双光子荧光探针在生物传感中的应用

赵惠; 胡文博; 范曲立

doi:10.7536/PC210408

化学进展 ›› 2022, Vol. 34 ›› Issue (4) :815-823 DOI: 10.7536/PC210408

综述

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双光子荧光探针在生物传感中的应用

赵惠 ¹ ,
胡文博 ² ,
范曲立 ¹^,^*

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Two-Photon Fluorescence Probe in Bio-Sensor

Hui Zhao ¹ ,
Wenbo Hu ² ,
Quli Fan ¹^,^*

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摘要

荧光探针由于其灵敏度高、选择性好等优势已经成为研究复杂生物系统的有力工具。和单光子荧光探针相比,双光子荧光探针由于其激发光源较大的穿透深度、低的组织自发荧光干扰以及较好的空间选择性在生物传感中发挥着不可替代的重要作用。在本篇综述中,我们从双光子荧光探针的设计原理出发,系统全面地介绍了双光子荧光探针在金属离子、细胞微环境、活性物质(包含活性氧、活性氮、活性硫)、酶和亚细胞器(线粒体、溶酶体)等检测中的应用研究。在此之后,展望了有机双光子荧光探针在开发和应用方面尚待科学界解决的关键机遇和挑战。

Abstract

Fluorescent probes have become a powerful tool for the study of complex biological systems due to their high sensitivity and selectivity. Compared with single-photon fluorescence probe, two-photon fluorescence probe (TPFP) plays an irreplaceable role in biosensor due to its larger penetration depth, lower interference of tissue autofluorescence and better spatial selectivity. In this review, starting from the design strategies of TPFP, we systematically and comprehensively introduce the application of TPFP in the determination of metal ions, celluar microenvironment, reactive species (including reactive oxygen species ROS, reactive nitrogen RNS, reactive sulfur RSS), enzymes, organelles (mitochondria, lysosomes) and so on. After that, we look forward to the key opportunities and challenges in the development and application of organic TPFP.

Contents

1 Introduction

2 Design principle of two-photon fluorescence probes

3 Bio-application of two-photon fluorescence probes

3.1 Two-photon probes for metal ions

3.2 Two-photon probes for cellular microenvironment

3.3 Two-photon probes for reactive species

3.4 Two-photon probes for enzymes

3.5 Two-photon probes for organelles

4 Conclusion and outlook

Graphical abstract

关键词

荧光探针 / 双光子吸收 / 生物传感

Key words

fluorescent probe / two-photon absorption / bio-sensor

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赵惠, 胡文博, 范曲立. 双光子荧光探针在生物传感中的应用[J]. 化学进展, 2022, 34(4): 815-823 DOI:10.7536/PC210408

Hui Zhao, Wenbo Hu, Quli Fan. Two-Photon Fluorescence Probe in Bio-Sensor[J]. Progress in Chemistry, 2022, 34(4): 815-823 DOI:10.7536/PC210408

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1 引言

荧光探针是指能够与被分析物相互作用并伴随其光谱性质的变化来确定被分析物的物质。其中,小分子荧光探针由于可以很容易被细胞负载,并且能够快速检测生物环境中的目标分子,因此在生物系统的研究中应用非常广泛^[1,2]。常见的小分子荧光探针大多数都是基于普通的荧光团(如荧光素、香豆素、BODIPY、罗丹明等)设计开发而来的^[3]。然而这些荧光团通常都是单光子激发,激发波长处于紫外-可见光区域(350~550 nm),这类荧光探针在检测过程中会受到光散射、自体荧光以及光损伤等情况的干扰,因此制约了小分子荧光探针在生物检测中的发展应用^[4]。

为了解决以上问题,双光子激发荧光探针的概念被提出。双光子激发是指在强激光光源的激发下,材料同时吸收两个长波长的光子,通过一个虚拟的中间态跃迁到高能态,发射出一个波长较短的光子的过程^[5](图1)。和单光子激发荧光探针相比,一方面,双光子吸收材料的激发波长处于生物光学透明窗口(650~950 nm)范围内,可以有效提高组织穿透深度(>500 μm);另一方面,双光子激发只会发生在激发光源焦平面处,能够增加空间选择性^[6]。目前,基于双光子激发的荧光探针已经广泛应用于细胞中某些物质的定位、运动和浓度的探测,它的发展对于临床诊断以及药物筛选等领域的发展都具有重要的意义^[7]。

在本篇综述中,我们从双光子荧光探针的设计原理出发,系统全面地介绍了有机双光子荧光探针在金属离子、细胞微环境、活性物质(包括活性氧ROS、活性氮RNS、活性硫RSS)、酶和细胞器(线粒体、溶酶体)等检测中的应用研究,最后对其应用前景进行概括,并展望了有机双光子荧光探针在开发和应用方面的机遇和挑战,为未来设计性能更加优异的有机双光子荧光探针提供参考。

2 双光子荧光探针的设计原理

双光子荧光探针与单光子荧光探针的设计原理基本是一致的^[8],它通常由三个部分组成,第一部分是双光子荧光团,当双光子荧光探针与目标分子结合或反应后,双光子荧光团的荧光发射强度和波长会发生变化。第二部分是识别受体,用于与目标分子结合或反应。第三部分用于连接双光子荧光团和受体^[9]。

目前文献报道的双光子荧光探针作用机制主要可以分为以下三种,第一种是光诱导电子转移(PET)(图2a),PET过程是指在光激发条件下,供电子基团能够将其处于最高能级的电子转入激发态下荧光基团空出的电子轨道,使被光激发的电子无法直接跃迁到原基态轨道发射荧光,从而导致荧光的猝灭。当与目标分子结合后,供电子基团的给电子能力降低,PET过程被抑制,荧光基团中被光激发的电子能够直接跃迁回原基态轨道,从而增强双光子荧光团的荧光发射。

第二种是分子内电荷转移(ICT),基于ICT的双光子荧光探针主要由供电子基团和吸电子基团连接而成,在基态时表现为极化结构,而在光激发条件下,偶极矩增大,容易发生ICT过程(图2b)。例如,当目标分子是阳离子时,如果它与吸电子基团结合,将增大分子内电荷转移程度,导致荧光光谱红移,而如果它与供电子基团结合,则使共轭体系的推-拉电子特征下降,导致荧光光谱蓝移。

第三种是荧光共振能量转移过程(FRET),此类探针一般是由两个荧光团通过一个柔性受体连接,这两个荧光基团一个是能量供体,另一个是能量受体。FRET过程的发生与很多因素有关,比如光谱重叠程度、跃迁偶极的相对方向、供体与受体之间的距离等。未结合目标分子前,两个荧光团紧密连接,产生共振能量转移致使荧光猝灭,一旦受体与目标分子结合后,两个紧密连接的荧光团会彼此分开,共振能量迁移被阻断,探针荧光恢复(图2c)。下面,我们将通过具体实例分析这些双光子荧光探针的作用机制在生物检测中的实施过程。

3 双光子荧光探针的生物应用

3.1 金属离子检测

细胞内的金属离子作为结构或催化所需的辅助因子,在调节细胞功能和参与许多细胞过程中起着重要作用^[10]。金属离子稳态平衡的破坏会导致衰老和疾病,包括癌症、神经性疾病和糖尿病等。为了保证正常的代谢过程,必须严格控制金属离子的稳态。因此,开发能够在活细胞、组织和生物水平检测金属离子的双光子荧光探针非常重要。

通常,金属离子响应性的双光子荧光探针是由双光子荧光团和能够结合金属离子的受体组成的。根据荧光强度的变化或者发射峰位置的变化,可以将这些探针分为两大类。常见的打开/关闭型(turn-on/off)探针主要依赖于荧光强度的变化,因为与金属离子结合会改变荧光探针的双光子吸收截面,最终表现出荧光亮度的变化。锌元素作为人体内的一种微量元素,在基因转录、细胞增殖、蛋白质代谢和抗氧化等方面发挥着重要作用。检测锌离子(Zn²⁺)浓度的变化对于研究Zn²⁺相关疾病如阿尔茨海默症、帕金森病和前列腺癌具有重要意义。Ahn等通过将吗啉基团和N,N-二-(2-吡啶基)乙二胺(DPEN)配体共轭到萘酰亚胺染料上,开发了用于检测溶酶体中Zn²⁺的新型双光子荧光探针(图3)^[11],此探针在加入Zn²⁺后,PET过程受到抑制,导致它在pH=5.0条件下表现出明显的荧光增强。然而,在pH=7.4条件下,此探针只表现出微弱的荧光,表明它能够特异性识别溶酶体中的Zn²⁺。当用900 nm光激发时,此探针能够检测NIH 3T3细胞溶酶体内的Zn²⁺。此外,它还可以通过双光子显微成像技术对小鼠脑深部组织内源性Zn²⁺进行成像。和上述检测原理类似,一系列其他类型的双光子荧光探针也已被报道,它们分别在与一价铜离子(Cu⁺)^[12]、钙离子(Ca²⁺)^[13]、镁离子(Mg²⁺)^[14]、钠离子(Na⁺)^[15]、铁离子(Fe³⁺)^[16,17]和汞离子(Hg²⁺)^[18]等金属离子结合时都表现出明显的荧光增强。

然而,上述打开/关闭型探针只是通过猝灭荧光团的发光来改变探针发光的亮度,却没有改变发色团固有的性质。由于细胞内的光漂白、不均匀分布和噪音信号的存在,很难准确区分实际荧光信号的强度变化。因此,仅仅依赖单一荧光强度变化来获取细胞内金属离子的定量信息在一定程度上是不可靠的。相比较而言,与金属离子结合时发射峰位置的变化可以抵消上述因素引起的荧光强度差异。在典型的双光子荧光探针的设计中,金属离子的结合可同时改变荧光强度和发射峰的位置。Tian等报道了一种基于ICT的Zn²⁺比率双光子荧光探针(图4)。它是由2,2-联吡啶基作为电子受体,苯基作为电子供体,烯烃作为连接体结合而成,表现为D-π-A-π-D结构^[19]。由于烯烃较大的共轭长度和苯基强的给电子能力,此探针在700 nm波长处具有较大的双光子吸收截面(516±77 GM),当探针与Zn²⁺配位后双光子吸收截面增加到958±144 GM。此外,在加入Zn²⁺后,探针的荧光量子效率由0.59增强至0.71。通过双光子荧光发射光谱可以看出,加入Zn²⁺后,此探针的发射光谱由465 nm红移到550 nm。进一步通过双光子共聚焦荧光成像可以观察到,在SHSY-5Y细胞中,双光子荧光探针红色通道(495~585 nm)与绿色通道(460~495 nm)的荧光发射比(I_red/I_green)与Zn²⁺浓度呈剂量依赖性。此外,此探针还可用于监测患有阿尔茨海默病的小鼠大脑和斑马鱼体内Zn²⁺水平的增加,证明它可以作为一个强大的双光子荧光探针来检测活体内Zn²⁺的内源性水平。类似的比率型双光子荧光探针用于检测铜离子(Cu²⁺)^[20]、镁离子(Mg²⁺)^[21]、钯离子(Pd²⁺)^[22]等也已成功被开发。

3.2 细胞微环境检测

pH、极性和黏度是细胞微环境的重要参数,在控制细胞内信号传导、转运、与生物大分子相互作用等方面起着重要作用。这些参数的不平衡会导致细胞功能紊乱。

其中,pH作为一种重要的细胞微环境因子,与细胞增殖、凋亡、内吞过程和酶活性调节等多种细胞行为密切相关。在不同的细胞室中,pH值从4.0变化到8.0,其中,细胞质pH值接近7.2,而线粒体pH值约为8.0,溶酶体pH值为酸性(pH值4.0~5.5)。pH值的异常变化可以被认为是许多疾病的标志,包括炎症、阿尔茨海默病和癌症等。目前常见的用于检测pH的双光子荧光探针通常都是依赖于质子化过程中其吸收或发射光谱的位移变化。例如,Kim等报道了一种基于2-萘酚的比率型双光子荧光探针^[23],该探针以苯并咪唑-2-酮为荧光团,三苯基磷盐为线粒体靶向单元(图5)。苯并咪唑质子化后,由于其吸电子能力的增强和ICT作用的增强,它的荧光在604 nm处逐渐增强,在540 nm处逐渐减弱。在820 nm的双光子光源激发下,用荧光比(I_red/I_green)可以测定探针标记的HeLa细胞线粒体pH的异质性。

类似地,Park等开发了一种比率型双光子荧光探针^[24],将吡啶连接到2-甲氧基-6-(5-口恶唑基)萘的荧光团中作为质子化位点,因为吡啶的pK_a约为5.0,适合检测弱酸性环境,吡啶氮原子质子化后吸电子能力的增强,ICT作用增强,使荧光红移,从而可以用比值法检测pH值。

针对细胞微环境中的极性所设计的探针大多也是基于ICT原理,当周围溶剂的极性发生变化时,探针的荧光会发生明显的蓝/红移或者发生荧光强度的变化。Lin等报道了一种具有“D-π-A”结构的双光子荧光探针,有助于检测活体系统中的溶酶体极性(图6)^[25]。它使用1,8-萘酰亚胺作为双光子荧光团和电子受体,二苯胺作为电子供体,它们之间通过苯基连接。其中,吗啉是溶酶体靶向基团,能够促进探针在溶酶体中的积累。当溶剂从非极性溶剂甲苯变为极性溶剂DMSO时,此探针的荧光光谱显示出高达106 nm的红移,荧光强度从0.308降低到0.009,降低了43倍。此探针在低极性溶酶体中荧光较强,而在高极性溶酶体中荧光变弱,这主要是由于正溶剂化作用引起的。最后,用此探针可以对胚胎和成年斑马鱼模型的极性变化进行成像,发现在500~550 nm处胚胎斑马鱼的荧光增强了1.8倍,说明胚胎斑马鱼的极性环境低于成年斑马鱼。

作为活细胞的主要特性,亚细胞黏度在扩散介导的细胞过程中对控制扩散和双分子反应速率起着重要作用。大多数黏度响应探针都包含可旋转的共轭部分,环境黏度的变化可以通过控制其分子旋转的程度从而改变荧光强度。Lin等基于此设计了一种具有深红色荧光发射的开启型双光子荧光探针,用于监测线粒体的黏度(图7)^[26]。此探针的设计主要基于限制半菁的自由旋转从而提高探针荧光强度,并使用咔唑、半菁分别作为线粒体靶向基团和可旋转基团。当在低黏度(1.4 cP)的甲醇-甘油体系中检测时,探针在520 nm光激发下呈较弱的荧光,表明探针的荧光由于半菁的自由旋转被猝灭。然而,在高黏度体系(956 cp)中,由于抑制了咔唑部分和吲哚盐之间单键的自由旋转,发射强度提高了32倍。经莫能菌素或制霉菌素负载后的HeLa细胞和斑马鱼在单光子模式和双光子模式下均显示出增强的荧光,最后分别在炎症、脂肪肝和肿瘤模型中验证了此探针跟踪黏度的能力。

3.3 活性物质检测

活性氧(ROS)是氧正常代谢的天然副产物,包括过氧化氢(H₂O₂)、单线态氧(¹O₂)、超氧阴离子自由基(

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)、过氧化氢自由基(HO₂·)、羟基自由基(HO·)、过氧自由基(RO₂·)和次氯酸(HOCl)等。

其中,在生命系统中产生的最重要的初级活性氧是

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,它在维持细胞氧化还原稳态中起着重要作用。

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的浓度是其他ROS水平的重要反映,因为首先在线粒体内产生的

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将迅速转化为H₂O₂,从而导致其他ROS的形成。然而,过多的

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水平会导致缺血再灌注、退行性疾病和许多其他氧化应激引起的疾病。因此,开发一种追踪

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的新型荧光探针具有越来越重要的意义。为此,Zhang等设计了一种基于咖啡酸苯乙酯和

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之间相互作用的新型开启型双光子荧光探针,在

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存在条件下,咖啡酸的邻苯二酚结构由原来的电子供体被氧化成电子受体苯醌,从而使探针的荧光增强。它可以用于动态和可逆地研究肝细胞、斑马鱼和小鼠在模拟缺血-再灌注损伤期间的

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波动,具有高分辨率和较大的组织穿透深度^[27]。Yoon等在之前对高度亲核的

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和ONOO^-敏感的磷酸基团工作的启发下,开发了一种新的基于开启式硫代磷酸盐的双光子荧光探针,用于检测

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(图8)^[28]。它首次将硫代磷酸盐部分用作对

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的特定反应位点。亲核的

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首先与缺电子的磷基反应,随后,磷基中相对较弱的π键被破坏,形成带负电的氧,然后伴随着副产物二苯基磷酸(DPPA)的产生形成磷氧双键,并且产生高荧光亮度的5-(二甲氨基)-萘-1-硫醇。值得一提的是,这个探针可以很容易地通过一步反应合成,具有较好的光稳定性和生物相容性,同时它对

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具有较高的特异性和敏感性,结果表明此探针在470 nm处的发射强度与

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浓度呈线性关系。

H₂O₂是细胞信号传导的关键调节因子,通过NADPH氧化酶复合物的激活从

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中衍生出来。H₂O₂参与多种生物反应,刺激细胞增殖、分化、迁移和死亡。越来越多的证据表明,过量的H₂O₂与许多疾病有关,例如心血管疾病、神经退行性疾病和癌症。因此,研制高效的H₂O₂响应荧光探针对于阐明H₂O₂的生物学功能具有重要意义。Masanta等开发了一种新型比率荧光探针用于检测线粒体H₂O₂^[29],该探针以芳基硼酸酯基氨基甲酸酯为H₂O₂反应位点,三苯基磷为线粒体靶向部分。此探针具有较大的双光子吸收截面,对H₂O₂有明显的发光颜色变化,并且其具有对H₂O₂选择性好、细胞毒性低、对生物膜pH不敏感等特点,这使得活体细胞及100~180 mm深度的活体组织中线粒体H₂O₂水平的变化可视化,并且不受其他生物相关物种的干扰。类似地,Tang等也合成了一种基于黄酮醇-硼酸盐结合物的双光子荧光传感器,它能够以光可控的方式实现特定的H₂O₂响应和CO的精确释放(图9)^[30],在H₂O₂存在下,探针的最大吸收波长红移,并且在480 nm和585 nm处出现了两个荧光发射峰,其中585 nm处的发射主要是由于被保护的羟基的释放,恢复了激发态分子内质子转移导致的。

次氯酸(HOCl)是一种有效的中性粒细胞抗氧化抗菌剂,主要由髓过氧化物酶催化H₂O₂和氯离子(Cl^-)产生。HOCl在天然免疫系统中具有特殊的抗菌作用,能氧化修饰各种蛋白质官能团(巯基和氨基)生成氯胺和醛产物,提高机体免疫力。然而,过量的HOCl与许多疾病有关,如类风湿性关节炎、帕金森病、阿尔茨海默病和癌症。因此,开发HOCl响应性探针对于了解其生物学效应非常必要。Mao等开发了一种基于喹诺酮的比率型双光子荧光探针用于检测HOCl(图10)^[31]。利用 HOCl氧化和脱保护氧硫杂环戊基导致ICT效应增强,荧光发射红移。此外,具有典型“推-拉”结构的反应产物能够促进其双光子吸收,使其能通过双光子荧光显微镜监测HOCl的波动。实验结果表明,HOCl的加入使探针492 nm处的发射强度减弱,562 nm处的发射增强。此外,在820 nm双光子激发条件下,能够在 RAW264.7细胞中检测到内源性HOCl。更重要的是,在伤口愈合过程中产生的过量HOCl也能够通过比率双光子荧光成像进行监测。

活性氮(RNS)是一类由一氧化氮(NO)衍生的具有化学活性的分子,与活性氧(ROS)共同作用于细胞。研究发现NO是一种重要的信号分子,参与许多生理和病理过程的调控。尤其是NO可以作为一种神经递质,通过在中枢神经系统中的扩散作用于邻近的神经元。此外,NO对心血管的保护作用也得到了证实。NO稳态失调与许多疾病有关,如阿尔茨海默病、肺纤维化、缺血再灌注损伤和癌症。因此,对完整组织中NO的监测对于了解其生物学作用至关重要。Xiao等基于萘酰亚胺结构设计了第一个靶向溶酶体的用于检测NO的双光子荧光探针^[32],其中,萘酰亚胺衍生物是一类具有优良双光子性质的荧光团,并已经被广泛应用于双光子荧光探针的设计^[33],在此结构中引入邻苯二胺,可以利用PET效应实现对NO的特异性识别。Seo等开发了一种快速而特异的NO反应双光子荧光探针^[34],其中乙酰氨基作为报告物,二氨基苯作为NO的反应位点被脯氨酸连接。与NO反应后,双光子激发荧光强度在5 min内增加了68倍,这可能是由于被氧化后PET被阻断所致。此外,Mao等首次开发了用于检测NO的远红外发射的双光子荧光探针(图11)^[35]。它以邻苯二胺作为NO识别位点,尼罗红作为双光子荧光团构建的。最初,尼罗红的荧光通过PET过程被邻苯二胺单元阻断。当探针与NO接触时,邻苯二胺转化为三唑,从而破坏PET过程,导致远红外发射(最大为650 nm)。此探针能够在820 nm激发下分别对HeLa和RAW264.7细胞外源性和内源性NO进行双光子荧光成像。此外,它还能够以高分辨率对168 mm深度的小鼠肝组织中的NO进行成像。

硫化氢(H₂S)是一种能与ROS和RNS发生强烈相互作用的活性硫。各种生理过程,包括神经元传递的调节、胰岛素释放的调节、平滑肌的松弛和代谢率的降低都与H₂S有关。因此,对H₂S的高选择性识别对了解其生物学和病理功能具有重要意义。叠氮基具有很强的吸电子能力,是目前比较常用的H₂S识别方法。叠氮化物的引入会破坏典型的D-π-A结构,导致无双光子激发荧光。当这种叠氮基被H₂S特异性地还原为电子供体氨基时,它将表现出强烈的荧光发射。基于这一机制,Bae等报道了一种线粒体定位的双光子荧光探针,以萘衍生物作为双光子发色团,4-叠氮苄基氨基甲酸酯作为H₂S反应位点,三苯基膦盐作为线粒体靶向部分^[36]。在硫氰酸盐与叠氮基反应后,通过改变发射峰位置和增加双光子吸收截面,实现了对活体星形胶质细胞和活体脑片中H₂S的定量检测。此外,Tang等还报道了一种可以同时检测H₂S和HOCl的双光子荧光探针(图12)^[37],它是用哌嗪连接7-氨基香豆素和罗丹明B构建的,其中,硫内酯和叠氮基分别作为HOCl和H₂S反应基团。当单独加入HOCl后,580 nm处的荧光逐渐增加。单独添加H₂S会导致445 nm处的发射逐渐增强,这主要是由于香豆素衍生物形成D-π-A结构导致的。此探针可以在750 nm的双光子激发条件下,分别成像RAW264.7细胞中内源性生成的H₂S和HOCl。与单响应探针相比,这种双响应探针可以在同一生物系统中通过测量两种分析物获取不同的信息,这对于探索与多种疾病和紊乱相关的多种分析物的生物学效应具有重要意义。

3.4 酶检测

酶是具有高度选择性的催化剂,在加速代谢反应速度和特异性方面起着至关重要的作用。酶活性的异常与多种疾病的发生有关,包括帕金森病、阿尔茨海默症和癌症。确定这些酶在活细胞中的位置和表达水平对于早期诊断和监测疾病治疗的有效性至关重要。

Hu等通过将双光子荧光团纳入模块化探针设计,首次报道了用于检测酶的双光子荧光探针^[38]。这种模块化设计需要包含一个酶底物、一个荧光团和一个猝灭剂。由于FRET作用,探针通常处于关闭状态,因为荧光团被猝灭剂有效猝灭。当被引入细胞后,酶底物的酶切反应导致猝灭基团的释放,同时释放的还有高荧光的中间产物,它具有足够长的半衰期以扩散出酶活性位点,并标记与预期靶点位于同一亚细胞器中的可用蛋白质,由于荧光团在原位活性位点的累积从而导致荧光放大。这种具有良好时空分辨率的新型荧光探针有望扩大体内活性探针的广度,为细胞生物学研究开辟许多新途径。最近,Tian等同样基于FRET开发了一种能够检测β-分泌酶(BACE1)的双光子比率荧光探针^[39]。BACE1是阿尔茨海默症中的一种重要的酶。此探针以花青衍生物(mCyd)作为能量供体,Alexa Fluor 633(AF633)作为能量受体。它们之间由肽链连接,此肽链能够被BACE1高选择性切割(图13)。当探针在820 nm双光子光源激发条件下,主要表现AF633的发射光,因此在651 nm处为最大发射。随后,随着BACE1的增加,由于mCyd和AF633之间的FRET消失,主要表现mCyd的发射光,因此651 nm处的发射峰强度逐渐减弱,578 nm处发射增强。最终,通过双光子荧光成像检测到阿尔茨海默症小鼠海马区的BACE1,成像深度可达300 mm。

另外,甾体硫酸酯酶(STS)也是比较重要的一种酶类,它主要来源于内质网,负责芳基和烷基甾体硫酸盐的水解。STS的活性和反应与包括雌激素相关的乳腺癌在内的生理过程和病理条件有关。与正常组织相比,乳腺肿瘤组织中STS表达增加。最近,Li等设计合成了一种基于双光子荧光染料4-羟基-1,8-萘酰亚胺的双光子荧光探针,用于STS的比率检测^[40]。其中,硫酸基团和甲基磺酰胺基团分别作为STS识别位点和内质网靶向基团。它主要基于ICT机制,通过改变羟基上的给电子能力来调控其荧光强度。当探针添加STS后,由于酶解和苯酚的释放,可以观察到探针的红移发射。最后,利用双光子三维成像技术,可以监测乳腺肿瘤组织STS活性的增强情况。

除了能够检测酶类,双光子荧光探针还可用于蛋白质标签标记。Xiao等利用萘酰亚胺开发了一种高效的双光子荧光团,用于亚细胞蛋白质的特异性标记和成像^[41]。蛋白质标记的萘酰亚胺具有较大的双光子吸收截面,在蛋白质特异性双光子荧光成像中具有潜在的应用前景。

3.5 亚细胞器检测

特异定位亚细胞器的双光子荧光探针的开发对于阐明细胞活动具有重要意义。溶酶体是一种典型的酸性细胞器,pH值为4.5~5.5,主要作用是消化食物或者分解死亡细胞。此外,当肿瘤侵袭时,溶酶体的定位常常由核周区向周围区域改变。因此,溶酶体探针的开发对于活细胞中溶酶体的定位和运动以及研究肿瘤侵袭过程中细胞的活动过程具有重要意义。通常情况下,作为质子化位点的叔胺经常被引入溶酶体探针中,在酸性囊泡中质子化,同时伴随双光子荧光的增强。为了确定探针在细胞中的位置,通常需要将细胞与荧光探针进行共定位,以检测靶点和溶酶体的位置。Wang等设计合成了基于芴的溶酶体探针LT1,在芴的9位有一对10个单元的聚乙二醇(PEG)基团,使探针具有较好的水溶性和生物相容性^[42]。用LT1和市售的单光子荧光探针(LT-Red)共染色HCT116细胞的单光子荧光图像显示,LT1与LT-Red在细胞中的定位几乎相同,表明LT1具有较高的溶酶体特异性。然后对HCT116细胞进行初步的双光子荧光成像,证明了LT1探针作为检测溶酶体的双光子荧光探针的优势。然而,利用单光子荧光探针与溶酶体双光子荧光探针偶联来显示溶酶体在细胞中的分布是有争议的,因为双光子荧光成像和单光子荧光成像必须是在溶酶体可以移动的间隔获得。为了克服这一争议,采用两个溶酶体双光子荧光探针同时成像是一种首选方法。Son等开发了两种双光子荧光探针(CTL-blue和CTL-yellow),它们的发射峰位置离得较远,可以用于共定位实验^[43]。用CTL-blue和CTL-yellow共标记的HeLa细胞的双光子荧光成像图表现出几乎完美的重叠。

线粒体最突出的作用是以ATP的形式产生能量。此外,线粒体参与控制各种细胞生物过程,如氨基酸和脂质的生物合成、细胞程序性死亡、钙离子和ROS水平。鉴于线粒体在细胞凋亡途径的调控中起着关键作用,许多以线粒体为靶点的抗癌药物已经被开发出来。Tang等设计了一种具有聚集诱导发射(AIE)和拉曼输出的双模线粒体靶向探针,用于活体线粒体成像^[44](图14)。此探针以氰基苯乙烯作为AIE骨架,吡啶盐作为线粒体的靶向基团,二苯乙炔作为拉曼信号报告因子,拉曼信号峰在2225 cm^-1。在DMSO中,探针在380 nm处有吸收,500 nm处有荧光发射。在800 nm的双光子激发下,它的双光子吸收截面为14.2 GM。当水含量从0%增加到70%时,由于极性增加导致分子内扭曲电荷转移过程增强,荧光强度降低。随着水含量从70%增加到99%,AIE作用诱导荧光增强。此外,探针在780 nm处表现出最大的双光子激发,并且双光子荧光强度随着探针浓度的增加而增强。

4 结论与展望

本文从双光子荧光探针的原理出发,综述了许多研究小组对双光子荧光探针在生物传感应用中的研究。然而,目前大多数双光子荧光探针虽然可以实现近红外光激发,但是它们的发射波长相对较短,开发具有近红外发射的双光子荧光探针,能够在成像过程中减少发射光散射,并且实现更深穿透深度^[45]。此外,目前常见的双光子荧光团的吸收截面较小,并且由于周围水分子的猝灭作用,其双光子吸收截面会进一步降低,在荧光探针的生物应用中,探针成像的亮度不够,无法获取高质量的图片。在这种情况下,增加激光强度是弥补上述缺点的一种方法,然而,增加激光强度很容易超过光热损伤的阈值,因此,探索双光子吸收截面较大的双光子荧光团,对于其在生物传感中的应用具有很重要的意义。

此外,比率型双光子荧光探针的开发也是非常重要的,它可以促进生物医学应用中由于内部校准而进行的定量测量,基于FRET的系统可以为比率型双光子荧光探针的设计提供一种潜在的策略。最后,在开发高效的双光子荧光探针时,还应考虑目前在单光子荧光探针设计中众所周知的因素,包括水溶性、荧光量子效率、光稳定性、细胞毒性和细胞通透性等。

参考文献

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