酶催化原子转移自由基聚合

王慧悦; 胡欣; 胡玉静; 朱宁; 郭凯

doi:10.7536/PC211009

化学进展 ›› 2022, Vol. 34 ›› Issue (8) :1796-1808 DOI: 10.7536/PC211009

综述

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酶催化原子转移自由基聚合

王慧悦 ¹ ,
胡欣 ²^,^* ,
胡玉静 ¹^,^* ,
朱宁 ¹^,^* ,
郭凯 ¹

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Enzyme-Catalyzed Atom Transfer Radical Polymerization

Huiyue Wang ¹ ,
Xin Hu ²^,^* ,
Yujing Hu ¹^,^* ,
Ning Zhu ¹^,^* ,
Kai Guo ¹

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摘要

原子转移自由基聚合(ATRP)是制备分子量以及分散度可控聚合物的重要途径。然而,受制于除氧步骤复杂、金属催化剂残留以及单体适用范围有限等因素,ATRP难以应用于批量制备功能化聚合物/共聚物材料,限制了其进一步应用。近年来提出和发展的酶催化聚合,为高效便捷除氧、拓展单体适用范围以及制备具有特殊(纳米)结构的纯净聚合物/共聚物提供了新思路。本文详细介绍了酶的结构与催化机理,以酶的种类进行分类,系统总结了具有不同结构的酶催化体系(包括过氧化辣根酶、血红蛋白、血红素、漆酶等)的催化机理、适用单体、优缺点及应用等;综述了酶以及酶模拟物催化ATRP体系的发展现状;最后,对酶催化ATRP的发展前景和挑战进行了探讨和展望。

Abstract

Atom transfer radical polymerization (ATRP) is an important method for preparing polymers with controllable molecular weight and polydispersity. However, due to the complex oxygen removal steps, metal catalysts residue, and limited monomer scope, it is difficult for ATRP to be widely used in the large-scale preparation of functionalized polymers/copolymers. With the development of enzyme-catalyzed polymerization, radical polymerization has made significant progress in efficient and convenient oxygen removal, expanding monomer scope, and the synthesis of polymers/copolymers with special (nano) structures. This review highlights the structure of enzymes and their catalytic mechanism in enzyme-catalyzed ATRP. Various enzyme/ enzyme mimics catalysis system (including horseradish peroxidase, hemoglobin, heme, laccase, etc.) employed in ATRP are carefully summarized in order. Finally, the opportunities and challenges of enzyme-catalyzed ATRP are discussed for the further development in this field.

Enzyme-Catalyzed Atom Transfer Radical Polymerization

Contents

1 Introduction

2 Horseradish peroxidase(HRP)catalyzed ATRP

3 Hemoglobin catalyzed ATRP

4 Hemin and Enzyme mimic catalyzed ATRP

5 Laccase catalyzed ATRP

6 GOx-HRP cascade catalysis applied as initiator

7 Conclusion and outlook

Graphical abstract

关键词

原子转移自由基聚合 / 酶 / 催化

Key words

ATRP / enzyme / catalysis

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王慧悦, 胡欣, 胡玉静, 朱宁, 郭凯. 酶催化原子转移自由基聚合[J]. 化学进展, 2022, 34(8): 1796-1808 DOI:10.7536/PC211009

Huiyue Wang, Xin Hu, Yujing Hu, Ning Zhu, Kai Guo. Enzyme-Catalyzed Atom Transfer Radical Polymerization[J]. Progress in Chemistry, 2022, 34(8): 1796-1808 DOI:10.7536/PC211009

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1 引言

原子转移自由基聚合(ATRP)是制备具有精确拓扑结构、分子量以及分散度可控聚合物的重要手段^{[1⇓⇓⇓⇓~6]}。然而,受制于过渡金属催化剂的毒性以及残留等影响^[7⇓~9],聚合产物难以应用于微电子、生物医用等领域^[10]。近年来,改进ATRP体系蓬勃发展^[11,12],包括引发剂连续再生催化剂ATRP (ICAR ATRP)^[13⇓~15]、电子转移再生催化剂ATRP (ARGET ATRP)^[16]、零价铜催化的活性自由基聚合(SET-LRP/SARA ATRP)^[17]、电调控ATRP (eATRP)^[18]及光诱导ATRP (photo-induced ATRP)^{[19⇓⇓~22]}等在内的一系列新体系被相继提出,显著降低(甚至完全规避)了产物中的金属残留,拓展了ATRP技术的应用场景^[23,24]。然而,一些功能化单体仍然难于通过ATRP进行聚合,限制了该方法在制备功能材料领域中的进一步应用^[25]。此外,ATRP在反应过程中,自由基/活性种极易受到氧的影响,发生阻聚以及淬灭等反应,降低聚合反应效率,常规下需要进行冷冻解冻泵循环(freeze-pump-thaw)以及惰性气体保护等方法消除体系中的氧。这对除氧设备以及操作提出了较高的要求,也限制了ATRP技术的应用场景。因此,亟待开发新ATRP技术,以拓展适用单体范围、高效便捷制备功能化聚合物/共聚物新材料。

酶作为一种高效性与专一性的生物催化剂,具有绿色、无毒、可再生、反应条件温和及环境友好等特点^[26],已被广泛应用在各类反应中^[27⇓~29]。此外,酶催化过程还表现出优异的区域选择性、立体选择性以及化学选择性^[30],并且可以在温和的条件下催化反应的进行,已广泛应用于开环聚合^{[31⇓⇓⇓~35]}或缩聚^{[36⇓⇓~39]}等反应。将酶用于可逆失活自由基聚合(RDRP)近年来崭露头角:Qiao等^[40]、Boyer等^[41]、安泽胜等^[42]发展了酶参与的RAFT,并广泛应用于聚合诱导自组装等^[43,44]。Bruns等^[26]、di Lena等^[45,46]及Matyjaszewski等^[47]相继发展了(模拟)酶催化ATRP的新方法,并取得了重要进展。根据过渡金属的种类不同,ATRP可以使用Cu (包括Cu(0)、Cu(I)、Cu(Ⅱ))^[48⇓~50]、Fe(包括Fe(0)、Fe(Ⅱ)、Fe(Ⅲ))^[51]、Ru、Ir等金属作为催化剂,通过其价态变化对聚合进行调控。酶催化则是利用其金属-蛋白结构中金属中心(如含有铁中心的过氧化辣根酶(Horseradish Peroxidase, HRP)^[52]、含有铜的漆酶(Laccase)^[53]和过氧化氢酶(Catalase)^[54,55]等)与过渡金属催化体系结构相似的特征,对引发剂/休眠种进行活化,引发功能单体进行ATRP。酶催化体系在制备功能化聚合物/共聚物,尤其是在实现较难聚合单体(如,N-乙烯基咪唑(NVIm)、甲基丙烯酸(MAA)等)的自由基(共)聚合中具有显著优势,拓展了ATRP技术在功能高分子材料制备领域的应用。

在便捷除氧方面,酶也表现出极大的优势^[56]。Matsuda等^[57]发展了葡萄糖氧化酶(GOx)除氧方法,随后该方法被广泛地应用于光引发^[58]、热引发^[59]的自由基聚合中^[60,61],并表现出良好的除氧效果。将酶催化除氧应用于ATRP具有操作便捷、环境友好等优势,更可以突破ATRP厌氧条件的限制,甚至在开放环境中进行^[62]。此外,由于酶具有金属活性中心-蛋白质空腔的特殊结构,其作为催化剂在构筑具有仿生特点的纳米结构聚合物、选择性构筑具有功能化改性表面层等方面也展现出巨大的优势^[63⇓~65]。

本文系统总结了近年来酶催化原子转移自由基聚合的研究进展,详细阐述了酶的结构与催化机理,系统总结及对比了具有不同金属活性中心的(模拟)酶(包括铁作为活性中心的HRP、血红蛋白、血红素以及铜作为活性中心的Laccase、Catalase等)催化ATRP聚合的适用单体、单体转化率、分子量及分散度、优缺点等;综述了酶以及酶模拟物催化ATRP体系的发展现状;列举了酶催化ATRP制备功能化材料的应用场景;最后概括了酶催化应用于ATRP的研究现状并对其发展前景与挑战等进行了探讨和展望。

表1总结了不同酶催化乙烯基单体的ATRP聚合的相关性能数据。

2 辣根过氧化物酶(HRP)

辣根过氧化物酶(HRP; EC 1.11.1.7)是过氧化物酶的一种,在植物辣根中含量高,是辣根中多种该类同工酶的总称。它是由单一肽链和铁卟啉结合而成的糖蛋白,其活性中心含有铁和钙两种金属。HRP已被广泛应用于乙烯基单体、芳香族化合物的自由基聚合,其结构如图所示(图式1a),具有308个氨基酸残基,铁卟啉为辅基。HRP的大小约为4.6*6.7*11.7 nm,分子量约为40 kDa。其催化的最适pH值为5左右,但因氢供体的不同,pH值又会有一定的差异。

HRP主要是通过过氧化氢(H₂O₂)/β-二酮类化合物/过氧化物酶三元氧化还原体系进行催化自由基聚合,具体催化机理如图式1b所示。处于基态的HRP中的Fe(Ⅲ)被氧化,得到含有Fe(Ⅳ)中心的高氧化态的Compound Ⅰ。随后,Compound Ⅰ在还原性底物的存在下,与H⁺作用,得到另一个含有Fe(Ⅳ)中心的Compound Ⅱ。Compound I与Compound Ⅱ都具有强氧化性。当体系中的H₂O₂过量时,HRP会进一步与Compound II反应生成含有Fe(Ⅲ)的复合物Compound Ⅲ和O₂,Compound Ⅲ会自发恢复成HRP天然基态,而O₂则会抑制聚合反应的进行。因此,在使用HRP催化聚合反应过程中,控制H₂O₂的用量至关重要,但这并不阻碍HRP在催化可控自由基聚合中的使用。

2011年,di Lena等^[45,46]发展了蛋白酶催化的ARGET ATRP,分别研究了HRP、过氧化氢酶以及漆酶三种不同的酶催化的丙烯酸聚乙二醇(PEGA)的ARGET ATRP过程。反应以烷基卤化物(2-溴丙腈(BPN)、2-溴代异丁酸乙酯(EBiB))为引发剂,对三种酶催化效果进行对比。以过氧化氢酶作催化剂,抗坏血酸(AscA)作还原剂时,在60 ℃反应条件下进行8 h后,单体转化率可达90%以上,所得聚合物分子量M_n为8700 g/mol,与理论值接近,分散度-D≤1.70。当反应温度降低时,单体转化率也随之降低。以HRP作催化剂时,单体转化率可达96%以上,且聚合物分散度-D≤1.60。为提高过氧化氢酶的稳定性,有研究者使用聚乙二醇缩水甘油酯(PGMA)和细菌纤维素对过氧化氢酶进行固定化修饰,进一步提高其生物相容性及热稳定性,拓展了其应用^[55]。

同年,Bruns等^[67]以HRP为催化剂,以溴异丁酸乙二醇酯(HEBIB)为引发剂,AscA为还原剂,在没有任何过氧化物的参与下,实现了N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm, NIPAm, NIPA)的ARGET ATRP。所得聚合物分子量M_n为50 000~220 000 g/mol,分散度-D为1.40~1.80。预测聚合机理如图式2所示,低价态金属铁中心的HRP (Fe Ⅲ)催化HEBIB (休眠种)产生初始自由基(活性种)并形成含有高价态铁活性中心的HRP (Fe Ⅳ),自由基/活性种引发单体聚合,并通过HRP(Fe Ⅳ)调控体系内自由基的浓度。HRP (Fe Ⅳ)经AscA被还原为HRP (Fe Ⅲ)再次参与催化反应。研究表明,通过调节聚合反应体系的pH值与还原剂AscA的浓度,可以实现对单体转化率、分子量以及分散度-D的调控。该体系主要缺点在于:当聚合物分子量随反应时间不断提高,具有高分子量的聚合物无法到达酶空腔内中的活性中心,阻碍了长链高分子的形成,导致短链聚合物的增多,降低了聚合的可控性。

酶具有活性金属中心-蛋白质空腔特殊结构,其可以作为纳米反应器为制备具有良好生物相容性以及安全性的高分子材料提供了一个理想的平台。基于该思路,Bruns等^[68]在成功实现了HRP催化的ATRP后,又尝试将这一酶促聚合反应封装在作为纳米反应器的聚合物囊泡中进行,并获得了亲水性聚合物填充的聚合物囊泡结构,以模仿构建具有浓缩细胞液或者粘性细胞骨架的细胞结构,获得具有独特性能的纳米聚集体。聚(二甲基硅氧烷)-嵌段-聚(2-甲基-2-口恶唑啉) (PDMS-b-PMOXA)两嵌段聚合物通过自组装形成纳米聚集体,并将HRP包覆其中(如图 1)。通过加入2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮(PP-OH)作为光反应剂,可供小分子化合物通过的纳米囊泡反应器得以构筑。该反应过程以聚乙二醇丙烯酸酯(PEGA)为单体、HEBIB作引发剂,抗坏血酸钠(NaAsc)作为还原剂。反应过程中,小分子的单体、引发剂以及还原剂溶解于磷酸盐缓冲液,进入囊泡反应器中进行ATRP,而生成的亲水聚合物PPEGA无法透过纳米反应器,填充在聚合物囊泡中。反应进行24 h后,聚合物PPEGA的转化率可达40%,分子量M_n=3000 g/mol,-D=1.55。使用游离HRP作为催化剂时,聚合物PPEGA的转化率较低12%,分子量M_n可达3400 g/mol,-D为1.18。

酶作为纳米反应器时,由于其内部限域空间可以有效促进催化剂与底物接触,因而可以提高反应速率,抑制副反应的发生。此外,其独特空腔结构则可以为聚合提供个性化的反应场所,实现对反应产物结构以及构型的调控,有助于从分子层面上理解催化与反应过程。而结合了纳米反应器与酶催化聚合优势的全蛋白纳米反应器,为提高聚合反应尺寸以及化学选择性(如根据蛋白质衣壳的孔径提高底物选择性等)、实现高分子特定结构的折叠等提供了一个全新的思路,为酶催化活性自由基聚合在生物医药、食品级材料以及微电子设备领域的应用奠定了实践基础。

蛋白质衣壳具有特定尺寸的孔径,可使不同尺寸的分子选择性透过,同时其空腔结构可以负载、释放大分子,并使大分子在空腔中发生折叠形成特定的纳米结构。基于蛋白质衣壳的特点,Bruns等^[69]构建了具有中空纳米结构的蛋白质衣壳热聚体(THS)纳米反应器,并将烟酰胺修饰后的HRP催化剂交联在THS的内壁,获得具有全蛋白质结构的纳米反应器。反应以PEGA作为单体,HEBIB作引发剂,NaAsc作为还原剂,水与四氢呋喃(7∶3 v/v)作混合溶剂,进行了ATRP。通过调整酶的固定/游离态,得到分子量与分散度可控的聚合物(固定: conversion=6%, M_n=4400 g/mol, -D=1.08; 游离: conversion=18%, M_n=43,700 g/mol, -D=1.23)。转化率及分子量的较大差异可能是因为蛋白质衣壳的选择透过性导致的。

水凝胶是通过化学、物理交联形成的一种亲水性的三维网格结构聚合物,具有良好的生物相容性和可渗透性,在生物医药领域有很好的发展前景。封装在水凝胶系统中的仿生酶和天然酶具有较高的稳定性和高效催化的能力,能够确保更高的负载量和更好的底物迁移率,已经成为生物学领域研究的热点。纳米尺度的水凝胶具有尺寸稳定性和负载传输性,在体内生物应用方面有很大潜力。

王启刚等^[70]基于HRP催化具有生物相容性的N-丙烯酸-L-赖氨酸单体的ATRP聚合体系和Fe(Ⅱ)的交联强化,构建了金属配位的聚合物纳米凝胶(SiO₂@MPGs)(图式3a)。纳米凝胶网格中有铁作为金属配合物的双氨基酸系统,这为其实现模拟酶活性提供了基础。同HRP相比,其具有相似的双电子催化机制及高氧化能力的Fe(Ⅲ)络合中间体,并且在催化过程中不产生·OH。SiO₂@MPGs在体内、体外均可实现高效的催化效率,其催化的高活性氧(ROS)响应的荧光成像机理如图式3b所示,这与其独特的结构紧密相关。在静脉注射模拟酶等试剂后,小鼠的各个组织器官及脏器均未观察到组织损伤和炎症,表明纳米凝胶的生物安全性。

3 血红蛋白

血红蛋白(Hemoglobin, Hb)是脊椎动物红细胞的主要成分,由四条肽链通过非共价键连接聚集而成,每一条链均有一个亚铁血红素。血红素位于肽链相互盘绕折叠形成的球形结构(珠蛋白)中,其活性中心的亚铁离子通过共价键与卟啉环中四个吡咯环上的氮原子及组氨酸残基中的氮原子相连。Hb同HRP一样,金属中心的Fe元素具有明显的氧化还原性,能够在Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ价态间变换^[71⇓~73]。Hb有一个半胱氨酸残基,半胱氨酸的硫醇基团起链转移剂的作用,形成一个以硫为中心的自由基,引发新链的生长,形成蛋白质-聚合物结合物。在自由基聚合过程中,常将Hb马来酰胺化,产生不易被自由基攻击的硫醚键,阻断半胱氨酸,抑制链转移,这使得Hb催化自由基聚合过程更加复杂。Hb催化自由基聚合,具有显著的生物相容性、医用性能,可用于检测血清或尿液中的血红蛋白含量,此方法可代替有毒的氰化钾试剂,使聚合过程具有绿色可持续和环境友好的特点^[74]。

马来酰胺化的Hb具有原子转移自由基聚合酶(ATRPase)活性,能够催化乙烯基单体的ATRP,并对单体表现出选择性。Bruns等^[75]以HEBIB、BPN作引发剂,AscA作还原剂,分别催化NIPAAm、PEGA和聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯(PEGMA)的ATRP(图式4)。反应进行4 h内,NIPPAm单体转化率达73%,聚合反应遵循一级动力学,随着还原剂消耗殆尽反应停止,再次加入AscA,反应重新开始,但聚合表现出不可控现象,即分子量降低(M_n最高达292 500 g/mol),分散度变高(-D=1.73~2.50),这可能是由于不可逆的链终止导致。而PEGA和PEGMA的聚合过程可控性较好,当PPEGA和PPEGMA的分子量为6200~6500 g/mol时,PPEGA的-D从1.14上升至1.42,而PPEGMA的-D则不超过1.17。PEGA聚合初期引发缓慢,在Hb有效地介导PEGA聚合之前,可能需要经历一些由蛋白质、单体和聚合物之间的相互作用引起的结构变化。

酶具有专一性和环境敏感性,可以通过改变ATRP体系的温度、pH值以及单体种类等环境因素对酶的催化活性进行调控。Bruns等^[76]利用酶对环境的选择性发展了可精确调控的Hb催化的表面引发ATRP(SI-ATRP) 方法(图式5)。以2-溴代异丁酰溴(BiB)对硅片进行表面改性,在NaAsc和醋酸缓冲溶液条件下合成具有热敏性的PNIPAm和PPEGA聚合物刷。研究发现,对于不同的单体/聚合物,Hb表现出不同的亲合力。PPEGA聚合物刷对Hb具有排斥作用,因此,在SI-ATRP过程中,PPEGA在表面形成增长缓慢,随后通过多步聚合可以使PNIPAm层继续生长在PPEG表面。而具有低临界温度(LCST)的PNIPAm聚合物刷,则可以通过温度调控聚合物刷表面的蛋白亲和力,在不同的温度下通过分子链的坍塌和伸展实现对Hb的吸附和排斥,从而对聚合进行调控。同时,通过调节体系的pH值可以对蛋白质的折叠结构产生影响从而调节多步SI-ATRP的总聚合速率。

酶作为催化剂不仅可应用于水介质中的SI-ATRP,还可以通过调节其表面的物理化学性质,尤其是表面Hb蛋白质的亲和作用实现对SI-ATRP过程的精确调控。为探究表面与具有催化活性的生物分子之间的界面相互作用,实现材料的可控功能化奠定了坚实的基础。

作为一种金属蛋白结构,酶的结构中具有典型的金属活性中心,可代替过渡金属参与eATRP过程。eATRP是近年来发展的一类改进ATRP,通过电化学将高价态过渡金属还原为低价态,使金属催化剂用量降低至ppm级,并使催化过程更高效^[77]。孙越等^[78]研究了酶催化辅助的eATRP,成功地合成蛋白质印迹聚合物(PIP)(如图2)。Hb在聚合过程中兼具蛋白质催化剂与PIP模板的功能,在聚(甲苯胺蓝)(PTB)修饰的玻碳电极(GCE)表面涂一层纳米铂(Pt)组成的GCE/PTB/nPt电极作为eATRP的阴极,饱和甘汞电极和铂丝分别用作参比电极和对电极,在磷酸盐缓冲溶液(PBS, pH=7)中进行。通过电化学调控,在反应电位为-0.51 V时,血红蛋白中的Fe(Ⅲ)可被还原为Fe(Ⅱ),形成还原型血红蛋白,进而催化Hb进行ATRP得到PIP。由于该反应既不需要有毒的过渡金属作催化剂,又不需要还原剂,规避了二者对聚合反应的影响,在制备生物功能材料、生物传感器等方面有着广泛的应用前景。

肌红蛋白(Mb),由一条肽链和一个血红素辅基组成,主要分布于心肌和骨骼肌组织,具有同Hb一样的活性中心。Hajizadeh等发展了Mb催化的SI-ATRP。在引发剂功能化的硅(Si@initiator)表面进行NIPA和N-(3-氨丙基)甲基丙烯酰胺(APMA)的无规共聚(Si@P(NIPA-co-APMA))及嵌段共聚(Si@PNIPA-b-PAPMA),合成了具有热敏性的聚合物刷^[79]。在聚合反应过程中,一部分Mb作为催化剂,催化聚合反应的进行;另一部分则以共价或非共价键的方式直接与引发剂(-Br)反应,阻止反应的发生。这也是导致接枝共聚物不均匀的原因之一。同时,由于PNIPA具有热敏性,当温度升高至40 ℃,其化学结构会发生变化,刷子发生“塌陷”,尺寸减小16%。而共聚物Si@P(NIPA-co-APMA)在升高温度时,由于PNIPA链变疏水,刷子中的阳离子基团产生强烈的库仑排斥,从而抑制热诱导的链崩塌,尺寸增加7%。Mb催化的核-壳结构的纳米共聚物的合成,拓宽其在如药物输送等生物医疗领域的应用范围。

4 血红素及其衍生模拟酶

血红素是HRP、Hb等酶的辅基,由四吡咯环及一个亚铁离子组成,又称亚铁血红素,结构如图式6所示。亚铁血红素发生氧化作用,铁离子变为Ⅲ价,此时的卟啉铁复合物成为高铁血红素,带有一个单位的正电荷。为使其成为电中性,高铁血红素中的铁离子(Ⅲ)通常结合一个氯离子,即氯高铁血红素。当氯离子被羟基取代时,为羟高铁血红素。金属蛋白酶(如HRP、Hb等)通常只适用于水相中催化单体聚合,在有机相中易失活,但血红素恰好避免这一点,其可以代替HRP催化NIPAAm的ATRP^[80]。血红素还具有良好的耐酸性,可催化酸性单体的聚合^[81]。高铁血红素是血红素中最普遍的类型,同酶一样具有绿色无毒的特点,可作为模拟酶催化ATRP。

Kadokawa等^[80]以血红素代替HRP作催化剂,2-溴丁酸乙酯(EBB)为引发剂、Asc为还原剂,在DMF/H₂O混合溶剂中催化NIPAAm进行ATRP,其预测机理如图式7所示,血红素(Fe(Ⅲ))被Asc还原为亚铁血红素(Fe(Ⅱ)),随后与引发剂反应生成初始自由基,所产生的休眠体(Fe(Ⅲ))再次被Asc还原,以此循环往复,引发单体NIPAAm的聚合。反应在室温下进行,24 h后,转化率达到80%,理论分子量M_n,th=22 700 g/mol,GPC测得分子量M_n=31 800 g/mol,-D=1.80。在整个聚合过程中,-D始终维持在1.70~2.00。结果表明,血红素可代替HRP催化NIPAAm单体的ATRP,但聚合过程可控性仍较差。提高血红素催化乙烯基单体ATRP的可控性,是未来道路上的一大挑战。

大量研究表明,酸性单体,如:甲基丙烯酸 (MAA),并不适用于ATRP过程,因为在酸性环境中,会出现不利于聚合的反应,如羧酸可能会取代催化剂中的卤素等。酶也只有在合适的pH条件下,才具有最佳活性催化单体聚合。血红素具有良好的耐酸性,是酸性单体的最佳催化剂。2018年,Matyjaszewski等^[81]研究了在H₂O/DMF混合溶液中,氯高铁血红素催化MAA的ATRP(图式8a)。为提高血红素的水溶性,将其用两个聚乙二醇单甲醚(MPEG₅₅₀)进行修饰,并通过添加过量的NaBr,得到足够量休眠态Fe(Ⅲ)-Br,修饰后的血红素结构如图式8b所示。在α-溴代苯乙酸(BPAA)、聚(乙二醇)₂₀₀₀甲醚-α-溴苯乙酸酯(PEG_2kBPA)(图式8c)作引发剂,添加0.2 M的NaBr,反应进行4 h后,转化率分别为31%和39%,测得分子量M_n为7800 g/mol和10,300 g/mol,均接近理论值,-D为1.44和1.55。结果表明,反应可控。在此基础上,以PEG_2k-b-PMAA-Br (M_n=22 400 g/mol)为大分子引发剂,甲基丙烯酸聚乙二醇单甲醚酯(OEOMA₅₀₀)为单体,合成PEG-b-PMAA-b-POEOMA₅₀₀三嵌段共聚物,分子量M_n为84 600 g/mol,-D为1.63,证明通过氯高铁血红素可以催化MAA单体的聚合,所得聚合物链端官能团还具有较高保真度。

次血红素6肽(DhHP-6)是一种含血红素的过氧化物酶模拟物,由六个氨基酸残基和一个卟啉铁组成,是一类具有酶活性的人工合成材料(图式9a)。DhHP-6具有很高的氧化还原酶活性,能适应较大的pH(3.0~11.0)范围,因此可催化单体的种类很多。大多数情况下,DhHP-6应用于非均相溶液,可循环回收使用,是一个潜力很大的人工催化剂。2015年,Tang等^[82]将DhHP-6应用于ATRP,在pH=3.0~11.0的缓冲溶液中催化PEGMA₅₀₀的ARGET ATRP (图式9b)。所得聚合物的分子量随单体转化率线性增加,且-D相对较低。研究还将ATRP与酶促开环聚合(eROP)结合,生成了具有可生物降解的三种类型的嵌段共聚物(PCL-b-PGMA、PCL-b-PMAA和PCL-b-PHEMA),其中,GMA单体聚合的可控性最好,MAA、HEMA两种单体聚合的可控性较差。

但DhHP-6作为催化剂仍存在一些问题,如:催化过程中DhHP-6易发生自聚;长时间储存,DhHP-6活性容易降低等。为了改善这些问题,Tang等^[83]将卟啉咪唑酸酯骨架8(ZIF-8)嵌入DhHP-6中,获得复合DhHP-6@ZIF-8 (图3),以BPN为引发剂,在30 ℃进行PEGMA₅₀₀的ATRP。还原剂将DhHP-6@ZIF-8从稳定态Fe(Ⅲ)还原为低价态的Fe(Ⅱ),随后与烷烃引发剂反应,形成初始自由基(Pn·)和休眠物种Fe(Ⅲ)-Br,循环往复,建立自由基与休眠物种之间的平衡。结果表明,DhHP-6固定后催化可控性明显提高,单体转化率达76.1%,M_n可达45,900 g/mol。

5 漆酶

漆酶(Laccase from T. versicolor)是一种以Cu离子为活性中心的氧化还原酶,广泛应用于自由基聚合反应。相较于过氧化物酶,漆酶的聚合体系非常简单,不需要添加额外的氧化剂,直接利用氧气参与氧化还原反应催化聚合。结构如图式10a,一般是由500个氨基酸的单一多肽组成,含有四个Cu(Ⅱ)辅基(Ⅰ型Cu²⁺、Ⅱ型Cu²⁺、两个Ⅲ型Cu²⁺),以单体糖蛋白的形式存在。其中Ⅱ型Cu²⁺和两个Ⅲ型Cu²⁺形成一簇,并通过组氨酸-半胱氨酸-组氨酸(His-Cys-His)与Ⅰ型Cu²⁺连接在一起。在反应过程中,漆酶最突出的特点为氧代替H₂O₂作为氧化剂,但氧同样会对反应造成抑制作用。有学者称可能正是因为氧的抑制作用妨碍了漆酶的广泛应用^[84]。

2011年,di Lena等^[45]研究在漆酶的催化下,以维生素C作还原剂,不同的引发剂对PEGMA的ATPR影响。聚合机理如图式10b所示,烷基卤化物引发剂在酶的催化下,与还原剂作用,产生初始自由基,与单体进一步聚合。当EBiB作引发剂时,反应进行1 h,单体转化率达20%,分子量M_n为272 000 g/mol,-D为2.43。2 h后,体系黏度增大。当2BPN、碘代乙酸乙酯(EIAc)作引发剂时,前者聚合速度加快,30 min后,转化率达28%,后者22 h后,转化率为15%,且其分散度较高,达1.94以上。结果表明,在三种引发剂的作用下,单体转化率较低,聚合物分散度较高。漆酶催化ATRP可控性较差,这也进一步解释了漆酶在ATRP领域的应用较少的原因。

由于酶具有专一性,不同的酶对单体具有不同的选择性。自di Lena等^[46]率先研究了不同酶的催化效果之后,2014年,Ko等^[85]也研究对比了HRP、漆酶及过氧化氢酶分别在室温下催化NIPAM的SI-ATRP,第一次实现将漆酶应用于固体材料木质素的表面接枝改性,并得到厚度大于100 nm的PNIPAM聚合物刷 (M_n=1×10⁶ g/mol,-D<1.30)。实验以AscA为还原剂,纯水为溶剂,还原剂的浓度直接影响了PNIPAM聚合物刷的接枝效率。随着AscA浓度从1.42×10^-5增加至5.68×10^-5 mol/L,PNIPAM聚合物刷的接枝密度也随之增加(72±19 nm至113±16 nm)。当AscA浓度增加至14.18×10^-5 mol/L时,PNIPAM聚合物刷的接枝厚度降至67±21 nm。相同AscA浓度(5.68×10^-5 mol/L)下,HRP和过氧化氢酶作催化剂时,PNIPAM聚合物刷的接枝厚度仅为10±25 nm和39±27nm,分散度也较宽(1.66~2.93; 1.31~1.53)。但三种催化剂作用下,接枝密度并没有明显不同,均为7.3×10^-2~12.39×10^-2nm^-2。

以咪唑环为特征的聚乙烯基咪唑(PNVIm)类聚合物在材料科学领域(如:锂离子电池等)^[86]及医学生物领域(如:基因载体等)^[87]被广泛地研究,其应用性能均依赖于分子量及分散度可控性^[88]。然而,由于N-乙烯基咪唑(NVIm)的ATRP过程链终止和链转移的发生,所得PNVIm通常有较宽的分散度,可控性差^[89]。另外,所得聚合物会紧密络合金属离子^[90],以至于传统ATRP的金属催化剂难以从聚合物中去除,这大大影响了PNVIm的商业应用。在2016年,Bruns等^[91]研究了漆酶催化的NVIm的可控自由基聚合,并利用漆酶中紧密结合铜离子的三维结构,避免了金属离子催化剂难以去除的问题。在pH值为4的醋酸盐缓冲溶液中,成功获得分子量M_n为1600~9970 g/mol的PNVIm (-D=1.27~1.56),且聚合反应遵循一级动力学。相反,HRP和Hb作催化剂时,转化率极低,这可能是由于它们与漆酶的催化剂机理不同所导致的。

水凝胶能够吸收大量的水,可用于装载释放水溶性生物大分子。张强等首次^[92]以漆酶为催化剂,以PEGA₄₈₀为单体、NaAsc为还原剂、EBiB为引发剂,一锅法合成负载蛋白质的水凝胶(图式11)。通过筛选三种不同的配体,发现三(2-二甲氨基乙基)胺(Me₆TREN)的添加,可以降低反应温度,提高反应动力学,与漆酶中的铜原子进行耦合形成配合物,使其保持良好的酶活性。参与反应的交联剂聚(乙二醇)二丙烯酸酯分子量,对聚合物水凝胶性能有明显影响。当分子量为400 g/mol时,反应60 min,转化率为80%,漆酶在水凝胶中的负载率为84%,释放率为11%,水凝胶吸水率294%;分子量为1000 g/mol时,反应45 min,转化率为78%,漆酶在水凝胶中的负载率为83%,释放率为3%,水凝胶吸水率400%。负载漆酶的水凝胶在ABTS溶液中进行酶氧化实验时,重复使用6次,酶活也没有发生明显的降低。负载性能优良的水凝胶在蛋白质输送和水处理方面有广泛的应用前景。

漆酶具有能够进行电子转移的金属氧化还原活性中心及复杂的蛋白质结构,在非天然环境下,尤其是恶劣环境或非水溶剂条件下,其会发生结构变性,乃至失活。为拓宽漆酶在非天然环境下的应用范围,Averick等^[93]通过接枝聚合物对漆酶进行修饰,并研究其在不同pH值、高温及有机溶剂(乙腈、四氢呋喃和乙醇)中稳定性及活性的变化。为适应不同环境,选择亲水单体丙烯酸聚氧乙烯(OEOA)及两亲性单体甲基丙烯酸二甲氨基乙基酯(DMAEMA)和二甲氨基丙基丙烯酰胺(DMAPA)对漆酶-iBBr进行接枝(图式12)。结果表明,接枝共聚物后的漆酶,通过聚合物的复杂链结构对活性中心及氨基酸链进行包覆,使其在非天然环境下仍能保持其活性。其中,漆酶-PDMAEMA共聚物适用范围最广,在酸性或碱性条件,高温(40 ℃或50 ℃),乙醇(含10%水)等条件下,均能保持酶稳定性及活性。

叶绿素是一种含有Mg²⁺离子的生物催化剂,研究者以漆酶为代表的铜基催化剂为参照,将叶绿素进行铜修饰,合成叶绿素铜(如图式13)。Bruns等^[94]将叶绿素铜作为催化剂和共聚单体,以PEG-Br为引发剂,NaAsc为还原剂,催化PEGA的ATRP。叶绿素铜在NaAsc的还原作用下生成活性自由基,自由基再对引发剂进行活化(如图式13),最后生成叶绿素含量可控poly(PEGA-co-叶绿素)共聚物。反应在水相中进行,遵循一级动力学,聚合物的分子量(M_n=4000~5000 g/mol, -D≤1.11)随转化率的上升而增加。该催化体系由于具有廉价易得且绿色可持续的特点,在生物医用及太阳能收集等相关材料的制备领域具有巨大的潜力。

6 GOx-HRP酶联催化用于ATRP引发

氧气作为一种高效的自由基捕获/抑制剂,极易与链增长自由基发生反应,形成稳定的过氧化自由基和氢过氧化物使链增长反应淬灭^[95]。包括ATRP在内的RDRP的氧气耐受性是该技术面临的重大挑战。因此,发展在富氧体系下可以进行的新型ATRP具有重要意义^[96,97]。Matyjaszewski等^[98]发展了GOx除氧技术,并将其应用于模拟呼吸代谢过程并进行ATRP,聚合过程具有良好的氧气耐受性和可控性。GOx除氧技术具有良好的普适性,可以用于包括ATRP在内的其他RDRP,如,An等^[99⇓~101]将GOx、吡喃糖氧化酶(P2Ox)催化除氧应用于HRP/H₂O₂/ACAC三元体系催化水溶性单体的RAFT聚合;Tan等^{[102⇓⇓~105]}将GOx催化除氧应用于光诱导RAFT聚合诱导自组装等。

GOx-HRP酶联催化系统不直接参与ATRP的催化,但可以作为引发体系生成自由基,实现金属催化剂的还原,应用于改进ATRP。2018年,Matyjaszewski等^[106]发展了GOx-HRP与活性铜(ppm级)组成的生物催化系统,在开放环境下进行新型酶促ICAR-ATRP,实现了对低聚(环氧乙烷)甲基醚甲基丙烯酸甲酯(OEOMA₅₀₀)的可控聚合。聚合机理如图式14所示,GOx在氧气的作用下将葡萄糖氧化生成葡萄糖内酯和H₂O₂,而H₂O₂在HRP的作用下与ACAC反应,产生ACAC自由基,参与铜的氧化还原,进行链增长过程。反应进行1 h内,合成高分子量、低分散度的聚合物(M_n>70 000 g/mol,1.13≤-D≤1.27)。研究表明,充足的氧气有助于自由基的产生与聚合物链的延伸过程。GOx-HRP作为引发体系,实现了蛋白质、DNA为模板的生物缀合物(蛋白质-b-POEOMA、DNA-b-POEOMA)的合成,对合成良好生物相容性的材料提供了依据。Lv等^[107]还将GOx-HRP应用于生物传感器的制备,通过SI-ATRP制备pH响应的印迹聚合物。其可用于临床检测血清中葡萄糖浓度,对协助糖尿病和低血糖的诊断以及检测治疗反应具有重要意义。

7 结论与展望

本文系统总结了近年来酶催化ATRP研究的最新进展,以活性金属中心对酶进行分类,对酶催化引发体系、单体、反应条件、聚合机理等进行了详细的介绍。酶催化作为一种新型催化体系,具有绿色高效、环境友好、适用单体范围广、可制备具有特殊分子构型的聚合物、且除氧便捷等优势,酶催化体系的应用对拓展ATRP适用单体范围、稳定制备具有特殊复杂结构的聚合物/共聚物提供了一种高效、便捷的方式。同时,酶催化ATRP由于良好的生物相容性甚至活体细胞修饰兼容性等,可作为绿色无毒生物检测手段,在生物医用领域具有巨大的潜力。此外,酶催化ATRP还具有聚合条件温和、聚合过程以及立体选择性效率高、反应过程及最终产物结构可控、绿色可持续等优势。

酶催化可控聚合正处于高速发展阶段,近年来发展的新型光酶可控自由基聚合技术^[108,109],为酶催化可控自由基聚合制备分子量可控及超高分子量聚合物提供了新的启发。展望未来,发展更多具有高活性的酶催化体系,以拓宽单体选择范围、提高聚合反应的可控性及合成超高分子量聚合物,对酶催化ATRP具有重要的意义。此外,通过固定化酶技术,将酶催化与微流场技术相结合,发展连续流酶催化聚合体系,高通量制备具有复杂结构的新型功能性聚合物也具有重要的研究价值。

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