基于二氧杂环丁烷骨架的化学发光探针发展和应用研究

傅安辰; 毛彦佳; 王宏博; 曹志娟

doi:10.7536/PC220731

化学进展 ›› 2023, Vol. 35 ›› Issue (2) :189-205 DOI: 10.7536/PC220731

综述

扫码查看或转发全文

基于二氧杂环丁烷骨架的化学发光探针发展和应用研究

傅安辰 ¹ ,
毛彦佳 ² ,
王宏博 ² ,
曹志娟 ¹^,^*

作者信息 +

Development and Application of Dioxetane-based Chemiluminescent Probes

Anchen Fu ¹ ,
Yanjia Mao ² ,
Hongbo Wang ² ,
Zhijuan Cao ¹^,^*

Author information +

文章历史 +

摘要

光学分析法具有无损、实时和空间分辨能力的特点,是研究疾病发生、发展和诊疗的一种重要技术手段,包括荧光、生物发光和化学发光(CL)。近年来,以金刚烷稳定的二氧杂环丁烷为骨架的化学发光探针(AD-CL)获得关注。该探针不但具有无需激发光源,可避免光漂白、光毒性,灵敏度较高的CL法传统优势;且具有检测体系简单,无需氧化剂的参与,可在生理条件下发光等特点。最近,经过进一步的结构优化与改造,AD-CL骨架探针在生理条件下的发光性能大幅提升,在物质检测、光学成像等领域中的应用越来越广泛。本文综述了AD-CL探针的发光原理以及最新的研究进展,主要分为两部分:AD-CL探针的优化与改造策略以及AD-CL探针在不同物质检测的应用。

Abstract

Optical analysis is non-destructive, real-time with a specific spatial resolution, which has been developed as an essential technology to study the occurrence, development, diagnosis, and treatment of diseases. It contains fluorescent (FL), bioluminescent (BL) and chemiluminescent (CL) methods. Among them, CL probes with an adamantane-dioxetane chemiluminescence (AD-CL) scaffold attracted much attention. Recently, significant improvement on these probes has been achieved with the elimination of external light source, low phototoxicity, high sensitivity, and a facile system without additional reagents, such as oxidants. Until now, the CL probes were further developed with special modifications and new synthesis routes based on the AD-CL scaffold, realizing the detection and optical imaging of various biomolecules in living systems with enhanced properties. Herein, the recent research progress on AD-CL probes has been reviewed. The review is divided into two parts. The first part will mainly introduce the molecular modification strategy of AD-CL probes and the second part will focus on their application in several cases.

Contents

1 Introduction

2 Modification of AD-CL probes

2.1 Intramolecular modification of AD-CL probes

2.2 Supramolecular modification of AD-CL probes

3 Application of AD-CL probes

3.1 Application on small molecules detection

3.2 Application on macromolecules detection

3.3 Application on pathogenic and drug-resistance bacteria detection

3.4 Other application

4 Conclusion and outlook

Graphical abstract

关键词

二氧杂环丁烷 / 化学发光 / 探针 / 分子设计 / 光学成像

Key words

dioxetane / chemiluminescence / probes / molecular design / optical imaging

引用本文

引用格式 ▾

傅安辰, 毛彦佳, 王宏博, 曹志娟. 基于二氧杂环丁烷骨架的化学发光探针发展和应用研究[J]. 化学进展, 2023, 35(2): 189-205 DOI:10.7536/PC220731

Anchen Fu, Yanjia Mao, Hongbo Wang, Zhijuan Cao. Development and Application of Dioxetane-based Chemiluminescent Probes[J]. Progress in Chemistry, 2023, 35(2): 189-205 DOI:10.7536/PC220731

登录浏览全文

4963

注册一个新账户忘记密码

1 引言

分子中的基态电子吸收能量被激发至激发态,当其回到基态时会产生电磁辐射,即产生发光现象^[1]。化学发光(Chemiluminescence, CL)的激发能量储存在分子内部,在发生特定的化学反应时释放,产生发光现象。常见的CL体系包括过氧草酸酯、鲁米诺等,通常以过氧化氢触发氧化反应,产生CL^[2]。与基于生物体内特殊的酶(虫萤光素酶)和底物(虫萤光素等)产生的生物发光(Bioluminescence, BL)^[3],以及基于光激发产生的荧光(Fluorescence, FL)不同,CL方法既不需要酶相关基因的转染和酶底物的递送,也不需要外界光源的激发,因此可避免自体荧光、光散射等影响^[4,5],具有操作简单、成本低、背景低、灵敏度高等优点,在药物、环境、临床和食品检测等领域具有广阔的应用前景。

大多数CL体系发光需经过以下两个步骤:第一步,通过氧化反应生成一个不稳定的高能中间体;第二步,高能中间体分解生成激发态物质,当其回到基态时产生CL^[6]。大多数的CL反应依赖于氧化剂的参与,且需要在偏碱性环境中进行。因此,多数CL体系无法直接应用于体内分析,而多用于体外监测生物体中某些氧化物的变化或参与反应的相关物质,不能在生理条件下应用,应用范围有限。

二氧杂环丁烷化学发光探针具有相对简单的检测体系。重要的是:引入金刚烷稳定探针结构,以类苯酚结构为检测基础,最终构成金刚烷-二氧杂环丁烷(Adamantane-Dioxetane Chemiluminescence,AD-CL)的探针骨架,可以实现对包括氧化物在内的其他物质的检测,应用范围广。近年来,随着研究者对AD-CL探针研究的深入,其在探针设计、物质检测、生物成像等领域,特别是在生理条件下的应用得到了巨大的发展。本文综述了AD-CL探针的研究进展,包括对于AD-CL探针分子的改造、超分子改造及其对各种检测对象的具体应用。

2 基于二氧杂环丁烷骨架的化学发光探针分子改造

1963年,White等^[7]发现萤火虫的发光机制涉及到一个二氧杂环丁烷的化学结构,此结构不稳定,会自发分解生成激发态的羰基结构,当其回到基态时,伴随着BL现象的产生。受到此机制的启发,研究者们合成了一系列基于二氧杂环丁烷结构的物质,这些衍生物在室温下非常稳定,但是其CL进程难以控制并且发光效率较低,应用受到限制^[8]。1982年,Schaap等^[9]首次发现了二氧杂环丁烷衍生物的一种特殊的发光途径。这类衍生物的结构特点在于:二氧杂环丁烷结构与金刚烷相连变得更为稳定,再与一个含掩蔽基团的类苯酚结构相连,形成金刚烷-二氧杂环丁烷(AD-CL)的发光体系。起初,AD-CL和被保护的酚羟基结构位于苯环的对位,之后发展了两者处于间位的衍生物。研究发现,该结构具有较高的量子产率。如图1所示,在AD-CL骨架分子的基础上,于酚羟基保护基团位置设计目标分析物的识别结构,当目标分析物与之反应时,保护基团离去,酚氧负离子裸露,随即通过化学反应触发的电子转移发光(Chemically Initiated Electron Exchange Luminescence,CIEEL)进程进行分解,生成激发态的苯甲酸酯结构,当其回到基态时发出蓝光^[9]。按照此设计思路,Schaap等^[9]合成出了一系列AD-CL探针,用于检测氟化物、酯酶。但是,这些AD-CL探针在生理条件下的应用仍然受到很大的限制:(1)发光强度较低,在以水溶液为基质的生理环境中溶解度差;(2)发射波长较为单一,且无法达到近红外,不利于生物组织的成像应用。近年来,研究者们针对上述不足,提出了一系列改进方式,进一步拓展了AD-CL探针的应用范围。

2.1 AD-CL分子内部结构的改造

AD-CL结构产生CL现象的核心在于一个苯甲酸酯激发态中间体的生成。研究者们对AD-CL分子结构的改造与修饰主要有三种方式,如图2所示:(1)引入吸电子基团,增大其在水溶液中的溶解性能和发光性能;(2)引入长共轭基团,延长发光波长,以至于近红外区;(3)引入苯氧基,缩短产生发光信号的时间,快速检测。以上策略从发光强度、生理条件发光效率以及响应时间方面,提高了AD-CL探针的化学发光性能,有利于增强检测灵敏度和组织穿透性,拓展其在生物检测中的应用。

首先,如图2A所示,在苯环上引入吸电子基团(Electron withdrawing group,EWG),如丙烯酸、丙烯酸甲酯、丙烯腈等,可以有效增大该结构的CL强度^[6]。同时,在酚羟基的邻位引入卤素原子,如氯原子(Cl),可以有效增加探针的光稳定性,并且降低其pK_a值,增大激发态中间体在生理条件中(pH约为7.4)的解离程度,从而有利于探针在体内的应用^[10,11]。

其次,研究者将长共轭基团,如近红外小分子共价连接至AD-CL结构,通过增加AD-CL结构的共轭程度,延长CL波长(图2B),有利于成像分析的组织穿透性。具有丙二腈结构的近红外荧光小分子(DCMC)可共价连接至酚羟基对位或邻位,有特定化合物引发的发射波长分别在690和700 nm的化学发光^[12]。Huang等^[13]将该近红外小分子结构中的氧原子(O)分别替换成硫原子(S)和硒原子(Se)后,得到CL波长分别为760和780 nm的相应探针,由于CL波长红移,光信号将更容易穿透生物体,这将有利于组织水平上的生物检测与成像。为了调节CL的波长,如图2B所示,研究者将不同的荧光基团,如荧光素、醌-花菁(QCy),通过连接基团共价连接至酚羟基间位,当待测物引发CIEEL进程时,生成的激发态苯甲酸酯中间体通过能量转移(Energy transfer, ET)将能量传递至荧光基团,使其受激至激发态,当其回到基态时,即发射出对应荧光团的发射波长的光^[14]。

再次,研究者提出,具有快速响应待测物特征的AD-CL的构建将有利于提高检测的灵敏度和体内应用的实时监测能力。由于光子能够在较短的时间内释放,其信噪比(Signal/noise, S/N)将更高,灵敏度增强;而响应时间的缩短,有利于实时反应体内生物分子的浓度变化。研究者在酚羟基邻位吸电子基团引入苯或酚氧基(图2C),发现可增加酚氧负离子自由基的稳定性从而产生更快速的化学激发,有利于提高光子释放速度^[15]。然而,需要指出的是,根据应用目的的不同,对于化学发光速率的要求不同。若需要快速响应生物分子的实时变化,则需接触目标分子后立即发光,持续时间不能太长。若需要长时间监测生物分子,反应速率过快,极有可能错过成像的窗口期,不利于体内成像的应用。因此,可以长时间发光的探针将更有优势。

此外,通过增加分子中AD-CL单元的数量,使得多个发光信号的累积,达到增大CL强度的目的。例如,将两个AD-CL分子通过连接基团连接,当化学反应触发保护基团离去时,能够得到两个苯甲酸酯激发态中间体(图3A),发光信号因叠加而增强,研究者将其应用于检测氟化物和过氧化氢^[16,17]。随后,进一步设计成“多米诺”式的信号放大体系(图3B),多个AD-CL结构通过酯键相连。保护基团离去时,暴露酚氧负离子,继而引发“自分解式”消除反应,生成多个苯甲酸酯激发态中间体结构,大幅度提高了发光信号强度^[18]。

AD-CL探针的化学发光性能和结构中与金刚烷-二氧杂环丁烷部分结合的芳香环密切相关,而目前的探针大多以间羟基苯甲醛为起始原料,后续的化学修饰在此结构基础上进行,因此只能采用苯环,这就限制了具有不同化学发光特性的AD-CL探针的发展;此外,通过现有的方式得到AD-CL探针母核,通常需经历约七步的化学反应,且个别反应条件较为苛刻,例如-78 ℃的Wittig-Horner反应,合成步骤较为繁琐,产率也有待提高。最近,研究者开发了一条全新的AD-CL合成路线,首先通过Stille交叉偶联反应实现不同芳基的卤化,该卤化芳烃再与锡烷-烯醇醚化的金刚烷通过一步反应相连,最后在单线态氧的条件下生成AD-CL^[19]。通过此策略,研究者实现了各种卤化的芳基或具有共轭结构的母核与功能化金刚烷基团的相连,发展了一系列具备不同化学发光波长、量子产率和发光强度的AD-CL探针,极大地丰富了探针的种类。同时,这一简化的合成步骤,也为加快新型探针的合成以及探索其应用提供了一种高效的使用方式。

综上所述,近年来研究者对AD-CL分子结构做出的修饰与改造,提高了CL强度,延长了CL波长,加快了CL反应速率,使AD-CL探针更适用于生理条件下、生物组织中物质的检测与成像。基于分子内部结构的探针研究仍有较大的发展空间,在进一步的研究中。

2.2 基于超分子形成的结构改造

研究者不仅仅对单个AD-CL分子的结构进行改造,还设法引入其他分子,与AD-CL元件产生相互作用,可以进一步改善AD-CL分子的发光性能,包括增强信号强度、增强稳定性、延长信号持续时间。

由于AD-CL分子光信号与水分子的猝灭相关,可在体系中加入表面活性剂,营造疏水的环境,减少水的猝灭效应,进一步增强CL信号。例如,Gnaim等^[6]在体系中加入了表面活性剂-荧光染料复合物。如图4A所示,市售的Emerald Ⅱ,由聚合物和祖母绿染料组成,可通过自组装形成胶束,这将有利于苯甲酸酯激发态中间体向荧光染料传递能量,荧光染料受激后发射出相应波长为540 nm的光。整个过程无需外来光源,仅涉及到体系内部CL能量的转移,最终达到增强发光信号的目的。

AD-CL探针还可以与β-环糊精(β-CD)进行组装,构建超分子化合物体系,可有效增强该结构在水溶液中的发光强度(图4B)。Shabat课题组^[20]将AD-CL探针与β-CD按1∶1形成主客体复合物,在水溶液中,CL强度比原先提高了约60倍。研究者进一步对该超分子化合物体系进行了改造:将荧光素共价修饰至β-CD上,AD-CL探针与该荧光素-β-CD结构可形成1∶1的主客体复合物,当保护基团与待测物反应离去,启动CIEEL进程后,激发态苯甲酸酯的CL能量将转移至β-CD表面修饰的荧光素上,荧光素受激后发射相应的波长,发光强度比原先提高了约1500倍。

近年来,研究者将同时具有亲水性与亲油性结构组成的两亲性分子与AD-CL体系相结合,构建了一系列基于纳米共沉淀的新型超分子CL体系。一般而言,AD-CL小分子和(或)发生能量转移的荧光受体分子被包裹在亲脂疏水的核内部,亲水性的外部具有良好的水溶性,通过共沉淀的方式形成纳米粒以构建超分子体系,可以将AD-CL分子和其他荧光分子收敛聚集在纳米尺度内,AD-CL分子与周围的荧光分子之间距离靠近,可有效地进行能量传递,通过化学发光能量转移(CRET),提高CL波长。降低背景的同时,还可以增强组织穿透能力(图4C)。Ni等^[21]通过将AD-CL分子前体与具有聚集诱导发射(Aggregation-Induced Emission AIE)和两亲性的荧光分子TPE-Ph-DCM通过纳米共沉淀的方式制备得到纳米粒。对该纳米粒进行光照后,TPE-Ph-DCM将产生单线态氧¹O₂,使前体分子转变为具有双氧桥的AD-CL结构,该结构可自发降解,启动CIEEL进程,此时,CL能量将转移至TPE-Ph-DCM,TPE-Ph-DCM受激发射出大于650 nm的光。该体系不仅可延长发光波长,前体分子的设计使得双氧桥在光照TPE-Ph-DCM时才能产生,一次白光照射,可持续激活发光分子,发光信号可以持续10天以上,有望用于手术导航。上述AD-CL结构的自发降解过程也可以通过加热的方式实现,Andronico等^[22]采用纳米共沉淀法将AD-CL结构与荧光两亲性物质CN-PPV包裹入纳米粒中,因为该AD-CL结构稳定性较好,当温度上升至110 ℃时,才会产生降解,启动CIEEL进程,此时CL能量通过Förster共振能量转移(Förster Resonance Energy Transfer,FRET)转移至荧光物CN-PPV,相应发射波长约640 nm。同样地,基于化学发光共振能量转移(Chemiluminescence Resonance Energy Transfer,CRET)策略,Cui等^[23]设计出三种具有不同发射波长的半导体两亲性聚合物SP,分别为PFPV、PFBT和PFODBT,将其与

O 2 · -

敏感的AD-CL结构及PEG-PPG-PEG的共聚物通过纳米共沉淀法制备得到SPNRs纳米粒,

O 2 · -

可以启动CIEEL进程。通过CRET效应,苯甲酸酯激发态中间体将能量转移至半导体聚合物上,三种半导体聚合物受激发射出相应的波长,分别为540、540和700 nm。

综上所述,研究者采用表面活性剂、环糊精和具有两亲性的聚合物等,探究了AD-CL分子与其他分子之间的相互作用,构建了超分子AD-CL发光体系,增加了其在生理条件下的CL强度,红移了CL波长并可延长发光持续时间。多样化的超分子结构的构建还将进一步改善AD-CL的发光性能以及体内过程。

3 基于二氧杂环丁烷化学发光探针的应用

研究者们对AD-CL体系作出的一系列卓有成效的改造,推进了该探针在物质检测,特别是生理条件下生物相关物质检测以及生物组织成像领域中的应用。下面将从不同分析物类型的角度,介绍AD-CL骨架的化学发光探针近年来的典型应用实例。

3.1 小分子的检测

生物体内的多种生物活性小分子是非常重要的功能物质,参与细胞信号传导等生理过程,可以作为分子指标用于疾病的诊断与治疗^[24,25]。这些活性小分子主要有活性氧、活性氮和活性硫,包括过氧化氢(H₂O₂)^[12,26,27]、单线态氧(¹O₂)^[28,29]、次氯酸(HClO)^[30]、硝酰基(HNO)^[31]、过氧亚硝基(ONOO^-)^[32]、半胱氨酸(Cys)^[33]、谷胱甘肽(GSH)^[11,26]等。设计能够特异性响应于活性小分子的基团作为AD-CL探针的保护基团,不仅可用于它们的特异性测定,还对评估疾病状态、药物治疗效果具有辅助作用。

¹O₂是一种参与细胞信号传导的小分子^[34],与线粒体膜通透性^[35]相关,可用于肿瘤光动力疗法^[36]。2017年,Shabat课题组^[28]设计并合成出第一个用于检测单线态氧¹O₂的AD-CL探针SOCL,检测原理如图5A所示:当¹O₂存在时,SOCL可以激活二氧杂环丁烷探针的自发降解,产生CL。为了增强SOCL的细胞膜穿透性,研究者对该结构进行了细胞穿膜肽CPP的修饰,得到探针SOCL-CPP,能够用于光动力疗法中¹O₂水平的检测。Yang等^[29]设计并合成出检测¹O₂的探针CL-SO,能够产生700 nm位于近红外波长处的CL,有利于增强探针在生物组织水平中¹O₂的检测与成像能力。

硝酰基(HNO),又称亚硝酰基,是一氧化氮的单电子还原产物,具备显著的生物活性,可用于治疗心血管疾病。An等^[31]设计并合成可用于定量检测HNO的探针HNOCL-1(图5B),由于该探针能够快速响应HNO(20 min内信号达到最大),因此能够实时监测活细胞内HNO的水平变化。

半胱氨酸(Cys)属于生物硫醇小分子,在生理病理进程中扮演重要的角色,包括氧化还原、信号转导、重金属解毒等,Cys的水平异常与许多疾病相关,如类风湿性关节炎、帕金森、阿尔茨海默病等,Cys的缺乏会导致造血功能障碍、白细胞减少、银屑病等,张新荣课题组^[33]设计并合成特异性检测半胱氨酸的AD-CL探针CL-Cys(图5B),检测原理如下:敏感基的丙烯酸酯结构可与Cys发生Michael反应,环化后自离去产生酚氧负离子,启动CIEEL进程,产生CL信号。该探针对Cys的检测具有很高的特异性,对谷胱甘肽、同型半胱氨酸基本无响应,并且该探针可在小鼠皮下成像内源性Cys。

生物硫醇参与生物体氧化还原反应,与癌症、阿尔茨海默病等相关^[37,38],本课题组以经典的硫醇反应敏感分子——2,4-二硝基苯磺酰氯(DNBS)为识别基团,设计并合成了用于检测生物硫醇的AD-CL探针——SHCL(图5B)和NCCL,两者主要区别在于是否具有氯取代结构^[11]。研究发现,对比NCCL,具有氯取代结构的探针SHCL具有较低pK_a值,能够在体外较宽的浓度范围内、肿瘤细胞内、肿瘤组织中反映生物硫醇的水平,进一步验证了氯取代对于AD-CL探针的重要性。

除了以上生物活性分子之外,AD-CL探针还可用于其他离子和分子的测定。氟离子过量会导致氟骨症或DNA损伤等^[39],Turan等^[16]设计并合成可用于检测氟离子的AD-CL探针(图5B),以叔丁基二甲基硅醚作为识别基团通过二羟甲基苯酚连接两个AD-CL,待测物氟离子与之反应后,暴露出酚氧负离子,可释放两分子的AD-CL,比单个AD-CL产生的光强更高,氟离子的检测灵敏度更高。甲醛是一种食品和环境中常见的有害化合物,在人体内通过多种代谢和表观遗传过程也可产生,Shabat课题组^[40]设计并合成可用于裸鼠体内内源性甲醛分子检测的AD-CL探针——CFAP540与CFAP700(图5B)。其中,带有DCMC近红外基团修饰的CFAP700可发出波长为700 nm的近红外光,组织穿透性更强,有利于生物体成像,但是其细胞透膜性不如具有丙烯酸甲酯取代的CFAP540,因此两者在细胞成像中各有优势。

AD-CL化学发光前体的预累积,再集中激发,将有利于瞬时发光强度的提升,从而获得高亮度的体内生物成像结果。例如:Zhang等^[41]开发了一种“dual-lock”响应探针,探针不含有双氧桥结构,在体内生物分子作用下,产生一个稳定的AD-CL化学发光前体,在病灶部位积累,随后外加光激发促进自由基反应原位生成大量不稳定的双氧桥产物,经过CIEEL过程,释放高强度的化学发光信号。与传统的“one-lock”相比,亮度提高了460倍,对于生物成像应用具有重要意义(图5C)。但是,该研究直接将探针注射入裸鼠的皮下瘤内,而实际应用可能需进一步和靶向基团修饰联用,可达到真正意义上的病灶部位积累的目的。

3.2 大分子的检测

生物大分子,特别是生物体内各种蛋白酶,如组织蛋白酶B、硝基还原酶、乙酰胆碱酯酶和成纤维细胞激活蛋白等,承担着重要的生理功能,其活性水平与疾病的发生与发展密切相关,同时也可以作为药物作用的靶点。发展快速、准确、灵敏的检测或成像技术,对于临床疾病指标的测定、生物标志物与疾病关系的研究、疾病治疗评估、推进诊疗一体化,具有重要意义。AD-CL的检测体系较为简单,仅需在待测物样品中,加入对应的检测探针即可,为临床快速诊断提供了新的方式,研究者探究了其在某些临床疾病指标中的检测应用情况。

1987年,Schaap等^[42]首次将AD-CL探针用于生物大分子碱性磷酸脂酶(ALP,与骨骼疾病、肝炎以及前列腺癌等多种疾病相关^[43])的检测(图6B),该探针仅被用于体外碱性条件下碱性磷酸脂酶的测定。由于该探针在生理条件下(pH=7.4)发光较弱,很难在生物体内应用。

2016年来,随着AD-CL探针中引入吸电子基团,生理条件下的发光性能大幅度提高,被应用于各种生物酶的检测。NAD(P)H:醌氧化还原酶-1(NQO1,与细胞癌变密切相关^[44]),研究者设计三甲基对苯醌结构保护酚氧基的探针^[45],用于体外、细胞测定以及荷瘤裸鼠肿瘤成像分析。酪氨酸酶(Tyrosinase)与黑色素瘤相关,将间羟基苄醇通过连接基团与AD-CL骨架相连,可用于体外测定酪氨酸酶^[46]。乙醇氧化酶(AOX,用于合成^[47]及分析测试领域^[48]),研究者^[49]利用AOX能够催化甲醇生成H₂O₂的特性,进行探针结构设计,可以间接测定AOX。γ-谷氨酰转肽酶(GGT)是一种细胞膜结合蛋白酶,可维持细胞GSH和Cys的稳态,血清GGT活性的测定是临床血液常规检查,可用于诊断肝脏和阻塞性胆道疾病,An等^[50]将AD-CL探针的识别基团设计成可供GGT剪切的γ-谷氨酸结构(图6B),用于测定GGT,该探针能够在体外及活细胞内高灵敏地响应GGT,并且能够准确反映脂多糖小鼠血清中升高的GGT水平,为临床血清检测GGT提供了新的方法;进一步地,研究者还探索了探针在尾静脉注射后实时成像荷瘤裸鼠GGT活性水平的能力,用于指示裸鼠皮下肿瘤的位置。值得一提的是,研究者第一次尝试利用AD-CL单分子探针溶液体系,在裸鼠的血液循环系统中成像皮下瘤的能力——单分子的AD-CL首先聚集在肝肾部位,随后可转移至皮下瘤位置,通过设置成像观察时间,可避免肿瘤部位的成像干扰。由于供氧和消耗不平衡,通常会造成实体肿瘤的缺氧环境,硝基还原酶(NTR)是生物体中具有代表性的还原酶之一,是缺氧的常见生物标志物,广泛用于评估肿瘤缺氧程度^[51]。张新荣课题组^[52]以4-硝基苄基结构作为AD-CL探针的保护基团(图6B),缺氧环境中,NTR在辅助因子烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的存在条件下,将4-硝基苄基结构还原为相应的4-羟胺苄基,随后通过1,6-重排消除反应引发CIEEL进程,产生CL。该探针可以可视化测定体外及内源性NTR,并且可成像、实时分析肿瘤移植小鼠的缺氧状态。乙酰胆碱酯酶(AChE)可降解硫代胆碱产生巯基化合物,受此启发,本课题组^[11]将所设计的用于测定生物硫醇的探针SHCL扩展用于检测AChE。AChE以碘硫代乙酰胆碱为底物,将其水解,生成具有亲核性的硫醇物质,可以与探针SHCL进一步反应,从而产生CL信号(图6B),研究发现,探针SHCL可在体外、动物组织、人血浆中测定AChE,是一种快速的AChE分析方法。

AD-CL探针的识别基团不仅可以特异性响应体内蛋白酶生物标志物,借此探究蛋白酶与疾病之间的关系。另外,识别基团的水溶性可改善AD-CL探针的生理条件下发光性能以及细胞膜透过性能。因此,许多亲水性基团,如氨基酸、肽链、聚乙二醇(PEG)的引入进一步改善了AD-CL探针的性能,并进一步拓展它们在疾病诊断和成像分析方面的潜力。氨肽酶N(Aminopeptidase N,APN)被证明与肝损伤和癌症等多种疾病相关,最近,本课题组^[53]发展了一种用于检测APN的探针APN-CL,该探针的保护基团被设计为可被APN特异性识别并剪切的亮氨酸结构,从而能够在体外高灵敏度地选择性检测APN,并且能够响应人血浆中、肿瘤细胞内和荷瘤裸鼠肿瘤部位的APN活性。组织蛋白酶B(Cathepsin B)在胰腺癌干细胞样细胞中高表达,与癌症相关^[54],Shabat课题组^[55]利用Cathepsin B可特异性识别并剪切缬氨酸-瓜氨酸(Val-Cit)中瓜氨酸羧基端的特性,将含Val-Cit肽段的基团通过连接基团——对氨基苄醇,共价连接至AD-CL结构上,设计出可以检测Cathepsin B的AD-CL探针(图6B)。当待测物剪切肽段后,连接基团自发进行1,6-消除过程,得到酚氧负离子结构,从而启动CIEEL进程,最终产生CL。为了改善探针的水溶性及细胞透膜性,研究者还对探针的保护基分别进行了两种结构修饰:一是将探针中缬氨酸N端的苄氧羰基(Cbz)替换为聚合度为17的PEG结构;二是引入马来酰亚胺连接基团,用于连接半胱氨酸-甘氨酸-赖氨酸-精氨酸-赖氨酸(CGKRK)肽段,该肽段包含三个带正电荷的残基,可以增加水溶性,用于改善探针的细胞膜通透性和肿瘤靶向性。所有的探针对Cathepsin B均有响应,其中搭载了多肽片段的探针具备更好的细胞膜穿透性、更高的发光强度和检测灵敏度。由于Cathepsin B在癌细胞中过表达,应用该探针对癌变细胞RAW 264.7(白血病相关)、CT26(结肠癌细胞)和3T3(鼠纤维细胞)进行成像,发现仅癌细胞有光信号产生,证明了探针可以在细胞水平上可视化检测Cathepsin B,并能够区分癌细胞与正常细胞。成纤维细胞激活蛋白(Fibroblast Activation Protein Alpha,FAPa)与肿瘤、炎症及细胞纤维化相关疾病相关,本课题组^[56]利用FAPa能够特异性识别并剪切甘氨酸-脯氨酸(Gly-Pro)中脯氨酸氨基端的特性(图6B), 设计并合成三种具有不同甘氨酸封端结构的AD-CL探针:苄氧羰基(Cbz)保护的探针CFCL、叔丁氧羰基(Boc)保护的探针BFCL和喹诺酮保护的QFCL。研究发现,CFCL对FAPa的选择性最佳,能够在体外、细胞、裸鼠体内、皮下瘤、人血浆中反映FAPa活性,同时我们还探索了探针在FAPa抑制剂筛选中的应用。前列腺特异抗原(PSA)是前列腺癌的特异性生物标志物^[57],研究者^[58]以组氨酸-丝氨酸-丝氨酸-赖氨酸-亮氨酸-谷氨酰胺(HSSKLQ)肽段作识别基团设计AD-CL探针,用于测定人精液中PSA。

通常,AD-CL探针通过暴露出酚氧负离子开启CIEEL进程,产生CL。然而,相当一部分的蛋白酶仅能在肽段的某一区域进行剪切,如基质金属蛋白酶等,导致AD-CL无法产生酚氧负离子,限制了该探针在蛋白酶检测中的应用。为了打破这一限制,研究者提出了一种基于CRET策略的新型蛋白酶检测模式^[59]。在酚羟基结构的邻位设计一段可被待测物剪切的肽段,该肽段一端连接有荧光猝灭基团,因为猝灭基团的存在,将启动CRET进程,此时酚氧负离子仅能与猝灭基团发生作用,而不能进行电子转移导致二氧杂环丁烷的断裂;只有当待测物切断肽段,猝灭基团与AD-CL主体结构分离时,才能够阻断CRET进程,从而启动CIEEL进程,产生CL信号(图6A)。研究者采用此策略,设计出用于检测基质金属蛋白酶(MMPs)的AD-CL探针,基质金属蛋白酶与癌症^[60]、继发感染及器官功能衰竭^[61]相关,并可以选择性识别并剪切脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-缬氨酸-精氨酸-甘氨酸(PLGVRG)肽段中G-V的肽键。因此,研究者将该肽段作为识别基团组装至AD-CL探针骨架上,由基质金属蛋白酶剪切后阻断CRET,产生CL。

AD-CL探针可用于体内生物分子的成像检测,还可以用于体内细胞生物功能的评价。自然杀伤细胞(Natural Killer,NK)是一种免疫细胞,可以杀死某些类型的癌细胞,NK细胞的过继转移(Adoptive Transfer)是一种很有应用前景的肿瘤免疫疗法^[62]。Shabat课题组^[63]设计了一种AD-CL探针在动物水平上用该探针评价了NK-92细胞过继转移免疫疗法的疗效。仅在瘤内注射NK-92细胞后的MDA-MB-231细胞荷瘤小鼠中能够看到探针产生的光信号,不注射NK-92细胞仅注射探针的肿瘤部位,以及仅注射NK-92细胞不注射探针的肿瘤部位均不能观察到光信号的产生。这是研究者用AD-CL探针在体内水平评价NK细胞抗肿瘤活性的第一次尝试,证明探针用于疾病治疗评估的可能性。

此外,AD-CL探针还可以设计成前药的形式,在引入设计识别基团的同时,引入药物分子结构,使得探针在病灶处响应标志物后,释放出药物,同时达到成像和治疗的效果。研究者^[12,26]以β-半乳糖结构作识别基团设计,成功用于体外Heck293-LacZ细胞中β-半乳糖苷酶(β-galactosidase/β-gal,在原发性卵巢癌细胞中过表达^[64],与细胞衰老、Morquio B综合征、β-半乳糖唾液酸血症密切相关^[65])的测定与成像。Shabat课题组^[66]对探针进行前药设计,用于监测药物体内进程(图7),基本原理如下:苯酚结构处采用识别基团保护,对位连接药物分子,获得前药分子,当识别基团由待测物反应后离去,可以通过自发降解过程启动CIEEL进程,产生CL并释放药物单体。实际应用时,研究者将识别基团设计为肿瘤细胞内高表达的β-gal的底物结构——β-半乳糖,药物为甲基瑞奥西汀E,得到前药Prodrug 1,为了与Prodrug 1作对照,研究者将β-半乳糖替换为甲基结构得到Prodrug 2。细胞和动物水平上的实验结果表明:只有当β-gal与识别基团反应后,才能启动CIEEL进程,产生CL并实现药物的释放,而对照分子则不能发光,也无法释放药物。

以上应用实例说明,该类探针可以被广泛用于各种类型的生物分子的检测,为发展新的临床疾病指标的检测方式,为研究疾病机制、揭示疾病与生物标志物的关系,特别是为肿瘤疾病相关物质的研究提供了新的方向。另一方面,AD-CL作为分子型光学探针,通过结构设计,特别是结合前药设计的理念,还可以发展成为诊疗一体化工具,用于疾病治疗评估、药物靶向递送,有望在疾病诊断与治疗方面发挥重要作用。

3.3 病原体和耐药菌的检测

细菌的检测在疾病预防、食品安全等领域中具有重要的意义,2019年,Shabat课题组^[67]第一次将AD-CL探针CLSP和CLLP(图8)分别用于食源性致病菌^[68]——沙门氏菌(能引起肠热和腹泻^[69])和单核增生李斯特菌(能引发肠胃炎、白血病、胞膜炎等疾病^[70])的检测。其中,CLSP的识别基团为辛酯结构,CLLP的识别基团为肌醇-1-磷酸酯结构。与荧光探针相比,检测灵敏度提高约600倍。

肺结核病是全球十大死因之一,通常由结核分枝杆菌的感染引起,通过早期诊断可以有效避免死亡的发生,Babin等^[71]开发了一种结核分枝杆菌特异性检测用AD-CL探针——FLASH,可用于药物敏感性的监测。该探针的识别基团是结核分枝杆菌的Hip1蛋白酶的底物,在体外对重组Hip1蛋白酶具有飞摩尔(fmol)级别的响应,可以在几分钟内检测到人痰液样本中的数千个结核分枝杆菌,并且具有高选择性。同时,研究者还利用该探针评价了多种抗生素对样本中结核分枝杆菌的杀伤效果,可用于结核病类药物筛选、耐药性测定等。

碳青霉烯酶产生菌(Carbapenemase Producing Organisms,CPOs)可以水解碳青霉烯类药物从而产生耐药性,对抗菌治疗构成严重的威胁,为了保证抗菌治疗的临床疗效,碳青霉烯类药物应慎重使用,因此,CPOs的早期发现和诊断非常重要^[72]。Shabat课题组^[73]设计并合成可用于检测活菌内CPOs的AD-CL探针CPCL(图8)。碳青霉烯酶可以水解识别基团的β-内酰胺环,通过1,8-消除过程快速分解,启动CIEEL进程,从而产生CL。

β-内酰胺酶阳性细菌可以对常用的β-内酰胺类抗生素产生耐药性,影响疾病治疗,对人类健康产生威胁。Shabat课题组^[74]根据β-内酰胺酶阳性细菌降解β-内酰胺类药物时会产生代谢物硫化氢(H₂S)的特性,设计了可以响应H₂S的AD-CL探针(图8),用于检测细菌抗生素耐药性。

3.4 其他

多通道、多标志物的检测探针能够拓展分析物的检测范围,适用于样品中多组分的同时检测,多通道荧光探针一直是研究热点^[37,75,76]。研究者将化学发光与荧光结合,构建化学发光-荧光双通道双标志物检测探针。Cheng等^[77]将响应

O 2 · -

的AD-CL结构与响应Caspase-3的近红外荧光探针相连形成一个单一的探针分子,实现了两种物质的同时检测,由于成像通道分别为化学发光通道和荧光通道,因此检测互不干扰(图9A);在此基础上,Huang等^[78]构建了具有高肾脏清除效率的分子肾脏探针(MRP),用于药物诱导的小鼠急性肾损伤(AKI)的体内光学成像,MRP 由三氟甲烷磺酸基保护的AD-CL元件和天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酸(Asp-Glu-Val-Asp,DVED)保护的近红外荧光元件组成,分别响应AKI的

O 2 · -

与Caspase-3,并且连接可以提高小鼠肾脏清除效率的环糊精结构(CCD),进行多分子、多通道成像,此外,MRP 还可以作为尿液分析的外源示踪剂,其性能优于现有的临床检测方法,展现了此类探针在疾病诊断和生物研究方面的巨大潜力(图9B)。

4 结论与展望

基于AD-CL骨架的CL探针近年来获得迅速发展,应用范围越来越广泛。AD-CL探针具有以下特征:(1)背景干扰低、灵敏度高等化学发光技术的传统优势。可以在不需要外加激发光源条件下获得发光信号;(2)体内发光性能显著提高。酚氧基邻位吸电子基团(—Cl)的引入,降低探针的pK_a值,有利于在生理条件下酚氧负离子的形成,从而提高化学发光量子效率和发光强度,显著改善了在生理条件下的发光性能。一些近红外基团和共轭基团的修饰,进一步将延长了发射波长,有利于组织穿透性;(3)酚氧基部位保护基团的设计,进一步扩大了AD-CL相关探针的应用范围,涵盖各类生物小分子、大分子、细胞和细菌等。(4)基于锡烷-烯醇醚化金刚烷与卤化芳基的合成方案不仅简化合成步骤,提高了产率,且有助于在AD-CL的骨架上引入各种不同发光性能的芳香基团或其他长共轭基团,有助于多样化探针设计与合成。然而,该合成方法需借助卤素基团连接,所以酚氧基邻位不易引入吸电子的卤素基团,而卤素的引入有利于降低pK_a值,进而提高其生理条件下的发光性能。因此,这一合成路径上如何引入卤素取代,将可能成为下一步发展方向之一。另一方面,目前该类探针仍有较大的发展空间。首先,该类探针多数在体内消除较快,并且无主动靶向基团,如何进一步提高分子靶向功能是另一发展方向。其次,探针在体内易于降解,适当提高其在体内的稳定性有助于其体内应用。为此,结构中引入长循环基团如聚乙二醇,或者与其他胶束、脂质体、纳米共价材料的结合将可能成为进一步改造探针稳定性的途径。再次,靶向头基的连接将有可能改善该探针在体内应用的主动靶向性能,在改善稳定性的同时,提高靶向性。可以预见,随着对该结构的进一步研究,通过改造与优化,尤其是靶向性能、稳定性能和发光性能三方面的提高,将大大提升其在生物组织成像、药物靶向递送等领域的应用能力,为疾病的预防与诊断、生物学研究等提供一种重要的工具。

参考文献

原文顺序 | 出版日期 | 本文引用

[1]	Siraj N, El-Zahab B, Hamdan S, Karam T E, Haber L H, Li M, Fakayode S O, Das S, Valle B, Strongin R M, Patonay G, Sintim H O, Baker G A, Powe A, Lowry M, Karolin J O, Geddes C D, Warner I M. Anal. Chem., 2016, 88(1): 170.

[2]	Zhang Z, Lai J H, Wu K S, Huang X C, Guo S, Zhang L L, Liu J. Talanta, 2018, 180: 260.

[3]	Mezzanotte L, van ‘t Root M, Karatas H, Goun E A, Löwik C W G M. Trends Biotechnol., 2017, 35(7): 640.

[4]	Yan Y C, Shi P F, Song W L, Bi S. Theranostics, 2019, 9: 4047.

[5]	Yang M W, Huang J G, Fan J L, Du J J, Pu K Y, Peng X J. Chem. Soc. Rev., 2020, 49(19): 6800.

[6]	Gnaim S, Green O, Shabat D. Chem. Commun., 2018, 54(17): 2073.

[7]	White E H, McCapra F, Field G F. J. Am. Chem. Soc., 1963, 85(3): 337.

[8]	Hummelen J C, Luider T M, Wynberg H. Pure Appl. Chem., 1987, 59(5): 639.

[9]	Schaap A P, Gagnon S D. J. Am. Chem. Soc., 1982, 104(12): 3504.

[10]	Eilon-Shaffer T, Roth-Konforti M, Eldar-Boock A, Satchi-Fainaro R, Shabat D. Org. Biomol. Chem., 2018, 16(10): 1708.

[11]	Fu A C, Mao Y J, Wang H B, Cao Z J. J. Pharm. Biomed. Anal., 2021, 204: 114266.

[12]	Green O, Gnaim S, Blau R, Eldar-Boock A, Satchi-Fainaro R, Shabat D. J. Am. Chem. Soc., 2017, 139(37): 13243.

[13]	Huang J S, Jiang Y Y, Li J C, Huang J G, Pu K Y. Angew. Chem. Int. Ed., 2021, 60(8): 3999.

[14]	Hananya N, Eldar Boock A, Bauer C R, Satchi-Fainaro R, Shabat D. J. Am. Chem. Soc., 2016, 138(40): 13438.

[15]	Hananya N, Reid J P, Green O, Sigman M S, Shabat D. Chem. Sci., 2019, 10(5): 1380.

[16]	Turan I S, Akkaya E U. Org. Lett., 2014, 16(6): 1680.

[17]	Seven O, Sozmen F, Simsek Turan I. Sens. Actuat. B Chem., 2017, 239: 1318.

[18]	Gnaim S, Shabat D. J. Am. Chem. Soc., 2017, 139(29): 10002.

[19]	Gnaim S, Gholap S P, Ge L, Das S, Gutkin S, Green O, Shelef O, Hananya N, Baran P S, Shabat D. Angewandte Chemie Int. Ed., 2022, 61(22): e202202187.

[20]	Gnaim S, Scomparin A, Eldar-Boock A, Bauer C R, Satchi-Fainaro R, Shabat D. Chem. Sci., 2019, 10(10): 2945.

[21]	Ni X, Zhang X Y, Duan X C, Zheng H L, Xue X S, Ding D. Nano Lett., 2019, 19(1): 318.

[22]	Andronico L A, Chen L, Mirasoli M, Guardigli M, Quintavalla A, Lombardo M, Trombini C, Chiu D T, Roda A. Nanoscale, 2018, 10(29): 14012.

[23]	Cui D, Li J C, Zhao X H, Pu K Y, Zhang R P. Adv. Mater., 2020, 32(6): 1906314.

[24]	Sies H. Redox Biol., 2017, 11: 613.

[25]	Dickinson B C, Chang C J. Nat. Chem. Biol., 2011, 7(8): 504.

[26]	Green O, Eilon T, Hananya N, Gutkin S, Bauer C R, Shabat D. ACS Cent. Sci., 2017, 3(4): 349.

[27]	Ye S, Hananya N, Green O, Chen H S, Zhao A Q, Shen J G, Shabat D, Yang D. Angew. Chem. Int. Ed., 2020, 59(34): 14326.

[28]	Hananya N, Green O, Blau R, Satchi-Fainaro R, Shabat D. Angew. Chem. Int. Ed., 2017, 56(39): 11793.

[29]	Yang M W, Zhang J W, Shabat D, Fan J L, Peng X J. ACS Sens., 2020, 5(10): 3158.

[30]	Ye S, Yang B W, Wu M L, Chen Z F, Shen J G, Shabat D, Yang D. CCS Chem., 2022, 4(6): 1871.

[31]	An W W, Ryan L S, Reeves A G, Bruemmer K J, Mouhaffel L, Gerberich J L, Winters A, Mason R P, Lippert A R. Angew. Chem. Int. Ed., 2019, 58(5): 1361.

[32]	Cao J, An W W, Reeves A G, Lippert A R. Chem. Sci., 2018, 9(9): 2552.

[33]	Sun J Y, Hu Z A, Zhang S C, Zhang X R. ACS Sens., 2019, 4(1): 87.

[34]	Klotz L O, Briviba K, Sies H. Methods Enzymol., 2000, 319: 130.

[35]	Beghetto C, Renken C, Eriksson O, Jori G, Bernardi P, Ricchelli F. Eur. J. Biochem., 2000, 267(17): 5585.

[36]	Lucky S S, Soo K C, Zhang Y. Chem. Rev., 2015, 115(4): 1990.

[37]	Zhang H, Xu L Z, Chen W Q, Huang J, Huang C S, Sheng J R, Song X Z. Anal. Chem., 2019, 91(3): 1904.

[38]	Li X, Qian S J, He Q J, Yang B, Li J, Hu Y Z. Org. Biomol. Chem., 2010, 8(16): 3627.

[39]	Hou D Y, You Y, Wu X H, Li C, Wu S, Zhang C L, Xian Y Z. Sens. Actuat. B Chem., 2021, 332: 129508.

[40]	Bruemmer K J, Green O, Su T A, Shabat D, Chang C J. Angew. Chem. Int. Ed., 2018, 57(25): 7508.

[41]	Zhang Y T, Yan C X, Wang C, Guo Z Q, Liu X G, Zhu W H. Angew. Chem. Int. Ed., 2020, 59(23): 9059.

[42]	Schaap A P, Sandison M D, Handley R S. Tetrahedron Lett., 1987, 28(11): 1159.

[43]	Gao L P, Li Y, Huang Z Z, Tan H L. Anal. Chimica Acta, 2021, 1148: 238193.

[44]	Siegel D, Yan C, Ross D. Biochem. Pharmacol., 2012, 83(8): 1033.

[45]	Son S, Won M, Green O, Hananya N, Sharma A, Jeon Y, Kwak J H, Sessler J L, Shabat D, Kim J S. Angew. Chem. Int. Ed., 2019, 58(6): 1739.

[46]	Shelef O, Sedgwick A C, Pozzi S, Green O, Satchi-Fainaro R, Shabat D, Sessler J L. Chem. Commun., 2021, 57(86): 11386.

[47]	Kakoti A, Kumar A K, Goswami P. J. Mol. Catal. B Enzym., 2012, 78: 98.

[48]	Patel N G, Meier S, Cammann K, Chemnitius G C. Sens. Actuat. B Chem., 2001, 75(1/2): 101.

[49]	Gnaim S, Shabat D. Org. Biomol. Chem., 2019, 17(6): 1389.

[50]	An R B, Wei S X, Huang Z, Liu F, Ye D J. Anal. Chem., 2019, 91(21): 13639.

[51]	Kim S J, Yoon J W, Yoon S A, Lee M H. Molecules, 2021, 26(4): 1088.

[52]	Sun J Y, Hu Z A, Wang R H, Zhang S C, Zhang X R. Anal. Chem., 2019, 91(2): 1384.

[53]	Sun R, Wu X S, Mao Y J, Wang H B, Bian C, Lv P P, Zhao Z, Li X W, Fu W, Lu J Z, Cao Z J. Luminescence, 2022, 37(8): 1335.

[54]	Fujimoto T, Tsunedomi R, Matsukuma S, Yoshimura K, Oga A, Fujiwara N, Fujiwara Y, Matsui H, Shindo Y, Tokumitsu Y, Suzuki N, Kobayashi S, Hazama S, Eguchi H, Nagano H. Oncol. Lett., 2020, 21(1): 30.

[55]	Roth-Konforti M E, Bauer C R, Shabat D. Angew. Chem. Int. Ed., 2017, 56(49): 15633.

[56]	Fu A C, Wang H B, Huo T T, Li X W, Fu W, Huang R Q, Cao Z J. Anal. Chem., 2021, 93(16): 6501.

[57]	Angelis G D, Rittenhouse H G, Mikolajczyk S D, Shamel L B, Semjonow A. Rev. Urol., 2007, 9: 113.

[58]	Gutkin S, Green O, Raviv G, Shabat D, Portnoy O. Bioconjugate Chem., 2020, 31(11): 2488.

[59]	Hananya N, Press O, Das A, Scomparin A, Satchi-Fainaro R, Sagi I, Shabat D. Chem. Eur. J., 2019, 25(64): 14679.

[60]	Lenci E, Angeli A, Calugi L, Innocenti R, Carta F, Supuran C T, Trabocchi A. Eur. J. Med. Chem., 2021, 214: 113260.

[61]	Wohlschlaeger J, Stubbe H D, Schmitz K J, Kawaguchi N, Takeda A, Takeda N, Hinder F, Baba H A. Pathol. Res. Pract., 2005, 201(12): 809.

[62]	Nguyen R, Wu H Y, Pounds S, Inaba H, Ribeiro R C, Cullins D, Rooney B, Bell T, Lacayo N J, Heym K, Degar B, Schiff D, Janssen W E, Triplett B, Pui C H, Leung W, Rubnitz J E. J. Immunotherapy Cancer, 2019, 7: 81.

[63]	Scott J I, Gutkin S, Green O, Thompson E J, Kitamura T, Shabat D, Vendrell M. Angew. Chem. Int. Ed., 2021, 60(11): 5699.

[64]	Chatterjee S K, Bhattacharya M, Barlow J J. Cancer Res., 1979, 39: 1943.

[65]	Redy-Keisar O, Kisin-Finfer E, Ferber S, Satchi-Fainaro R, Shabat D. Nat. Protoc., 2014, 9(1): 27.

[66]	Gnaim S, Scomparin A, Das S, Blau R, Satchi-Fainaro R, Shabat D. Angew. Chem. Int. Ed., 2018, 57(29): 9033.

[67]	Roth-Konforti M, Green O, Hupfeld M, Fieseler L, Heinrich N, Ihssen J, Vorberg R, Wick L, Spitz U, Shabat D. Angew. Chem. Int. Ed., 2019, 58(30): 10361.

[68]	Sher A A, Mustafa B E, Grady S C, Gardiner J C, Saeed A M. Int. J. Infect. Dis., 2021, 105: 54.

[69]	Yang X Y, Jiang Y J, Song Y, Qin X, Ren Y W, Zhao Y M, Man C X, Zhang W. Int. Dairy J., 2021, 118: 105022.

[70]	Fan Y L, Paoli G, Song M H, Shi X M, Yang M C. J. Chin. Inst. Food Sci. Technol., 2021, 21(3): 253.

[71]	(范一灵, George C.Paoli, 宋明辉, 史贤明, 杨美成. 中国食品学报, 2021, 21(3): 253.).

[72]	Babin B M, Fernandez-Cuervo G, Sheng J, Green O, Ordonez A A, Turner M L, Keller L J, Jain S K, Shabat D, Bogyo M. ACS Cent. Sci., 2021, 7(5): 803.

[73]	Che H J, Liao Q F, Wu S Y, Liu Y, Zhang W L, Peng L, Zhou Y, Kang M. Modern Preventive Medicine, 2021, 48: 524.

[74]	(车辉娟, 廖全凤, 吴思颖, 刘雅, 张为利, 彭丽, 周益, 康梅. 现代预防医学, 2021, 48: 524.).

[75]	Das S, Ihssen J, Wick L, Spitz U, Shabat D. Chem. Eur. J., 2020, 26(16): 3647.

[76]	Gholap S P, Yao C Y, Green O, Babjak M, Jakubec P, Malatinský T, Ihssen J, Wick L, Spitz U, Shabat D. Bioconjugate Chem., 2021, 32(5): 991.

[77]	Wu Z, Liu M M, Liu Z C, Tian Y. J. Am. Chem. Soc., 2020, 142(16): 7532.

[78]	Yang L, Zhang Y, Ren X J, Wang B H, Yang Z G, Song X Z, Wang W. Anal. Chem., 2020, 92(6): 4387.

[79]	Cheng P H, Miao Q Q, Li J C, Huang J G, Xie C, Pu K Y. J. Am. Chem. Soc., 2019, 141(27): 10581.

[80]	Huang J G, Li J C, Lyu Y, Miao Q Q, Pu K Y. Nat. Mater., 2019, 18(10): 1133.

[1]	Siraj N, El-Zahab B, Hamdan S, Karam T E, Haber L H, Li M, Fakayode S O, Das S, Valle B, Strongin R M, Patonay G, Sintim H O, Baker G A, Powe A, Lowry M, Karolin J O, Geddes C D, Warner I M. Anal. Chem., 2016, 88(1): 170.
[2]	Zhang Z, Lai J H, Wu K S, Huang X C, Guo S, Zhang L L, Liu J. Talanta, 2018, 180: 260.
[3]	Mezzanotte L, van ‘t Root M, Karatas H, Goun E A, L?wik C W G M. Trends Biotechnol., 2017, 35(7): 640.
[4]	Yan Y C, Shi P F, Song W L, Bi S. Theranostics, 2019, 9: 4047.
[5]	Yang M W, Huang J G, Fan J L, Du J J, Pu K Y, Peng X J. Chem. Soc. Rev., 2020, 49(19): 6800.
[6]	Gnaim S, Green O, Shabat D. Chem. Commun., 2018, 54(17): 2073.
[7]	White E H, McCapra F, Field G F. J. Am. Chem. Soc., 1963, 85(3): 337.
[8]	Hummelen J C, Luider T M, Wynberg H. Pure Appl. Chem., 1987, 59(5): 639.
[9]	Schaap A P, Gagnon S D. J. Am. Chem. Soc., 1982, 104(12): 3504.
[10]	Eilon-Shaffer T, Roth-Konforti M, Eldar-Boock A, Satchi-Fainaro R, Shabat D. Org. Biomol. Chem., 2018, 16(10): 1708.
[11]	Fu A C, Mao Y J, Wang H B, Cao Z J. J. Pharm. Biomed. Anal., 2021, 204: 114266.
[12]	Green O, Gnaim S, Blau R, Eldar-Boock A, Satchi-Fainaro R, Shabat D. J. Am. Chem. Soc., 2017, 139(37): 13243.
[13]	Huang J S, Jiang Y Y, Li J C, Huang J G, Pu K Y. Angew. Chem. Int. Ed., 2021, 60(8): 3999.
[14]	Hananya N, Eldar Boock A, Bauer C R, Satchi-Fainaro R, Shabat D. J. Am. Chem. Soc., 2016, 138(40): 13438.
[15]	Hananya N, Reid J P, Green O, Sigman M S, Shabat D. Chem. Sci., 2019, 10(5): 1380.
[16]	Turan I S, Akkaya E U. Org. Lett., 2014, 16(6): 1680.
[17]	Seven O, Sozmen F, Simsek Turan I. Sens. Actuat. B Chem., 2017, 239: 1318.
[18]	Gnaim S, Shabat D. J. Am. Chem. Soc., 2017, 139(29): 10002.
[19]	Gnaim S, Gholap S P, Ge L, Das S, Gutkin S, Green O, Shelef O, Hananya N, Baran P S, Shabat D. Angewandte Chemie Int. Ed., 2022, 61(22): e202202187.
[20]	Gnaim S, Scomparin A, Eldar-Boock A, Bauer C R, Satchi-Fainaro R, Shabat D. Chem. Sci., 2019, 10(10): 2945.
[21]	Ni X, Zhang X Y, Duan X C, Zheng H L, Xue X S, Ding D. Nano Lett., 2019, 19(1): 318.
[22]	Andronico L A, Chen L, Mirasoli M, Guardigli M, Quintavalla A, Lombardo M, Trombini C, Chiu D T, Roda A. Nanoscale, 2018, 10(29): 14012.
[23]	Cui D, Li J C, Zhao X H, Pu K Y, Zhang R P. Adv. Mater., 2020, 32(6): 1906314.
[24]	Sies H. Redox Biol., 2017, 11: 613.
[25]	Dickinson B C, Chang C J. Nat. Chem. Biol., 2011, 7(8): 504.
[26]	Green O, Eilon T, Hananya N, Gutkin S, Bauer C R, Shabat D. ACS Cent. Sci., 2017, 3(4): 349.
[27]	Ye S, Hananya N, Green O, Chen H S, Zhao A Q, Shen J G, Shabat D, Yang D. Angew. Chem. Int. Ed., 2020, 59(34): 14326.
[28]	Hananya N, Green O, Blau R, Satchi-Fainaro R, Shabat D. Angew. Chem. Int. Ed., 2017, 56(39): 11793.
[29]	Yang M W, Zhang J W, Shabat D, Fan J L, Peng X J. ACS Sens., 2020, 5(10): 3158.
[30]	Ye S, Yang B W, Wu M L, Chen Z F, Shen J G, Shabat D, Yang D. CCS Chem., 2022, 4(6): 1871.
[31]	An W W, Ryan L S, Reeves A G, Bruemmer K J, Mouhaffel L, Gerberich J L, Winters A, Mason R P, Lippert A R. Angew. Chem. Int. Ed., 2019, 58(5): 1361.
[32]	Cao J, An W W, Reeves A G, Lippert A R. Chem. Sci., 2018, 9(9): 2552.
[33]	Sun J Y, Hu Z A, Zhang S C, Zhang X R. ACS Sens., 2019, 4(1): 87.
[34]	Klotz L O, Briviba K, Sies H. Methods Enzymol., 2000, 319: 130.
[35]	Beghetto C, Renken C, Eriksson O, Jori G, Bernardi P, Ricchelli F. Eur. J. Biochem., 2000, 267(17): 5585.
[36]	Lucky S S, Soo K C, Zhang Y. Chem. Rev., 2015, 115(4): 1990.
[37]	Zhang H, Xu L Z, Chen W Q, Huang J, Huang C S, Sheng J R, Song X Z. Anal. Chem., 2019, 91(3): 1904.
[38]	Li X, Qian S J, He Q J, Yang B, Li J, Hu Y Z. Org. Biomol. Chem., 2010, 8(16): 3627.
[39]	Hou D Y, You Y, Wu X H, Li C, Wu S, Zhang C L, Xian Y Z. Sens. Actuat. B Chem., 2021, 332: 129508.
[40]	Bruemmer K J, Green O, Su T A, Shabat D, Chang C J. Angew. Chem. Int. Ed., 2018, 57(25): 7508.
[41]	Zhang Y T, Yan C X, Wang C, Guo Z Q, Liu X G, Zhu W H. Angew. Chem. Int. Ed., 2020, 59(23): 9059.
[42]	Schaap A P, Sandison M D, Handley R S. Tetrahedron Lett., 1987, 28(11): 1159.
[43]	Gao L P, Li Y, Huang Z Z, Tan H L. Anal. Chimica Acta, 2021, 1148: 238193.
[44]	Siegel D, Yan C, Ross D. Biochem. Pharmacol., 2012, 83(8): 1033.
[45]	Son S, Won M, Green O, Hananya N, Sharma A, Jeon Y, Kwak J H, Sessler J L, Shabat D, Kim J S. Angew. Chem. Int. Ed., 2019, 58(6): 1739.
[46]	Shelef O, Sedgwick A C, Pozzi S, Green O, Satchi-Fainaro R, Shabat D, Sessler J L. Chem. Commun., 2021, 57(86): 11386.
[47]	Kakoti A, Kumar A K, Goswami P. J. Mol. Catal. B Enzym., 2012, 78: 98.
[48]	Patel N G, Meier S, Cammann K, Chemnitius G C. Sens. Actuat. B Chem., 2001, 75(1/2): 101.
[49]	Gnaim S, Shabat D. Org. Biomol. Chem., 2019, 17(6): 1389.
[50]	An R B, Wei S X, Huang Z, Liu F, Ye D J. Anal. Chem., 2019, 91(21): 13639.
[51]	Kim S J, Yoon J W, Yoon S A, Lee M H. Molecules, 2021, 26(4): 1088.
[52]	Sun J Y, Hu Z A, Wang R H, Zhang S C, Zhang X R. Anal. Chem., 2019, 91(2): 1384.
[53]	Sun R, Wu X S, Mao Y J, Wang H B, Bian C, Lv P P, Zhao Z, Li X W, Fu W, Lu J Z, Cao Z J. Luminescence, 2022, 37(8): 1335.
[54]	Fujimoto T, Tsunedomi R, Matsukuma S, Yoshimura K, Oga A, Fujiwara N, Fujiwara Y, Matsui H, Shindo Y, Tokumitsu Y, Suzuki N, Kobayashi S, Hazama S, Eguchi H, Nagano H. Oncol. Lett., 2020, 21(1): 30.
[55]	Roth-Konforti M E, Bauer C R, Shabat D,. Angew. Chem. Int. Ed., 2017, 56(49): 15633.
[56]	Fu A C, Wang H B, Huo T T, Li X W, Fu W, Huang R Q, Cao Z J. Anal. Chem., 2021, 93(16): 6501.
[57]	Angelis G D, Rittenhouse H G, Mikolajczyk S D, Shamel L B, Semjonow A. Rev. Urol., 2007, 9: 113.
[58]	Gutkin S, Green O, Raviv G, Shabat D, Portnoy O. Bioconjugate Chem., 2020, 31(11): 2488.
[59]	Hananya N, Press O, Das A, Scomparin A, Satchi-Fainaro R, Sagi I, Shabat D. Chem. Eur. J., 2019, 25(64): 14679.
[60]	Lenci E, Angeli A, Calugi L, Innocenti R, Carta F, Supuran C T, Trabocchi A. Eur. J. Med. Chem., 2021, 214: 113260.
[61]	Wohlschlaeger J, Stubbe H D, Schmitz K J, Kawaguchi N, Takeda A, Takeda N, Hinder F, Baba H A. Pathol. Res. Pract., 2005, 201(12): 809.
[62]	Nguyen R, Wu H Y, Pounds S, Inaba H, Ribeiro R C, Cullins D, Rooney B, Bell T, Lacayo N J, Heym K, Degar B, Schiff D, Janssen W E, Triplett B, Pui C H, Leung W, Rubnitz J E. J. Immunotherapy Cancer, 2019, 7: 81.
[63]	Scott J I, Gutkin S, Green O, Thompson E J, Kitamura T, Shabat D, Vendrell M. Angew. Chem. Int. Ed., 2021, 60(11): 5699.
[64]	Chatterjee S K, Bhattacharya M, Barlow J J. Cancer Res., 1979, 39: 1943.
[65]	Redy-Keisar O, Kisin-Finfer E, Ferber S, Satchi-Fainaro R, Shabat D. Nat. Protoc., 2014, 9(1): 27.
[66]	Gnaim S, Scomparin A, Das S, Blau R, Satchi-Fainaro R, Shabat D. Angew. Chem. Int. Ed., 2018, 57(29): 9033.
[67]	Roth-Konforti M, Green O, Hupfeld M, Fieseler L, Heinrich N, Ihssen J, Vorberg R, Wick L, Spitz U, Shabat D. Angew. Chem. Int. Ed., 2019, 58(30): 10361.
[68]	Sher A A, Mustafa B E, Grady S C, Gardiner J C, Saeed A M. Int. J. Infect. Dis., 2021, 105: 54.
[69]	Yang X Y, Jiang Y J, Song Y, Qin X, Ren Y W, Zhao Y M, Man C X, Zhang W. Int. Dairy J., 2021, 118: 105022.
[70]	Fan Y L, Paoli G, Song M H, Shi X M, Yang M C. J. Chin. Inst. Food Sci. Technol., 2021, 21(3): 253.
[70]	(范一灵, George C.Paoli, 宋明辉, 史贤明, 杨美成. 中国食品学报, 2021, 21(3): 253.).
[71]	Babin B M, Fernandez-Cuervo G, Sheng J, Green O, Ordonez A A, Turner M L, Keller L J, Jain S K, Shabat D, Bogyo M. ACS Cent. Sci., 2021, 7(5): 803.
[72]	Che H J, Liao Q F, Wu S Y, Liu Y, Zhang W L, Peng L, Zhou Y, Kang M. Modern Preventive Medicine, 2021, 48: 524.
[72]	(车辉娟, 廖全凤, 吴思颖, 刘雅, 张为利, 彭丽, 周益, 康梅. 现代预防医学, 2021, 48: 524.).
[73]	Das S, Ihssen J, Wick L, Spitz U, Shabat D. Chem. Eur. J., 2020, 26(16): 3647.
[74]	Gholap S P, Yao C Y, Green O, Babjak M, Jakubec P, Malatinsky T, Ihssen J, Wick L, Spitz U, Shabat D. Bioconjugate Chem., 2021, 32(5): 991.
[75]	Wu Z, Liu M M, Liu Z C, Tian Y. J. Am. Chem. Soc., 2020, 142(16): 7532.
[76]	Yang L, Zhang Y, Ren X J, Wang B H, Yang Z G, Song X Z, Wang W. Anal. Chem., 2020, 92(6): 4387.
[77]	Cheng P H, Miao Q Q, Li J C, Huang J G, Xie C, Pu K Y. J. Am. Chem. Soc., 2019, 141(27): 10581.
[78]	Huang J G, Li J C, Lyu Y, Miao Q Q, Pu K Y. Nat. Mater., 2019, 18(10): 1133.