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人造细胞的化学构建及其生物医学应用研究

蔡雪儿 ,  简美玲 ,  周少红 ,  王泽峰 ,  王柯敏 ,  刘剑波

化学进展 ›› 2022, Vol. 34 ›› Issue (11) :2462-2475

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化学进展 ›› 2022, Vol. 34 ›› Issue (11) :2462-2475 DOI: 10.7536/PC220308
综述
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人造细胞的化学构建及其生物医学应用研究

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Chemical Construction of Artificial Cells and Their Biomedical Applications

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摘要

人造细胞是模拟生物细胞结构,人工构建的与细胞功能相近的微米囊泡。人造细胞的构建主要有两种模式:自上而下模式主要利用生物学方法对生物基因序列进行重新设计,获得具有细胞类似结构功能的人造细胞;自下而上模式主要利用化学方法采用非生命物质构筑简化的细胞结构模型。自下而上化学模式构建的人造细胞大多只包含执行所需功能的最小单元,具有简单的细胞仿生的结构与功能。本文详细综述了人造细胞的构建模式以及化学构建人造细胞的常见类型,包括脂质囊泡、蛋白体囊泡、聚合物囊泡、凝集体液滴和胶体囊泡等,总结了人造细胞在分析传感、细胞结构与功能模拟、生物载体转运、微纳米反应器、疾病诊疗方面的生物医学应用现状。

Abstract

Artificial cells are micro-vesicles that are artificially engineered to possess some structures and functions, similar to biological cells. There are two approaches for fabricating artificial cells. The top-down approach mainly makes a kit in biological methods to redesign and modify biological gene sequences to create artificial cells, and the bottom-up approach mainly adopts chemical methods to prepare protocell models from non-living matter. Here we review in detail towards the different chemically constructed artificial cells, including lipid vesicles, proteosomes, polymersomes, coacervate droplets and colloidosomes. Taken together, this minireview unravels an update on recent efforts in biomedical applications of artificial cells over a broad range of analytical sensing, cell structure and function simulation, biological cargo delivery, micro-nano reactors, and disease diagnosis and treatment.

Contents

1 Introduction

2 Construction of artificial cells

2.1 Top-down approach

2.2 Bottom-up approach

3 Classification of chemically constructed artificial cells

3.1 Lipid vesicles

3.2 Proteosomes

3.3 Polymersomes

3.4 Coacervate droplets

3.5 Colloidosomes

4 Biomedical applications of artificial cells

4.1 Simulation of cell structure and function

4.2 Analytical sensing

4.3 Transport of biological carriers

4.4 Micro-reactors

4.5 Diagnosis and treatment of diseases

5 Conclusion and outlook

Graphical abstract

关键词

人造细胞 / 自下而上 / 化学构建 / 生物医学应用

Key words

artificial cells / bottom-up / chemical construction / biomedical applications

引用本文

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蔡雪儿, 简美玲, 周少红, 王泽峰, 王柯敏, 刘剑波. 人造细胞的化学构建及其生物医学应用研究[J]. 化学进展, 2022, 34(11): 2462-2475 DOI:10.7536/PC220308
Xueer Cai, Meiling Jian, Shaohong Zhou, Zefeng Wang, Kemin Wang, Jianbo Liu. Chemical Construction of Artificial Cells and Their Biomedical Applications[J]. Progress in Chemistry, 2022, 34(11): 2462-2475 DOI:10.7536/PC220308

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1 引言

人造细胞是人工构建的具有生物细胞类似结构与功能的简化的微腔室结构。1964年,加拿大McGill大学Chang首次提出了人造细胞的概念[1],其构建了具有生物相容性的半透膜,用于包裹组织细胞。目前人造细胞[2,3]的定义有许多种,广义的角度来看,包括模仿细胞设计的具有某些细胞特性(表面特征、形状或一些特定功能等)的工程体系,也包括具有细胞结构的细胞模拟物。人造细胞作为简化的模型,将有利于细胞结构与功能的机制研究;人造细胞有助于建立非生物物质与生物细胞之间的联系,建立非生命系统与生命系统之间的桥梁,为生命起源相关研究提供实验与理论依据。同时,人造细胞有望增加或者强化细胞的某种结构与功能,作为微反应器,“细胞工厂”应用于生物制造,在细胞工程、生物医学工程等方面得到广泛应用。

细胞具有生命力特征,从生物学的角度来看,描述一个“具有生命力”的体系,意味着其可以进行自我维持、自我繁殖、进化和死亡,但已知的最简单的生物体也非常复杂,这使得合成“具有生命力”的人造细胞十分困难和具有挑战性。细胞主要有三方面的特征:(1)腔室结构。稳定的半透膜包围着细胞里各种成分,保护它们不被外部环境破坏,也能对膜内外物质进行选择性的物质运输和能量转换。(2)遗传物质。脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)携带遗传信息,转录与翻译后有助于细胞进化。(3)反应代谢。为细胞提供能量,使其进行自我维持、自我更新以及自我处理信息的一系列代谢途径。这三个特征赋予了生物细胞的“生命力”。虽然迄今为止还没有创造出具有活细胞所有基本特性的人造细胞,但这是人造细胞研究努力的目标[4⇓⇓~7]。

2 人造细胞的构建

目前构建人造细胞主要有两种基本模式,分别是自上而下和自下而上。自上而下模式是从具有生命特征的有机体开始,采用生物技术,将基因组剥离到维持细胞生命基本属性所需的最低数量的基因,或者用合成的基因组完全取代原有基因组。相反,自下而上的方法则是从头开始,采用化学的途径,通过组装非生命物质来构建具有细胞类似结构与功能的人造细胞。

2.1 自上而下构建模式

自上而下的人造细胞构建侧重于通过减少或简化活细胞的基因组来构建“最小细胞”[8]。“最小细胞”指的是一种理论上的细胞,它只有执行最基本的生命功能(即生存)所需的最低数量的基因。“最小细胞”的研究有望加深对生命活动基本过程的理解。

1995年,文特尔等[9]发现寄生细菌生殖道支原体只有517个基因,这是已知的最简单的生物体之一。如此小的基因组激发了科学家开发“最小细胞”的灵感。实验发现将非必需基因剔除以检查细胞的生存能力时,当有256~350个基因就足以维持一个细胞的生命。随后,在2004年,Gil等[10]重新定义了影响细胞生存活力的最小基因数量。通过实验和计算发现维持活细菌细胞功能的最小基因数目可以减少到206个基因。在这206个基因中,仍有许多基因控制部分非必需功能,这意味着基因数量还可以进一步减少。2010年,文特尔研究所的研究人员以及合作者[11]应用基因组最小化和工程生物学工作流程构建了包含最简单生命系统的生物体,设计了功能性合成基因组,构建了包含最简单生命系统的人造细胞JCVI-syn1.0,同时可以驱动该人造细胞的繁殖。2016年,Hutchison等[12]再次降低基因组复杂性以构建几乎最小的活菌JCVI-syn3.0。2021年,Pelletier等[13]发现JCVI-syn3A有19个基因没有保留在JCVI-syn3.0中且其形态变异明显低于JCVI-syn3.0,并利用反向遗传学方法确定了19个基因中有7个是恢复正常形态所必需的并影响“最小细胞”的分裂。

合成生物学使大型DNA序列的构建成为可能。这些化学合成的基因组提供了合成具有自我复制能力的新细胞所需的遗传信息。这将有助于了解最小单元的细胞生命,而且在生物技术领域具有潜在的应用价值。

2.2 自下而上构建模式

自下而上模式是通过组装一系列非生命物质来构建人造细胞。2005年,Science杂志社在庆祝创刊125周年之际,公布了125个最具挑战性的科学问题。其中,生命起源,地球生命如何产生列为最具挑战性的科学问题之一。细胞腔室模型的形成标志着生命的产生。由非生命物质“合成”类生命体,驱动非生命物质组装合成类生命物质,并模仿生命体的行为特点来驱动非生命物质的运动和相互作用,是启动“非生命物质创造生命”的关键步伐。细胞是生命的基本组成单元,由非生命物质“合成”人造细胞,构建细胞原始模型,将为生命起源研究提供相应的理论基础,并为理解生命起源本质提供重要指导。自下而上化学构建人造细胞,作为人造细胞模型的种类繁多,比如美国哈佛大学Szostak教授发展了脂肪酸囊泡结构,俄罗斯科学家Oparin提出凝集体液滴的人造细胞结构模型。英国Mann院士等在阳离子肽/聚电解质和三磷酸腺苷(ATP)形成的凝集体微滴表面自组装脂肪酸膜,提出了一种新的含膜人造细胞模型。短链或长链阳离子肽(低聚赖氨酸、聚赖氨酸)或合成聚电解质(聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDDA))与带负电的单核糖核苷酸即ATP或寡核苷酸和多核糖核苷酸的混合物的二元组合,在低于临界囊泡浓度下添加油酸钠会形成膜结合的凝集体微滴[14]。肽(如聚-L-赖氨酸(pLys)和ATP[15]、含有阳离子和芳香族残基的肽与ATP[16]、化学物质驱动的肽和RNA[17])可以自下而上自发形成复杂或简单的凝集体液滴,氢键、π-π堆积和静电相互作用等使凝集体液滴内部相对疏水并导致许多分子的浓缩,吸收和浓缩各种溶质可以用于进一步反应。凝集体液滴可以通过浓缩反应物、降低反应屏障或稳定中间体或产物来提高小分子和大分子的反应速率。如果这些反应可以由化学物质驱动,会使凝集体液滴具有类似生命的行为,如生长运动和分裂等。人造细胞的功能细胞周期中,DNA复制和分离可以与细胞生长和分裂完美地结合在一起[18]。

自下而上制备的人造细胞成分确定,结构相对简单,允许在一个简单的环境中独立地研究细胞生物学的特定方面,便于实现对生物变量的控制,而不受活细胞的干扰[19]。自下而上模式中的人造细胞在基础生物学领域非常重要,可以对简单的代谢途径或酶等进行生物学研究,可以作为生物反应器,作为可编程的微隔室并根据需要合成多种药物或化合物,可以进行信号通路的重建[20,21],作为生物传感器[22,23],用于代谢工程[24⇓~26],用于生产病毒[27]等。自下而上构建的脂质体人造细胞缺乏细胞表面受体,具有较低的免疫原性,不会引发强烈的免疫反应,比细胞递送系统具有更大的优势,更有利于药物递送和原位药物合成。从零开始构建一个满足生命多种需求的自我维持的人造细胞,可以利用微流控技术不断提高人造细胞在大小、结构、划分程度、隔间之间的连通性、膜组成、分子组成、内部体积与含量方面的控制水平[28⇓⇓⇓~32]。自下而上构建人造细胞将增强对生命系统中基本物理和化学过程的理解,将在微反应器的智能自主开发方面得到潜在应用。本文将主要介绍自下而上构建的人造细胞类型及其生物医学应用。

3 化学构建人造细胞的分类

自下而上化学构建的人造细胞,具有结构简单、功能相对单一等特征;根据成分和结构的不同进行了划分,包括有脂质囊泡[33,34]、蛋白体囊泡[35]、聚合物囊泡[36,37]、凝集体液滴[38⇓~40]和胶体囊泡[41]等(图1)。

3.1 脂质囊泡

脂质囊泡是指由脂质双分子层包裹微液滴构成的腔室囊泡。脂肪酸和磷脂是两种具有代表性的脂质分子。游离脂肪酸具有亲水性头部和疏水性尾部,在pH为中性的水中可以自发组装形成双分子层,以减少疏水性尾部与环境中水的接触[47]。引入不同链长的脂肪酸,可以降低临界聚集浓度,增强囊泡的热稳定性,甚至可以在强碱性、高温和高盐条件下形成囊泡[48]。脂肪酸的酰基链越短,形成囊泡所需的浓度越高,其热稳定性越低,渗透性越高。

磷脂是目前比较常见的细胞膜类脂质,存在于细胞膜和膜包围的胞内细胞器中[49⇓~51]。酰基链和头基大小不同的磷脂分子,其自发曲率也有所不同,膜静电能驱动带电脂类成型并控制相应的百分比[52],渗透压的变化也可以进一步控制囊泡膜及囊泡的裂变[53],囊泡膜的融合还能诱导腔室内的级联酶反应。脂膜是一种流体结构,会经历不断的合成、重塑、分裂和融合[54]。Han等[55]总结了磷脂不同的组装方式,包括管状(图2a)、锥体(图2b)、双胞体(图2c)、囊泡(图2d)和池堆(图2e)等,并介绍了这些磷脂组件在人造细胞中的应用,包括使用池堆状的磷脂组件模拟细胞器,用重组膜蛋白模拟细胞膜的功能并利用蛋白质合成的新陈代谢途径(图2f),采用磷脂构建的囊泡模拟细胞遗传信息的分裂(图2g),具有高阶层次结构的磷脂囊泡在人造组织中的应用(图2h)。基于非球形磷脂的人造细胞器具有结构类似于真实细胞器的优点,利用磷脂自组装构建的形状类似中国古币的人造细胞器的直径和方形边缘与圆盘直径的比例可以通过不同的乙醇含量、磷脂浓度和冷却速度来控制,进一步模拟高尔基体、粗面内质网等[56]。在油脂混合物中制备油包水乳状液,随即加入两相系统,磷脂单分子层可以在上油相和下水相之间的界面上形成。在溶液中,磷脂等成膜分子通常会自组装成多层洋葱状结构。因此,尽管自组装过程可以形成纳米级的单层磷脂囊泡,但需要通过液滴或表面的支撑来构建磷脂囊泡[57]。

大多数人造细胞是薄层状的磷脂囊泡,根据其制备方式的不同,分为多层和单层囊泡。单层膜的磷脂囊泡是最接近真实细胞细胞膜的。磷脂囊泡也可根据直径大小进一步分为大于1000 nm的巨型囊泡(GUVs)、100~1000 nm的大型囊泡(LUVs)和小于100 nm的小型囊泡(SUVs)。GUVs、LUVs和SUVs可以用来模拟真核细胞、胞内细胞器和病毒的膜。如图3所示[58],目前制备磷脂囊泡的方式主要有挤压法、电场法、液滴在不同相中转移形成方法和微流控技术。如图3a所示,挤压法是制备囊泡最常见的方法,将脂质膜与含水缓冲液水合可以产生分散体,通过冻融循环和聚碳酸酯过滤器可以使其更均匀并形成单分散的单层囊泡。如图3b所示,电铸是产生GUV和多泡囊泡(MVV)的一种简单且广泛使用的方法,在沉积于两块氧化铟锡(ITO)板之间的脂质水合膜上施加交流电,交变电场会使水进行垂直于电极表面的周期性电渗运动,形成蘑菇状结构后继续生长直到囊泡从表面分离。如图3c所示,通过界面单层将脂质单层包裹的油包水油滴转移到水相中可以形成GUV。该过程主要由重力驱动,其中液滴负载有致密的内部溶液,可以通过色谱柱下沉,也可以使用离心力或显微操纵器物理驱动液滴通过界面,常用来设计不对称的GUV并控制尺寸分布。如图3d所示,单分散和不对称的GUV可以通过使用水/油/水(W/O/W)双重乳液作为模板来设计囊泡,使用平面膜作为起点来产生囊泡,然后使用流体脉冲射流来夹住囊泡,但产率较低。磷脂囊泡对离子高度不渗透,而小的中性分子如水和甘油可以自由进出。通过将嵌段/接枝共聚物、小分子表面活性剂、纳米粒子和聚合物偶联物引入双层膜中来提高磷脂囊泡的柔韧性、强度、渗透性和稳定性。在磷脂囊泡表面镶嵌如离子通道、ATP酶、质子泵等来模拟真实细胞生理活动和行为等。磷脂囊泡和脂肪酸囊泡相比而言,由于磷脂分子(含有两个连接在甘油上的脂肪酸链)比脂肪酸分子更趋向于严格地聚集在一起,因此磷脂分子形成的双分子层结构更稳定,渗透性更差。磷脂囊泡群体的空间几何形状可控,化学通讯可定向[59]。目前磷脂囊泡在靶向药物递送[60]、生物反应器[61]和生物传感器[62]等领域被广泛研究。

3.2 蛋白体囊泡

蛋白质分子因其固有的生物相容性,生物降解性和生物功能性而成为构建人造细胞模型的重要材料。蛋白质囊泡作为人造细胞模型的显著特征在于其简便的设计和多样的功能性[63]。由于自然界中存在数百万种不同结构功能的蛋白质,使用蛋白质作为结构单元将为人造细胞的设计与构建提供丰富的原料库,该原料库具有复杂的动态结构和生物催化功能。迄今为止,已开发出多种方法来构建蛋白体,主要包括聚合诱导法、自组装方法、逐层技术、W/O界面自组装方法、膨胀或挤压方法等。如图4所示,是采用聚合诱导法制备蛋白体囊泡,在牛血清白蛋白(BSA)存在下,N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)的热分散聚合过程中,脱水的PNIPAM链与BSA可以发生疏水相互作用,形成空心蛋白体,NIPAM在溶液中的均相聚合向蛋白质体中的非均相聚合转变,其形成是可逆的[64]。要构建蛋白质微囊结构,应有效地执行水溶液中某些两亲性蛋白质的直接自组装[65]。Mann等[66]报道了基于两亲性蛋白质-聚合物纳米共轭物自发界面组装的具有蛋白质囊泡结构的人造细胞模型。这种弹性隔室是半透性的,对温度敏感且具有酶促活性,使其成为人造细胞构建的良好模型。此外,该蛋白体膜也非常坚固。它可以承受部分脱水和再水化,并在70℃的温度下保持90 min的结构完整。该蛋白体可以作为一种人造细胞模型,用于研究嗜热酶的微观限制或开发能够进行温度循环程序,如聚合酶链式反应(PCR)介导的捕获性遗传聚合物扩增的人造细胞。

3.3 聚合物囊泡

聚合物囊泡是由两亲性聚合物分子形成的双层或单层中空球体。如图5a所示,采用的高分子聚合物可以是二嵌段共聚物、三嵌段共聚物或接枝共聚物[67]。二嵌段共聚物具有一个亲水性和一个疏水性结构域,可自组装成双层结构。三嵌段共聚物和接枝共聚物之间有两个亲水性结构域和一个疏水性结构域,可组装成单层结构。聚合物囊泡的制备方式和磷脂囊泡类似,也可通过微流控等技术制备。但聚合物的分子量更高,形成的囊泡比磷脂囊泡的机械性能更好[68,69]。与脂质囊泡相比,聚合物囊泡具有较高的物理和化学稳定性,容易通过调整聚合物的化学结构来调整其化学和物理属性(例如电荷、刺激响应性和膜厚度)。溶质可渗透的聚合物囊泡是纳米反应器或纳米工厂在药物递送和人造细胞方面的结构性隔室。如图5b所示,Akiyoshi等[70]开发了一种基于温度响应性麦芽三糖-b-聚(N-n-丙基甘氨酸)自组装的溶质可渗透聚合物囊泡,是由自组装聚合物双层膜包裹的纳米级至微米级球形微囊组成。由热响应性聚合物组成的两亲共聚物可以用来制备溶质可渗透的囊泡,起到纳米反应器的作用,具有高的分子转化效率。电荷是决定溶质渗透性的最重要因素,因此阴离子染料基本上不会透过膜,具有良好亲和力和电中性溶质可以有效地渗透,阳离子染料最容易渗透。

3.4 凝集体液滴

凝集体液滴是指高浓度的生物分子基于多重相互作用(静电相互作用、疏水作用、π堆积和氢键作用等)发生液液相分离形成的一种致密性液体状凝聚物。也可以由聚电解质和胶体粒子形成,得到具有独特性质的凝集软质相。两种带不同电荷的聚电解质混合后可能自发形成这种大分子富集的液滴,凝集体液滴粒径在纳米级或者微米级,看似像乳浊液但并不需要表面活性剂等稳定分子。

2015年,英国皇家科学院院士Mann发展了凝集体液滴的人造细胞概念,液液相分离形成的凝集体液滴,可以作为最简单的细胞腔室结构,执行最简单的生化反应与生命活动。构建凝集体液滴的物质的范围已经从蛋白质和多糖扩展到多聚核苷酸、合成高分子、表面活性剂、纳米颗粒等。其应用范围也从最初水处理等范围扩展到了微纳米反应器、水下黏合剂和细胞模型等细胞生物学领域。由液液相分离形成的凝集体液滴主要具备以下几个特征。(1)分子富集能力,凝集体液滴对分子的富集能力可以体现在水处理方面的应用。Valley等[71]探索了一种基于凝集体液滴的废水处理新方法,其利用由两性离子聚电解质和阴离子无机聚金属氧酸盐纳米团簇形成的大离子凝聚络合物从废水中提取亚甲基蓝染料和其他阳离子工业染料,其效率可以在1 min内达到近99%的去除率,并且通过Fenton氧化法对凝聚物进行漂白,实现凝集体液滴的重复使用。(2)凝集体液滴对负载物具有保护效应,将不稳定的酶或者药物封装在凝集体液滴内部,可以与外界环境隔离开来,保护其不受外界环境的影响。(3)液体流动性,通过液液相分离形成的凝集体液滴具有流动性和变形性,可以体现在凝集体液滴之间可以相互融合。(4)反应调控作用,可以将两个不相容的级联酶反应分隔开来,使其相互之间不受干扰且高效地进行。

如图6所示,由两种带相反电荷的聚电解质水溶液的自发液液相分离形成的分散在水中的水滴,是富含聚电解质的致密相[72]。简单肽和核碱基的混合可以形成核苷酸凝集体液滴。生物相关的核苷酸凝集体液滴在温度高达85 ℃、pH值在2~10之间的环境中是稳定的,并且能够随着pH循环诱导凝集体的可逆生长和分解,在拥挤的内部富集酶和纳米颗粒而不丧失功能。凝集体液滴是无膜的,容易形成,具有高黏度、生物分子的选择性包封、动态行为如溶质的聚合和交换以及响应环境刺激的适应性反应等特征,其形成和分解会受到聚电解质的混合比、浓度、电荷密度和一些环境刺激(如pH、光、离子强度、温度等)的影响[73⇓~75]。调节聚电解质的电荷密度或基质中的离子强度,可以控制复合凝集体液滴的动态组装[76]。

3.5 胶体囊泡

如图7所示,胶体囊泡是由Pickering乳状液滴转化而来的内部中空的纳米颗粒囊泡,纳米颗粒可以稳定胶体囊泡中的液体[77]。胶体囊泡包封的材料可以被释放,其释放速率由紧密堆积的颗粒外壳的性质决定。其渗透性主要取决于壳中颗粒间间隙的大小,可以通过改变颗粒的尺寸来调节渗透性并应用于制药、食品和化妆品等行业中。利用微流控技术制备胶体囊泡时可以利用模板精确控制其形状、大小和结构。胶体囊泡的属性由纳米颗粒决定,纳米颗粒通过粒子间相互作用组装成胶体囊泡。胶体囊泡的选择性和渗透性取决于纳米颗粒形成的孔径大小。可以通过利用不同大小、形状、表面性质和功能不同的纳米颗粒控制胶体小泡的渗透性、弹性和功能。纳米颗粒的形状可以是球形、棒状、片状或板状,形成不同形状的胶体小泡。尽管纳米颗粒不像磷脂分子一样能形成类似细胞膜的结构,但其可用于研究细胞行为或者作为微反应器等[78]。

以上阐述的人造细胞是单一类型的囊泡结构,由多种物质形成的具有多种类型囊泡特征的称为杂合囊泡[79]。比如,将嵌段聚合物/接枝共聚物与磷脂结合形成的囊泡,既具有磷脂囊泡的流动性和生物相容性,又具有聚合物囊泡的机械/热稳定性,且囊泡的渗透性增强。将肽引入磷脂囊泡后,由于肽的生物相容性更强,这可以提高人造细胞的生物相容性,并且由于其构象随pH改变而发生改变,可以作为释放物质的触发器。混合的双层膜的孔隙度、渗透性、曲率以及与其他细胞膜相互作用的方式决定了杂合囊泡的功能[80⇓~82]。如图8所示,Liu等[83]将两性磷脂分子二棕榈酰基卵磷脂(DPPC)自组装在DNA/DEAE-dextran液液相分离形成的凝集体液滴表面,发展了一种含磷脂双层膜结构的内部大分子拥挤的人造细胞新型模型——凝集体巨型囊泡,内部为具有液液相分离特性的凝集体,提供了大分子密集的腔室环境,外膜为双层磷脂膜,提供了具有尺寸选择性的膜通透性结构,对于分子量低于4 kDa的物质具有膜渗透性。液液相分离的凝集体液滴为生化反应的进行提供了类似细胞的生物大分子密集腔室环境。

4 人造细胞的生物医学应用

4.1 细胞结构与功能的模拟应用

人造细胞作为稳定且可控的细胞模型,为细胞的生物机制研究提供了简化的结构模型,可以作为细胞功能特征的模拟。例如,利用人造细胞模拟真实细胞生长和分裂[84]、聚合酶链反应[85]、RNA聚合[86]、蛋白质合成[87]、体外转录和翻译[88]以及细胞间相互作用[89]等。

下面介绍几种对细胞结构与功能的模拟:(1)物质运输。物质运输有主动和被动运输以及刺激-响应运输。细胞为了在动态的环境中维持生命,需要一种具有选择性渗透的边界,它不仅可以保留细胞里的重要成分,同时还可以与外界环境进行物质和能量交换。嵌入离子通道、离子载体和受体的半透膜通常用作细胞膜模拟物。Gaitzsch等[90]将质子泵镶嵌在由不对称三嵌段聚合物(PEG-PDPA-PSS)形成的聚合物囊泡上构成了一个简化的细胞模型,这个模型中质子在光照下从膜外传输到了囊泡的内部,模拟了真实细胞膜上质子的传输。Sacanna等[91]设计了一种人造细胞,是可以重现活细胞的主动运输功能的具有单个微孔的无机中空微胶囊。该人造细胞采用一种聚合物构建物质可控进出的红细胞大小的球形细胞膜模拟物,膜上钻的纳米孔可以模拟细胞中进行物质交换的蛋白质通道。通道内添加的可被光激活并进行相关化学反应形成真空环境的固体光催化剂,可在光激活时捕获周围不同环境中的物质如固体颗粒、杂质、乳液液滴和细菌等,在停止光照时在细胞膜内反应,该过程还可以逆转并模拟废物排出过程。(2)细胞生长和分裂。细胞自我复制最少需要两个基本组成部分,即自我复制的基因组和可以生长与分裂的腔室。Ting等[92]利用脂肪酸囊泡比磷脂囊泡更具渗透性和稳定性的特点,在脂肪酸和其他表面活性分子的环境中,通过融合其他脂肪酸囊泡或与囊泡内部物质相互作用进行融合生长,从而模拟了真实细胞的生长过程。(3)细胞融合。融合是细胞间和细胞内活动的重要组成部分,模拟细胞的融合构建的人造细胞融合模型中有电荷驱动和纳米颗粒介导的两种细胞融合情况。如图9所示[93],Bolognesi等利用金纳米颗粒(AuNP)介导的囊泡融合模拟了细胞的融合过程。通过生物素/链霉亲和素连接物将150 nm AuNP附着在囊泡的外表面上,当这些粒子进入激光焦点时,它们吸收的能量以热的形式消散,温度急剧升高,在高时空分辨率下实现了融合。向一个囊泡中加入钙黄绿素染料,向另一个囊泡中加入荧光标记的脂质(Rh-PE),证明了两个囊泡的融合。(4)DNA、RNA和蛋白质合成。为了模拟细胞的遗传功能,将各种各样的生物大分子封装在人造细胞里进行DNA复制、RNA聚合和蛋白质合成等反应。其中研究得最多的是PCR和体外转录和翻译(IVTT)。Nies等[94]在磷脂囊泡中模拟了Φ29病毒复制周期。(5)细胞间相互作用。利用人造细胞作为细胞模型模拟细胞间的相互作用。Qiao等[95]利用含有凝集体液滴和蛋白质聚合囊泡通过静电相互作用模拟了细胞的掠食行为,为研究人造细胞间相互作用提供了一种策略。如图10所示,Han等[96]利用超声平台制备GUV或红细胞(RBC)的均匀阵列或GUV/RBC的杂化构件。使用声学驻波压力场将GUVs和RBCs群体在空间上组织成扩展阵列。在不同的杂交微阵列中,含有葡萄糖氧化酶的GUV和具有过氧化物酶活性的红细胞之间的两步酶促级联反应可以实现化学信号转导,模拟了细胞间的相互作用。GUV对葡萄糖的摄取产生内源性H2O2信号,该信号被转移到RBC并被处理,H2O2和Amplex Red通过RBC膜的扩散从而输出红色荧光。

4.2 分析传感应用

人造细胞力求具有感性响应特征,在构建智能响应的微型生物传感器方面具有潜在应用[97]。人造细胞可以通过扩散化学信号、电信号、机械信号等相互通信,这些信号可以被合成的、可激活的传感路径识别和处理,人造细胞之间可以通过混合通信系统进行物质交换与代谢,并感知其他人造细胞的位置信息等。

因此,人造细胞可以利用各种信号传递过程相互交换信息并感知其环境,进行环境监测、食品检测、生理健康监测等。人造细胞生物传感模式大多结合蛋白质基因表达技术,设计并利用人造细胞来感知外界分子并启动基因编码的反应,包括高度调节的天然和合成膜成分,高度受控的遗传编码分子传感器,以创建一个独立的传感环境[98⇓~100]。这些传感器通常利用膜孔的蛋白质表达来响应信号分子,从而促进与活细胞和人造细胞的通讯[101]。

van Hest等[102]开发了一种人造细胞群落之间的仿生通信途径,如图11所示,作为发送者的人造细胞将ATP转化为腺嘌呤核糖核苷酸(AMP),AMP变构激活受体人造细胞中的酶级联反应以产生还原型辅酶I(NADH),NADH是重要的合成代谢产物,在此专门用作成功通讯的荧光报告基因。由于NADH是参与大量同化反应的重要能量富集代谢产物,因此可以扩展该平台以在接收器内产生各种功能响应。作为接收器的人造细胞可以通过信号放大步骤将来自作为发送器的人造细胞的弱信号转换为强响应,这有助于信号在人造细胞群落内的长距离传播,有效地远距离发送信号。Ces等[103]研究一种能感知外界环境的人造细胞,通过激活人造细胞内部构建的信号通路,实现对外界的化学信号感知并做出反应。实验结果表明,构建的人造细胞可以感知环境中的钙离子并以发光的形式做出响应,有望开发出能追踪肿瘤标志物或检测环境中重金属的人造细胞。Zhang等[104]将无细胞表达(CFE)与基于聚合物的水相两相系统(ATPS)相结合,产生了可用于检测的含有转录和翻译机制的无膜人造细胞,在多个人造细胞中,每个人造细胞执行不同的传感反应,可以排列在同一微孔中,以在化学上检测来自同一样品的多个目标。在冻干和再水化后仍能保持功能,并可视化读数,可作为最小的多分析物检测工具。

4.3 生物载体的转运应用

对于体积太大或亲水性太强而不能通过扩散渗透细胞膜的物质,如核酸、蛋白质、多肽、药物、探针和纳米颗粒等,可以利用载体促进其在体内的递送[105]。载体可以保护运载的物质不受外界环境的干扰且能靶向释放。人造细胞中的双层囊泡能与细胞膜融合直接将运载的物质在细胞内部释放。通过对载体进行修饰和功能化,促进特定的吸收和内吞作用。

一个理想的人造细胞载体需要一个门控系统来有效地装载、保护、递送和按需释放环境敏感的物质。小干扰RNA (siRNA)为癌症等疾病提供了高度选择性和有效的药物,但其血浆寿命短、细胞摄取差和细胞内运输不顺畅。cNGQGEQc肽功能化的可逆交联嵌合聚合物(cNGQ/RCCPs)可以介导Polo样激酶1特异性siRNA (siPLK1)高效靶向递送至裸鼠的原位肺肿瘤[106]。cNGQ/RCCPs由可生物降解的聚(乙二醇)-b-聚(三亚甲基碳酸酯-co-二硫杂环戊烷三亚甲基碳酸酯)-b-聚乙烯亚胺(PEG-P(TMC-DTC)-PEI)不对称三嵌段共聚物和(cNGQ-PEG-P(TMC-DTC))二嵌段共聚物共同自组装而成,可以高效负载siRNA至内腔避免其体内降解,延长其循环时间,提高其肿瘤累积、选择性和有效载荷在细胞质的释放速度,增强α3β1过表达的A549肺癌细胞的有效摄取,从而有效治疗携带原位A549人肺肿瘤的裸鼠。不平衡条件对由聚阴离子(羧甲基葡聚糖(CM-Dex)、三磷酸腺苷(ATP))和聚阳离子(聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDDA)、聚-L-赖氨酸(pLys))等形成的复杂凝集体液滴的生长、分裂和融合等机制的影响已被广泛关注[107,108]。一种基于凝集体液滴的可在全水环境中依赖接触的选择性捕获客体原始细胞的人造细胞模型被开发,可触发的膜动力学与分子拥挤的内部腔室环境相结合,有望在药物递送方面有进一步的应用[109]。

如图12所示,Du等构建了由嵌段共聚物聚(环氧乙烷)-嵌段-聚[N-异丙基丙烯酰胺-7-(2-甲基丙烯酰氧基乙氧基)-4-甲基香豆素-2-(二乙氨基)甲基丙烯酸乙酯]和[PEO-b-P(NIPAM-stat-CMA-stat-DEA)]自组装而成的双重门控聚合物囊泡,证实了siRNA和质粒DNA的成功包封[110]。有效的体外和体内基因转染以及来自绿色荧光蛋白(GFP)编码质粒的GFP的表达,说明这种具有双门控系统的聚合物囊泡可以作为用于基因递送。温度控制的“登机门”可以在室温下打开,在水溶液中直接将siRNA和质粒DNA封装到聚合物囊泡中。“下机门”可以通过质子海绵效应触发细胞内释放。

4.4 微纳米反应器的应用

细胞可以精确地控制高效和高选择性的生物催化反应并产生复杂的分子,其原因是细胞腔室化结构将底物和催化性酶封装在一个又一个隔间里,将不同的反应进行空间分离。腔室化的现象在生物体中普遍存在,甚至最小的病毒,都存在腔室化结构。典型的细胞膜是由两亲分子自组装形成的双层膜。在许多细胞中发现构成细胞膜的磷脂分子的体积非常小,因此构成的膜是流体状的、柔软的,是细胞融合、出芽和分裂的基础。细胞膜作为细胞内容物和外界环境的屏障,进行选择性物质交换。更重要的是,多重和分层腔室的划分允许不同的过程互不干涉和协调地进行,腔室化是所有生物的基石。基于此,科学家在人造细胞里尝试构建生物催化级联反应,将人造细胞作为微反应器。如Tan等[111]将葡萄糖氧化酶(GOx)和辣根过氧化物酶(HRP)组成的级联反应固定在人造细胞中(图13),该人造细胞包含隔离的区室,不同的酶被固定在不同的区室,区室中可以发生级联酶促反应,以高效率得到产物,实现工程化的串联反应。使中间产物过氧化氢高效递送至下一步反应,利用葡萄糖触发的不相容的级联反应产生的羟基自由基的高细胞毒性,实现以葡萄糖为动力杀死癌细胞的目的。

4.5 疾病诊疗应用

细胞功能的障碍可能引起疾病,采用人造细胞代替功能障碍的真实细胞,有望拓展人造细胞的诊疗应用。糖尿病的产生原因之一是β-细胞胰岛素分泌功能发生障碍,基于此,Gu等[112]构建内部与外部环境隔绝的双层脂膜人造细胞。在人造细胞群体外环境加入设计好的胰岛素载体。当血糖水平上升时,这些载体的表面就会发生变化,促使它们与人造细胞的外膜融合,人造细胞释放胰岛素,该种人造细胞有望应用于糖尿病的治疗。

内皮细胞一氧化氮持续供给不足是心血管疾病产生的原因之一,基于此,Liu等[113]设计和构建了生物衍生的红细胞膜包被的凝集体囊泡的人造细胞模型,具有高血液相容性和延长血液循环时间的功能。如图14所示,Liu等基于红细胞膜碎片和凝集体液滴易同化的特性,将来自于真实细胞的细胞膜与凝集体液滴相结合,含有血红蛋白的红细胞膜碎片自发组装在含有GOx的聚多糖聚核苷酸凝聚微滴表面,形成治疗性人造细胞。利用空间隔离的酶编程空间偶联的GOx/血红蛋白级联反应,在葡萄糖和羟基脲存在的情况下,构建的内部分子拥挤的人造细胞通过内源性H2O2信号介导一氧化氮释放。体外和体内实验均证实了一氧化氮介导的血管扩张,该工作有望应用于高血压等心血管疾病的治疗。对该人造细胞进行表面修饰或在植入性的医疗装置中固定该治疗性人造细胞,可能有助于血管舒张相关药物的安全递送以及将药物递送到特定的疾病部位,用于相应疾病的诊疗。

5 结论与展望

人造细胞是联系非生物物质和生命物质的桥梁,作为一种简化的细胞模型,由于其结构简单、性能稳定,模拟真实细胞的结构与功能,在细胞生物学研究、生命起源研究以及生物医学工程领域都得到了广泛关注。人造细胞主要有两种构建模式,分别是自上而下和自下而上,虽然采用方法不同,但共同的目标都是为了构建生命系统。自下而上化学构建人造细胞是人造细胞模型构建的主要途径。腔室化是生命系统的基本属性,脂质囊泡、蛋白体囊泡、聚合物囊泡、凝集体液滴和胶体囊泡是目前广泛研究的化学构建的人造细胞模型。人造细胞在细胞结构与功能模拟、新型生物传感器、生物载体转运、微纳米反应器、疾病诊疗等生物医学领域展现了巨大的应用潜力,有望开发出能追踪或检测生物体内外或环境中特定物质的人造细胞检测器,更接近真实细胞结构与功能且可动态调节的人造细胞,更高效、独立和靶向性更强的治疗性生物递送载体,功能集成化的多腔室人造细胞微反应器等。未来有望将自上而下的工程学方法和自下而上的合成生物学方法结合起来,在复杂功能化、全新调控途径的设计方面实现新的飞跃。功能化人造细胞在微纳生物载体、微反应器生物工程、在智能生物分析传感和疾病治疗方面都具有广阔的应用前景。

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基金资助

国家自然科学基金项目(22177032)

湖南省杰出青年基金项目(2021JJ10013)

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