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催化水解反应的肽基模拟酶的活性来源、催化机理及应用

赵自通 ,  张真真 ,  梁志宏

化学进展 ›› 2022, Vol. 34 ›› Issue (11) :2386-2404

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化学进展 ›› 2022, Vol. 34 ›› Issue (11) :2386-2404 DOI: 10.7536/PC220301
综述
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催化水解反应的肽基模拟酶的活性来源、催化机理及应用

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The Activity Origin, Catalytic Mechanism and Future Application of Peptide-Based Artificial Hydrolase

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摘要

肽基材料由于其与蛋白质高度相似和结构可控等优势,是构建人工模拟酶的一种理想材料;此外,小肽中氨基酸排列的多样性、序列的自组装特性、纳米结构稳定性、结构简单易于设计、良好生物相容性等优势,使得构建具有高效催化活性的肽基模拟酶具有非常好的应用前景。利用肽基材料通过理性设计活性位点来构建模拟酶具有多方面优势:(1) 氨基酸序列可以直接从天然酶中的活性位点获得,保留酶的功能,但降低了酶固有的复杂性;(2) 肽序列中可以嵌入各种具有特定结构及功能的活性位点,便于对模拟酶进行人工理性设计;(3) 肽具有良好的生物相容性,可以在温和条件下催化反应进行。根据催化降解化学键的不同,可将肽基水解模拟酶分为以下几种:催化酯键降解的肽基模拟酶、催化肽键降解肽基模拟酶、催化糖苷键水解的肽基模拟酶。本文主要分析了具有水解酶活性的肽基模拟酶的活性来源、构建方法及微观结构、催化反应类型、催化影响因素、活性改善方法、作用机理及未来潜在应用等;以期为构建具有高效水解催化活性的模拟酶提供借鉴,推进肽基水解模拟酶的研究发展及实际应用。

Abstract

Small peptides are the ideal material to construct artificial enzymes due to their advantages of high similarity to natural enzymes and controllable structure. Small peptides have more simple structures which makes them convenient for rational design. Meanwhile, the diversity of amino acids arrangement, self-assembly characteristics of the sequence, the stability of the nanostructure, and good biocompatibility make it possible to construct high-efficiency catalytic active peptide-based artificial enzymes with broad application prospects. There are many advantages to using peptide-based materials for rationally designing active sites to construct artificial enzymes. (1) The amino acid sequences can be derived directly from the active sites in the natural enzyme, therefore preserving the function of enzymes but reducing much of the complexity that is inherent to nature enzymes; (2) Various active sites with specific structures and functions can be embedded in the peptide sequence, which is convenient for the artificial rational design of the artificial enzymes. (3) Peptides have good biocompatibility and hydrolysis reaction under mild conditions. According to the different catalytic degradation of the chemical bond, the peptide-based artificial hydrolases are mainly divided into the following categories: catalytic ester bond degradation peptide-based artificial enzyme, catalytic peptide bond degradation peptide-based artificial enzyme, catalytic glycosidic bond degradation peptide-based artificial enzyme. Therefore, this review mainly summarizes the peptide-based artificial hydrolase from activity origin, construction methods, microstructure, catalytic reaction type, catalytic influencing factors, activity improvement methods, activity mechanism, and future application. To promote the designing of peptide-based artificial enzymes with more efficient catalytic activity, accelerate the development and practical application of peptide-based artificial hydrolase.

Contents

1 Introduction

2 Activity origin of peptide-based artificial hydrolase

3 Catalytic reaction type of peptide-based artificial hydrolase

3.1 Catalytic ester bond hydrolysis

3.2 Catalytic peptide bond hydrolysis

3.3 Catalytic glycosidic bond hydrolysis

4 Activity improvement of peptide-based artificial hydrolase

5 Research progress in the application of peptide-based artificial hydrolase

6 Conclusion and prospects

Graphical abstract

关键词

肽基模拟酶 / 活性来源 / 水解反应 / 催化机理 / 应用研究

Key words

peptide-based artificial enzyme / activity origin / hydrolysis reaction / catalytic mechanism / future application

引用本文

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赵自通, 张真真, 梁志宏. 催化水解反应的肽基模拟酶的活性来源、催化机理及应用[J]. 化学进展, 2022, 34(11): 2386-2404 DOI:10.7536/PC220301
Zitong Zhao, Zhenzhen Zhang, Zhihong Liang. The Activity Origin, Catalytic Mechanism and Future Application of Peptide-Based Artificial Hydrolase[J]. Progress in Chemistry, 2022, 34(11): 2386-2404 DOI:10.7536/PC220301

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1 引言

天然水解酶(Hydrolase,EC3.1~EC3.13)是一类来源于生物的功能性蛋白质,相比于化学催化剂,天然酶具有反应条件温和、高催化效率和高度专一性等特点[1]。随着越来越多的天然水解酶不断被发现,天然水解酶在食品、医药、化工、环境治理等各个方面的应用越来越广泛[2⇓~4]。尽管目前已经发掘了各种能够降解特定化学键的水解酶类,但是在实际的应用中,由于酶的高度特异性,对于大多数工业工艺过程而言,天然的酶制剂往往无法满足特定的反应要求,使得天然酶应用受到巨大的限制,故而酶的特异性改造、理性设计成为当前的研究热点[5,6]。其次,天然酶的稳定性较差,在温和适宜的反应条件下能够实现高效催化,但是对温度、pH、有机溶剂等的耐受性较差,极易发生变性失活[7,8]。因此,设计开发出一种能够适应各种复杂极端工业化生产环境,同时满足催化特定反应的催化剂依然是一项极具挑战且意义重大的任务。近年来,随着人们对天然酶结构研究的不断深入,并逐阐明了天然酶的催化机理,在此基础上科研人员希望尝试利用简单的有机或者无机组分构建出能够具有天然酶活性的人工模拟酶[9⇓⇓⇓~13]。

经过众多科研人员的努力,能够模拟天然酶催化活性的人工模拟酶的不断被发现,其催化反应的类型包括:氧化还原酶类[14,15]、水解酶类[16,17]、转移酶类、裂合酶类[18]、异构酶类、核酶类,甚至开发出了目前没有天然酶能够催化降解的反应类型[19,20];依据用于构建模拟酶的材料的不同可以大致将其分为以下几种:贵金属纳米酶、淀粉样模拟酶(环糊精为基等)、核酸类模拟酶、肽基模拟酶、以及其他以天然骨架分子构建的模拟酶等[9,13,16]。其中肽基模拟酶由于结构及催化原理更加接近天然酶,而且肽基材料具有与蛋白质高度相似和结构简单可控等优势,是构建人工模拟酶的一种理想材料[21];此外小肽中氨基酸具有排列的多样性、序列的自组装、纳米结构稳定性、结构简单易于设计、良好的生物相容性等优势,使得构建具有高效催化活性肽基模拟酶具有广阔的应用前景[22]。同时肽基模拟酶的研究对研究天然酶的起源,探索生命最初起源、更加深入理解酶的作用机理等也具有重要意义[23]。因此,本文综述了目前已经发现的具有水解酶活性的肽基模拟酶,分析肽基水解模拟酶活性来源、构建方法及微观结构、催化反应类型、催化影响因素、活性改善方法及其作用机理等;为构建具有更加高效水解催化活性的模拟酶、推进肽基水解模拟酶的研究发展及实际应用提供参考。

2 肽基水解模拟酶的活性来源

天然酶的催化活性源于天然酶蛋白形成的特定三维立体结构,而其中最重要的结构是酶的活性中心,天然酶的活性中心是由多肽链上的特定氨基酸在立体空间中形成的具有一定柔性的三维活性空穴,主要分为能够实现对底物特异性结合的结合中心和实现对底物特异性催化中心[24]。大多数天然酶的活性中心氨基酸具有高度保守性,酶活性中心常见的氨基酸有:组氨酸、天冬氨酸、精氨酸、谷氨酸、丝氨酸、赖氨酸等[24,25]。目前研究较为清楚的是丝氨酸蛋白酶的催化三联体:丝氨酸、天冬氨酸、组氨酸;催化反应的过程是组氨酸中的咪唑集团攻击肽键中的羰基碳原子,随后丝氨酸及天冬氨酸起到稳定中间过渡态的作用[26,27](图1)。因此,天然酶的高效催化活性主要来源于两方面:(1) 能够刚好容纳底物分子的活性空穴;(2) 催化活性氨基酸对底物的攻击及对过渡态的稳定。

同时,小分子肽具有自组装特性,目前已经发现了大量的小分子肽序列可以通过自组装作用形成特定的纳米结构,如纳米管、纳米球、纳米酶纤维、纳米囊泡、纳米片层等结构(图2),因此在特定的纳米结构中引入活性氨基酸,使其在纳米结构表面规律排列,便可以模拟出类似天然酶的活性位点[28]。所以,肽基模拟酶构建主要受酶活性位点的结构和催化机制的启发,通过小肽分子的自组装或者辅以其他支撑结构模拟出天然酶的活性中心,可以产生具有酶样活性位点的超分子催化剂(构建原理如图3所示)。利用肽基材料理性设计活性位点来构建模拟酶具有多方面优势:(1) 氨基酸序列可以直接从天然酶中的活性位点获得,保留酶的功能,但降低了酶固有的复杂性;(2) 肽序列中可以嵌入各种具有特定结构及功能的活性位点,便于对模拟酶进行人工理性设计;(3) 肽具有良好的生物相容性并可以在温和条件下催化反应进行。

此外,有许多天然酶具有辅酶或者辅基,对天然酶的活性有重要作用;还有一些金属酶,需要金属离子的存在才能发挥其高效催化的功能。与天然酶相似,肽基模拟酶活性也受到一些辅基(血红素)、金属离子(锌离子、铜离子)等的调控,它们通过共价或者非共价键的方式与模拟酶结合,赋予或者增强了模拟酶的催化活性。

尽管目前通过人工理性设计得到的模拟酶的催化活性多数低于天然酶的催化活性,但是模拟酶具有许多天然酶没有优势,也克服了许多天然酶的弊端。比如,模拟酶的结构简单、易于设计和生产,可以针对特定反应类型进行理性设计、稳定性强,对温度、酸碱、有机溶剂等的耐受性强,在相对苛刻的环境中具有优势[29]。

3 肽基水解模拟酶的催化反应类型

根据模拟酶所催化降解化学键的不同,目前已经报道的肽基水解模拟酶主要分为以下几种:催化酯键降解的肽基模拟酶(表1)、催化肽键降解肽基模拟酶(表2)、催化糖苷键水解的肽基模拟酶(表3)。

3.1 酯键水解模拟酶

具有水解酶类活性的肽基模拟酶中关于降解酯键的模拟酶最多。酯酶(EC3.1)能够催化酯键的快速裂解,可以将酯类物质水解为相应的醇和酸,酯酶普遍存在于生物体内,且在食品、医药、化学、生物等领域应用广泛,是一种重要的水解酶,其中丝氨酸蛋白水解酶催化中心氨基酸组氨酸(His)、天冬氨酸(Asp)和丝氨酸(Ser)又称为催化三联体常被引入肽序列中构建酯酶模拟物[27]。此外,大量研究报道组氨酸可以作为多肽模拟酶活性位点催化酯类物质水解[14,30]。现在的研究基于多肽的模拟酶水解的酯类底物主要包括对硝基苯酚乙酸酯(pNPA)[31]、对硝基苯酚丙酸酯(pNPP)[31,32]、对硝基苯酚丁酸酯(pNPB)[33]、对硝基苯乙酸甲酯(pNPMA)[32]、邻苯二甲酸二辛酯(DEHP)[34]、Cbz-Phe-ONP[35]、尿苷3'-(2,2,2-三氯乙基)磷酸盐(Uridine 3'-(2,2,2-Trichloroethylphosphate))[36]、十六烷基酪氨酸乙酯(ATEE)[37]、苯甲酰酪氨酸乙酯(BTEE)[37]等。

3.1.1 组氨酸为活性中心构建肽基模拟酶

组氨酸是天然水解酶催化活性中心最常见的活性氨基酸,组氨酸的侧链咪唑基团对酶的高效催化活性至关重要;因此最早的肽基模拟酶便是在具有自组装功能的小肽序列中通过理性设计的方法添加组氨酸,成功模拟了天然酯酶的催化活性。Guler等[38]利用双亲性多肽(Peptide amphiphiles,PAs)构建了一个具有催化酯键(DNPA)降解能力的人工水解酶,通过其烷基尾部的疏水坍塌和肽段之间形成的β折叠片自组装成纳米纤维结构,而组氨酸的嵌入用于模拟酶天然酶的催化活性位点。以DNPA为底物研究了该模拟酶的酶促反应动力学表明kcat/KM为19.76 s-1·L·mol-1,同时发现在反应体系pH为7.4时其催化速率最好,作者推测模拟酶的水解速率的提高是由于在这些纳米纤维结构内部有序的反应位点的高密度呈现所导致的。

Huang等[32]以聚脯氨酸形成的β-折叠结构作为构架,设计了一系列催化酯水解的脯氨酸低聚肽;且发现(2S,4R)-4-羟基脯氨酸((2S,4R)-4-hydroxyproline, Hyp)的活性比脯氨酸好;因为其可以稳定聚脯氨酸结构及羟基可能参与稳定反应中间体。MAX1-H2H5、MAX1-H2S5具有酯键降解活性,且其在pH=10.0时的活性最好。

3.1.2 小分子肽结合金属离子构建肽基模拟酶

多数天然酶(如血红蛋白、肌红蛋白)需要辅酶、辅基才能发挥其催化活性;而金属蛋白酶在其催化中心结合Zn2+、Cu2+、Mg2+、Fe2+等金属离子增加或者激活其催化活性。因此,在肽基模拟酶中添加金属离子辅助模拟酶天然酶的催化中心能够改善模拟酶的催化活性。Al-Garawi等[39]通过理性设计的方式对能够自组装成淀粉样纤维的小肽序列进行改造,设计了一系列的小肽序列(图5)。活性验证结果表明Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ均能够催化pNPA的降解,其中序列Ⅲ(Ac-IHIHIYI-NH2)的催化活性最好,kcat/Km为355 L·mol-1·s-1,与天然碳酸酐酶的活性对比表明每摩尔肽的催化效率时每摩尔碳酸酐酶的约6.5倍。催化机理研究表明,水分子激活了锌离子-咪唑基团复合体,形成四面体结构,可以直接作用于pNPA的羧基,形成酰基-Zn-咪唑的复合物;第六位的酪氨酸辅助锌离子-咪唑基团复合体的质子化过程。

3.1.3 小分子肽结合金纳米颗粒构建肽基模拟酶

金纳米材料的尺寸减小到纳米水平,具有高比表面积,与其他材料相比具有更优越的物理化学性质。由于纳米材料表面的原子非常活跃,这些活跃的表面原子甚至能够像天然酶一样催化底物的反应,因此金纳米颗粒具有良好的催化性能,越来越多具有卓越催化活性的纳米酶被设计出来。

小分子肽与金纳米颗粒的具有良好的相容性,研究表明将富含组氨酸的小肽(AHHAHHAAD)固定在纳米线表面,最终可形成组氨酸金纳米线(图6)[40]。同时,将手性氨基酸接枝到纳米颗粒表面可以间接赋予它们立体选择性,其中氨基酸的功能可能与天然酶中的蛋白质相似[41,42]。因此,若能综合小分子肽和金纳米颗粒的优势,则有望开发出活性更好、稳定性更强的模拟酶。

Tan等[16]将自组装偶氮苯肽(Azo-GFGH)固定在环糊精(CDs)覆盖的金纳米颗粒(AuNPs)表面构建了一个具有级联催化作用的模拟酶(AuNP@CDs-Azo-GFGH),可以先作为酯酶模拟酶催化pNPA降解为4-硝基苯酚(pNP);然后在紫外线的照射下自组装肽分解,此时金纳米颗粒可以将pNP催化还原为4-氨基苯酚(图7)。

Mikolajczak等[43]报道了一种具有酯酶性质的肽-金纳米颗粒偶联物的设计和合成,其活性受肽构象变化的调节,通过添加与其互补的α-螺旋结构小肽可以显著抑制模拟酶的催化活性。该模拟酶是通过对Litowski等[44]发现的超螺旋束小肽序列IAAL E3(Ac-EIAALEKEIAALEKEIAALEK-NH2)进行理性设计改造构建的,在IAAL E3结构中富含谷氨酸残基的区域插入带有咪唑基团侧链的组氨酸;因此组氨酸的咪唑基团处于一个富含羧酸盐的环境中,能够形成一个加速酯水解的催化活性电荷中继网络;同时当肽被固定时,羧酸-咪唑相互作用的协同生成可能会增强。最终得到E3H15(H2N-CGGYE5IAALEKEIAH15LEKEIAALEK-CO2H),而且E3H15的N端半胱氨酸很容易通过硫醇键和金纳米粒子表面固定。作者构建的肽-纳米颗粒偶联物(Au@E3H15)催化pNPA中的酯键水解的速率比E3H15大一个数量级,而且其活性受到能够与E3H15形成平行异二聚体α螺旋超螺旋束的K3的调节(图8)[43]。

随后,Mikolajczak等[18]又构建了一种基于金属纳米颗粒+小肽+锌离子的人工水解模拟酶,在肽-金纳米颗粒偶联物(Au@IHQ-NP)中加入Zn(Ⅱ)离子,实验结果表明显著提高了pNPA的酯水解速率和二氧化碳的水化作用。由于Zn(Ⅱ)能够降低结合水的pKa,形成高度亲核的氢氧化物,与二氧化碳反应,近距离结合,产生 HCO 3 -。这说明Pep-Au-NPs能够像天然金属酶一样进行催化反应,开辟了采用“纳米颗粒+小肽+金属离子”构建模拟酶的新途径。

3.1.4 分子印迹法构建肽基模拟酶

分子印迹技术(Molecular imprinting technology, MIT)是制备具有一定识别作用、高度选择性和空间结构的聚合物的一种技术,广泛应用于分离分析和模拟生物酶催化领域。在模拟酶的构建过程中可以利用分子印迹法以底物、产物或类似物为模板构建人工酶的催化中心,该方法能够提高模拟酶的催化活性及特异性[33,45,46]。其原理是印记分子作为模板,帮助模拟酶形成了能够更容易结合特定底物的类似天然酶的活性空穴;在提高模拟酶催化活性的同时,也能在一定程度上提高模拟酶的特异性。

Zhu等[21]通过将分子印迹聚合物与肽组装结合,开发了一种基于肽的人工水解酶(图9)。首先将含组氨酸的肽(Fmoc-FFH)与聚合物成分和印迹模板混合;在非共价力驱动(π-π堆叠、氢键、范德华力、疏水相互作用);小分子肽可以自组装成超分子纳米纤维,在紫外光的作用下发生聚合形成纳米纤维聚合物水凝胶;去除模板后便可获得能与模板或类似物结合的类似天然酶活性空穴的特定空腔,从而使印迹人工酶具有特定的选择性。分子印迹法可以提高酯键降解模拟酶的底物特异性及催化活性,这种方法理论上可以针对任何底物,对模拟酶进行催化特异性的改造;同时这种方法构建出的活性空穴使得肽基模拟酶的催化特异性和催化活性更加接近于天然酶。为具有特异性催化功能的肽基模拟酶的构建提供了一种新的方法。

3.1.5 催化活性可调节肽基模拟酶

通过在小肽序列中添加对光、酸碱度、温度、敏感的物质,构建结构可调节的小肽自组装结构,并结合肽基模拟酶的构建原理,可以构建出活性可调节控制的人工肽基模拟酶,增加了对酶活性的控制,拓宽了肽基模拟酶在未来实际生产中的应用范围。目前已经开发出来的活性可调节肽基模拟酶主要有以下两种。

(1) 光控制活性可调节肽基模拟酶

Zhao等[47]利用一种光响应的叠氮苯以组氨酸为催化活性氨基酸设计了一种可以通过光照控制催化活性的肽基模拟酶(Azo-GFGH),由于组氨酸残基和超分子组装中的疏水微环境的临近效应该模拟酶具有酯键降解活性(图10)。模拟酶结构在紫外光照条件下可以由反平行的β折叠结构转变为无规则结构,催化活性被抑制。Singh等[48]首次尝试将一个催化中心锚定在一种可以光、热等条件下相互转换的肽纳米结构上,构建出了具有可调节催化活性的模拟酶。将芴甲氧羰基和4-甲基香豆素固定在NVFFAC小肽序列的N端,并在C端添加两个组氨酸,构建了双亲多肽1-2。双亲多肽不仅再酰胺键之间具有氢键,而且肽的芳香部分还提供了π-π堆积和疏水相互作用,同时,C端的两个组氨酸可以使1和2在水溶液中的自组装具有溶解性。双亲多肽1-2经过自组装形成的1NF、1TB、2NF、(di-2⊂γ-CD)NS经过活性验证发现具有酯键降解活性,其中1TB的活性最好(kcat/Km=1.71 L·mol-1·s-1)。

(2) pH控制活性可调节肽基模拟酶

Zhang等[49]通过在一个pH响应小肽的末端添加具有催化作用的组氨酸成功构建出了活性可调控的人工水解酶(VK2H)(图11)。通过将pH从酸性转变为碱性,pH响应肽能够实现从随机线圈到β-折叠构象的转变。β-折叠片自组装形成长纤维,疏水边缘和组氨酸残基延伸在一个有序的阵列作为催化微环境,这显示出显著的酯酶活性。实验结果显示,以pNPA为底物,在pH值为5.3~9.5范围内,当pH值小于7时VK2H没有降解活性,当pH值大于7时,随着pH值的增加VK2H的催化活性显著增加,与VK2H的纳米纤维结构的形成一致,说明具有催化微环境是由纳米纤维形成的;因此可以通过调整体系pH的实现对该人工模拟酶的活性控制。

3.1.6 单一氨基酸自组装构建肽基模拟酶

苯丙氨酸中同时存在带有正电荷以及带有负电荷的基团,同时具有芳香基团,这些特性使得苯丙氨酸可以通过氢键、π-π堆积、疏水作用进行自组装形成特定纳米结构。Adler-Abramovich等[50]发现苯丙氨酸(F)可以自发地自组装成具有淀粉样蛋白特征的超分子交叉β片二级结构。随后Makam等[7]首次通过单个苯丙氨酸与锌离子通过自组装形成纳米针状结构构建出了一种人工模拟酶;采用苯丙氨酸与锌离子通过自组装可以形成长达几微米的针状纳米结构,晶体结构衍射结果分析表明,一个锌离子通过胺(氨基)和羧酸盐(羧基)基团与两个苯丙氨酸结合;层间通过π-π作用稳定(图12)。活性验证表明模拟酶同时具有酯酶活性及碳酸酐酶活性,这是目前发现的分子量最小的人工水解酶,基于质量计算该人工模拟酶的催化活性(kcat/KM =46×10-2 (gL-1)-1·s-1)是天然碳酸酐酶(kcat/KM =5.7×10-2 (gL-1)-1·s-1)的8倍。

依据密度泛函理论(M06-2X/6-31+g(d,p))计算得到的反应机理如下(图12C):复合物1为起始复合物,在复合物1中一个水分子结合到锌原子(Zn-O距离为2.095 Å);结合的水分子转移一个质子到与Zn结合的一个氨基基团,生成氢氧化物亲核复合物2;质子转移的过渡态是通过复合物周围的另一个水分子在锌结合的水和氨基之间形成一个质子桥得到复合物TS1/2;底物(pNPA)接近氢氧化物亲核复合物2后形成复合物3;pNPA羰基的碳原子与氢氧根离子的氧原子之间随后形成键形成复合物4;复合物4中与锌结合的氧原子属于pNPA的羰基,而不是氢氧化根离子的氧原子。随后在复合物5中形成了一个产物对硝基苯酚(pNP),剩余的醋酸离子与锌离子配合物结合;对硝基苯酚从活性位点释放后形成复合物6;最终一个质子通过质子桥(TS6/7)从氨基转移到醋酸根离子,导致复合物7的形成,同时生成里一个醋酸产物,并恢复原来的复合物1。同时F-Zn(Ⅱ)即使在5个循环周期后仍保持了99%的活性,且热重分析证明了F-Zn(Ⅱ)催化剂的另一个显著特征是其较高的热结构稳定性。

Chen等[30]研究了组氨酸环二肽与锌离子通过自组装作用构建了具有酯键降解能力的模拟酶,结构表明组装后的模拟酶是由纳米颗粒单体组装成的纳米线(图13),具有丰富孔隙,单晶的晶体结构分析表明属于斜方晶系(Pbcn),活性验证表明该模拟酶具有酯酶活性,而且其结构简单易于合成、稳定性高,机理研究表明羟基亲核攻击是催化循环的限速步骤。同时Liu等[14]利用单个组氨酸组成的不同长度是小肽序列经过自组装作用形成了纳米片层结构,活性验证结果表明其具有过氧化物酶活性,同时具有在多次酸性环境及加热循环处理后仍然具有良好催化活性。

3.1.7 具有多种催化功能的肽基模拟酶

Sarkhel等[51]基于共价催化理论利用来源于Aβ蛋白的片段LVFFA,构建了多个具有酯酶活性的β淀粉样纳米管模拟酶:Im-KL、Im-RL、Im-EL、Im-OL,其中Im-KL的活性最好([vi]Im-KL =5.6 μmol·L-1·min-1)。Chatterjee等[52]在此基础上发现HL能够较好地结合血红素(约血红素∶肽=1∶150),观测到Soret带的红移表明形成血红素-组氨酸复合物,圆二色谱观测到非手性的血红素的负考顿效应(negative Cotton effect)表明血红素与纳米管的手性表面结合。随后以2-甲氧基苯酚(2-methoxy phenol, MP)为底物的活性测定表明血红素-HL结合体(Hemin-HL)具有过氧化物酶活性,kc=14.5min-1。串联催化试验表明,hemin-HL能够催化2-甲氧基醋酸苯酯(2-methoxy phenyl acetate,MPA)先水解后被氧化的串联反应,尽管模拟酶的氧化速率比细胞色素C低了3倍以上,但是其串联催化活性是细胞色素C的6.8倍。为了研究氨基酸及纳米结构对催化活性的影响,构建了一系列的突变体Hemin-KL、Hemin-HE、Hemin-HHL,但是其催化活性均低于Hemin-HL,说明纳米管形貌对级联催化的重要性。HL与KL-组氨酸和CytC的水解率均为中等水平(分别为1.3倍和2倍)。因此,级联反应激活显著较高的原因可能是由于组氨酸暴露的HL纳米管中的通道的作用(图14)。

Mikolajczak等[18]设计了具有酯酶及碳酸酐酶(裂解酶、EC 4.2.1.1)催化活性的肽-金纳米颗粒偶联物(Pep-Au-NP),设计的肽序列中包含与金属表面结合区域、疏水活性位点区域和极性区域。其中Zn(Ⅱ)-Au@IHQ-NP的酯酶活性最高,kcat/KM为16.06。5次循环重复利用后的活性为初始活性的94%以上,说明该模拟酶具有很好的重复利用性。

3.2 肽键水解模拟酶

肽键是将氨基酸分子间的氨基和羧基脱水缩合而形成的化学键,是一种酰胺键。由于酰胺氮上的孤对电子对离域与羰基碳轨道重叠,因此酰胺碳氮与羰基氧之间发生共振作用(Resonance interaction),进而导致肽键稳定性很强。在生理条件下肽键的半衰期长达600年(图15),因此通过理性设计的方式构建能够降解肽键的模拟酶极具挑战[53]。而肽键的降解在研究蛋白质功能、蛋白质在溶液中结构、蛋白酶的活性位点、配体诱导的构象变化、金属结合位点的阐明、疾病的治疗等方面具有重要意义[54]。

除了天然酶以外,研究人员发现过渡金属配合物具有促进肽键水解的潜力,以活化的酰胺或氨基酸酯作为肽键模型研究金属离子对肽键的降解作用已有研究;锌金属配合物(Ⅱ)、铜(Ⅱ)、镍(Ⅱ)、钯(Ⅱ)、铈(Ⅳ)和锆(Ⅳ)等金属配合物被发现能有效促进肽和蛋白质中未活化的酰胺键的水解[54,55]。Gao等[56]构建利用小肽与多金属氧酸盐模拟天然胰蛋白酶成功构建了一种具有多种催化功能的模拟酶。天然胰蛋白酶的催化机理是活性中心丝氨酸的电负性羟基攻击底物中肽键的碳基的正电碳原子(限速步骤);组氨酸的咪唑基团作为广义碱稳定中间过渡态,并形成四面体结构;在新产生的氢键的帮助下,Asp的电负性碳基进一步稳定了所得到的His-H+;通过这种方式,反应过渡态被稳定,底物的肽键被水解(图16)。

研究表明多金属氧酸盐POMD(K6[P2W18O62], Wells-Dawson structure)可以抑制Aβ蛋白的聚集,通过特异性地结合Aβ蛋白的“histidine13-histidine-glutamine-lysine16(HHQK)”阳离子部位。POMD是带负电的,可以像天然丝氨酸蛋白酶中的活性带负电的羟基一样攻击肽键重点羰基碳原子;His在天然蛋白酶中的作用可以被富含His的七肽替代(N-His-Sar-His-Sar-His-Sar-His, Sar=sarcosine; 具有超氧化物歧化酶样活性),因此Gao等[56]尝试利用多金属氧酸盐和小肽的协同作用来模拟天然胰蛋白酶的活性;同时,7肽的超氧化物歧化酶活性随着金属离子(特别Cu2+)的螯合而增强;最后,POMD中丰富的电负性氧可以像类似于天然酶中的Asp氨基酸一样发挥作用(图17)。AuNPs用于促进七肽和POMD之间的电子转移,同时可以作为7肽及POMD的骨架;POMD可以接枝到AuNPs表面;7肽可以通过在N端添加半胱氨酸的方法固定在AuNPs表面,最终构成多功能模拟酶(AuNPs@POMD-8pep)。该模拟酶同时具有蛋白酶活性及超氧化物歧化酶活性;其中以BAPNA为底物测定酶的比活力为8.80×105 U·mg-1,远远大于相同条件下天然胰蛋白酶的比活力5.14×10U·mg-1。同时研究结果表明该模拟酶可以降解引起阿尔兹海默症的Aβ蛋白可用于该疾病的积极治疗。

Ikehara等[57]提出了生命起源与[GADV]-蛋白世界的假说,认为生命起源于蛋白质世界,是由于[GADV]-蛋白的伪复制(Pseudo-replication)形成的。Oba等[58]在寻找这一假说的证据时发现了[GADV]-P30具有类似酶的活性,可以催化牛血清蛋白的降解;进一步的研究发现不含有环二肽的[GADV]-随机八肽([GADV]-octapaptides with random sequences)具有催化降解牛血清白蛋白肽键的作用。

基质金属蛋白酶(MMPs)是一种锌依赖内肽酶,可以降解胶原蛋白、糖蛋白和蛋白多糖等,该类酶被认为是多种血管生成和肿瘤转移过程所必需的酶。日本Akizawa团队[59]开发了一种筛选MMPs分子伴侣小肽的方法,并且从1000多种肽中发现了22肽,JAL-AK22 (KYEGHWYPEKPYKGSGFRCI HI),该肽具有激活MMP-7的作用,但是并不清楚该肽是如何激活MMP-7;因此经过进一步的研究发现该肽具有催化自我水解活性;同时也能通过降解作用切割MMP的前导肽从而使其激活(图18)。作者验证了22肽是否能够降解一些人体内固有的蛋白质如人血清白蛋白等5种蛋白,结果的发现该肽并不能对这些蛋白产生降解作用。

后续研究发现该22肽的一个降解产物9肽,JAL-TA9 (YKGSGFRMI),具有和22肽相似的性质,即类似丝氨酸蛋白酶活性。同时又发现了一些和22肽和9肽同源的其他小肽同样具有类似活性。由于该22肽来源于Tob/BTG酶家族的保守序列区域;这些蛋白质在多种细胞类型中表现出抗增殖活性,参与了肿瘤发生的调控。因此验证了9肽是否能够降解引起AD的Aβ蛋白片段,经过验证发现,该肽能够降解Aβ蛋白的一些关键片段,作者认为这一发现具有重要的应用前景,可以用于制备治疗慢性神经退化疾病。

同时也研究该肽对引起帕金森病的关键蛋白的一些控制片段的降解作用,结果发现该肽具有同样的效果。因此来源于天然酶的一些片段,可能确实具有一些类似酶的功能,进而可以说明小分子肽,应该也具有类似酶的降解作用[60⇓⇓⇓⇓⇓~66]。经过初步分析推测这些小肽的催化机理是:9肽或者其他有类似功能的小肽,自身具有紧密的结构,而且自身的分子量较小,肽可以很轻松地进入到Aβ蛋白的内部,从而在其内部作用,将Aβ蛋白降解(图19)。

3.3 糖苷键水解模拟酶

糖苷水解,特别是纤维素(潜在燃料)由于其紧密的氢键网络和范德华力的相互作用很难水解[67],天然糖苷水解酶的作用机理如图20所示。由于糖苷水解酶中活性位点的复杂性,催化糖苷水解模拟酶的设计相对困难,尽管已经发现基于多金属氧酸盐(Polyoxometalates)[68]、环糊精[48]和碳纳米管[29,69]的模拟酶能够催化糖苷键的降解,但是目前已报道的利用肽基模拟酶催化糖苷键水解的模拟酶较少。

Liu和Wang等[70]利用肽组装策略,设计了一系列包含多个谷氨酸或者天冬氨酸的β折叠7肽,经过自组装后发现超过一半的肽具有纤维二糖的水解活性。研究结果表明对催化活性有重要影响因素分别是:(1)谷氨酸的数量;(2)小肽骨架的分子构象;(3)分子内氢键的分布;(4)羧基的负分子静电势区域;(5)对底物的空间位阻;(6)肽纳米纤维的晶体状态。He等[29]利用同质氧化石墨烯(GO)-肽纳米纤维混合水凝胶(GO-PNFs)设计了具有β-糖基水解酶活性的模拟酶,能够实现纤维二糖和纤维戊糖的高效降解。研究结果表明,氧化石墨烯-PNF对纤维二糖和细胞戊糖水解的高催化性能可能归因于肽纳米纤维结构的形成、最佳的分子构象和进入底物的空间位阻较小。同时,氧化石墨烯不仅可以作为附着肽纳米纤维混合水凝胶的平台,而且还创造了疏水微环境,促进了质子转移过程,这是催化水解的必要步骤,从而提高了催化活性。

4 肽基水解模拟酶的活性改善方法

自组装肽通过氢键、疏水和静电相互作用,能够形成特定的三维结构(淀粉样纤维结构、纳米颗粒、纳米纤维、纳米管、纳米球等),且在其小肽序列中嵌入具有催化活性的氨基酸(组氨酸、精氨酸、谷氨酸、丝氨酸、天冬氨酸),同时具有催化氨基酸的自组装小肽三维结构能够结合金属离子,从而实现催化活性的获得或者增强。因此肽基模拟酶具有催化活性三要素是:小肽自组装成特定三维结构、小肽序列中存在规律排布的催化氨基酸在组装后形成类似天仍酶的催化位点、金属离子结合在催化位点附近,辅助催化活性的形成或者增强催化活性[39](催化位点周围的配体影响Zn离子结合位点结合底物的亲和力,有助于组装肽的酶活性)。

肽基模拟酶与天然酶相比具有稳定性强、重复利用效果稳定的优势。Makam等[7]研究表明由苯丙氨酸+Zn离子构建的肽基模拟酶,再经过5次重复使用后仍然具有99%的活性,同时在经过200 ℃、300 ℃、400 ℃的条件下处理2 h后,与未处理样品比催化活性没有差异。Tan等[16]研究发现模拟酶AuNP@CDs-Azo-GFGH的催化活性再经过三次循环后基本保持不变。Li等[34]研究了塑化剂(DEHP)降解模拟酶(Co-HSD)的可重复利用性,结果表明经过5次循环后活性损失小于10%。

虽然肽基模拟酶具有诸多优势,逐渐成为生物催化领域的研究热点,有望在未来成为新一代的催化剂;但是目前肽基模拟酶的研究仍然处在初步探索阶段,存在较多问题需要克服,其中模拟酶的活性低是目前亟待解决的关键问题。根据目前已有的报道,改善模拟酶的催化活性的方法主要有以下几种。

(1) 优化活性氨基酸的排列位置。Baruch-Leshem等[71]证明了催化三联体残基沿着两亲性β链定位的顺序影响组装结构和催化活性。这项研究揭示了在设计催化两亲性组装中一个被忽视的因素,即构成活性位点的带电残基实际上参与分子间稳定相互作用,进而可能阻碍它们的催化作用。Guler等[38]认为组氨酸的位置和数量会影响构建的酯酶模拟酶的活性。

(2) 增强模拟酶与底物之间的亲和力。Sarkhel等[51]报道了交叉β淀粉样蛋白纳米管的共价催化。该模拟酶建立在短淀粉样肽组装的能力上,不仅作为高效的水解酶,而且还展示了共价催化等先进的特性。赖氨酸和咪唑类的微环境具有较高的底物亲和力,加速催化活性。

(3) 优化模拟酶与底物反应过程中的pH。Huang等[32]的研究发现,pH值(5~10)影响自组装肽纳米结构,pH依赖性构象与催化活性相关,在pH=10.0时催化活性最强。

(4) 利用共价键催化机理改善催化活性。Sarkhel等[51]利用催化剂和底物之间的共价键来放大催化速率,试验也表明赖氨酸和咪唑类微环境具有较高的底物亲和力,加速催化活性。

(5) 利用分子印迹法增强底物结合特异性和催化活性。Zhu等[21]利用丙烯酰胺、异丙基酰胺作为单体,利用模拟酶底物pNPA作为模板分子,利用分子印迹的方法,增强具有催化活性模拟酶SA-H底物特异性及催化活性。

5 肽基水解模拟酶的应用研究进展

肽基模拟酶利用天然酶的活性中心氨基酸及金属离子,通过小肽自组装模拟酶天然酶的结构,同时能够与纳米酶、印迹酶结合拓宽了模拟酶的构建方式,提高了模拟酶的催化活性,促进了模拟酶的实际应用。目前已有研究表明肽基模拟酶在治疗阿尔茨海默病[61]、降解塑化剂[72]、降解纤维素[29]、降解真菌毒素[73,74]等方面具有显著效果。同时由于肽基模拟酶与天然酶的高度相似,结构简单易于控制,克服了天然酶的瓶颈,使其未来在食品及化学工业、疾病治疗、有害物质降解、快速检测等方面拥有更加广阔的应用前景。

阿尔茨海默症是由于Aβ蛋白的聚集形成了淀粉样斑块进而伴随认知减弱,目前的治疗方式多数只能被动缓解该病症的进一步恶化,并不能真正清除淀粉样斑块的聚集以达到彻底的治疗目的。Hatakawa等[61]发现9肽ANA-TA9可以降解Aβ蛋白,同时对人体的其他常见蛋白没有降解作用;同时进一步试验表明ANA-TA9在给药后能够很好的突破血脑屏障,具有主动治疗阿尔茨海默症的潜能。He等[29]利用同质氧化石墨烯(GO)-肽纳米纤维混合水凝胶(GO-PNFs)设计了具有β-糖基水解酶活性的模拟酶,能够实现纤维二糖和纤维戊糖的高效降解,该肽基纳米酶给未来纤维素降解的潜在应用提供了新的思路。

Li等[72]依据丝氨酸蛋白酶催化机理构建了用于降解塑化剂(PAEs)的酶模拟,包括一个活性位点(SHD)、一个自组装多肽(LKLKLKL)、一个间隔区(GGG)和一个可聚合位点(DOPA),对细胞中DEHP的降解具有较高的降解活性。为了进一步提高DEHP的降解能力和适用性,用NaIO4氧化法将再生纤维素(RC)膜功能化形成醛基,然后通过席夫碱反应与酶模拟物偶联将模拟酶固定在再生纤维素(RC)膜上,可以实现以连续循环的方式降解DEHP。作为生物催化膜,该生物催化膜不仅能有效降解DEHP,而且具有良好的稳定性,为消除DEHP污染奠定提供了新的途径[34]。

Hu等[73]与Peng等[74]在研究微生物对赭曲霉毒素A(OTA)的降解时分别发现具有OTA降解活性的枯草芽孢杆菌CW14及短波单胞菌ML17中分子量小于3 kDa的未知物质具有OTA脱除活性(图23)。

通过初步的分离表征并结合目前已经发现:(1)微生物源的小分子肽种类丰富,功能多样;(2)来源于甲烷氧化细菌的小分子肽类物质(甲烷氧化菌素)具有拟酶活性;(3)来源于天然蛋白质的小肽片段(ANA-TA9)具有催化肽键降解作用;(4)基于小肽构建的人工肽基模拟酶能够模拟多种天然水解酶活性;初步推测这些活性成分可能是一些小分子肽类物质,并正在对这些小分子物质进行进一步的纯化及鉴定,由于小分子肽与天然大分子蛋白相比具有结构简单、易于控制、耐热性强、生物相容性好等诸多优势,这一发现在未来可能为真菌毒素的绿色安全脱除提供了新的思路。

6 结论与展望

肽基模拟酶是在模仿天然酶结构及催化机制的基础上,利用天然酶的活性中心氨基酸及金属离子,通过小肽自组装模拟酶天然酶的结构,并结合纳米酶、印迹酶等构建的新型超分子催化剂。肽基模拟酶具有催化活性三要素是:小肽自组装成特定三维结构、小肽序列中存在规律排布的催化氨基酸在组装后形成类似天仍酶的催化位点、金属离子结合在催化位点附近,辅助催化活性的形成或者增强催化活性。

肽基模拟酶在实际应用层面与天然酶及其他类型的模拟酶相比具有明显优势。其一,肽基模拟酶的催化机理及活性中心与天然酶最相近,随着对天然酶结构及催化机理的深入研究,肽基模拟酶是未来最有望替代天然酶的模拟酶。其二,肽基模拟酶的主要构建材料是小分子肽,与天然酶一级结构一致,但是氨基酸数量少,结构简单,降低了酶固有的结构复杂性,克服了天然酶结构复杂难以控制的瓶颈。其三,肽基模拟酶通过小分子肽的自组装作用形成的纳米结构更加稳定,在多次重复利用后仍能保持原有催化活性,更加绿色节约,同时克服了天然酶在高温下容易变性失活的瓶颈。其四,肽基模拟酶能够与其他多种类型的模拟酶结合,实现优势互补,增强了对酶功能特性的控制。最后,小分子肽具有良好的生物相容性,与大分子蛋白相比在人体内不易引起免疫反应,在疾病治疗领域有巨大优势。

在理论研究层面,肽基模拟酶的发现与对天然酶的结构及催化机理的研究相辅相成;诸如丝氨酸蛋白酶的催化三联体氨基酸(丝氨酸、天冬氨酸、组氨酸)及其他活性中心氨基酸的分子催化机理发现,是构建肽基模拟酶的基础;同时利用活性中心氨基酸构建的肽基模拟酶具有催化活性,也为验证天然催化机理提供了证据;此外,肽基模拟酶的发现,证实了仅有几个氨基酸小分子肽序列,能够自发结合及组装,同时具有催化功能;而已有研究表明单个氨基酸在一定条件下可以自我复制形成小肽序列[23],这说明在地球生命诞生以前的没有中心法则存在的环境中,具有催化作用的小分子肽依然可以形成,并有可能自我进化,这为研究酶的起源乃至生命的起源提供新的思路。

虽然肽基模拟酶具有多方面优势,拥有广阔的应用前景,但受限于对天然酶结构及催化机理的研究,以及小分子肽组装与控制等的研究,关于肽基模拟酶的研究仍然处在初步探索阶段,也存在一些问题需要解决。首先,目前已经报道的催化水解反应的肽基模拟酶仅实现了对典型酯键、糖苷键、肽键等化学键的降解,涉及的可催化底物种类少、结构单一,因此更多的针对特定底物的肽基模拟酶亟待开发,不断拓展肽基模拟酶可催化底物范围。其次,肽基模拟酶的催化活性与天然酶相比偏低;需要在不断深入研究天然酶催化分子机理,小肽结构控制的基础上优化模拟酶的设计,迭代更新,提高肽基模拟酶的活性。最后,肽基模拟酶底物特异性偏低;主要受限于对小肽组装结构的控制,不能完全模拟出天然酶的结合特定底物的活性空穴,需要开发更多方法(如印迹法)提高模拟酶的底物特异性。虽然目前存在诸多问题,但是随着越来越来的研究人员的不断努力,这些问题在未来会迎刃而解,使肽基模拟酶在食品及化学工业、疾病治疗、有害物质降解、快速检测等领域得到广泛的应用。

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基金资助

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山东省自然科学基金项目(ZR202102260301)

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