荧光探针在半胱氨酸检测的应用

周宇航; 丁莎; 夏勇; 刘跃军

doi:10.7536/PC210933

化学进展 ›› 2022, Vol. 34 ›› Issue (8) :1831-1862 DOI: 10.7536/PC210933

综述

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荧光探针在半胱氨酸检测的应用

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Fluorescent Probes for Cysteine Detection

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摘要

半胱氨酸(Cys)是三种生物硫醇之一,是20种天然氨基酸中唯一一种含还原性巯基的天然氨基酸,是组成细胞内多肽和蛋白质的基本氨基酸之一。其参与体内细胞的氧化还原调控,调节体内氧化还原平衡,维持机体正常代谢,在生理过程中发挥着至关重要的作用。然而体内的Cys浓度水平异常会引起一系列生理疾病,体内的Cys浓度作为几种疾病的生物标志物具有临床意义。因此有效地识别和检测半胱氨酸受到越来越多的研究者们的青睐。相较传统检测方法,荧光探针因其操作简单、灵敏度高、响应迅速和实时检测等优点,已被广泛用于检测生物硫醇。本文基于常见荧光团的结构性能特征,综述了近三年来检测Cys的荧光探针,重点概述了其传感机制,并对其生物应用进行了简要说明,展望了未来Cys探针的研究方向与应用前景。

Abstract

Cysteine (Cys) is one of the three biological thiols. It is the only natural amino acid containing a reducing sulfhydryl group among the twenty natural amino acids. It is one of the basic amino acids that composes intracellular polypeptides and proteins. It participates in redox regulation of cells, regulates the redox balance in the body, and maintains the normal metabolism of the body, which plays a vital role in the physiological process. However, abnormal levels of Cys concentration in the body can cause a series of physiological diseases, and the concentration of Cys in the body has clinical significance as a biomarker of several diseases. Therefore, the effective identification and detection of cysteine is favored by more and more researchers. Compared with traditional detection methods, fluorescent probes have been widely used to detect biological thiols because of their simple operation, high sensitivity, rapid response and real-time detection. Based on the structural and performance characteristics of common fluorophores, this article reviews the fluorescent probes used to detect Cys in the past three years, focuses on their sensing mechanisms, briefly describes its biological applications, and prospects the future research directions and application prospects of Cys probes.

Contents

1 Introduction

2 Organic small molecule fluorescent probes for detecting Cys

2.1 Coumarin-based fluorescent probes for Cys detection

2.2 Rhodamine-based fluorescent probes for Cys detection

2.3 Benzothiazole-based fluorescent probes for Cys detection

2.4 Fluorescein-based fluorescent probes for Cys detection

2.5 Naphthalimide-based fluorescent probes for Cys detection

2.6 BODIPY-based fluorescent probes for Cys detection

2.7 Cyanine-based fluorescent probes for Cys detection Cys probes

2.8 NBD-based fluorescent probes for Cys detection Cys

2.9 Others fluorescent probes for Cys detection

3 Nano-fluorescent probes for Cys detection

3.1 Based on quantum dots for Cys detection

3.2 Based on gold nanomaterials for Cys detection

3.3 Based on Carbon dots for Cys detection

4 Based on fluorescent protein probes for Cys detection

5 Conclusion and outlook

Graphical abstract

关键词

半胱氨酸 / 荧光探针 / 荧光团 / 检测

Key words

cysteine / fluorescent probe / fluorophore / detection

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周宇航, 丁莎, 夏勇, 刘跃军. 荧光探针在半胱氨酸检测的应用[J]. 化学进展, 2022, 34(8): 1831-1862 DOI:10.7536/PC210933

Yuhang Zhou, Sha Ding, Yong Xia, Yuejun Liu. Fluorescent Probes for Cysteine Detection[J]. Progress in Chemistry, 2022, 34(8): 1831-1862 DOI:10.7536/PC210933

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1 引言

半胱氨酸(Cys)、同型半胱氨酸(Hcy)、谷胱甘肽(GSH)是细胞内常见的三种生物硫醇,它们在调节人体新陈代谢和细胞氧化还原稳态等许多生理过程中扮演着非常重要的角色^[1]。虽然Cys与Hcy和GSH具有相似的结构单元(图1)和反应特性,但它们在生理过程中发挥着不同的作用^[2]。半胱氨酸作为一种必要的含巯基氨基酸,参与蛋白质的合成、代谢和解毒等重要过程。Cys是Hcy的代谢产物,是抗氧化剂GSH的前体,是人体新陈代谢中硫化物的来源,人体内正常水平的Cys浓度为30~200 μM^[3]。三种生物硫醇在人体内水平异常可导致各种健康问题。体内Cys水平缺乏会导致生长迟缓、毛发褪色、肝脏以及肌肉损伤和脂肪流失等相关问题,过多的Cys会引起风湿性关节炎、帕金森病和阿尔兹海默病等疾病^{[4⇓⇓⇓⇓~9]}。就目前研究来看,Hcy和GSH的存在会对Cys的检测造成干扰,特异性识别检测体内的Cys仍是一个巨大挑战。因此,开发对Cys在人体细胞组织中的有效实时特异性检测的技术迫在眉睫,并且具有十分重要的临床意义。

目前报道的用于检测Cys的方法主要有电化学法、毛细管电泳法、高效液相色谱法、气相色谱-质谱法,表面增强拉曼散射法(SERS)和分光光度法等^{[10⇓⇓~13]}。然而,这些方法存在所需仪器昂贵、检测复杂、检测时间长等不足。近年来,荧光分析技术由于其灵敏度高、选择性好、所需试样量小、成本低及生物相容性好等优点被广泛用于特异性检测Cys^[14]。此外,光学显微镜广泛投入使用,加快了荧光技术在体内外对半胱氨酸进行实时检测,因其具有高度的时间和空间分辨率优点,使半胱氨酸在靶向物内的分布实现了可视化^[9]。荧光探针主要由三部分组成,分别为荧光团(Fluorophore)、连接臂(Relay)和识别基团(Receptor)。待检测物与识别基团发生相关反应后,信号通过连接臂传送到荧光团,引起荧光变化,荧光团是发出光学信号的信息源^[15,16]。每种荧光团都有其优缺点,不同的荧光团具有不同的荧光量子产率,不同的发射波长和不同的斯托克斯位移(Stokes shift)。

本文综述了近三年来用于检测半胱氨酸的荧光探针,根据制备方法主要分为两大部分:化学荧光探针和基因荧光探针。化学荧光探针主要包括有机小分子荧光探针和纳米荧光探针。通过荧光团的结构对这些探针再次进行区分,对这些探针特征进行仔细比较及综合概述。

2 检测Cys的有机小分子荧光探针

有机小分子荧光探针主要是通过与待测物之间发生特异性作用,引起荧光基团的化学环境发生变化,通过颜色的改变、光谱的移动、荧光强度的改变等表现来对待测物进行定量检测。这些特异性作用由于光诱导电子转移(Photoinduced electrontransfer,PET)、分子内电荷转移(Intramolecular charge transfer,ICT)、扭转分子内电荷转移(Twisted intramolecular charge transfer,TICT)、激发态分子内质子转移(Excited-state intramolecular proton transfer,ESIPT)、荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)、跨键能量转移(Through bond energy transfer,TBET)和单体-激基缔合物(Excimer/Exciplex)等机制的存在导致荧光信号发生改变^[17⇓~19]。有机小分子荧光探针的荧光团是建立在含有共轭结构的化合物上,常见的用于检测半胱氨酸的荧光团有香豆素、苯并噻唑、罗丹明、荧光素、氟硼吡咯等。

2.1 基于香豆素的Cys荧光探针

香豆素(Coumarin)存在于自然界许多植物中,包含1-苯并吡喃2-酮基团,这是一个非常庞大的化合物家族,是一种天然产物^[20]。香豆素类化合物因其优异的光学性质和生命活性可以应用于荧光染料、激光染料以及抗真菌和抗肿瘤剂等医用品中,如具有抗癌作用的化合物^[21,22]、抗增殖剂^[23]、抗氧化剂、抗真菌剂^[24]。香豆素母体结构(图2)是两环结构,包含吡喃酮和苯环,分子结构包含碳碳双键单元且被固定在顺式构象中,因此可以有效地避免乙烯基化合物中正常碳碳双键顺-反异构转化,有助于香豆素发射强荧光和表现出良好的光稳定性。基于香豆素衍生物的荧光探针具有良好的光稳定性,具有大的斯托克斯位移、较高的摩尔消光系数和荧光量子产率^[25,26]、优异的生物相容性^[27]、完美的细胞渗透性^[28]、修饰位点多^[29],以及合成简单等优点被广泛用作荧光化学传感器的构建。由于Cys亲合性强,可以与α,β-不饱和酮基团发生亲核反应加成至香豆素类衍生物上。

通过在香豆素母体的3位、4位、7位或8位引入某些取代基后,会产生稳定且较强的荧光信号。Cao等^[30]通过在香豆素的3位、4位和7位引入三种不同的取代基,合成了一种多信号荧光探针1(图3)。通过探针与三种生物硫醇不同的反应机理会产生三种具有不同光谱响应的产物。探针1对Cys(0~20 μM)的检出限为 6 nM。在活细胞荧光成像实验中,探针1对Cys、Hcy和GSH分别在绿、蓝和红三种不同颜色的发射通道中产生明显的荧光信号,表明了探针1在活细胞中特异性检测Cys的应用潜力。由于多反应位点较单反应位点具有更高的灵敏度和选择性,他们课题组最新合成了一种具有两个潜在的巯基识别位点的探针2(图4)^[31]。当加入Cys时,首先探针以α,β-不饱和乙酰基部分作为巯基迈克尔加成位点,可观察到明显的荧光增强,随后与作为荧光淬灭基团以及巯基亲核取代反应位点的2-噻吩羰基发生裂解反应,荧光开始缓慢减弱。由于Cys较Hcy/GSH空间位阻更小,巯基的亲和能力更强,探针可以快速地特异性检测Cys,检出限为0.24 μM。这也是截至目前报道的第一个利用两级层级反应对Cys进行特异性单一检测的探针。这种两级层级反应使在活体细胞中动态监测Cys成为可能,为未来发展新型特异性识别的探针提供了设计策略。

Cheng等^[32]通过在香豆素母体的3位和7位引入不同的取代基,利用迈克尔加成,以及分子内重排策略设计合成了一种新的荧光探针3检测三种生物硫醇(图5)。加入Cys/Hcy,与探针3号位取代基上的共轭炔烃发生迈克尔加成后进行分子内重排,在430 nm波长激发下,在495 nm处显示明显的荧光增强,加入GSH,与探针发生加成后,无法进行分子内S,N重排,所以无荧光产生。探针对Cys(0~10 μM)检出限为49 nM。在小鼠的肝组织荧光成像实验中,探针显示处双光子荧光特性,可以在深组织中检测Cys,成像深度最大可达107 μm。但是由于Hcy和Cys具有相似的结构,探针2无法特异性检测Cys。

Chu等^[33]在香豆素母体的7位和8位分别引入丙烯酸酯和烯丙基设计合成了一种比色型荧光探针4(图6)区分检测Cys和Hcy。探针4本身是弱荧光的,加入Cys后,探针的丙烯酸酯基团容易与Cys发生亲核加成,随后分子内迅速进行重排环化,脱去一个7元环,可引起5倍的荧光增强,溶液由无色变为黄色。而加入Hcy和其他氨基酸没有引起溶液颜色和荧光强度的改变。探针3对Cys的检出限为2 μM。通过在丙烯酸酯的邻位引入烯丙基对开发特异性检测Cys的荧光探针具有启发意义。

Zou等^[34]同样在香豆素母体的7位引入丙烯酸酯基团合成了探针5(图7)。Cys与探针上的丙烯酸酯基团发生迈克尔加成,促使ESIPT过程开启,可诱导35倍的荧光增强,较探针4荧光变化更明显,探针对Cys的检出限为88.2 nM,较探针4灵敏度更高。即使加入分子结构类似的Hcy/GSH也不会造成干扰,探针的斯托克斯位移为216 nm。探针5还具有良好的生物相容性和低细胞毒性,被成功应用在活细胞中Cys荧光成像。

Zhang等^[35]通过在香豆素母体的4位和7位引入吗啉和丙烯酸酯基团,分别作为溶酶体靶向基团和Cys的特异性识别单元,设计合成了一种检测溶酶体中Cys的荧光探针6(图8)。由于吗啉基团与丙烯酸酯基团之间的PET过程,探针6本身不发荧光,当加入Cys后,探针发出强烈荧光,这是因为Cys与丙烯酸酯发生共轭加成,检测限为0.28 μM。在HeLa细胞中的共聚焦荧光显微镜成像显示,该探针能够特异性检测活细胞中溶酶体Cys,为今后溶酶体Cys引发的相关疾病研究提供重要的借鉴意义。

Xiao等^[36]利用香豆醛和萘基基团进行偶联设计合成了一种在不同的激发波长下用不同的发射通道可以对Cys和GSH进行区分检测的荧光探针7(图9)。探针本身有弱荧光产生,加入Cys后,在360 nm波长激发下,在470 nm处发出强烈的荧光,加入Hcy/GSH,探针对其的荧光响应较加入Cys时要弱。在HeLa细胞荧光成像实验中,Cys和GSH分别能在蓝色和绿色通道中有明显的荧光发射,表明探针可以高效地检测活细胞中的Cys。

Hien等^[37]合成设计了一种利用Cu²⁺和香豆素荧光配体之间形成的络合物作为基于络合物交换反应检测生物硫醇的新型化学传感器8(图10)。Cu²⁺可以淬灭香豆素的荧光,逐渐加入Cys至Cys的浓度为传感器浓度的2倍时,荧光强度几乎完全恢复,这是因为探针与Cys反应生成[CuX₂]²⁺复合物,导致荧光团释放出来,荧光恢复。Hcy和GSH也可以引起不同程度的荧光恢复,但恢复率都小于Cys,探针对Cys的检出限为0.3 μM。该探针为利用金属离子与有机小分子荧光团之间形成的配合物检测生物硫醇提供了新的研究方向。

通过利用香豆素母体上取代基对其进行选择性修饰可以更好地改善其荧光性质。一般基于香豆素荧光团检测Cys的探针多数是在其母体的3位和7位引入识别位点,在香豆素母体的7位引入氨基类基团可以增强分子内电荷转移(探针1、2、3、7、8),在母体3位引入Cys识别基团具有更低的检测限和更快的反应速率(探针1、3)。

2.2 基于罗丹明的Cys荧光探针

罗丹明(Rhodamine)类化合物是一种以氧杂蒽为母体的碱性荧光染料(图11),其螺内酰胺具有开环和闭环两种结构,处于开环状态时:整个分子处于共轭状态,发出很强的荧光,且颜色发生明显的改变;处于闭环状态时:无色且不产生荧光^[38,39]。罗丹明类染料刚性平面结构大、光稳定性好^[40,41]、高摩尔消光系数、荧光量子产率高^[42]、激发波长较长^[43,44]、受背景干扰较小^[45]、良好的水溶性^[46,47]和灵敏度^[48,49]。通常利用罗丹明类化合物与其他荧光团结合设计成比率型荧光探针。比率式荧光探针通过双通道发射强度变化具有自校准能力,可提高传感器的灵敏度和精确性,可用于更好的成像应用。近红外荧光团具有独特的比率检测和近红外成像特征,如深入组织穿透性好、低细胞和组织背景荧光^[50,51]。

Yu等^[52]通过在罗丹明分子骨架上引入喹啉基团,设计合成了新型近红外比率型荧光探针9(图12),较传统罗丹明染料,该探针扩大了π共轭体系,增大了斯托克斯位移,具有优异的荧光量子产率。用Cys处理后,导致探针的螺内酰胺处于闭环状态,712 nm处的近红外荧光发射下降,在462 nm处有由喹啉基团引起的可见光荧光增强,当加入40 μM Cys时,探针7的荧光强度比(I_{462 nm}/I_{712 nm})从0.063增加到7.206,荧光增强114倍。加入Hcy时,也有类似的光谱响应,但是由于Cys的伪一级速率常数更大,反应能更快达到饱和。探针对Cys的检出限为0.12 μM。在进行Caov 3 cells细胞成像发现探针7有两种不同的荧光发射,可以对细胞内的Cys实行可视化特异性检测。

除了可以检测活细胞内的Cys,Liu等^[53]同样合成了一种比率型荧光探针10(图13)来检测牛血清、水、牛奶及苹果等中的Cys,通过在罗丹明骨架上引入丙烯酸酯作为识别位点,加入Cys后,探针本身在592 nm处的荧光发射降低,伴随着发射蓝移在584 nm出现一个新的荧光发射峰,且荧光强度降低,加入其他分析物,荧光强度没有明显变化,这是由于Cys与探针发生迈克尔加成,随后分子内环化脱去一个7元环,荧光开启,荧光强度在1.5 min内即可达到平稳,这与以往报道的多数检测Cys的荧光探针具有更快的的反应速率。而在动力学上七元环比Hcy诱导形成的八元环更有利,而GSH由于结空间位阻大,反应速率慢,探针10对Cys的检出限为20 μM。

Xia等^[54]采用作为能量供体的香豆素和能量受体的罗丹明,设计合成了基于FRET机制的近红外比率型荧光探针11(图14)。在探针溶液中逐渐加入Cys,香豆素供体的荧光明显增加,罗丹明受体的荧光逐渐减少,因为罗丹明受体上形成了闭环螺内酰胺结构,与Cys的反应导致罗丹明受体的荧光淬灭。加入Cys,荧光强度比最终从0.235增加到4.237,荧光增强18倍,探针对Hcy的比率变化较Cys小得多,对GSH的反应不敏感。探针对Cys的检出限为1.5 μM。该探针可实现对在活细胞线粒体中的Cys的双通道靶向荧光检测,并被成功应用于黑腹果蝇的体内成像。

Liu等^[55]同样基于FRET机制,采用罗丹明作为FRET的能量供体,奈酰亚胺为供体,设计合成了一种双光子荧光探针12(图15)。探针以2,4-二硝基苯磺酰基(DNBS)为识别单元,在395 nm波长的紫外灯激发下,Cys浓度不断增加,590 nm处的荧光逐渐增强,加入Hcy/GSH荧光响应较Cys弱。探针对Cys的检出限为0.47 μM。在800 nm(双光子)波长激发下,该探针不仅在活细胞的线粒体中可实现内源性和外源性Cys的荧光成像,还可以实现组织成像,成像深度为80 μm。

Xue等^[56]基于罗丹明B (RhB)与二氧化锰纳米片(MnO₂NFs)和生物硫醇之间的氧化还原反应,构建了一种快速选择性检测生物硫醇的比率型荧光探针13(图16)。由于MnO₂ NFs的强氧化性,RhB被氧化成其衍生物,伴随溶液颜色由紫色变为淡粉色,荧光由红色变为绿色,形成MnO₂ NFs-RhB。在MnO₂ NFs-RhB溶液中逐渐加入0~40 μM的Cys,在365 nm波长的紫外灯激发下,在523 nm处探针本身的绿色荧光逐渐减弱,位于579 nm处的RhB衍生物的红色荧光增强,这是由于Cys可以将MnO₂ NFs还原成Mn²⁺来抑制RhB的氧化,探针对Cys(0~15 μM)的检出限为 0.282 μM。该探针可用于检测人体血清中的Cys。

Maiti等^[57]利用RhB与金纳米粒子(AuNPs)在水介质中的相互作用设计合成了一种比色型荧光传感器14高选择性检测L-Cys(图17)。由于静电相互作用RhB染料在AuNPs表面上紧密堆积从而引发FRET过程,导致体系几乎无荧光。当加入L-Cys后,有明显荧光产生,并且溶液由酒红色变成蓝黑色,这是因为L-Cys与Au NPs通过Au-S键有着更强的化学吸附作用使得RhB被释放出来,荧光恢复。探针对L-Cys检出限为0.01 μM。人体尿液中的L-Cys可以使探针荧光恢复率达到35%,表明探针可作为一种有效途径来诊断半胱氨酸尿症。

利用罗丹明与其他荧光染料或纳米材料进行结合设计成比率型荧光探针检测Cys,荧光变化更为明显(探针11、12、13、14),且与纳米材料结合时表现出更低的检测限(探针13,14)。

2.3 基于苯并噻唑的Cys荧光探针

苯并噻唑(Benzothiazole)由于本身的刚性平面结构(图18)和离域大π键^[58],量子产率高、Stokes位移大、良好的光稳定性和响应速率快等^[59],在荧光探针方面应用广泛。苯并噻唑类荧光探针通过络合反应、水解反应、亲核加成反应等来检测金属离子、阴离子、小分子和生物大分子,可用于生物细胞成像^[60]和酸碱度传感^[61]。苯并噻唑类探针表现出一些特殊的荧光性质,如ESIPT、ICT、AIE等。

Ren等^[62]基于ESPIPT机制设计合成了一种用于Cys的近红外传感器15 (图19)。在含探针溶液中加入Cys后,在686 nm处由于ESIPT过程从而出现强发射峰;加入Hcy或GSH,除了在470 nm处荧光发射些许增强外,在686 nm处无明显荧光增强,这是因为Hcy/GSH没有诱导分子内环化,阻断了ESIPT过程,这就可以实现对Cys与Hcy/GSH的区分检测。探针15在pH 8的溶液中对Cys的检出限为0.20 μM,对Cys响应的Stokes位移为263 nm。探针实现了HeLa细胞和小鼠体内Cys的荧光成像,表明了探针可以在生物体内有效检测Cys。

Anusuyadevi等^[63]同样基于ESIPT机制,以丙烯酸酯基团作为识别位点,设计合成了一种高选择性地检测Cys的荧光探针16(图20)。由于丙烯酸酯基团阻碍了探针的ESIPT过程,探针本身不发荧光,随着加入Cys的浓度逐渐增加,478 nm处的荧光强度逐渐增强,其他阴离子和氨基酸的存在不会干扰对Cys的检测。探针对Cys的检出限为0.478 μM。在HeLa细胞的荧光成像实验中,探针可以通过荧光强度的不同来检测Cys的浓度变化,从而监测细胞内的氧化还原状态,这表明该探针可以作为一种高效探针来研究细胞内氧化还原不平衡时对Cys的快速测定。

Zhang等^[64]基于ICT过程设计合成了一种近红外比率荧光探针17(图21)。该探针使用甲基丙烯酸酯作为Cys识别位点和ICT过程的触发点。在365 nm波长的紫外灯激发下,探针本身发蓝色荧光,加入Cys,探针在710 nm处发红色荧光,并且发现探针的荧光强度比(

I 710 n m

/I_{430 nm})与Cys的浓度(1~40 μM)呈线性相关,检出限为0.5 μM。在其他氨基酸、阴离子和阳离子存在的情况下,探针17对Cys的选择性高。另外,探针可以检测HeLa细胞中内源和外源的Cys。

Wei等^[65]同样基于ICT过程,利用丙烯酸酯作为Cys识别位点,线粒体靶向比率型荧光探针18(图22)。与探针14不同的是,探针18以萘作为电子供体,苯并噻唑作为电子受体,当加入Cys后,与萘上的丙烯酸酯发生亲核加成,ICT过程开启,探针在525 nm处的荧光发射降低,在595 nm处荧光发射增强,伴随着荧光颜色从绿色变成橘红色,Stokes位移达119 nm。探针对Cys检出限为74 nM。通过对HepG2细胞共聚荧光成像实验,发现来自探针的荧光与来自MTDR(一种线粒体靶向深红染料)的荧光进行重叠,表明该探针能够实现对线粒体内Cys的靶向荧光成像。

Zhao等^[66]基于ESIPT和ICT共同作用设计合成了一种新型近红外荧光探针19(图23),荧光团由苯并噻唑衍生物和甲基喹啉合成,以丙烯酸酯为识别位点,带正电荷的甲基喹啉基团阻碍了ICT过程,因此探针荧光被猝灭。加入Cys后,丙烯酸酯识别基团和荧光团之间形成的羟基键很容易断裂,酚羟基和苯并噻唑基团之间引发ICT和ESIPT过程,同时产生大的Stokes位移(310 nm),荧光信号增强,即使在其他氨基酸和阳离子存在下,仍可高选择性地检测Cys,对Cys的检出限为0.062 μM。探针还可以检测A549细胞产生的内源性Cys。

Long等^[67]同样基于ESIPT和ICT机制,设计合成了探针20(图24)。通过扩展苯并噻唑的π共轭体系,从而引发ICT过程,并将最大发射峰波长转移到近红外区。在411 nm波长紫外灯激发下,探针本身不显现荧光,加入Cys后,在713 nm处显示荧光逐渐增强,在其他分析物存在下探针对Cys的选择性依旧很高。探针对Cys的检出限为102 nM。对Cys响应的Stokes位移为302 nm。在单/双光子波长激发下,探针可检测HeLa细胞中内源和外源的Cys。除此之外,该探针还可应用于斑马鱼和小鼠大脑和腹腔中Cys的荧光成像。

Tang等^[68]基于远红外荧光“开启”型响应策略设计合成了一种基于苯并噻唑的高效荧光探针21(图25)。在探针溶液中逐渐加入Cys后,在365 nm波长紫外灯激发下,在607 nm处观察到逐渐增加的荧光发射,这是由于探针与Cys之间的共轭加成环化反应,荧光团被释放,探针对Cys(0~8 μM)检出限为0.12 μM,响应的Stokes位移为210 nm。探针可以通过不同颜色的荧光来实现Cys与其他氨基酸和人体常量元素的区分检测。探针具有良好的水溶性、低细胞毒性和高细胞膜通透性,被成功应用于水溶液和MCF-7细胞线粒体中Cys的靶向荧光成像检测。

Yang等^[69]基于白光发射策略,结合苯并噻唑和硝基苯并呋咱(NBD)设计合成了一种新型荧光传感器22(图26)。在其他氨基酸、阴离子和金属离子存在下,只有Cys可以使探针的两个荧光团发生裂解,生成两个产物,产生白光。探针对Cys的检出限为37 nM。在HeLa细胞的荧光成像实验中,这种白光发射系统也同样适用,表明该探针具有良好的生物相容性,使得它在医学领域的应用成为可能。

Gholami等^[70]利用汞对含硫氨基酸的强亲和性设计合成了一种新的基于苯并噻唑的双化学传感器23(图27),其可以检测水溶液中的Hg²⁺和Cys。在ACN:H₂O (V∶V=1∶1)溶液中加入Hg²⁺后,由于传感器和Hg²⁺离子之间配位络合物的形成,溶液由红色变成蓝色,向其继续加入Cys后,Hg²⁺对氨基酸巯基的高亲和力导致染料被释放出来,溶液重新变成粉红色,且加入Cys后20 s即可反应完成,传感器-Hg²⁺复合物对Cys的检出限为0.1 μM。实验还发现, 用传感器-Hg²⁺复合物涂布的试纸条遇纯化的含硫醇的氨基酸也可以引起颜色变化,表明该复合物可作为一种简单的比色型传感器筛选纯化的生物硫醇,但这种复合物传感器没办法对三种生物硫醇进行区分检测。

基于苯并噻唑类的检测Cys的荧光探针多是在其1位上引入相关取代基进行修饰,且多数这类探针具有大的Stokes位移能够有效降低背景荧光的干扰(探针15、19、20、21),检测灵敏度高,此外还可通过与金属离子形成络合物,来提高对Cys的响应速率(探针23)。

2.4 基于荧光素的Cys荧光探针

荧光素(Fluorescein)又被称为荧光黄、荧光橙黄、荧光红等,属于氧杂蒽类荧光染料。从分子结构(图28)上看,荧光素分子中包含羟基修饰的氧杂蒽环和螺环内酯两部分。在酸性条件下,荧光素处于闭环状态,无荧光产生;在碱性条件下,螺环内酯开环,同时氧杂蒽环形成一个共轭醌式结构,有强烈荧光出现。荧光素具有大的摩尔消光系数^[71]、高的荧光量子产率^[72,73]、发光信号稳定^[74]、良好的水溶性、激发波长和发射波长均位于可见光范围内^[75]。

Ji等^[76]基于Cys与丙烯酸酯的加成环化反应,设计合成了一种新的荧光探针24(图29),探针使用荧光素和久洛利定作为荧光团,探针在PBS缓冲溶液(pH 7.4)中展现出极低的背景荧光,加入Cys,在538 nm波长紫外灯激发下,567 nm处显示出近30倍的荧光增强,加入GSH只有微弱的荧光增强,其他氨基酸的加入几乎没有发出荧光。探针对Cys的检出限为39.2 nM,由于探针的低细胞毒性和良好的细胞渗透性,他们成功地把它应用在活的HepG2细胞荧光成像。Shi等^[77]同样利用丙烯酸酯为识别位点,设计合成了一种比率型荧光探针25定量检测活细胞中的Cys(图30)。在生理酸碱度条件下,在480 nm波长激发下,探针在520 nm处的信号强度随着Cys浓度的增加而增强,在700 nm处的荧光发射强度几乎不变。通过计算荧光强度比值可确定Cys的浓度从而实现对Cys的定量检测。

Karakuş^[78]等利用炔基酯为识别位点,设计合成了一种开启型荧光响应探针26检测Cys(图31)。与丙烯酸酯类似,炔基酯充当迈克尔加成反应的受体,探针自身无荧光产生,随着加入Cys的浓度逐渐增加,515 nm处的荧光强度逐渐增强,这是由于Cys上的—SH与探针末端炔基发生加成随后环化促进酯的裂解,导致荧光团被释放。探针对Cys的检出限为182 nM。加入其他的氨基酸荧光强度较无明显变化,表明探针对Cys的检测具有高选择性。另外,该探针在生理pH范围内对Cys具有高选择性,在A549 细胞中实现Cys的荧光成像。

Wang等^[79]利用DNBS为识别位点,设计合成了一种比色型视觉传感器27(图32)。传感器本身荧光很弱,加入Cys,溶液颜色由淡黄色变成黄绿色,其他氨基酸和金属离子存在不会干扰Cys的检测。探针对Cys检测限为6.5 μM。实验发现,探针对水和牛奶中Cys浓度的回收率高达106.7%和109.2%,表明传感器使得其在食品中检测Cys成为可能。

同样利用DNBS作为Cys识别位点,Du等^[80]利用碳氮三键对荧光素骨架进行修饰,并且引入2个DNBS设计合成了一种“开启”型响应荧光探针28(图33)。在向探针的水溶液中分别加入Cys、Hcy和GSH时,在519 nm处可观察到明显的绿色荧光发射,其中由Cys引起的荧光强度最大,这是由于Cys与DNBS反应,然后分子内环化脱去五元环,醌式结构形成。探针对Cys的检出限为0.021 μM,较探针27灵敏度更高,可应用在HeLa细胞内源和外源的Cys荧光成像。

Liu等^[81]通过苯基硒酰氯与荧光素反应设计了一种可逆的荧光探针29来监测活细胞中的Cys与HClO(图34)。探针本身由于带孤对电子的Se与荧光素母体之前的PET过程呈现非常弱的荧光,但由于加入具有氧化性的HClO后,探针中的富电子的Se被氧化成缺电子的SeO,阻断了PET过程,有荧光发射。当加入具有还原性的Cys时,SeO又被重新还原成富电子的Se,随着Cys浓度的增加,荧光逐渐降低,并且该探针对HClO和Cys之间的响应表现出高度的可逆性,且检测限低,分别为1.1和3 nM。根据细胞成像实验,探针可以通过监测绿色通道中的荧光强弱来实现对细胞内源性HClO和Cys的监测,并且这种高度可逆型的荧光探针为生命系统中的氧化还原稳态的研究提供了策略。

Qin等^[82]利用生物硫醇可以通过硫基与AuNPs 结合策略,设计合成了一种基于荧光内滤效应(Inner filter effect,IFE)和纳米粒子聚合机制共同作用的“开启型”荧光探针30(图35)。由于荧光素和AuNPs之间的IFE过程,荧光素荧光被猝灭,探针几乎无荧光。分别加入Cys/Hcy/GSH后,由于其诱导了AuNPs的聚集,三种生物硫醇引起了不同程度的荧光恢复。探针对Cys的检出限为0.6 μΜ。另外,探针对人体血清中的Cys回收率达95.6%~103.9%,表明探针可以用于人体中Cys的特异性检测。

基于荧光素的荧光探针最大发射波长多数在500~520 nm之间(探针25、27、28),这比结构类似的罗丹明染料的最大发射波长短。此外一般通过在荧光素的内酯式结构的3位(或6位)引入Cys的识别位点,其中探针3位和6位引入2个识别基团可以提高检测的灵敏度。

2.5 基于萘酰亚胺Cys荧光探针

萘酰亚胺衍生物结构(图36)中含有拉电子作用的“酰亚胺”结构和极易修饰和制备的R₂位的基团,当R₂位为吸电子基团时,萘酰亚胺衍生物的荧光很弱;当R₂位为供电子基团时,萘酰亚胺衍生物发出强烈荧光,是经典的基于ICT机制的染料^[83]。萘酰亚胺类衍生物具有刚性平面,拥有较大的π电子共轭体系,结构简单易于修饰^[84,85]、光稳定性好、荧光量子产率高、Stokes位移大^[86]、选择性好^[87]、灵敏度高^[88,89]等优异特性,因此被广泛用于荧光染料、发光器件、生物医药等多领域。

Hou等^[90]通过在1,8-萘酰亚胺骨架上引入多氰基呋喃基团并且以丙烯酸酯为识别位点,设计合成了一种近红外荧光探针31(图37)。探针在620 nm的激发波长下几乎没有荧光发射,加入10当量Cys后,由于探针ICT过程的恢复使其在665 nm处观察到40倍的荧光增强,探针对Cys(0~70 μM)检测限为0.093 μM。当Cys与Hcy/GSH共存时对Cys的检测几乎没有干扰作用,表明探针可以高选择性、快速和灵敏地区分检测Cys和其他生物硫醇。除此之外,探针还可应用于HeLa细胞和斑马鱼的内源和外源Cys的荧光成像。

Aydin等^[91]利用丙炔酸甲酯为Cys的识别位点,设计了一种“关-开”型荧光探针32高选择性地识别Cys(图38)。探针本身在416 nm有极强的蓝色荧光发射,逐渐加入Cys,发生迈克尔加成环化,探针的荧光主体结构被破坏,荧光发射蓝移至413 nm且强度减弱,而加入其他的氨基酸无明显荧光变化,探针对Cys的检出限为9.02 nM。由于正常细胞和癌细胞中Cys浓度不同,可以通过探针荧光的颜色变化对正常细胞和癌细胞进行区分,表明了该探针在医疗诊断中的应用潜力。

Zhu等^[92]利用4-氯-7硝基苯并呋咱(NBD-Cl)作为Cys识别位点,设计合成了荧光探针33(图39)。探针由于反应基团与荧光团部分的PET过程,无荧光产生。加入生物硫醇时,与探针发生亲核取随后分子重排,导致在550 nm处的荧光强度增加,且吸收光谱红移,且溶液由无色变成黄色。探针对Cys检测限为0.31 nM,可见该探针对Cys的灵敏度极高。但是其无法对三种Cys/Hcy/GSH进行区分检测。

Wang等^[93]通过在1,8-萘酰亚胺骨架上引入7-氯苯并呋咱-4-磺酰基(SBD-Cl),设计了一种基于FRET机制并可以对三种Cys/Hcy/GSH进行区分检测的探针34(图40)。SBD-Cl作为FRET的能量受体,萘酰亚胺部分作为能量供体。探针本身在533 nm显示非常弱的荧光发射,加入Cys后,559 nm处的荧光发射逐渐增强,黄色荧光开启,加入Hcy/GSH,由于其不能诱导探针分子内重排,荧光无明显变化。探针对Cys的检出限为0.87 μM。通过探针对HeLa细胞的共聚焦荧光成像实验发现,加入外源性Cys时,探针在原有的蓝色通道的荧光降低,而在绿色通道出现荧光,表明该探针可以检测活细胞中外源性Cys。同样利用SBD-Cl为识别位点,Li等^[94]设计合成了一种在不同颜色通道中可对Cys和H₂S进行区分检测的荧光探针35(图41)。1,8-萘酰亚胺上连接的三甘醇可以提高探针的水溶性,防止因分子间聚集而导致荧光淬灭。探针对Cys的检测限为16.7 nM。

Rong等^[95]利用DNBS做为识别基团,设计合成了一种通过开关响应检测生物硫醇的具有红色发射的和大斯托克斯位移的荧光探针36 (图42)。由于识别基团DNBS与荧光团之间PET过程,导致探针几乎不发荧光,随着加入的三种生物硫醇浓度不断增加,由于探针与生物硫醇发生亲核反应,识别基团与荧光团分离,阻断了PET过程,荧光恢复。探针对Cys检出限为9.87 nM。探针还可以检测MCF-7细胞中内源性和外源性生物硫醇,由于三种生物硫醇具有相似的结构,探针无法对它们进行区别检测。

Cao等^[96]利用2-噻吩羰基作为识别部分,设计合成了一种特异性检测Cys的荧光探针37(图43)。向探针的PBS缓冲溶液中分别加入400 μM Cys、Hcy和GSH时,实验发现加入Cys时最先达到最大荧光发射强度,这是由于其伪一级速率常数和二级速率常数最大,GSH次之,Hcy最小。所以探针可以对三种生物硫醇实现区分检测。探针对Cys(0~30 μM)的检出限为0.065 μM。探针还可以实现对斑马鱼体内的生物硫醇成像。

萘酰亚胺母体结构中的3位和4位以及R1位为反应活性位点,可对这些位点进行修饰来改善其水/脂溶性(探针35)、荧光发射波长(探针36)、响应灵敏度(探针33)等特性,尤其是在3或4位引入给电子基团时,与母体构成D-A结构,诱导ICT过程(探针31)。

2.6 基于氟硼吡咯的Cys荧光探针

氟硼吡咯(BODIPY)结构(图44)是由次甲基连接的两个吡咯单元和两个吡咯氮配位的BF₂基团组成。氟硼吡咯类染料具有较高的摩尔消光系数^[97]、荧光光量子产率高^[98]、发射波长在可见光区^[99]、光稳定和化学稳定性好^[100⇓~102]以及中心骨架的可修饰性高等优点。但同时也存在一些缺点,如水溶性差^[103]、发射波长短及Stokes位移较小^[104],使其应用受到了限制,可以对母体结构进行修饰,可设计、合成多种性能优异的荧光探针^[105,106],现已被广泛用于生物医疗、环境检测及光学领域。

Wang等^[107]通过在BODIPY母体的1-芳基对位引入吸电子三氟甲基、中性取代氢及供电子甲氧基三个不同的取代基,设计了3种荧光探针。3种探针都是无荧光的,且对Cys的时间响应均可在10 min内完成。实验发现,只有引入吸电子三氟甲基基团的探针38响应速度最快(图45),表明具有吸电子取代基的探针更有利于亲核攻击,反应更快速。探针38对Cys检出限为52 nM。他们课题组还通过在BODIPY的1位和7位引入甲基,3位和5位引入两个芳香基团,中间位置引入吸电子的噻唑硫醚基团^[108],设计合成了探针39(图46)。探针由于与Cys发生芳香取代-重排反应,在567 nm处可观察到80倍的荧光增强,并且在1 min内荧光强度可达到最大值的四分之三,说明探针39对Cys响应的速度快,检出限为51 nM。向这两种探针溶液中加入其他氨基酸和硫醇,除了Hcy引起微弱的荧光增强外,其他均无明显的荧光变化,表明这两种探针对Cys具有良好的选择性,在细胞成像实验中都能检测活细胞中的Cys。

Pham等^[109]在BODIPY母体的3-芳基对位分别引入含2,4-二硝基苯、甲苯或(二甲氨基)萘三种不同的取代基设计了近红外比率型荧光探针。实验发现,引入2,4-二硝基苯的探针40吸电子能力更强(图47),较其他两种探针具有更强的亲核取代能力,探针40对Cys的检出限为5.23 μM。与探针38相比,该探针具有更长的荧光发射,且与Cys反应伴随着颜色变化。

Ji等^[110]通过在BODIPY的1位和7位引入芳香环,设计合成了一种用于Cys特异性检测的线粒体靶向探针41 (图48)。由于PET过程,探针几乎没有荧光,与Cys反应后在617 nm处荧光显著增强,探针对Cys检出限为70 nM。对于Hcy仅有微弱的荧光增强,对于GSH几乎无荧光变化。表明其他分析物不会干扰Cys的检测。在HeLa细胞的共聚焦荧光显微镜成像实验中,探针具有良好的线粒体靶向能力,可以实现对小鼠体内Cys的成像。

Tao等^[111]在BODIPY的meso位引入了一个甲氧基苯硫基,使得探针的背景荧光极低,并在1位和7位引入提供空间位阻的甲基基团,设计合成了近红外荧光探针42(图49)。探针本身荧光极弱,加入Cys后,在580 nm波长紫外灯激发下,因为探针与Cys发生芳香取代重排在685 nm处观察到45倍荧光增强。加入Hcy/GSH,荧光均无明显变化。探针对Cys的检出限为118 nM。探针成功应用在HeLa细胞内源性Cys和小鼠体内深层组织的荧光成像。

Mei等^[112]同样在meso位接入苯基硒作为活性基团,在3位和5位引入2个甲基合成了探针43(图50)。加入Cys后,阻断了苯基硒与BODIPY主体之间的PET过程,与苯基硒发生芳香取代重排,荧光释放。对Cys的检出限为4.1 nM。与在meso位用硫醚取代的探针43相比,该探针对Cys有着更高的荧光量子产率,且响应速率更快,在2 min内即可达到平稳。通过对HepG2细胞共聚焦荧光成像实验发现,用Cys/Hcy处理过的细胞仅在蓝色通道发现荧光,而GSH处理过的细胞仅在绿色通道发现荧光,表明探针可以对Cys/Hcy与GSH进行区分检测。

Wang等^[113]在BODIPY的meso位接入一个8-羟基喹啉基团,然后将作为Cys的识别基团和荧光的淬灭位点的DNBS引入到喹啉的羟基位置,设计合成荧光探针44(图51)。喹啉上的碱性氮原子提供了分子中的氢键,加入Cys,其带有的—SH上的硫原子与苯磺酸盐连接,生成一个带有质子的不稳定中间体,然后巯基上的氢质子通过形成双氢键与羧基上的氧原子和喹啉结构上的氮原子迅速结合并离去,这种去质子化过程可以有效地加快磺酸盐裂解反应的速度,根据反应速率的不同对三种生物硫醇进行可区分检测,探针与Cys的反应速率最快,检测限为33 nM。探针还可以在HepG2细胞和斑马鱼体内进行Cys成像。

Wang等^[114]以BODIPY为FRET供体,近红外罗丹明为FRET受体,通过二硫键将两者连接起来设计合成了一种比率型荧光探针45(图52)。探针本身在480 nm波长紫外灯激发下在656 nm处显示近红外罗丹明荧光,而BODIPY提供的荧光非常弱。当加入生物硫醇后,由于其破坏了探针中的二硫键,导致将供体和受体分开,FRET被中断,导致在近红外区的罗丹明荧光强度降低,512 nm处BODIPY的荧光强度增加,60 min后,荧光强度比率(F_{512 nm}/F_{656 nm})显示60倍荧光增强。探针成功应用在HeLa细胞内线粒体中的生物硫醇成像,但该探针无法实现对三种生物硫醇的区别检测。

Jia等^[115]通过利用醚键将半菁和BODIPY连接起来设计合成了一种可以同时识别Cys、GSH和亚硫酸盐的荧光探针46(图53)。分别加入Cys和GSH后,由于探针的发射光谱有一定的重叠,为了将它们进行区分,将探针封装到胶束内部制定纳米荧光探针,向其中分别加入Cys、GSH和亚硫酸盐,在490 nm波长紫外灯激发下,在529和588 nm处观察到由亚硫酸盐和GSH引起的两个强发射峰,在670 nm波长激发下,710 nm处有Cys和GSH的荧光发射峰,加入Cys发射峰更明显。探针对Cys的检出限为2.29 μM。探针还可用于活细胞中Cys、GSH和亚硫酸盐的生物成像。

基于BODIPY的荧光探针的发射波长长(探针40、41、42、46),可以通过对母体的1、3、5、7及meso位引入相应的取代基,进行功能修饰。如在其meso位引入一个强吸电子基可以加快与Cys的反应速率(探针38、40)。

2.7 基于花菁的Cys荧光探针

花菁类染料(Cyanine)结构(图54)一般是包括两个含氮的杂环,它们通过甲川链连接在一起。其中一端的氮带有正电荷为电子受体,另一端的氮不带电荷为电子给体,它们形成了一个具有“推-拉”电子效应的共轭体系^[116],其中心碳具有亲电性质,可以在中心碳上引入各类取代基来修饰其光谱性质。花菁类荧光分子探针在可见光区摩尔系数高、量子产率好、光谱范围广、抗干扰能力较强、灵敏度较好^[117,118]。

Yang等^[119]通过在七甲川菁中心碳上引入硫代芳基取代基,利用生物硫醇与荧光团的偶联反应合成设计了一种对Cys/Hcy显示开启荧光响应的探针47 (图55)。在660 nm波长激发下,探针本身无荧光,加入Cys/Hcy后,在750 nm处观察到显著的荧光发射,伴随着溶液由浅绿色变成蓝色,探针对Cys的检出限为0.39 μm。加入GSH和其他氨基酸,均未观察到明显的荧光响应,表明探针可以作为一种比色型荧光传感器选择性识别Cys/Hcy,但无法对两者进行区分检测。探针还可以应用在HeLa细胞中Cys的荧光成像。

Zhu等^[120]通过引入DNBS作为荧光淬灭和Cys识别位点,亲脂阳离子单元作为线粒体靶向位点,设计了一种快速响应生物硫醇的荧光探针48(图56)。由于DNBS与荧光团之间的PET过程,探针本身无荧光,加入三种生物硫醇后,PET过程受阻,在604 nm处呈现不同倍数的荧光增强,对Cys的检出限为13.4 μM。由于探针带正电荷,线粒体膜内呈负电位,可以通过静电相互作用很好地聚集在线粒体内。通过对HeLa细胞及其他癌细胞进行线粒体靶向荧光成像实验发现,探针48对硫醇响应的红色荧光与线粒体追踪染料所发出的绿色荧光完全重叠,证明了该探针确有很好的线粒体内生物硫醇的靶向荧光成像能力,可作为一种有效工具来监测氧化应激诱导的细胞内生物硫醇波动水平。

Zhang等^[121]通过调节花菁荧光团的共轭π电子体系,并以丙烯酸酯基团为生物硫醇的识别位点,设计合成了一种比率型近红外荧光探针49(图57)。向探针的缓冲溶液中逐渐加入Cys,溶液由绿色变成红色,探针在794 nm处的荧光发射急剧下降,635 nm处出现新的荧光发射,而加入Hcy和GSH,引起的荧光变化非常小,表明探针可以对Cys表现出高水平的比率荧光发射,检出限为0.09 μM。实验发现,探针还可以检测人类肺癌细胞中的线粒体内的Cys的水平,实现荧光成像,表明该探针在医学诊断领域具有很大应用潜力。

Men等^[122]利用嘧啶作为Cys的识别单元,设计合成了一种近红外的开启型水溶性荧光探针50(图58)。加入Cys/Hcy,在650 nm波长激发下,探针在743 nm处显示明显的荧光增强,这是由于Cys/Hcy与探针反应生成硫取代产物,并且随后分子内重排,分别生成五元和六元环过渡态,从而获得稳定的氨基取代物,但与Cys反应更快。探针对Cys检出限为0.17 μM。GSH由于没有相邻氨基,故不能发生分子内重排反应。因此该探针可以实现对三种生物硫醇的区分检测,并成功应用在活细胞和小鼠体内的内源性Cys/Hcy荧光成像。

Fang等^[123]合成设计了基于对氨基苯基硫醚取代的花菁类染料的近红外荧光成像和比率光声成像的双模式荧光探针51(图59)。在PBS/DMSO溶液(10 mM,pH=7.4,V:V=1∶1)中,探针在695 nm处产生微弱的光声(PA)信号,840 nm处呈现较强的PA信号,但无荧光产生,当加入Cys/Hcy时,840 nm处的PA强度明显下降,695 nm处的PA强度增强伴随着荧光强度增强。探针对Cys的检出限为0.47 μM。即使在GSH存在的情况下,也不会造成干扰,表明探针可以实现荧光和光声双模式来检测溶液中的Cys/Hcy,但无法将两者进行区分检测。此外,探针还实现了对小鼠和活细胞中的内源性Cys/Hcy的检测。

Li等^[124]利用NBD部分为识别位点,IR780作为荧光团,将它们通过醚键连接,设计合成了一种具有低背景荧光的增强型荧光探针52(图60)。由于NBD诱发PET过程,探针本身无荧光产生,加入Cys/Hcy和GSH后,分别在绿色通道和红色通道中观察到明显的荧光响应。探针可实现活细胞中线粒体内生物硫醇的靶向荧光成像以及小鼠急性肝损伤的体内荧光成像,表明其有望在医学相关诊断方面有一定的应用,但探针无法对Cys和Hcy 两者进行区分检测。

Niu等^[125]通过将氯苯甲酸酯基团引入到花菁骨架中,根据氯原子在酯基的邻位、间位和对位三个不同的位置分别构建了三种探针,它们的吸收光谱无明显差异,表明氯原子分别处在邻位、间位和对位时对探针的吸收光谱无显著影响。再向其分别加入Cys时,只有氯原子处在邻位的探针53(图61)在780 nm处的吸收峰明显下降,且可诱导其荧光增强35倍,探针53对Cys(0~250 μM)的检出限为228 nM。加入Hcy和GSH,探针53的吸收峰无明显变化。表明探针可以高选择性地识别Cys。该探针已被成功应用于HeLa细胞和小鼠体内Cys的荧光成像以及线粒体内的靶向荧光成像。

Zhang等^[126]通过将不同的吸电子和给电子基团引入花菁骨架中同样设计合成了三种荧光探针。它们分别以吸电子的4-(三氟甲基)苯基硫醚和3,5-双(三氟甲基)苯基硫醚以及给电子的3,4-甲氧基苯基硫醚作为识别单元,通过调节探针中识别单元的电子密度来调节反应速率。三种探针由于苯基硫醚单元引发的PET过程显示非常弱的荧光,加入Cys后,带强给电子识别单元的探针54(图62)反应速率最快,对Cys的检出限为7.7 μM。表明强给电子能力利于探针与Cys之间的取代重排反应,这为以后通过调节电子密度来调控反应速率合成探针提供了新的策略。探针可以应用于HeLa细胞线粒体中内源性Cys靶向荧光成像。

通过在花菁染料母体的中心碳上引入不同的Cys识别位点,具有不同的响应速率。当引入给电子识别单元时,响应速率最快(探针54)。基于花菁染料的荧光探针发射波长长(探针47、50、51、54),在近红外区域内对Cys响应性好,且母体结构一端的氮带正电荷,容易与线粒体膜内负电荷结合,从而实现线粒体内Cys靶向荧光成像(探针48、53、54)。

2.8 基于硝基苯并呋咱的Cys荧光探针

苯并呋咱类化合物(BD)的7位被硝基取代构成硝基苯并呋咱(NBD)。NBD结构中(图63)位于7位的硝基是吸电子基团,若在4位接一个吸电子基团,ICT过程被阻断,化合物自生无荧光产生;若4位接一个给电子基团,构成推-拉效应,有荧光产生。NBD类衍生物合成简单,选择性好,被广泛应用于荧光传感领域。NBD荧光团具有高灵敏度^[127,128]、大斯托克斯位移、高量子产率、良好的光学性质和细胞渗透性^[129⇓~131],以及进行长波发射和修饰性好^[132]等优点。

An等^[133]通过在NBD的4位引入缺电子的五氟苯酚设计合成了一种开启型响应探针55(图64)。探针本身由于在4位取代基的缺电子特性导致无荧光产生,而经过Cys处理后的探针溶液由于发生取代和斯迈尔斯重排反应导致荧光重新开启。而加入其他的硫醇物质和H₂S没有观察到类似的荧光变化。该探针还首次被应用到GBM(胶质母细胞瘤)细胞中Cys的荧光成像,表明探针55可以高选择性、高灵敏度地检测GBM细胞中的Cys,从而在医学领域实现对GBM的筛查。

Lu等^[134]通过在NBD的4位接入醚键将NBD和菲并咪唑两个荧光团连接,设计合成了一种简单的双发射荧光探针56(图65)。在365和480 nm波长紫外灯激发下,探针无荧光产生,加入Cys后,通过与探针发生芳香取代反应切断醚键,释放荧光团,分别在470和550 nm处显示蓝色和绿色荧光,探针对Cys(0~100 μM)的检测限为22.6 nM。加入Hcy/GSH时,在365 nm波长激发下,在470 nm处观察到强烈的蓝色荧光;而在480 nm波长激发下,加入Hcy/GSH后由于空间位阻的影响,探针在550 nm处显示非常弱的绿色荧光。探针被成功应用在HeLa细胞和斑马鱼细胞中对Cys进行可视化检测。

Zhou等^[135]同样在NBD的4位引入醚键将其与含α,β-不饱和酮的香豆素衍生物连接,设计合成出一种具有较大摩尔吸收率和量子产率的荧光探针57(图66)。由于PET效应,探针本身无荧光产生。加入Cys后,释放出两个发射峰相同的荧光团,检出限为0.44 μM。加入Hcy反应速率较Cys慢,加入GSH,其体积太大,无法诱导NBD衍生物发生重排,无荧光产生。在HeLa细胞的荧光成像实验中,探针57可以对由Cu²⁺诱导的氧化应激中Cys的荧光成像。另外,探针成功应用在体内检测内源性和外源性Cys的荧光成像。

同样利用醚键将香豆素和NBD结合,Jing等^[136]设计了一种双色模式的荧光探针58(图67)。探针本身没有荧光,加入Cys,醚键被切断,分别在465和565 nm处的蓝色和绿色通道中产生10.7倍和11.2倍的荧光增强,探针对Cys检出限为8 nM。当加入Hcy时,在蓝色和绿色通道中也显示较弱的荧光增强。添加GSH或H₂S,仅在蓝色通道观察到荧光。该探针被成功应用在HeLa细胞和斑马鱼体内在不同颜色通道中对三种生物硫醇和H₂S进行区分检测。

Yang等^[137]通过将醚键将NBD和另外一种荧光团结合,也设计合成了一种双色模式探针59(图68)。该探针可以在两个独立的激发波长下在绿、蓝颜色通道中同时检测Cys/Hcy和GSH。探针对Cys的检出限为0.015 μM。但与探针58不同,该探针无法对Cys/Hcy进行区分检测。他们成功利用该探针在大型溞体内进行内源性Cys/Hcy和GSH的可视化检测。

在NBD母体4位上不仅可以引入吸电子基团设计“关开”型荧光响应探针来实现对Cys的检测,还可通过在4位上引入其他的荧光团,可设计具有双发射通道的荧光探针,在细胞成像实验中,它能更好地对三种硫醇在不同的颜色通道实现区分检测(探针58、59),提高Cys的响应灵敏度。

2.9 基于其他结构的Cys荧光探针

近红外荧光成像对比传统的可见光荧光成像因其具有高时空分辨率、更深的组织穿透力,可进行更深层的成像,在生物医疗领域有着广泛的应用前景。

二氰基异佛尔酮衍生物是典型的基于ICT机制的近红外的荧光团,具有长波长荧光发射、大斯托克斯位移和良好的光稳定性。Qian等^[138]基于二氰基异佛尔酮衍生物,采用DNBS作为识别基团的荧光探针60(图69)。探针本身由于DNBS的强荧光淬灭效应不发荧光,分别加入Cys/Hcy/GSH,可观察到荧光增强,由Cys引起的最为明显,对Cys的检出限为36.93 nM。Qian等^[139]再次引入F—,Cl—,Br—和NO₂— 4种不同的吸电子取代基对二氰基异佛尔酮荧光团进行结构修饰,以丙烯酸酯为识别位点,设计了四种探针。由于NO₂^-为强吸电子基,破坏荧光团的ICT过程,所以被NO₂^-取代的探针几乎无荧光发射。由三个卤素取代的探针都能对Cys做出荧光响应。其中由Br—取代的探针61(图70)表现出214倍的最大荧光增强和86.9 nM最低的检测限。该探针可用于HeLa细胞中内源性和外源性Cys的荧光成像。Ge等^[140]以硫酯部分为Cys的受体合成设计了一种新型的红色发射荧光探针62(图71)。探针经Cys处理后,具有210 nm的斯托克斯位移,荧光增强70倍,并且溶液由黄色变成红色,这是因为Cys与探针硫酯部分的碳硫双键的亲核加成形成一个稳定的五元环,探针对Cys检出限为79 nM。加入其他的分析物荧光变化不明显,表明探针可以特异性地识别Cys。该探针还被成功应用在HepG2细胞中内源性和外源性以及小鼠体内外Cys的荧光成像。

基于ICT机制,Zhao等^[141]以查尔酮衍生物为荧光团,丙烯酸酯为识别位点,合成了一种具有大斯托克斯位移的荧光探针63(图72)。因其含有中央酮结构,具有接受电子的性质,作为识别位点的是一种吸电子基团,减弱了探针的ICT效应。探针几乎不产生荧光,加入Cys可诱导30倍的荧光增强,其对Cys的检测限为80 nM。而加入Hcy/GSH,产生的荧光可忽略不计。表明该探针可以高选择性地识别Cys。除此之外,探针可以检测HeLa细胞中内源性Cys。

基于ESIPT机制,利用丙烯酸酯作为ESIPT封闭基团和识别位点,Guo等^[142]利用水杨醛合成的席夫碱为荧光团主体结构,合成了探针64(图73)。加入Cys后,由于探针分子内氢键的恢复,ESIPT过程开启,荧光增强25倍,检出限为36.4 nM。通过对斑马鱼进行荧光成像,发现经探针孵育的斑马鱼体内有微弱荧光产生,表明该探针具有良好的生物渗透性,对监测活体生物内Cys水平具有重要的使用价值。Sheng等^[143]以咪唑并吡啶衍生物为发色团合成探针65(图74)。这类发色团斯托克斯位移较大、低背景荧光、高检测灵敏度。加入三种生物硫醇,因为Cys的pK_a值相对更低,Cys能诱导更为明显的荧光增强,探针65对Cys的检测限为0.07 μM。Li等^[144]合成了一种基于黄酮类衍生物为荧光团的新型荧光比率探针66(图75)。丙烯酸酯基团阻断了探针的ESIPT过程,导致在530 nm处荧光的淬灭,420 nn处的荧光正常发射。只有当加入Cys时,两个发射峰之间的荧光比值线性增加。基于这两种不同发射峰之间的荧光比率关系实现对Cys的高灵敏度检测。探针对Cys检出限为42.3 nM。探针65、66被成功应用于HeLa细胞中内源性和外源性Cys荧光成像。

Long等^[145]基于萘的衍生物,以α,β-不饱和酮作为Cys反应位点,吗啉部分作为溶酶体靶向部分合成设计了双光子“开启”型荧光探针67(图76)。加入Cys,与α,β-不饱和酮发生迈克尔加成,可引起136倍的荧光增强,探针对Cys检出限为11 nM。而加入Hcy/GSH,荧光强度仅增加4/12倍,这是因为Cys空间位阻较低,它可以快速高选择性地检测活细胞中的溶酶体Cys。另外,探针可实现HeLa细胞中内源性Cys以及高达184 μm的组织深处双光子荧光成像。

有机小分子荧光探针是利用有机合成的染料和识别基团结合,对有机小分子荧光团结构进行合理的修饰。现已研发出许多检测Cys的有机小分子荧光探针,相对于大分子标记物,有机小分子更容易透过细胞膜,可实现对细胞组织深处Cys的特异性检测。因此,有机小分子荧光探针因合成简单、操作简便以及优异的选择性受到生物传感领域的广泛关注。

3 检测Cys的纳米荧光探针

多数有机小分子荧光探针的原料具有污染性、荧光发射光谱和激发光谱受环境影响大及探针的不稳定性、不能长时间使用等缺点在一定程度上限制了其在生物、医疗等领域的发展。因此纳米材料作为荧光传感器用于Cys的检测引起了人们的广泛关注。纳米荧光探针因其独特的小尺寸效应、量子尺寸效应和表面效应等^[146],表现出与许多大块物体或者同质的大分子不同的光学性质。与有机小分子荧光探针相比,纳米荧光探针对目标分析物具有更高的检测灵敏度和更快的响应速率,这些优良性质使得纳米荧光探针在生物传感、医学工程以及环境检测等领域有着广泛的应用。目前常用于检测Cys的纳米荧光探针材料有量子点、金纳米材料、碳点等。

3.1 基于量子点的Cys荧光探针

量子点(Quantum dots, QDs)是由极少的原子或分子组成的纳米尺度范围内的具有半导体性质的微粒。量子点较传统有机染料具有如下优势:①荧光发光光谱窄使其具有更高纯度的光吸收,激发光谱宽,具有大的斯托克斯位移能有效避免光谱重叠^[147];②光化学稳定性好不易被分解;③颜色可调,可实现多色标记,这些优良的性质使得量子能够应用在检测各种小分子和离子中。

碳量子点(Carbon quantum dots,CQDs)具有强的光稳定性和抗光漂白性,以及可在紫外至近红外波长范围内进行荧光调控^[148]。基于CQDs的传感器和生物传感器的工作机制包括荧光淬灭、静态淬灭、动态淬灭、能量转移、内滤波效应(IFE)、光诱导电子转移(PET)和荧光共振能量转移(FRET)等^[149]。但是由于CQDs的荧光产率低、荧光颜色单一等缺点,限制其应用,通过掺杂元素成为提高其荧光产率的常用方法。利用掺杂氮元素的CQDs,Jiang等^[150]合成了半纤维素基碳量子点的荧光传感器68用来检测Ag⁺和L-Cys(图77)。由于Ag⁺与传感器表面的基团形成络合物,传感器68的荧光被淬灭。随着L-Cys的加入,其对Ag⁺的络合能力更强,导致其从传感器表面释放出来,荧光重新恢复,并且实验发现30天后传感器的荧光强度依旧可以保持在初始强度的85%左右,说明传感器的光致发光稳定性好,在pH 3~9内,荧光强度保持相对稳定。对L-Cys的检出限为242 nM。该传感器被成功应用于检测河水中的Ag⁺ 。

Wang等^[151]基于FRET机制,利用Cl、N和P元素共掺杂CQDs合成了一种“开-关-开”型传感器69(NPCl-CQD_S),该传感器可以按顺序检测核黄素、Ag⁺以及Cys(图78)。传感器本身在453 nm有一个强发射峰,呈现蓝色荧光,当向其加入核黄素后,会在530 nm处产生一个新的发射峰,由于作为能量供体的NPCl-CQD_S的发射光谱与作为能量受体的核黄素的吸收光谱重叠,引发FRET过程,加入Ag⁺会破坏核黄素与传感器之间的FRET过程,加入Cys,530 nm处的荧光重新开启,且在2.5 min后荧光强度基本恢复。对Cys的检出限为0.96 nM,灵敏度高。该传感器还表现出低细胞毒性,能够在HeLa细胞中实现Cys的荧光成像。

石墨烯量子点(Graphene quantum dots,GQDs)的吸收光谱覆盖在大部分可见光区,其表面基团和尺寸会影响其的紫外吸收峰波长的移动^[152]。与有机小分子荧光染料相比,GQDs在受能量较低的长波长的光激发时,可发射出较高能量的短波长的光^[153]。GQDs具有稳定的光致发光特性^[154]、生物相容性和低细胞毒性^[155],使其在生物传感领域有广大的应用前景^[156]。通过在GODs中掺杂杂原子可以改变其催化能力和电子带隙结构,从而改变GODs的荧光^[157]。Deng等^[158]利用Fe和N共掺杂GQD合成了传感器70(Fe,N-GQDs)来检测Cys(图79)。由于量子限制效应,Fe,N-GQDs在420 nm波长激发下,在480 nm处发出明亮的蓝绿色荧光,他们发现Fe,N-GQDs有过氧化酶的活性,可以催化H₂O₂把TMB(一种过氧化酶底物)氧化成蓝色的oxTMB。当向Fe,N-GQDs+H₂O₂+TMB溶液中加入L-Cys时,溶液从蓝色变成无色,表明L-Cys可以减少oxTMB产生,且L-Cys容易被H₂O₂氧化成胱氨酸从而消耗了溶液中H₂O₂的浓度,减少了TMB的氧化,传感器对Cys的检出限为140 nM。

Liu等^[159]利用N掺杂GQDs(N-GQDs)合成传感器71来识别Hg²⁺和Cys(图80)。Hg²⁺会附着在N-GQDs上表明会导致其荧光淬灭;加入Cys,荧光又重新恢复,形成的N-GQDs/Hg²⁺/cysteine还可以对H₂O₂进行定量检测;加入H₂O₂,半胱氨酸被氧化成胱氨酸,荧光减弱,荧光强度与H₂O₂浓度呈负相关。

Xue等^[160]通过利用马来酰亚胺修饰GQDs,设计合成了两种新型荧光探针72、73(图81)。在PBS缓冲溶液(pH 7.4)中,马来酰亚胺功能化的GQDs(M-GQDs)由于马来酰亚胺的猝灭作用是无明显荧光。探针72对生物硫醇的传感机制是利用马来酰亚胺基团的双键与生物硫醇中的—SH发生迈克尔加成反应生成饱和的马来酰亚胺环,阻断了ICT和PET过程,M-GQDs的荧光强度随着生物硫醇的加入逐渐增强。探针73是基于M-GQDs与(4-氨基苯基)卟啉(TAPP)之间的FRET过程,生物硫醇中的—SH破坏了 M-GQDs与TAPP之间的“供体-受体”关系,从而会使TAPP的荧光强度减弱而M-GQDs的荧光增强,形成一种比率关系,探针73能够更快速、高灵敏地检测生物硫醇,对Cys检出限为0.234 nM。

3.2 基于金纳米材料的Cys荧光探针

纳米金是指直径1~100 nm的金微小颗粒,一般分为金纳米颗粒(AuNPs)和金纳米团簇(AuNCs)。AuNPs化学稳定性好,且表面可修饰性强。AuNCs是由几个到几百个原子组成,具有良好的水溶性和生物相容性。与其他金属纳米材料相比,纳米金材料在紫外-可见光区域具有较宽的吸收范围,且安全性更好,在生物传感器领域有着广泛的应用前景。

Zhang等^[161]基于AIE效应利用GSH作稳定剂合成了一种稳定的AuNCs增强型荧光传感器74(图82)。在紫外光的激发下,探针发出微弱的橙色荧光。即使激发波长不同,AuNCs发射波长都稳定在600 nm处。在AuNCs的水溶液中分别加入1.5 mM Cys和1.0 mM GSH时,在透射电子显微镜中观察到有明显的聚集现象,荧光强度增强3倍,即使在紫外光下连续照射10 min,荧光强度基本不发生变化。探针对Cys(2.49 μM ~ 0.80 mM)的检出限为0.42 μM,该探针成功地应用于人体血清中生物硫醇的检测。

Niu等^[162]利用“开关”型策略设计利用牛血清蛋白(BSA)作稳定剂与AuCL₄^-反应合成了基于AuNCs的荧光传感器75(图83),可用于检测和识别Cys和Cu²⁺。Cys可以通过填充金纳米团簇的表面缺陷与传感器反应,导致荧光增强,加入Cu²⁺时,半胱氨酸被氧化成胱氨酸,导致Cys与传感器之间形成的S—Au键被破坏,纳米团簇聚集状态无法保持,从而荧光被猝灭。探针对Cys(0~15 μM)的检出限为30.4 nM。该传感器对在患有阿尔兹海默病小鼠的肝脏和心脏中的Cys成像时,荧光强度较正常小鼠明显降低,表明其可作为一种辅助性医疗方式用于相关疾病的诊断。

Li等^[163]同样基于“开关”型策略设计合成了基于AuNCs-AuNPs的探针76(图84)。首先基于电子转移的原理制备加入一种还原剂合成AuNCs复合材料。这种还原剂的浓度越高,AuNCs复合材料的荧光越强。再加入AuNPs后,合成探针76。由于AuNPs的吸收光谱与AuNCs复合材料的荧光发射光谱明显重叠,从而诱导荧光內滤效应,荧光被淬灭。加入L-Cys后,荧光重新开启,检出限为1.4 μM。荧光恢复率高达100.7%。探针对其他常见的金属离子和氨基酸几乎没有荧光响应,说明探针76抗干扰能力强,对Cys的选择性好,可用于人体血清中Cys的分析与检测。

Nguyend等^[164]以带正电的阳离子聚合物(PDADMAC)包裹住AuNPs,提高了其稳定性,合成了一种比色型传感器77检测Cys(图85)。AuNPs溶液本身呈红色,当加入Cys后,由于Cys中的—SH与金粒子之间的强亲合力,导致Cys与AuNPs之间通过Au—S键紧密结合在一起,13 min后在520 nm处出现最强吸收峰,伴随着溶液颜色由红色变成蓝色(或紫色),且当向存在Cu²⁺的AuNPs溶液加入Cys时,在520 nm处出现最强吸收峰的时间缩短至7 min,这是由于Cys的氨基和羧基与Cu²⁺形成了稳定的络合物,聚集得更紧密,提高了对Cys检测的灵敏度,检出限为88 nM。基于这个现象,通过研究AuNPs粒径的大小对Cys检测的影响^[165],结果表明较小粒径的AuNPs比较大粒径的AuNPs表现出更高的灵敏度。

沸石咪唑盐骨架(ZIFs)是一种金属有机骨架,当以钴(Ⅱ)为中心原子时,定义为ZIF-67。Liu等^[166]利用金纳米粒子对ZIF-67进行修饰,设计了探针78(图86)。与ZIF-67相比,利用金纳米粒子修饰的ZIF-67溶液中加入Cys,颜色变化更为明显。表明该探针可用作肉眼检测Cys的比色型探针,检测限为1 μM。

Chaicham等^[167]设计合成了一种基于AuNPs和GQDs的比色荧光传感器79检测Cys(图87)。GQDs可以有效促进AuNPs的形成和稳定,形成AuNPs/GQDs结构。在PBS缓冲溶液(pH 7.4)中,AuNPs/GQDs在525 nm处显示宽吸收带,加入Cys后,525 nm处的最大吸收峰明显降低,伴随着在645 nm处出现新的吸收带,溶液由红色变成蓝色,对Cys的检测限为5.88 μM。加入其他氨基酸,紫外-可见光谱无明显变化。该探针可以实现对牛奶和人体尿液中Cys的特异性检测。

3.3 基于碳点的Cys荧光探针

碳点(Carbon dots,CDs)是尺寸小于10 nm且具有良好的荧光发射特性的碳纳米颗粒。CDs的表面有许多官能团,可以对其进行修饰,如羧基可以使CDs具有良好的水溶性,这些官能团的存在使得CDs能够更好地与其他材料或生物试剂结合。除此之外,CDs的合成原料具有的来源广泛、合成简单、毒性低等优势使得受到的关注度逐渐提高,应用也越来越广。

Mohandoss等^[168]利用N,S共掺杂CD(N,S-CDs)设计合成了一种具有高量子产率的传感器80检测Cys(图88)。N,S-CDs溶液在日光下是无色的,在450 nm波长激发下发出绿色荧光,表明N,S-CDs具有良好的光致发光特性,且这种性质取决于其粒子大小和表面形态。加入Cys,由于—SH与N,S-CDs表面—NH₂之间的亲核作用,光致发光明显增强,且绿色荧光变成黄色荧光,加入其他分子或金属离子,无明显变化,对Cys检出限为23 nM。该传感器还能很好地穿透细胞膜,可实现对HCT 116细胞内Cys的荧光成像。

Xiang等^[169]将(N,S-CDs)与银纳米粒子(AgNPs)结合起来,设计合成了一种依赖于酸碱度的“开-关-开”型荧光传感器81(图89)。由于N,S-CDs表面存在具有强亲合力的—NH₂和—SH基团,将AgNPs吸附在其表面,使其荧光猝灭。加入三种生物硫醇时,由于硫醇的亲合力更强,使AgNPs从传感器81表面解离出来,荧光恢复。在pH 3时,三种生物硫醇都可以引起相似程度的荧光恢复,当pH 7时,只有Cys/Hcy会引起荧光恢复。该传感器对Cys的检出限为68.5 nM,已被成功用于测定人体血清中生物硫醇的浓度。Natesan等^[170]同样基于“开-关-开”策略设计了一种检测Ag⁺和Cys的CDs传感器82(图90)。CDs在530 nm处有一个强荧光发射峰,加入Ag⁺后,由于Ag⁺与CDs结合,导致荧光淬灭,而加入Cys后,Cys与Ag⁺的强结合作用使得其从CDs表面解离,荧光重新恢复。传感器对Cys的检出限为0.34 μM,可实现对活细胞中Cys的荧光成像。此外该传感器还被用作指纹染色的荧光染料。

Zhao等^[171]基于N掺杂黄色荧光碳点(y-CDs)与具有蓝色荧光的铜纳米粒子(CuNCs)设计了一种双发射的比率型荧光探针83检测生物硫醇(图91)。这是由于Cu²⁺可以与y-CDs表面的含氮基团发生配位,阻断了PET过程,导致y-CDs在567 nm处的黄色荧光增强,且通过FRET过程导致450 nm处CuNCs的蓝色荧光猝灭,加入生物硫醇可以阻止y-CDs与Cu²⁺螯合,导致y-CDs黄色荧光淬灭,CuNCs的蓝色荧光恢复。通过计算荧光强度比值可实现对Cys的定量检测,检出限为0.21 μM。该传感器还可在血清中对Cys进行比率型荧光检测。

Lu等^[172]首次基于纳米酶设计合成了一种比率型荧光探针84(图92)。由于铁离子具有强氧化性,在CDs中掺杂铁离子使其具有优异的过氧化物酶活性,然后结合作为酶底物的邻苯二胺(OPD),其能够被氧化成具有光致发光特性的氧化OPD,使得探针78在360 nm波长紫外灯激发下在460和560 nm处具有两个发射峰。加入L-Cys时,会抑制氧化OPD的产生,导致560 nm处的荧光强度降低,460 nm处的荧光强度不变,检出限为0.047 μM。在其他氨基酸和阳离子存在下,该探针仍能高选择性检测L-Cys。除此之外,该探针还被成功用于检测水和血清中的L-Cys,这为以后开发更多基于纳米酶的荧光探针提供了可鉴之处。

Liu等^[173]基于CDs报道了一种根据荧光强度的变化来定量检测溶酶体内Cys/Hcy浓度以及pH值的荧光传感器85(Scy-CDs)(图93)。该传感器在pH 7时,在556 nm处有强荧光发射,随着加入H⁺,pH下降,荧光强度逐渐减弱,在pH5.0~5.6之间荧光强度与pH呈线性关系,表明该传感器可测定溶酶体内(pH 4.4~6.5)pH值,存在Cys或Hcy的情况下,PET过程被阻断,荧光可以快速恢复,表明该传感器可以用于溶酶体内Cys的靶向荧光成像。

纳米荧光探针对Cys的检测大多可以在水溶液中进行,且稳定性好,较有机小分子荧光探针,操作简单、检出限更低、灵敏度更高,但对Cys的选择性低,难以实现特异性检测Cys,因此开发高选择性检测Cys的纳米荧光探针还有很大的研究空间。

4 荧光蛋白类

荧光蛋白(Fluorescent proteins,FPs)是通过转染质粒DNA在细胞内自身生产的蛋白,分子量为25~30 KDa。荧光蛋白具有良好的靶向性,其细胞毒性低、组织穿透力强、可以在细胞或生物体内提供精确的标记。但由于荧光蛋白的光稳定性差、斯托克斯位移小等劣势,对于生物荧光成像有一定的负面影响。近年来绿色荧光蛋白(GFP)开始广泛地应用于各种生物传感中^[174,175]。

用GFP作为发色团,Shen等^[176]将丙烯酸酯既作为荧光猝灭基团也作为Cys的识别基团,设计合成了一种具有红色发射波长开启型荧光响应探针86(图94)。探针在493 nm波长紫外灯激发下,随着加入Cys的浓度不断提高,620 nm处的荧光强度逐渐增强,在pH=4.2~8.5范围内,荧光强度保持稳定,对Cys(0~200 μM)的检出限为18.7 μM。加入Hcy/GSH,由于探针与其反应的动力学速率不同,与Cys反应最快,表明探针可以在生理酸碱度范围内高选择性地检测Cys。通过对Bel-7402细胞中共聚焦荧光显微镜成像,该探针可实现对活细胞中内源性和外源性Cys的检测。他们还设计了一种溶酶体靶向荧光探针87^[177](图95)。探针以DNBS作为荧光猝灭和Cys检测基团,并引入吗啉基团作为溶酶体靶向基团。探针87在470 nm波长下无荧光产生,再加入50 μM不同的生物硫醇和氨基酸与探针孵育30 min后,只有Cys和GSH引起明显的荧光开启变化,但由于GSH上的—SH活性比Cys高,这导致GSH的响应速度比Cys快。探针对Cys(0~14 μM)检测限为4.98 nM。被成功应用在Bel-7402细胞中溶酶体内源性和外源性的Cys靶向荧光成像。

5 结论和展望

本文综述了近三年来检测半胱氨酸的87种荧光探针的最新研究进展。对这些荧光探针的设计策略,对Cys的传感机制进行了重点概述。根据发色团的不同,这些荧光探针被分为三大类:有机小分子荧光探针、纳米荧光探针和基因荧光探针,然后在每个类别中把相似的检测机理和识别团的种类放在一起进行比较概述。概述发现有机小分子荧光探针中丙烯酸酯是最为常见的Cys识别基团,其通过与Cys发生共轭加成反应,随后分子内环化脱去,荧光团被释放出来,荧光开启,达到检测Cys的目的。有机小分子荧光探针具有良好的生物相容性可以特异性检测细胞深处组织的Cys,成像深度大于100 μm(探针3、探针67),还可同时实现单/双光子成像(探针20),但由于有机小分子探针荧光团结构相对简单,所以发光稳定性容易受环境等因素的影响。纳米荧光探针由于体积小,较有机荧光探针具有更低的检测限,低至0.234 nM(探针73),可以实现对Cys的超痕量检测。但由于多数纳米荧光探针对Cys的检测是需要借助第三方试剂,如金属离子等,以及对具有相似结构的三种生物硫醇难以区分,所以选择性较低。基因荧光探针因其低细胞毒性、组织穿透力强,可以在细胞或生物体内提供精确的标记,如实现溶酶体的靶向荧光成像(探针87)。

基于这些发现,未来我们对Cys的检测研究可以朝以下三个方面进行:(1)通过对荧光团结构进行修饰或开发新的荧光团和传感机制,在保证荧光特性的基础上,制备发光更为稳定,检测更为灵敏以及反应更为迅速的荧光探针;(2)开发具有特异性靶向位点识别、双(多)光子荧光探针来实现对细胞的功能性荧光成像;(3)发展能够实时、动态检测体内Cys的可视化荧光传感器。

总之,开发出能够在细胞组织内特异性识别检测Cys的荧光探针对于临床医学诊断领域具有重要意义。

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2021-09-29	2022-08-20	2021-11-27
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2022-04-01

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