测平台的性能。并且许多报告尚且缺乏有关CTC与EV的基本信息或者检测技术的重要分析指标(例如,精确度、准确度或检出限等),这些都使得这些检测方法的应用受到限制。另外即使说明了检出限,由于不同研究方法之间的量化单位不同,因此很难进行真正的比较。因此制定更多CTC与EV相关标准迫在眉睫。另外大多数研究都是从细胞系中分离出的EV或将癌细胞稀释在PBS缓冲溶液中制备模拟外周血样本,这些都不能代表真实的血液复杂环境。虽然其中有一些包括了患者样本,但数量较少,还需要通过使用大量的患者样本,进而优化统计数据的结果。因此也需要更多的研究来建立模拟样本,使得研究更接近血液真实环境。

综上:对于CTC与EV检测技术本身来说,需要在以下四个方面提升:(1)提高技术的特异性、灵敏度和多靶点检测的能力。(2)提高纳米颗粒的稳定性,因为基于纳米颗粒的生物传感器的检测信号大多数来源于纳米颗粒,纳米颗粒的结构稳定性、分散稳定性、表面修饰的稳定性等是检测信号稳定性的保证。(3)传感器设备尽量便携,成本低廉,这些更易于临床应用。(4)开发更多CTC与EV表面蛋白及基因等分子分析相关的技术。(5)建立相应的标准样品、标准物质、标准检测方法以及临床的指南和共识,让学术界、产业界、监管部门更好地进行分析方法的性能评估以及促进分析方法的性能提升,从而更好地发挥它们的临床应用价值,例如早期诊断、预后判断、临床用药指导以及疾病进展监测等。虽然基于液体活检中CTC与EV的研究还面临着许多问题,相信与纳米颗粒相结合的生物传感器的发展可以在先进的液体活检技术领域发挥关键作用。在不久的将来,用于液体活检的灵敏、准确、廉价、方便、多靶点联合,高度集成的纳米生物传感器系统将在生命健康领域中发挥越来越重要的作用。

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国家重点研发项目(2017YFA0205000)

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国家自然科学基金项目(31971295)

国家自然科学基金项目(21773042)

关键前沿科学研究项目(QYZDJ-SSW-SLH048)

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