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丝素蛋白3D打印在生物医学领域中的应用

古孝雪 ,  于晶 ,  杨明英 ,  帅亚俊

化学进展 ›› 2022, Vol. 34 ›› Issue (6) :1359-1368

PDF (7962KB)
化学进展 ›› 2022, Vol. 34 ›› Issue (6) :1359-1368 DOI: 10.7536/PC210633
综述与评论
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丝素蛋白3D打印在生物医学领域中的应用

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Silk Fibroin-Based 3D Printing Strategies for Biomedical Applications

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摘要

增材制造,也称为三维(3D)打印,正推动制造、工程、医学等领域的全面创新升级。3D打印技术由于能够个性化定制生物的复杂3D微结构,构建仿生的功能化活组织或人工器官,近十年来在生物医学领域中取得了长足的发展。丝素蛋白(SF)是一种来源丰富、生物可降解、力学性能优良、细胞相容性极佳的天然有机高分子,为3D打印墨水的设计提供了一种有前景的选择。然而,作为结构蛋白,单一组分的SF具有的生理功能有限,且其经过打印后的稳定性较差,限制了SF在3D打印以及生物医药领域中的进一步发展。为此,研究人员通过化学改性技术和先进3D打印技术相结合,使得改性后的SF能够更适用于3D打印,并发展成为一种具有应用价值的生物材料。本文综述了SF的结构特征、SF的化学修饰策略、打印墨水的制备策略以及3D打印SF材料在生物医学领域的最新应用进展,并展望了3D打印SF生物材料的未来发展趋势,为其在更广阔领域的应用提供一定的借鉴。

Abstract

Additive manufacturing, also known as three-dimensional (3D) printing, drives comprehensive innovations and upgrades in manufacturing, engineering, medicine, and other fields. 3D printing technology has made great progress in the biomedicine field in the past decade due to its ability to customize the complex 3D microstructures of organisms and construct biomimetic functional living tissues or artificial organs. In addition, silk fibroin (SF) is a natural organic polymer with abundant sources, biodegradable, excellent mechanical properties, and good cytocompatibility, which provides a promising choice for the design of 3D-printing inks. However, as a structural protein, single-component SF has limited physiological functions, and poor stability after printing, which limits the further development of SF in 3D printing and biomedical fields. For these reasons, researchers combined advanced 3D printing technologies with chemical modification methods to make the modified SF easy to be used for 3D printing and develop into a valuable biomaterial. Here, this article reviews the structural characteristics of SF, chemical modification strategies of SF, preparation strategies of printing inks and the latest application progress of 3D printed SF materials in the biomedical field. Meanwhile, we also look forward to the future development trend of 3D printed SF biomaterials, which provides a useful guideline for its application in a wider field.

Contents

1 Introduction

2 The structures and characteristics of SF

3 Preparation strategies of bio-inks

3.1 Compounding with polymers

3.2 Compounding with inorganics

3.3 Self cross-linking

3.4 Chemical modification

4 3D printing technologies

4.1 Inkjet

4.2 Extrusion

4.3 Photo-curing

5 Applications in the field of biomedical

5.1 Blood vessel regeneration

5.2 Cartilage repair

5.3 Bone repair

5.4 Skin healing

6 Conclusions and outlook

Graphical abstract

关键词

3D打印 / 丝素蛋白 / 生物墨水 / 生物材料

Key words

3D printing / silk fibroin / bio-ink / biomaterial

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古孝雪, 于晶, 杨明英, 帅亚俊. 丝素蛋白3D打印在生物医学领域中的应用[J]. 化学进展, 2022, 34(6): 1359-1368 DOI:10.7536/PC210633
Xiaoxue Gu, Jing Yu, Mingying Yang, Yajun Shuai. Silk Fibroin-Based 3D Printing Strategies for Biomedical Applications[J]. Progress in Chemistry, 2022, 34(6): 1359-1368 DOI:10.7536/PC210633

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1 引言

蚕丝纤维是一种高级的纺织原料,也是一种宝贵的天然有机高分子资源。其包括桑蚕丝(又称家蚕丝)和非桑蚕丝(如柞蚕丝、蓖麻蚕丝、天蚕丝等)两大类[1⇓⇓~4]。单根蚕丝纤维是由丝胶蛋白包裹着两根丝素单纤维共同组成。通过脱胶工艺去除蚕丝纤维表面的丝胶蛋白后,再进行溶解,可得到再生丝素(SF)水溶液[5]。以再生丝素水溶液为原料,通过冷冻干燥、相分离、静电纺丝、气体发泡、溶剂浇筑等传统的加工工艺和手段,可制备出多种形态和尺度的SF生物材料,用于缺损组织器官的修复以及在柔性传感器件中的应用[6⇓⇓⇓⇓⇓~12]。虽然传统的生物材料制备方法能够制备出规则形状的多孔支架材料,但其内部缺乏组织细胞迁移分化所需的孔隙率、多孔互联性以及复杂精细的微纳结构,限制了该类生物材料在生物医学领域的进一步应用[13]。

3D打印技术可以根据实际需要设计制造复杂精密的微结构和几何外形,用以促进体内受损组织和器官的再生,因此具有传统支架制备方法所不具备的优势,近年来在生物医学领域中发挥着不可忽视的作用[14⇓⇓⇓⇓~19]。由于SF来源丰富,种类繁多,可被加工和化学修饰,已被越来越多的研究者选择为3D打印的原材料,并且在生物医学领域得到了广泛的应用[20⇓⇓⇓~24]。

近五年来,关于3D打印SF研究和应用的报道与日俱增,但是相关的综述文章寥寥可数[18]。为此,本综述系统地梳理了该领域的最新研究进展,总结经验和规律,同时展望了有着古老历史的蚕丝通过3D打印技术焕发出的新功能和新用途。

2 丝素蛋白的结构与特征

作为研究最多的桑蚕(Bombyx mori)丝纤维是由占质量分数70%左右的SF和25%的丝胶蛋白组成,另外5%左右为其他物质。SF是由三个亚单元即重链、轻链和糖蛋白p25通过二硫键和疏水键结合形成[25,26]。其二级结构主要由无规卷曲和β-折叠两种构象组成。通过调控二级结构组成以及各结构之间的比例可以制得形态和性能各异的生物材料[27,28]。

由于SF的肽链中含有约1/4的极性氨基酸,因此很容易通过化学或物理方法,引入生物活性基团,赋予其特定的功能,从而提高3D打印SF材料的结构稳定性和生物功能性[29⇓~31]。

3 生物墨水制备策略

生物墨水的设计是3D打印过程中至关重要的一环,其中的几个重要参数,包括墨水溶液的剪切稀化特性、细胞相容性、溶胀比、表面张力和凝胶动力学等性能都是需要考虑的变量[32,33]。必须根据具体打印和应用要求进行合理选择。与许多生物大分子一样,再生SF溶液在其自然状态下并不满足这些特性,需要进一步改性和优化,才能满足可打印的需求(表1)。

3.1 高分子复合法

基于SF的理化特性,将SF与其他种类的高分子如明胶、海藻酸盐、壳聚糖、聚乙二醇、纤维素等混合后可以制备复合3D打印原液[41]。甚至有学者将桑蚕SF与蓖麻蚕SF以及明胶进行复合制备三元打印液的报道[22]。通过优化复合打印液的基本参数,可以改变3D打印材料的形状保真度、可打印性、机械性能和细胞存活率等[42⇓⇓⇓⇓⇓⇓~49]。

Rodriguez等[20]将甘油以3∶1的固定比例混合在SF溶液中,随后将SF/甘油溶液与明胶溶液按照2∶1的比例混合,再涡旋处理得到SF/明胶复合打印液。由于SF与甘油混合后可较为快速地产生不溶性结构,再通过温度控制明胶的凝胶-溶胶相变过程,使得SF/甘油/明胶复合打印液可进行3D打印,而无需添加其他有毒交联试剂。

为了证明SF与合成聚合物之间制备复合墨水的可能性,Zheng等[50]将分子量大于200 kDa的SF与聚乙二醇混合,并在37 ℃孵育至预凝胶状态,得到一种复合打印液。打印结果表明,与低浓度的SF凝胶(2.5%,w/v)相比,高浓度范围的SF凝胶(7.5%,w/v)在打印过程中能够显示出更好的形状保真度。

3.2 无机复合法

近年来,介孔生物活性玻璃(MBG)作为一种良好的药物载体和理想的骨修复材料被广泛应用。 Du等[51]将浓度为30 wt%的SF作为有机相,MBG为无机相,按溶液的质量比(MBG/SF)为80%∶20%,制备了MBG/SF打印前驱体溶液。用该前驱体溶液打印得到的支架具有优越的抗压强度(约20 MPa)、良好的生物相容性和促进骨形成能力。另外,还原氧化石墨烯(rGO)具有独特的物理和化学性质,在导电生物复合材料制备中备受瞩目。Ajiteru等[52]通过碳二亚胺试剂对甲基丙烯酰化的SF溶液进行修饰,随后与超声分散的rGO溶液进行混合,制备了具有导电性能的3D打印预混液。基于该预混液得到的支架材料具有独特的电学和生物学特性,无需添加额外的细胞分化诱导物质就可以诱导神经母细胞向神经元分化,从而具有潜在的促进神经组织再生的功能。

3.3 丝素自交联法

在常温条件下,一定浓度的SF溶液不需要外加任何离子和化学试剂就可以发生自凝胶现象,但是该过程较为缓慢(通常时间跨度为一周到半年之间)。而通过外部环境进行刺激,如机械搅拌、超声、热处理、低pH以及醇溶液处理可以将SF由溶液状态快速转变成溶胶状态,从而制备成可3D打印的SF前驱体液。早在2008年,Lewis课题组[39]就基于挤出式打印方式将质量分数为28%~30%的SF前驱体溶液打印成网格结构,通过在富含甲醇的凝结槽中浸泡处理促进SF从无规卷曲状态向β-折叠结构转变,得到结构稳定的SF打印支架。

然而,利用外部环境进行刺激促进SF的凝胶过程不利于封装在前驱体溶液中的细胞活力。通过调节SF溶液分子量大小以及微溶剂中凝聚态结构的改变,可以改善纯SF打印液的流变性能,使其适用于生物3D打印。Tao等[33]制备了终浓度为3 wt%,分子量介于90~350 kDa的SF前驱体溶液。随后使用喷墨打印机打印,该SF溶液可以形成具有适宜动态黏度(3 mPa·s)和表面张力(0.046 N/m)的稳定液滴,从而迅速固化与成型。该打印方式能够达到20 μm的分辨率,并可促进包覆的人骨髓间充质干细胞(hMSCs)的增殖与成骨分化。

3.4 化学改性法

由于SF肽链上存在多种活性氨基酸包括丝氨酸、酪氨酸、赖氨酸、谷氨酸等,使得SF肽链之间的化学改性很容易实现,如接枝反应、交联反应、官能团反应等,从而有利于打印前驱体的制备[53⇓⇓~56]。张耀鹏课题组[36]开发出了一种用于3D打印的前驱体溶液,其中包括氧化细菌纤维素纳米纤维(OBC)和SF。SF在辣根过氧化物酶(HRP)/H2O2交联之后形成骨架结构,浓度为7 wt%的OBC增加了打印过程中前驱体的黏度并进一步提高了支架的形状保真度。此外,细胞实验表明,接种在SF-OBC打印支架上的肺上皮干细胞(LESCs)能够保持至少一周的快速增殖能力,使得该打印支架有望应用于肺组织工程(图1)。

Kim等[40]将甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)添加到SF溶液中进行充分反应,即可制备GMA改性的SF墨水(Sil-MA)。经过GMA改性的SF引入了光交联位点,可通过光固化3D打印机中的紫外光照射进行层层固化,构建出结构复杂的仿真器官(图2)。

之后,该课题组[57]进一步尝试将该类型支架用于兔气管缺陷模型的修复,能有效提高细胞在打印支架内部的增殖和迁移,未来有望用于人体损伤器官组织的再生和修复。

由于SF具有大约5%的酪氨酸残基,使得SF分子之间可以发生酚类光交联。核黄素通过可见光照射能产生以单线氧为主的活性氧自由基,进而诱导SF分子之间产生化学交联,形成二酪氨酸键。利用此原理,Shin等[58]将SF溶液与0.5 mmol/L的核黄素溶液混合,制备可用于3D打印的前驱体溶液。经过3D打印得到的SF水凝胶微针具有很高的力学强度,在施加约300 mN的压应力后不会对微针结构造成严重损坏。与此同时,有研究通过过渡金属配合物、钌(Ru)和过硫酸盐化合物组合来制备SF前驱体溶液[59]。在光活化过程中,Ru2+的光解产生激发态的Ru3+进而氧化酪氨酸基团,然后通过与邻近的酪氨酸形成双酪氨酸键,使SF交联。Cui等[60]使用这种可见光介导的光氧化还原系统交联SF分子,SF分子间能产生快速光交联反应(<1 min)。并且这种光交联SF水凝胶与酶促交联SF水凝胶相比表现出更加稳定的机械性能,其压缩模量在五周之内能够维持稳定(图3),这对维持细胞的稳态起到积极的作用。

4 3D打印技术

3D打印SF支架已经被广泛地应用于组织器官原型的构建,这不仅为人体损伤器官修复与替换这一宏伟目标奠定了基础,还可作为体外模型服务用于药物筛选等领域。当前可应用于丝素的3D打印技术有很多,主要包括喷墨打印、挤出式打印和光固化打印(图4)。不同类型的打印机具有不同的打印分辨率、打印速度和细胞打印密度,具体应用时需根据需求来选择合适的打印机类型(表2)。

4.1 喷墨打印

喷墨打印(Inkjet printing)是一种用于液相材料沉积的技术。这一过程本质上是把数量众多的微小墨滴(通常只有几皮升)从喷嘴喷出,精确地涂覆在基板上的技术[65⇓~67]。早在2006年,Kaplan课题组[68]首次使用喷墨打印技术,在透明的乙烯基塑料上将0.6%w/w的SF溶液打印成平行线结构。将hMSCs接种在打印的平行线图案上培养一周后,hMSCs能够沿打印的SF平行线铺展并分化为成骨细胞。培养4周后,线间距小于1.25 mm的相邻平行线上的细胞发生桥接。该结果为喷墨打印SF材料调控细胞生长行为迈出了第一步。

4.2 挤出式打印

挤出式打印(Extrusion printing)是目前常见的一种生物打印方法。其打印步骤首先是将生物墨水或者打印原液注入连接喷嘴的储液器,随后在一定温度下,墨水一层一层从打印机的微型喷口挤出并在打印平台上固化成型。与喷墨打印相似,打印原液必须快速且可控地固化以产生机械稳定的打印材料[69,70]。

率先尝试用挤出式打印机打印SF生物材料的是Lewis课题组[39]。该团队成功地将浓度为28%~30%的SF溶液打印成正方形格子和圆形网状支架。实验发现,当剪切速率提高到100 s-1 以上时,由于SF溶液向β-折叠转变,溶液表现出明显的剪切增稠行为,导致打印过程中微喷嘴阻塞。为了避免打印过程中的剪切增稠现象,许多课题组进行了努力[71,72]。Ghosh课题组[73]将明胶添加到SF溶液中制备了SF/明胶用前驱体液,该溶液在一定浓度范围内均表现出剪切稀化作用,所以很容易从喷嘴挤出。该现象可能是两种蛋白质大分子链间疏水性和静电相互作用所致。

形状保真度以及可调的机械强度是挤出式3D打印时需要考虑的重要因素。这意味着打印成品需要在细胞培养一段时间后仍保持其形状稳定性,并且植入的水凝胶支架只有达到一定量级的刚度才能满足天然组织修复的需求。例如,对于哺乳动物的天然关节软骨外植体的平衡模量和动态刚度分别为0.27和0.41 MPa[74,75]。对于骨骼肌植入体来说,应力和应变的典型值分别约为100 kPa和20%[76]。基于此,Jose等[77]等使用明胶作为填充剂加入到多元醇/SF打印前驱体溶液配方中,打印出了模量为15.2±2.5 kPa的SF基支架。Rodriguez等[20]通过使用甘油处理打印后的SF/明胶支架,使复合支架的弹性模量由50 Pa增至1000 Pa。但该类型支架的力学性能仍有较大提升空间。为了克服以上难题,张耀鹏课题组[37]通过在SF/明胶复合生物墨水中添加0.7 wt%的细菌纤维素纳米纤维(BCNFs),显著增强了基于挤出式打印的复合支架的形状保真度和机械性能。实验表明,基于BCNFs增强的支架弹性模量达到186.5 kPa,并且具有较高的形状保真度。

4.3 光固化打印

光固化打印(Photo-curing printing)是利用打印机中的光源固化光敏树脂,逐点或者逐层堆积成三维模型的方法[78⇓~80]。光固化打印机主要分为立体光刻(SLA)、数字光处理(DLP)和选择性区域光固化(LCD)等打印方法。SLA打印成像原理是通过激光作为光源进行激光光斑点扫成像,进而使得墨水打印成型。DLP是通过对产品的横截面进行紫外投影,层层固化液态光敏材料来进行打印[40,81]。DLP打印有着更高的打印分辨率和打印速度,从而极大提高了打印结构的完整性和力学性能,在SF基3D打印技术中应用较多。LCD打印原理与DLP相似,都是面成型,区别在于DLP是通过数字投影仪进行光源投影,而LCD是使用普通的液晶LCD屏幕进行投影。

由于单纯的SF溶液不能发生光聚合反应,因此不能直接用于DLP打印[82]。为了解决这个问题,Kim等[40]用GMA改性SF,引入光敏基团,使SF可以用于DLP打印,并证明了打印过程对细胞没有损伤,且打印的支架结构具有良好的生物相容性。

当前,已开发出多种用于SLA打印的丙烯酸酯改性聚合物材料[83⇓~85]。由于SLA打印机的打印分辨率取决于光通过墨水的穿透深度,然而丙烯酸酯改性聚合物材料是透明的,光在透明溶液中具有很强的穿透力,造成打印分辨率无法控制。为此,Shin等[86]将SF与黑色素纳米粒子(SFM)结合,作为四臂聚乙二醇-丙烯酸酯(PEG4A)溶液的透明改性剂。通过将SFM加入到PEG4A溶液中,可以将光束限制在设定区域,有效地降低了溶液的透明度,提高了打印分辨率。此外,打印后PEG4A/SFM复合水凝胶的弹性模量比没有添加SFM的PEG4A水凝胶提高了约2.5倍。

5 在生物医学领域中的应用

5.1 血管再生

组织或器官内的血管系统在运输氧气和养分、物质代谢方面至关重要[87]。但是传统方法制备的人工血管存在形状不规则,植入体内易形成血栓等缺点限制了其在临床中应用。Kim等[40]成功通过改性SF墨水3D打印出管状血管结构,并且表现出优异的力学和流变性能,为后期体外培养高度血管化的器官提供了多种可能性。

5.2 软骨修复

软骨是一种非血管的结缔组织,由于其细胞有丝分裂能力差,导致软骨损伤发生后很难治愈[88]。传统软骨修复方法在模拟天然软骨组织的精细结构,特别是微纳米有序结构方面,仍然存在较大差距。利用3D打印技术,可以制备出具有微米级、高度复杂结构的类细胞外基质样支架[89]。Shi等[21]用3D打印技术制备了SF/明胶支架用于兔软骨修复,SF与明胶的巧妙组合极大地平衡了支架的机械性能和降解率,能够与软骨组织的生长速度相匹配,从而有效地促进兔膝关节软骨的修复。Xiao等[90]以甲基丙烯酸酯明胶和SF为原料,通过连续超声和光交联制备了一种负载MC3T3-E1前成骨细胞的互穿聚合物网络(IPN)水凝胶,用于软骨组织修复。细胞在培养第三天后具有较高的存活率和良好的增殖状态。该水凝胶生物学功能和生物力学稳定,并且可以通过调节GelMA的浓度来调控包封细胞的生长。

5.3 骨修复

先天性缺陷、肿瘤疾病和外伤会导致严重的骨骼缺陷[91]。基于3D打印支架的使用为上述问题提供了有效的解决方案。Kaplan课题组[92]通过直接书写打印技术将SF/羟基磷灰石支架图案化为3D晶格样结构,该结构是由互联的SF/羟基磷灰石组成,具有互联的孔隙通道和梯度网络。体外实验表明,接种在孔径为200~750 μm支架上的hMSCs在培养6周后能够铺满支架,并且骨组织的典型标志物——I型胶原蛋白能够在所有不同孔径支架上大量层积,表明该支架有望用于缺损骨组织的修复。

5.4 皮肤修复

皮肤是人体最大的器官,主要作为身体和外部环境之间的保护屏障[93⇓~95]。在日常生活中,皮肤不可避免地直接接触有害微生物,并且很容易遭受机械、热和化学损伤。Xiong等[96]采用3D打印技术制备了磺化明胶/SF复合支架,并在该支架上结合了碱性成纤维细胞生长因子2(FGF-2)。组织学结果显示,这种结合了FGF-2的SF复合支架可以支持肉芽组织的形成,并显著促进大鼠皮肤组织的再生(图5)。

6 总结与展望

本文阐述了SF的基本性质,对SF的化学改性修饰、打印前驱体溶液的制备以及对3D打印技术进行了探讨,并介绍了3D打印SF生物材料在生物医学领域中的具体应用。

尽管蚕丝作为纺织纤维的应用已有5000多年的历史,但其在3D生物打印中的应用才刚刚开始,要实现这项技术的临床应用仍然需要多方面的集中努力。一方面,现有的SF基生物墨水种类有限,局限于在有限的范围内进行探索,而大多数人体器官如心脏、肾脏和肝脏由不同类型的细胞和组织构成,所以由单一细胞种类以及单一原料成分构成的3D打印材料不可能模拟体内的实际情况,需要借助化学改性技术和组织工程技术进一步提高SF基活体细胞打印支架的仿真度,从形似到神似的转变。另一方面,3D打印SF材料的稳定性、功能性、精确性还需要进一步的提高。虽然3D打印技术在精准化、个性化治疗方面展现了巨大的优势,但受限于设备的发展和材料的开发,在生物医疗领域还没有达到成熟的应用。但是,随着研究者对SF理化性质了解的不断深入,打印材料的不断开发,打印设备的不断更新,新的打印策略如支撑浴悬浮打印、4D打印、异质结构打印、梯度材料打印等的不断发展,基于SF的3D打印技术在生物医疗领域的应用将会越来越成熟与多元[97]。

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基金资助

国家自然科学基金青年科学基金(31800807)

浙江省基础公益研究计划(LY22E030004)

中央高校基本科研业务费专项资金项目(2020QNA6028)

国家现代农业产业技术体系(CARS-18-ZJ0501)

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