蛋白质-多糖复合体系在活性物质传递中的应用

陈雅琼; 宋洪东; 吴懋; 陆扬; 管骁

doi:10.7536/PC220131

化学进展 ›› 2022, Vol. 34 ›› Issue (10) :2267-2282 DOI: 10.7536/PC220131

综述与评论

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蛋白质-多糖复合体系在活性物质传递中的应用

陈雅琼 ¹^,² ,
宋洪东 ² ,
吴懋 ¹ ,
陆扬 ¹ ,
管骁 ²^,^*

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Application of Protein-Polysaccharide Complex System in the Delivery of Active Ingredients

Chen Yaqiong ¹^,² ,
Song Hongdong ² ,
Wu Mao ¹ ,
Lu Yang ¹ ,
Guan Xiao ²^,^*

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摘要

蛋白质-多糖复合体系作为生物活性物质传递系统的壁材,有着人工合成聚合物或无机物等其他材料不可比拟的多重优势。本文就蛋白质和多糖之间的连接方式及蛋白质-多糖复合体系形成传递系统的多种形式进行了综述,以及对此领域的发展趋势进行了展望。结合蛋白质和多糖的结构特点,二者之间的链接方式分为非共价结合的物理共聚,和共价结合的美拉德偶联、化学交联、酶催化交联等方式,文中分别对各种连接方式的原理和机理,以及其影响因素做了深入阐述。以蛋白质-多糖复合体系为壁材对活性物质的传递形式大体上分成乳化系统、胶束、纳米凝胶、分子复合物以及壳核结构等系统。不同的活性物质的特征和传递需求,可针对性地选择合适结构的蛋白质和多糖种类以及二者的连接方式和传递系统的形式。并且,随着研究的逐步发展和推进,此领域的发展趋势朝着智能化和靶向性的方向进行。目前活性物质的蛋白质-多糖复合体系的传递系统,还依然面临着系统设计、评价和应用等多方面的挑战,这就要求我们在更全面更深入了解认识其对活性物质影响和功效的基础上,安全合理地设计和深入细致地评价活性成分的传递系统。

Abstract

Protein-polysaccharide complex system, as the wall material of bioactive ingredient delivery systems, have multiple advantages that other materials such as synthetic polymers or inorganic materials do not have. The connection mode between protein and polysaccharide, the various forms of protein-polysaccharide complex forming delivery system are reviewed, and the development trend of this field is prospected. According to the structural characteristics of proteins and polysaccharides, the linking methods between the two are divided into non-covalent binding such as physical copolymerization, and covalent binding such as Maillard coupling, chemical cross-linking, and enzyme-catalyzed cross-linking. The binding mechanism of the above connection methods and the influencing factors are expounded. The delivery forms of active ingredients with protein polysaccharide complexes as wall materials are generally divided into emulsion systems, micelles, nanogels, molecular complexes, and shell-core structure systems. According to the characteristics and delivery requirements of different active ingredients, proteins and polysaccharides with suitable structures and types, as well as their connection methods and delivery systems, can be selected in a targeted manner. Moreover, with the gradual development and advancement of research, the development trend in this field is moving towards the direction of intelligence and targeting. At present, the protein-polysaccharide complexes delivery system of active ingredients still faces many challenges in system design, evaluation and application. This requires us to design and evaluate the delivery system of active ingredients in a safe and reasonable manner based on a more comprehensive and in-depth study of its impact and efficacy on active ingredients.

Graphical abstract

关键词

蛋白质-多糖复合体系 / 传递系统 / 结合方式 / 靶向性 / 活性物质

Key words

protein-polysaccharide complex system / delivery system / binding method / targeted / active ingredients

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陈雅琼, 宋洪东, 吴懋, 陆扬, 管骁. 蛋白质-多糖复合体系在活性物质传递中的应用[J]. 化学进展, 2022, 34(10): 2267-2282 DOI:10.7536/PC220131

Chen Yaqiong, Song Hongdong, Wu Mao, Lu Yang, Guan Xiao. Application of Protein-Polysaccharide Complex System in the Delivery of Active Ingredients[J]. Progress in Chemistry, 2022, 34(10): 2267-2282 DOI:10.7536/PC220131

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1 Introduction

2 Characteristics of protein and polysaccharide complex delivery vehicles

3 The binding mode of protein polysaccharides

3.1 Non-covalent binding

3.2 Covalent binding

4 Delivery system forms of protein-polysaccharide complex system for active ingredients

4.1 Emulsifying system

4.2 Micelles

4.3 Nanogel

4.4 Molecular complex

4.5 Shell-core particles

5 The development direction and trend of intelligence and targeting

6 Conclusion and outlook

1 引言

生物活性物质是通过调节生理或细胞活动而对健康产生有益影响的成分。常见的生物活性物质包括多酚、精油、类胡萝卜素、维生素、矿物质、植物甾醇、生物活性肽和益生菌等。少量的这些活性化合物即可表现出各种对人体机体有益的作用,如抗癌、保护神经、抗炎、抗氧化和缓解疼痛等作用^[1]。食品是生物活性物质的主要来源,开发含有生物活性物质的功能性食品,或者从食品中提取生物活性成分加以服用,都是增加生物活性物质摄入的有前途的途径。然而,单纯地将生物活性物质以自由态的形式纳入食品系统或直接服用将面临着很多问题:(i)溶解度差^[2],(ii)物理稳定性变差^[3],(iii)食品加工和储存过程中的化学稳定性差^[4,5],(iv)异味^[6],(v)生物可及性和生物利用度差^[7]。而设计合适的传递系统是克服这些缺点的有效手段。传递系统的设计,首当其冲便是适合的传递材料的选择,目前来看,用于药物或活性物质包埋传递的材料主要是各种高分子聚合物^[8,9]。其中,人工合成高分子聚合物的降解性差,以及制备过程中引入的化学物质较多而存在安全方面的隐患等因素^[10],很少作为生物活性物质的传递材料被采用。而食品源的天然材料如多糖和蛋白质,因其安全无毒及良好的生物相容性,并且因其结构中的各种可修饰基团,在生物活性物质的传递中具有特殊的应用价值,成为不可替代的首选包埋材料^[11,12]。

本文就蛋白质和多糖复合体系传递载体的材料特点,传递系统中蛋白质和多糖结合的作用方式,传递系统的形式,以及该领域的发展趋势等方面进行综述和展望,为活性物质的安全高效传送提供参考。

2 蛋白质和多糖复合体系传递载体的特点

蛋白质和多糖是天然的生物高分子聚合物,来源丰富,具有构建高生物相容性和生物安全性的、经济可行的传递系统的潜力。考虑到蛋白质和多糖的多样性和具有独特的结构和功能特性^[2,4,5],组装的蛋白质和多糖载体可以建立成通用的运载工具,并且可以针对特定的应用目的传递生物活性物质。

通过组装的蛋白质和多糖载体构建的传递系统比其他载体具有多种显著的优势。首先,多糖和蛋白质的种类较多,并且含有—OH、—NH₂、—COOH等多种优良的可调节、可修饰基团,为蛋白质-多糖-活性物质之间的结合和传递系统的建立提供了结构上的保障^[13⇓~15],并且,蛋白质-多糖复合体系也因这些可修饰基团,而成为传递系统实现高生物利用度靶向性修饰的目标材料^[14,16,17]。其次,作为物理屏障,蛋白质和多糖构建的传递系统可以保护不稳定的生物活性化合物免受环境(光、氧等)影响,构建的三维网络可以延缓生物活性成分的释放,以达到活性物质长效缓释的目的^[18]。而且,相比单独的蛋白质或多糖,蛋白质-多糖复合体系作为运载工具可能具有更好的稳定性^[19],有利于生物活性化合物的高效包封、保护和释放,如多糖的参与可以提供空间位阻来抑制蛋白的聚集,或根据需要来改善活性物质的溶解性或粘附性^[17]。另外,某些多糖或蛋白质,因自身的结构特点,具有特别的传递优势,如壳聚糖因其正电荷结构具有特殊的肠上皮细胞粘附性和穿透效应^[11],海藻酸钠因含有大量的—COOH而成为天然的胃中收缩-小肠中释放的pH响应性控释材料^[20]。

3 蛋白质和多糖的结合方式

蛋白质和多糖之间的相互作用在设计新的传递系统中起着重要的作用,不同的生物活性物质,有着不同的传递需求,对蛋白质和多糖材料的选择以及它们的结合方式都有着特定的要求。目前,一般来说,蛋白质和多糖的主要结合方式如图1所示,基本上分为物理共聚、化学交联、生物结合及美拉德反应,从构建体系的结果来说,即形成非共价和共价的蛋白质-多糖复合体系。接下来,我们将详细讨论蛋白质和多糖之间各种类型的结合方式。

3.1 非共价结合

就蛋白质与多糖之间的非共价结合而言,相互作用可能包括静电相互作用、氢键作用和疏水作用等,即蛋白质和多糖的非共价结合实为物理凝聚过程。凝聚指的是富离子液滴的亚稳悬浮,有时被用来定义由疏水力连接在一起的胶体液滴的球形粒子^[16],Tiebackx是第一个报告凝聚作用^[21]这个术语的人。凝聚分为简单凝聚和复凝聚两种类型。简单凝聚是通过改变不同的参数来改变大分子的脱水条件加以实现的,比如通过溶剂条件的调整、加入微离子、改变温度等参数来使大分子溶质发生凝聚相分离。简单凝聚在蛋白质-多糖复合物的制备上,目前较多采用的是反溶剂分散法、离子凝胶法、热凝胶法等,在这些简单凝聚的基础上,与静电吸附等方法,或者几种简单凝聚法相结合可制备成蛋白质-多糖复合物。反溶剂分散法制备蛋白质-多糖复合物,多用于醇溶性植物蛋白,利用醇溶蛋白的疏水作用力形成凝聚物,相比较动物蛋白,疏水植物蛋白价格低廉,且具有持续控制药物释放的能力。如Song等^[22]将大麦醇溶蛋白和EGCG混溶于异丙醇中,再在一定的pH值条件下以一定的速率分散于水中,获得包封率为91.2%的纳米颗粒,再将壳聚糖溶液滴加入含此纳米颗粒的溶液中,并加一定量的三聚磷酸钠作为壳聚糖的离子胶凝剂,结合反溶剂法和离子凝胶法,制备成负载EGCG的大麦醇溶蛋白-壳聚糖纳米颗粒。同样地,玉米醇溶蛋白也被溶于乙醇中后,再滴加于加热糊化的羧甲基短直链淀粉中,形成包封多肽的三元纳米复合物,并在此结构基础上,利用静电吸附作用,在纳米复合物表面裹覆一层壳聚糖层,以优化多肽药物的口服利用度^[23]。就离子凝胶法的交联剂离子来说,多选用多价的阳离子,如Ca²⁺、Fe³⁺等作用于海藻酸钠及果胶等多糖^[24,25],而对于壳聚糖,上述的三聚磷酸钠是首选。

Bungenberg 和 Kruyt首次系统地研究了阿拉伯胶-明胶多糖蛋白体系,提出的复凝聚概念,即复凝聚是在一种溶剂中,两种带相反电荷的离子,形成两个或两个以上的相,每一相中都有两种聚合物^[16]。但蛋白质和多糖物理混合的同时可能导致不相容的情况存在,这在很大程度上取决于聚合物的固有性质,以及pH值、蛋白质/多糖比和离子强度,其中静电相互作用是主要的驱动力^[26]。显然,pH是蛋白质多糖凝聚的主要决定因素,三个关键的pH节点与可溶性和不可溶性蛋白质-多糖复凝聚物密切相关^[27]。这三个关键的pH值分别为pH_c、pH_φ1和pH_φ2,分别与可溶性蛋白质-多糖复凝聚物的形成、引发的不溶性蛋白质-多糖复凝聚物以及离解成不相容蛋白质和多糖相关^[28]。多糖中,除了壳聚糖等少数多糖以外,大部分多糖在很宽的范围内,呈负电荷,蛋白质的电荷则取决于环境pH值,如图2(a)所示,随着pH值的下降,首先,当pH>>pI,蛋白质带负电,多糖和蛋白质相互排斥;pH≈pI,蛋白质局部带正电,与多糖结合能力弱,形成可溶性复凝聚物(pH_c);pH< pI,蛋白质带正电,多糖和蛋白质结合,形成不容复凝聚物(pH_φ1);pH<多糖pKa,浊度下降,不溶复凝聚物溶解(pH_φ2)。

如图3所示,除了pH的重要作用以外,不同参数对复合凝聚过程有显著影响,包括材料性质如生物聚合物分子量、总生物聚合物浓度、生物聚合物混合重量比、生物聚合物电荷密度/生物聚合物柔性以及pH、压力/搅拌、温度、离子强度等工艺参数^[29,30]。其中,离子强度对上述的pH_c、pH_φ1、pH_φ2几个重要的pH节点也有着重要的影响,如图2(b)所示。精确控制蛋白质/多糖比和离子强度是组装蛋白质和多糖的关键,因为这些变量可能决定蛋白质-多糖复合物的网络结构^[28]。

3.2 共价结合

蛋白质和多糖的共价结合,即利用蛋白质和多糖上的可修饰基团,主要采用化学和生物的方法,连接蛋白和多糖,形成蛋白质-多糖偶联物。

3.2.1 化学结合法

蛋白质和多糖中含有羰基、羧基、氨基、巯基等活性基团,这些都是很优良的化学反应结合位点,单就这些反应位点来说,可以进行多个化学反应,如药物修饰领域常见的点击化学反应、乌吉(Ugi)反应、溴化氰(CNBr)偶联法、二硫键偶联法等^[31],但这些反应往往需要对多糖或蛋白的结构进行一定的结构修饰,如点击化学反应需要在多糖和蛋白结构上修饰上叠氮(—N≡N)和炔(—C≡C)的结构,二硫键偶联需要在蛋白和多糖中引入硫醇(—SH)结构,步骤较多,所要引入的化学试剂较复杂,且一般具有较大的毒性,而活性物质传输材料的安全性、生物相容性的基本要求,限制了其在活性物质传输领域的广泛使用。

所以本节就针对蛋白质多糖偶联的安全性高、反应要求简单易实现的化学方法:美拉德反应和化学交联反应,做出以下阐述。

3.2.1.1 美拉德反应

美拉德反应是蛋白质与多糖主链上还原糖的化学反应,是获取蛋白质多糖交联物的常用方法,如图4所示,该反应在一定时间、温度、pH和水分的条件下进行,由于多种多糖含有还原糖,糖分子上亲电子羰基与蛋白质分子上的中性氨基反应形成席夫碱,同时释放一分子水。这种席夫碱的重排导致形成更稳定的酮胺,并因此形成蛋白质多糖共价偶联物^[32,33]。因为简单条件下就可能引发美拉德反应,而且不引入其他的添加试剂,这在食品加工领域是非常重要的,所以美拉德反应有广泛的实际应用意义。

而且,美拉德反应是一种可行的用来共价交联蛋白质与中性电荷多糖的方法,如葡聚糖和淀粉,否则,蛋白质与非带电多糖的物理静电复合是不可能的^[34,35]。可以通过精确控制美拉德反应条件,形成具有较好功能特性的蛋白质-多糖共价偶联物。Zhou等^[36]利用美拉德反应,成功偶联了明胶和中性电荷多糖——葡聚糖,并包封茶多酚,并自组装形成复合凝聚核心胶束(C3Ms),对茶多酚实现高效递送,MTT实验结果显示C3Ms对MCF-7细胞的毒性强于游离茶多酚。

Martinez-Alvarenga等^[37]通过研究了多种因素对麦芽糊精结合的乳清分离蛋白美拉德反应糖基化程度和颜色变化,得出温度和水分活度分别占糖化程度影响的 48% 和 34%,以及显色影响的 26% 和 46%,是影响美拉德反应的最主要的影响因素。当然,反应时间也是另外一个重要因素,Liu 等^[38]通过美拉德反应获得分离乳清蛋白-葡聚糖偶联物,随着反应时间的延长,接枝度和褐变指数逐渐增加,α-螺旋的含量从23.9%增加到29.6%,β-折叠和无规卷曲的含量分别从23.8%和38.1%下降到19.6%和32.7%,表面疏水性降低,表面巯基含量和总巯基含量分别从5.3和15.4μmol/g增加到11.0和17.9μmol/g。

美拉德反应因其反应条件简单且不引入其他化学试剂,而备受关注。但美拉德产品通常是比较复杂的混合物,难以明确它们的组成和特征。在美拉德反应后期产生的一些不需要的晚期糖基化终产物(AGEs)可能是有毒的,可能是几种疾病的致病因素之一^[39],因此,提高反应条件的控制和彻底的产品纯化是美拉德产品安全生物医学应用的必要条件。湿热法缩短反应时间^[40],以及抗氧化剂的使用等方法^[39],提供了更好的合成过程的控制性,为美拉德反应偶联蛋白质和多糖提供了更多的可能性。

3.2.1.2 化学交联

蛋白质和多糖之间的化学交联可以通过添加交联剂发生。但交联剂由于生物降解而释放到宿主体内,可能会引起生理毒性。如戊二醛是一种双官能醛交联剂,但它被认为是对健康有不良影响的一个因素^[17],这导致了对低毒性、生物相容性和最好是食品级的合适替代交联剂的需求的增加。以下就常用的低毒的1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺/ n -羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)偶联、4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM)偶联,以及植物基交联剂京尼平偶联做以下综述。

EDC/NHS偶联。EDC/NHS因其无毒、生物相容性良好等特点,在蛋白质和多糖的诱导交联反应中应用很广泛^[41⇓~43]。EDC是一种水溶性的、零长度的交联剂,用于偶联胺和羧基,其交联方式如图5所示。EDC可以激活羧基生成不稳定的o-酰基异脲作为中间体,当这个中间体没有遇到胺时,它会水解并重新生成羧基。在n-羟基琥珀酰亚胺(NHS)存在的情况下,EDC可将羧酸基团转化为胺反应性NHS-酯,然后与胺结合形成酰胺键^[44]。可以看出,EDC和NHS都没有出现在最终的多糖蛋白偶联物中,只是帮助蛋白质和多糖上的氨基和羧基结合形成酰胺键,自身并没有成为交联物的一部分,而是成为一个小分子副产物,可以通过渗析等方式洗去,这种不引入其他物质结构的方式在活性成分的传递系统中是非常受欢迎的。维持pH控制对EDC/NHS反应至关重要,相对较低的pH值(3.5~4.5)是EDC活化羧基的最佳选择^[45]。

4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM)是一种有机三嗪衍生物,可以激活羧基形成酰胺,活化机制与EDC/NHS缩合反应相似,DMTMM与羧基反应形成反应性三嗪酯中间产物,然后蛋白质上的氨基和三嗪酯通过双分子亲核取代生成酰胺^[46],反应历程如图6所示。相比较EDC,DMTMM具有对水更稳定,并且活化羧基可以不需要控制pH值,以及容易去除副产物、反应活性高等优点^[47,48]。另外DMTMM活化的羧酸不易与醇羟基发生反应,因此通常不需要保护羟基^[49]。目前,DMTMM针对透明质酸、海藻酸盐、羧甲基纤维素等此类含羧基的多糖的交联,对其交联机理、特点以及应用进行了系统的研究,如Golunova等^[50]利用DMTMM作为交联剂对海藻酸盐和多肽进行偶联,证明了DMTMM作为偶联剂偶联高分子量海藻酸盐与不同氨基基团的分子反应的有效性。并且DMTMM可以与点击化学联合,为多糖和多肽及蛋白的结合提供新的思路。

京尼平交联。京尼平是一种天然来源的交联剂,可通过栀子苷水解或微生物转化制得,无毒,易溶于水^[51],并且京尼平已被证明具有肝保护活性,作为一种有效的抗氧化剂和线粒体解偶联蛋白2(UCP2)的抑制剂,也被报道具有显著的抗癌作用^[52]。所以相比于传统的双官能团交联剂戊二醛来说,京尼平有显著优势。京尼平含有羟基、羧基等多个活性官能基团,可以与含氨基的多糖和蛋白质如明胶、壳聚糖等进行单分子或多分子交联^[53],交联的反应机理如图7所示。(a)反应步骤是一个SN2亲核取代反应,由一个二级酰胺键取代京尼平分子上的酯基,(b)反应步骤为京尼平C3碳原子从一个伯胺基开始亲核攻击,形成一个中间醛基,二氢吡喃环打开后,第一步反应中形成的仲胺攻击生成的醛基,再脱水重排形成类吡啶衍生物,(c)展示了通过京尼平交联的两种方式,即单分子京尼平桥连和二聚体京尼平交联。可以看出,京尼平的交联反应基团是两个氨基,即对含氨基化合物进行交联,如京尼平对壳聚糖的交联和对胶原蛋白的交联^[54],已经广泛研究。而对于蛋白质和多糖之间的交联来说,即可对氨基多糖(如壳聚糖)和蛋白质两者之间进行交联,Mi^[55]以壳聚糖和明胶的京尼平交联反应为例,展示了氨基多糖和蛋白质的交联历程,并研究了偶联物产生荧光发射的可能性,为治疗放射性核素免疫靶向提供可能性。

3.2.2 酶催化交联

酶催化交联技术也是一种常用的蛋白质多糖偶联的途径。与化学交联方法相比,酶催化交联反应具有反应时间短、反应条件温和、底物特异性高、副产物少等优点,特别是在环保和食品安全方面,酶催化交联法有其独特的优势^[56]。蛋白多糖偶联反应主要使用的是谷氨酰胺转胺酶和多种氧化酶(主要有酪氨酸酶、漆酶和过氧化物酶)。它们具有不同的催化交联方式。

谷氨酰胺转胺酶的工作原理是催化蛋白质的酰基转移,主要作用于谷氨酰胺残基的γ-羧酰胺基与自由氨基之间的酰基转移反应。因此,可以通过它形成一个新的肽键^[57],反应历程如图8所示。一般来说,反应效率取决于分子构象和蛋白质分子中特定氨基酸残基的丰度和有效性,不过这种对氨基的偏爱也同时使这种方法受到一定的限制^[58]。Yang 等^[59]利用谷氨酰胺转胺酶催化壳寡糖与红豆籽铁蛋白进行糖基化反应,制备壳寡糖修饰的铁蛋白纳米颗粒,壳寡糖糖基化保持了铁蛋白的笼状球形结构,提高了铁蛋白的热稳定性,同时保留了由pH和尿素转变调节的纳米颗粒的可逆组装,使得芦丁分子被成功地封装在纳米颗粒中,显著提高了纳米颗粒中芦丁的热稳定性。对壳聚糖和谷氨酰胺转胺酶在蛋白质改性方面的应用具有重要意义。

酪氨酸酶、漆酶和过氧化物酶都属于氧化还原酶家族,并提供广泛的底物特异性,可催化具有苯酚和胺结构的各种化合物的氧化,在其催化作用下,蛋白质的可反应酪氨酸残基被氧化为高度活性的醌残基,这些被激活的醌残基可以与亲核取代基(如壳聚糖胺基)发生反应,三种氧化酶对酚的酶促氧化机理有所不同,见图9,酪氨酸酶催化的交联是基于醌的生成,而漆酶催化的交联是基于自由基及其进一步的反应^[56,60]。酪氨酸生成的醌类通过席夫碱和/或米歇尔型加合键与氨基葡萄糖(或壳聚糖)胺结合^[61]。而漆酶和过氧化酶通过自由基反应,可促使含络氨酸残基的蛋白质与含酚羟基的阿魏酸多糖(如阿拉伯木聚糖、玉米纤维胶和甜菜果胶等)偶联。并且,漆酶催化氧化是更环保的,因为水是唯一的副产物^[56],而过氧化物酶的底物特异性更广,因为过氧化物酶可以催化漆酶不能催化的一些化合物,如单酚和单胺^[60]。Chen等^[62]用谷氨酰胺转氨酶以及酪氨酸酶对明胶和壳聚糖进行交联制备凝胶,比较了两种方案所制备凝胶的性质,讨论了这些凝胶的实际应用及潜在应用,并总结了酶催化法的潜在优势:(ⅰ)酶催化形成凝胶而不需要低分子量化合物(单体、引发剂和交联剂)的引入。(ⅱ)酶直接催化聚合物形成凝胶,而不需要光或事先接枝可交联功能(例如,丙烯酸酯通常被接枝到聚合物和大分子上,以允许它们进行后续的凝胶形成)。(ⅲ)凝胶可以由明胶和壳聚糖两种具有有用功能特性的天然聚合物酶合成,且酶催化凝胶的形成过程简单,条件温和。

以上介绍的是目前较常用的几种蛋白质-多糖复合体系的共价或非共价结合的方式,此外还有温和的碱处理等方法也是制备蛋白质-多糖复合体系的潜在方法。考虑到天然聚合物自身固有的结构,因此在应用前需要根据特定的蛋白质和多糖的固有结构特性,对天然蛋白质或多糖进行修饰^[5],而新引入的官能团可能参与蛋白质或多糖的络合,更复杂的相互作用模式为开发更多的蛋白质-多糖复合体系组装方法提供了可能。表1总结了目前现有研究中用于活性物质传递系统的蛋白质-多糖复合体系之间的主要结合方式和影响因素。

4 蛋白质-多糖复合体系的传递系统形式

蛋白质-多糖复合体系可以作为构建模块创造复杂的结构作为生物活性成分的传递载体。如图10所示,现有报道的传递系统有乳化系统、胶束、纳米凝胶、分子复合物和核壳结构颗粒等系统。亲水(如表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、花青素等)、疏水(如姜黄素、白藜芦醇等)、活性多肽类等生物活性物质可有效地与蛋白质-多糖复合体系结合,提高这些生物活性物质的整体功效^{[72⇓⇓~75]},各种传递系统的实例如表2所示。复合物传递系统可根据具体需要进行适当设计和构建,以下就现有的常见传递系统进行阐述。

4.1 乳化传递系统

与单独的蛋白质或多糖相比,蛋白质-多糖复合体系通常能够改善乳液界面的稳定性,并能更好地保护乳液内相中的生物活性物质,这些乳剂总体分为∶纳米乳剂、多重乳剂和皮克林乳剂。

蛋白质-多糖复合体系可以在纳米 (50~1000nm)范围内稳定乳滴^[75]。由于大多数蛋白质-多糖复合体系的亲水特性超过了它们的亲脂特性,因此蛋白质-多糖复合体系通常能形成稳定水包油乳液,主要传递疏水生物活性物质。Shi等^[76]用乳清分离蛋白与葡聚糖的美拉德反应产物MRPs来制备O/W乳状液,用于考察乳液对油脂的保护作用,证明了MRPs与未改性蛋白相比,油脂的过氧化值(POV值)由171.44 meq/kg降至30.63 meq/kg,显著提高了乳剂的氧化稳定性。多重乳剂同时存在水和油的隔层,所以可以同时传递亲水和亲脂的生物活性成分。最常见的多重乳液为W/O/W乳状液,蛋白质-多糖复合体系稳定的双乳状液可以提高生物活性成分的负载能力、化学稳定性和控释性能^[77]。

皮克林乳液是由固体颗粒稳定的乳液,影响皮克林乳液性能的关键因素有皮克林乳化剂的性质、油水比、pH值、乳化剂浓度等^[84]。蛋白质-多糖颗粒作为皮克林乳化剂可以使用不溶性(如醇溶蛋白和壳聚糖等)或可溶性(如明胶、葡甘露聚糖等)生物聚合物组装。蛋白质多糖颗粒稳定的皮克林乳状液因为颗粒吸附在乳状液界面上可提供抵抗环境压力的物理屏障^[85],具有抗聚结稳定性好等优点,是近年来发展起来的一种具有生物活性物质传递功能的乳液。Estrada-Fernandez等^[79]用浓缩乳清蛋白与阿拉伯胶相互作用,通过调整pH值和物料比,获得可溶性(SC)和不可溶性(IC)复合物,分别作为水包油和油包水的活性界面,制备出O₁/W/O₂双乳,76 d后的最终平均粒径变化不大,表明它们具有长期的稳定性,通过共聚焦显微镜可以观察到内部油滴和双乳状水滴,以及外层的皮克林固体颗粒层。

4.2 胶束

胶束传递载体是指两亲性嵌段共聚物的球形超分子组装体。对于基于蛋白质和多糖的胶束,两亲性嵌段共聚物主要是蛋白质和多糖的美拉德偶联物,其中蛋白质和多糖分别充当疏水头和亲水尾,疏水性和亲水性生物活性成分都可以通过基于蛋白质-多糖复合体系的胶束来传递^[36]。Li等^[74]将卵清蛋白和葡聚糖通过美拉德反应偶联后,形成卵清蛋白作为疏水段,葡聚糖作为亲水段的二嵌段聚合物,自组装形成粒径为285 ~339nm的纳米胶束,对EGCG进行包埋传递,实现了在胃肠道环境中对EGCG的保护,并且与EGCG溶液相比,负载EGCG的偶联纳米颗粒显著提高了Caco-2单分子膜上EGCG的表观渗透系数(Papp),表明这些纳米颗粒可以提高EGCG的吸收。

4.3 纳米凝胶

纳米凝胶载体因其粒径小、溶解性好、负载高、控释性好而迅速成为生物活性物质传递领域的主要载体之一^[18]。纳米凝胶是由亲水性或两亲性大分子链的聚合物化学或物理交联而成,具有三维结构,粒径在1200nm范围内,纳米凝胶的结构通过静电相互作用、氢键或疏水相互作用稳定^[86]。纳米凝胶以自由水或束缚水的形式将水分子隔离在聚合物网络中,内部三维网络的高含水率支撑结构的柔性、收缩或膨胀,以响应外部条件。这种独特的结构特性,使得纳米凝胶常被用作纳米载体,将生物活性输送到人体系统中^[87]。天然多糖和蛋白质是制备凝胶的优良材料,可制备生物相容性、生物可降解、低毒和免疫原性较低的纳米凝胶。然而,多糖和蛋白质单独形成纳米凝胶系统,对外部环境很敏感、脆弱而不稳定,特别是多糖单独形成凝胶时,往往都要添加化学交联剂^[88]。所以,近年来的许多研究都广泛地利用多糖和蛋白质之间的各种相互作用力来制备蛋白多糖复合纳米凝胶系统。因为凝胶的溶胀特性,以及蛋白质和多糖的结构特征,蛋白质多糖复合凝胶可以被设计成胃肠道环境响应性系统,来达到活性物质的控制性释放以及提高其生物利用度的传送目的^[89]。Liu等^[90]用溶菌酶和羧甲基纤维素大分子自组装加热封装茶多酚,在静电作用和疏水力的驱动下形成了生物可降解的纳米凝胶(Ly-CMC NGs),纳米凝胶呈球形,稳定性好,粒度小,负载率高(包封率为89.05%± 3.14%),并且能实现在胃酸环境下为致密结构,在小肠pH环境下为疏松结构,使活性物质在小肠内可控释放,此负载茶多酚纳米凝胶对DPPH和ABTS的清除率分别为76.5%和86.1%,其抗肿瘤活性可有效抑制HepG2细胞的增殖。

4.4 分子复合物

分子复合物是指生物活性物质与生物聚合物(蛋白质或多糖)相互作用形成的分子组装物。多酚是分子复合物中研究最多的生物活性物质,在分子复合物中,蛋白质和多糖可以静电组装或共价交联,多酚和蛋白质之间可以通过氧气存在条件下的碱性溶液进行共价复合,或者在漆酶和过氧化酶等氧化酶的催化下,通过醌与蛋白上的氨基结合^[32],亦或直接通过多酚和蛋白质之间的羟基等基团之间产生的如氢键等的相互作用力形成物理聚合物^[91]。多酚和多糖之间可由羟基自由基引发的自由基接枝来进行共价结合,或者含有羧基和氨基的多酚和多糖(如含有氨基的壳聚糖和含羧基的绿原酸、没食子酸等酚酸)通过EDC/NHS的诱导结合^[92]。由于游离的多酚可能与生物大分子形成不溶性的聚集体,对比多酚-蛋白或多酚-多糖的二元复合物,多酚-蛋白质-多糖的三元分子复合物可以通过改善释放系统的物理稳定性和水溶性来提高多酚的功效,往往具有更优越的性质,如多酚通常与蛋白质有很强的结合亲和力,这往往导致大规模的聚集而产生沉淀,Xia等^[93]比较了牛血清蛋白在引入葡聚糖美拉德糖基化前后与EGCG的分子复合物的性质比较,发现葡聚糖的亲水性层抑制了牛血清蛋白与EGCG之间以疏水作用和氢键作用为主的过强相互作用,最终抑制了大规模的聚集。

另外,多酚-蛋白质-多糖的三元分子复合物可以提高蛋白质多糖复合物的功能性,如多酚的抗氧化抗自由基的优势,Liu等^[94]通过碱性氧化法获得绿原酸和乳铁蛋白的共价复合物,再与葡聚糖美拉德反应糖基化,制备了绿原酸-乳铁蛋白/葡聚糖三元共价复合物。该复合物有效地提高了β-胡萝卜素乳液表面的亲水性,增强了油滴之间的空间斥力,提高了乳液的理化稳定性,同时显著提高了乳剂中β-胡萝卜素的抗紫外线稳定性^[95]。更进一步地,该绿原酸-乳铁蛋白/葡聚糖三元共价复合物组成的界面涂层对β-胡萝卜素脂滴在消化过程中的性能的影响被深入研究,在模拟胃肠道条件下,该三元共轭体系稳定的乳剂对液滴聚集的稳定性优于其他体系,提高了β-胡萝卜素的生物可及性^[96]。

4.5 壳-核结构粒子

核壳颗粒常用于疏水性生物活性成分的传递。一般来说,疏水蛋白(玉米蛋白、大豆蛋白等)首先组装成蛋白颗粒作为内芯,生物活性成分主要通过疏水相互作用被封装到内芯后,亲水多糖以壳层形式附着在核球上。蛋白核促进疏水性生物活性成分的包封和保护,多糖壳通过产生更强的空间和静电排斥来改善颗粒的稳定性^[97]。Huang等^[2]用静电沉积方法制备了由疏水性玉米蛋白核包覆亲水性果胶壳组成的核壳纳米颗粒,用以封装姜黄素,具有姜黄素负载效率高、高颗粒产率、水分散性好等特点,并且尝试用海藻酸盐替代30%的果胶后,颗粒的聚集稳定性大大提高,通过Fe (Ⅲ)还原力、 DPPH·自由基和ABTS·⁺自由基阳离子清除实验分析,姜黄素包被于这些核壳纳米颗粒后表现出更高的抗氧化和自由基清除活性。他们继续开发以反溶剂沉淀法制备的疏水玉米蛋白-果胶的核壳型纳米粒子包封白藜芦醇,显示出了良好的体外抗氧化性和抗癌特性^[72]。近几年来,新的材料不断被开发,如大麦醇溶蛋白也成功地与EGCG通过反溶剂液-液分散法制备成纳米颗粒内核,再用静电层层堆积法包覆上壳聚糖外壳,形成核壳结构的纳米颗粒Cs-EHNs,通过Caco-2/HT29细胞共培养模型研究此壳聚糖外壳对纳米颗粒的吸收和跨细胞渗透性的影响^[22]。Cs-EHNs可显著提高EGCG的跨细胞通透性,Cs-EHNs的表观渗透系数(Papp)高于游离EGCG。此外,通过特异性的胞吞抑制剂研究了Cs-EHNs的细胞摄取,结果表明Cs-EHNs的摄取机制是通过小泡介导的胞吞和巨胞饮作用,制备过程示意图及EGCG的吸收效果如图11所示。

5 智能化与靶向性的发展趋势

在药物制剂领域,利用胃肠道环境的pH值和酶环境的差异,病灶部位的pH值、氧化-还原环境、温度等差异,高血糖患者血液中葡萄糖浓度过高等特点,针对性地设计出了各种pH 响应、还原性响应、温度响应、葡萄糖响应以及各种受体靶向的药物包埋传递系统^[98⇓~100],受到该思路的启发,在生物活性物质的传递上,该发展方向也成为一种趋势^[1,101]。有些多糖或蛋白质自身的结构就具有环境敏感性,如壳聚糖上的伯氨基团让壳聚糖在低pH时溶解,在高pH时收缩聚集,这对于癌细胞的弱酸微环境是一种很好的靶向控释材料。而像海藻酸钠、果胶、透明质酸等含有羧基的聚合物,则刚好相反,能实现在胃液的酸性条件下收缩保护活性物质,而在肠道近中性环境中溶胀释放,达到高的传输效率和生物利用度^[11]。近年来,对天然蛋白、多糖类聚合物的化学修饰嫁接环境敏感基团也成为研究的热点之一,Huang等^[102]利用牛血清蛋白(BSA)上的—NH₂作为目标修饰基团,利用巯基噻唑啉激活的热敏感物质PNIPAAm聚合物与之偶联,制备了热敏感响应的蛋白-聚合物偶联物(BSA-NH₂/PNIPAAm),再通过皮克林乳化方式形成囊泡结构,不仅提供了生产目标微容器的能力,还提供了以温度为介导释放生物活性物质负载的能力,为构建高生物相容性和细胞识别水平的靶向递送多功能微室提供方案。热敏偶联物及乳剂的制备方案及其热响应行为见图12。

另一方面,考虑到口服的便利性和生物利用度的提高,利用肠道上皮细胞高表达的各种特异性受体和转运蛋白进行主动转运而设计的转运载体也取得了很大的关注,研究较多的有叶酸受体、维生素B12受体、转铁蛋白受体和胆酸转运体等^[103]。Fan等^[104]通过脱氧胆酸靶向修饰的壳聚糖与γ-聚谷氨酸和多肽类活性物质的模型化合物胰岛素,通过非共价健物理共聚自组装,形成负载胰岛素的脱氧胆酸靶向修饰纳米粒(DNPs),可通过胆汁酸途径克服肠道上皮的多重屏障,实现了在胃肠道恶劣pH和酶环境下对胰岛素的保护,同时在肠上皮细胞运转时,通过根尖钠依赖性胆酸转运蛋白(ASBT)介导的内吞作用内化,并且实现溶酶体逃逸显著阻止了上皮细胞中的胰岛素降解,I型糖尿病大鼠的口服生物利用度为15.9%,为多肽类活性物质的口服吸收提供了传递方案。图13显示了此靶向DNPs纳米颗粒的构建方案、上皮细胞的摄取机制、以及胆汁酸途径从DNPs经上皮细胞转运克服肠道上皮细胞的多重屏障的示意图。另外,脂肪酸类物质特异性肠细胞运转载体,如脂肪酸转运蛋白4 (FATP4)和单羧酸转运蛋白1(MCT1)靶向性运转载体的构建和研究,对于活性物质传递也是一个很有意义的发展方向^[105,106]。

6 结论与展望

自de Jong等在明胶-阿拉伯胶体系(一种蛋白质多糖体系)上进行了复凝聚的开创性工作以来,多糖和蛋白质复合物在实际应用中受到了越来越多的关注,因其在传递生物活性物质中体现了多重的显著优势:(ⅰ)蛋白质和多糖材料的高生物安全性和高生物相容性。(ⅱ)蛋白质和多糖的种类很多,而且其中很多的结构中都含有优秀的可修饰的活性基团如氨基、羧基、羟基、酰胺基、酚等结构,这使得蛋白质和多糖之间,可用物理非共价复合、美拉德反应、EDC/NHS交联和酶交联等安全有效且少副产物甚至无副产物的方法进行复合或偶联,从而形成蛋白质-多糖复合体系。(ⅲ)蛋白质-多糖复合体系可形成用于封装活性物质的形式多样,可根据不同活性物质的不同传递需求,如增溶、抗氧化、胃肠道pH和酶环境保护、克服吸附屏障提高生物利用度等,来选择所需的蛋白质及多糖材料和所需的传递形式。

然而,尽管蛋白质-多糖复合体系的组装在许多方面促进了生物活性物质的传递,但传递系统的设计、评价和应用仍面临诸多挑战。需要重新考虑和提高蛋白质-多糖复合体系在生物活性成分传递方面的整体效率。首先,为了达到最佳的传递性能,应根据生物活性传递的具体需要,选择合适的蛋白质和多糖作为壁材,这就要求对多种蛋白质和多糖的结构有一个充分而全面的了解。例如,具有疏水空洞的蛋白质更适合于递送疏水生物活性化合物;为了提高生物活性物质的肠道通透性,设计以壳聚糖为外层复合纳米颗粒可能是一个很好的选择,因为壳聚糖与其他多糖相比,更容易粘附和渗透到粘液层;如果要设计一个pH响应的传递系统实现胃液中对活性物质的保护,而在肠道中溶胀释放活性物质,那天然含有—COOH 的多糖如海藻酸钠、果胶等多糖可能很利于目标的实现。其次,在完成构建蛋白质-多糖复合体系的传递系统后,对其进行评价时,目前多数用于评估生物活性成分的生物可及性的体外消化模型为基于“烧杯试验”的静态系统,没有考虑如肠道蠕动和动态变化等实际因素。另外,在蛋白质-多糖复合体系的智能化和靶向修饰上,目前多数的修饰还是可能会引入较多的化学物质,这与蛋白质-多糖复合体系传递生物活性物质的高生物安全性的目标有所分歧,更加安全高效的制备方案有待开发。另外,到目前为止,关于蛋白质或多糖如何影响生物活性成分生物利用度的体内药代动力学研究,以及细胞摄取的机制研究,特别是亚细胞结构水平的研究,仍然非常有限。

综上,蛋白质-多糖复合体系是很有应用前景的活性物质包封传递载体,我们可以在更全面更深入了解认识其对活性物质影响和功效的基础上,安全合理有效地设计活性成分的传递系统。

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2022-01-29	2022-10-24	2022-04-29
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2022-06-23

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