基于微流控芯片的体外三维肝脏生理模型的构建及应用

卢雪萍; 赵亮; 汪夏燕; 郭广生

doi:10.7536/PC230116

化学进展 ›› 2023, Vol. 35 ›› Issue (9) :1357-1368 DOI: 10.7536/PC230116

综述

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基于微流控芯片的体外三维肝脏生理模型的构建及应用

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Construction and Application of 3D Microfluidic Liver-On-A-Chip

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摘要

肝脏是身体内最重要器官之一,是生化代谢和合成过程最主要的器官。因此,深入了解肝脏生理生化过程、病理机制等,对于研究、预防、诊断、治疗肝脏相关或代谢相关疾病具有重要意义。肝脏体外培养模型是研究肝脏相关生物学机制的重要实验基础。传统体外细胞培养难以重现肝脏复杂的生理结构和微环境,且缺乏肝脏组织构造的基本三维特征。更重要的是,平面培养过程中细胞的组织形态架构、基因表达、物质代谢过程等与体内相比具有较大差异。微流控技术可以通过精巧设计与布局在微通道结构中培养相应细胞来模拟肝脏的生理结构,结合三维细胞培养技术,可以在微流控芯片上实现更类似于体内肝脏微环境以及与其他组织器官相互作用的体外肝器官模型。本文总结了基于微流控技术构建体外三维肝脏芯片的方法和最新进展,包括基于多孔膜培养、水凝胶培养、细胞团簇培养及生物打印的三维肝脏模型。进一步,我们也探讨了三维培养的肝脏芯片在重塑肝脏生理结构、探究机理和病理机制以及药物筛选和毒性测试方面的应用,并对三维肝脏微流控器官芯片的潜在价值及其面临的挑战进行了展望。

Abstract

As the largest internal organ in the human body, the liver plays an essential role in the metabolism. The liver or relevant diseases are one of the leading causes of death in the world, with the number of cases surging each year. Therefore, an in-depth understanding of the physiological and biochemical processes and pathological mechanisms of the liver is of great significance for the research, prevention, diagnosis, and treatment of liver-related or metabolism-related diseases. The in vitro liver culture model is an important experimental platform for the study of liver-related biological mechanisms. However, the traditional two-dimensional in vitro cell culture model makes it difficult to reproduce the complex physiological structure and microenvironment of the liver, and lack of disease characteristics. More importantly, the cell structure, gene expression, substance metabolism, and so on in the process of planar culture are significantly different from those in vivo. Microfluidic technology can simulate the physiological structure of liver by designing appropriate micro-structure, providing a microenvironment more like that in vivo by combining with three-dimensional liver tissue culture. Therefore, this paper summarizes the methods and latest progress in constructing 3D liver chips in vitro based on microfluidic technology, including porous membrane culture, hydrogel culture, cell spheroid-based culture, and 3D bioprinting. The applications of 3D cultured liver microchips in remodeling liver physiological structure, exploring mechanism and pathological mechanism, drug screening, and toxicity testing are further summarized. Finally, the potential value and challenges of 3D liver-on-a-chip are discussed.

Contents

1 Introduction

2 Construction methods for 3D microfluidic liver-on-a-chip

2.1 Porous membrane

2.2 Cell spheroids

2.3 Gel-based 3D culture

2.4 3D bioprinting

3 Application of 3D microfluidic liver-on-a-chip

3.1 Disease models

3.2 Drug screening

4 Conclusion and prospects

Graphical abstract

关键词

微流控芯片 / 三维培养 / 器官芯片 / 肝脏芯片 / 药物筛选

Key words

microfluidic chip / 3D cell culture / organ-on-a-chip / liver-on-a-chip / drug screening

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卢雪萍, 赵亮, 汪夏燕, 郭广生. 基于微流控芯片的体外三维肝脏生理模型的构建及应用[J]. 化学进展, 2023, 35(9): 1357-1368 DOI:10.7536/PC230116

Xueping Lu, Liang Zhao, Xiayan Wang, Guangsheng Guo. Construction and Application of 3D Microfluidic Liver-On-A-Chip[J]. Progress in Chemistry, 2023, 35(9): 1357-1368 DOI:10.7536/PC230116

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1 引言

肝脏是人体最重要的器官之一,在机体内担负着人体排泄、代谢、解毒、合成等诸多功能。肝脏病变威胁生命安全,每年都有几百万人由于肝脏相关疾病及其并发症死亡^[1⇓~3]。除了肝脏本身的疾病之外,化合物在肝脏代谢之后又可能会引起肝脏或其他器官的毒性,这也是目前药物研发过程中导致大量有潜力的化合物最终难以通过临床安全性评估的关键因素^[4]。使用动物模型是目前现代生物医学研究中极为重要的实验方法和手段,有助于理解和认识人类疾病的发生、发展规律以及用于临床新药疗效与安全性评估。因此,人们一直利用生物学意义上与人类基因高度相似且对病毒、细菌的反应与人可能相似的动物作为解剖和生理学模型。然而,动物为模型的实验研究并不完美:因为药物在不同物种中的吸收、分布和代谢方式不同,且基因组差异最终仍然会干扰分子水平的药物研究,使得从动物实验结果出发难以预测临床评价结果。2022年,美国参议院一致通过了美国食品药品监督管理局现代化法案(FDA Modernization Act 2.0),该法案取消了对新药进行动物试验的联邦授权,终止 “动物实验强制令”,拟推动大幅减少对试验动物的使用。FDA现代化法案将动物试验改成了非临床测试和试验:如基于细胞的分析、类器官、微生理系统、计算机模型等。

微流控芯片(microfluidic chip)又称为芯片实验室(lab-on-a-chip),是一种利用微加工技术制作且具有管道或腔室构造的功能性器件,其至少在一个维度上具有亚毫米结构^[5,6]。微流控技术涉及的尺度大体与哺乳动物细胞的尺度一致,使得它有可能容纳分子、细胞、仿生的组织,甚至器官单元。并且其特有的流体动态操纵体系使得它能够提供与体内更为接近的生理环境^[7]。因此,微流控系统被认为是极为重要的体外细胞研究的理想技术平台^[8]。我们将基于微流控技术制备出来具有人体器官特定功能、复杂结构和微环境的仿生微生理系统称为器官芯片^[9⇓⇓~12]。随着微流控技术和体外细胞培养技术的快速发展,器官芯片已逐渐成为体外仿生模型开发、疾病机制研究^[13]、药物筛选^[14]及生物医学等相关领域研究的新兴方法^[15]。

基于微流控技术的肝脏器官芯片可以在类似于活体器官环境中研究肝脏细胞以及相关组织及其功能在生理病理条件下的动态变化^[16]。在肝脏器官芯片研究中,以微流控芯片为载体的体外细胞培养是重要的平台技术^[17]。体外细胞培养技术目前主要分为二维平面培养(2D)和三维培养(3D)。如表1所示,传统的二维体外模型培养的细胞在基底上呈现单层生长,该方式培养周期短,花费少,但其不能够模拟组织或肿瘤本身的结构,也不能体现生理功能,并且培养过程中会改变细胞形态,丧失表型和极性,不能很好地反映体内生理环境^[18,19]。此外,由于缺乏浓度梯度和流体状态,细胞也会更倾向于维持在细胞周期的同一阶段,这会导致细胞对药物的反应发生显著变化。三维细胞培养模型主要是通过多孔膜^[20]、细胞团簇^[21]以及胶原或水凝胶^[22,23]进行细胞培养。三维培养可以增强细胞与细胞之间的相互作用、极性、表型和功能,能够弥补二维培养模式的不足^[24⇓~26]。因此,相较于基于二维体外培养的肝脏器官芯片,基于三维体外培养的肝脏器官芯片能够更好地重塑肝脏生理模型,也能够更精准地判断疾病机制和预测药物在人体内的反应^[27,28]。在此,我们对基本的体外肝脏细胞培养模式做出了初步的归纳,并对不同方法间的优缺点进行了总结与比较(表1)。

目前,尚未有综述对利用微流控芯片系统中三维肝脏组织培养及相关生物学研究进行系统性的总结与阐述。基于此,本文全面地总结了芯片微生理系统中构建肝脏组织器官的方法,以及应用这些系统在体外模拟和研究肝脏相关的生理和病理过程的最新进展。进一步地,对芯片中构建三维肝组织并维持其生理活性的相关方法进行了分类阐述和比较。此外,我们也对利用含有三维肝组织的微流控芯片系统用于药物或药物前体的效能评价相关研究进行了归纳和总结。

2 微流控三维肝脏芯片的构建方法

肝脏是体内最复杂的器官之一:在微观水平上,不同的细胞之间通过复杂的有序架构,形成肝小叶、肝窦等基本单元。微流控芯片技术能够在微米水平上对细胞进行空间可控的操控和排布。因此,器官芯片特别是肝脏器官芯片是当前微流控研究领域的前沿热点之一。构建能够模拟更类似于体内肝脏器官的体外模型用于人类肝脏疾病的研究及用于相关治疗药物开发是十分必要的。早期的肝脏器官芯片主要基于在芯片的腔室内或管道内对肝脏细胞或其他相关细胞进行培养,培养的形式多以简单的二维平面培养为主。随着对体内肝脏微环境与功能之间认识的不断深入,人们认为传统的平面培养已经难以在组织和器官水平实现对肝脏结构及其功能进行的体外重构和模拟。因此,如何在芯片上实现细胞群体间三维水平的复杂架构以及对细胞在三维空间进行精确的组织和排列成为新的研究热点。当前,基于不同的芯片制造技术和微加工模式,主流的三维肝脏器官芯片的构造方式主要分为以下几种:i)基于多孔膜在芯片中夹心的方式来实现不同的肝脏相关细胞在膜两侧分别培养;ii)基于多细胞团簇的技术培养三维肝脏, 并将其集成于芯片中;iii)利用生物相容性良好的水凝胶,在其中对肝脏及相关细胞进行培养以实现三维肝脏器官芯片;iv)利用生物3D打印机配合各种热固化或光固化的凝胶及生物墨水,将肝脏细胞或其他细胞混合打印出来,形成特殊的三维构造并集成于芯片装置中。以下本文将对体外三维肝脏微流控器官芯片的构建方法进行总结,并介绍利用以上各种方法的最新研究进展。

2.1 多孔膜

多孔膜材料基于本身的孔径大小和界面效应可以提供细胞培养的支撑面,同时实现溶液的自由透过,特别是能够对不同的细胞进行分隔培养且不影响细胞之间的化学物质交换。因此,基于多孔膜的细胞培养已经在组织工程及生物医药领域中有了广泛的应用^[29,30]。Hegde等开发了一种基于多孔膜的微流体装置,用于对肝细胞进行“三明治”式的培养^[31]。该装置设计通过多孔膜将两层PDMS芯片通道分隔开,从而形成一个由多孔膜分隔的两室装置。其中,顶部腔室用于持续灌注培养基,底部通道培养肝细胞。相比于静态模型,动态流体下培养的肝细胞功能更强且能够长时间保持肝脏的功能。在生理上,肝脏主要由肝细胞、Kupffer 细胞、肝星状细胞和肝血窦内皮细胞等组成。由于体内多种细胞间存在相互作用,且处于特定的生理生化环境,因此,在体外很难模拟体内肝组织的特定结构以及功能^[32⇓~34]。因此,Long等基于多孔膜开发了一种微流控肝器官芯片用于模拟体内肝窦结构(图1A)^[35]。芯片上层通道培养肝脏相关细胞(包括血管内皮细胞、肝星状细胞及Kupffer 细胞),下层通道培养肝实质细胞,并由芯片外接流体进行细胞动态培养。该芯片整合了流体动力和可视化追踪的两个关键因素及四种类型的原代肝细胞,高度集成了肝脏的关键结构,实现了肝脏微生理环境的模拟,可用于研究短时间内的免疫反应。总之,基于多孔膜方法构建微流控三维肝脏芯片是常见的方法之一,它能够很好地对体内肝窦结构进行模拟,并且动态的培养环境能够提供与体内相似的理化条件,在探究肝脏生理结构与功能间的关系等方面有着广泛的应用。

2.2 细胞团簇

多细胞团簇的方法也是一种重要的三维细胞培养技术。其基本原理是:在抑制细胞贴壁的条件下,细胞倾向于形成多细胞团簇,其具有多层细胞结构,细胞与细胞之间紧密相连。与二维单层细胞相比,呈现出接近于体内的三维立体结构,并能够维持细胞的表型和功能,并且具有与实体组织相似的特征。基于微流控芯片上的微坑结构能够快速高效地形成细胞团簇^[36]。Lee 等设计了蜂窝状排列的微坑阵列,用于形成和培养三维肝细胞团簇^[37,38]。相比于二维培养,三维团簇化的肝细胞显示出较高的细胞活性和功能。Luo与Liang等开发了一种芯片上动态培养肝细胞团簇的方法。研究结果显示:相比于静态培养,动态培养的肝细胞团簇的代谢功能更强^[39]。Shen等设计了一种基于水凝胶材料的微流控肝脏芯片^[40]。在水凝胶芯片中,肝脏细胞在芯片外通道的微孔形成肝细胞团簇,内通道用胶原培养内皮细胞。结果显示,8 d内肝脏细胞呈现出较高的活性,并且,相比于单独的肝脏细胞团簇培养,该研究发现肝脏细胞与内皮细胞共培养,能更好地再现肝脏体内的生理功能。Khademhosseini等提出通过将肝细胞和内皮细胞在芯片微坑中共培养成多细胞团簇,从而构建非酒精性脂肪肝的病理模型。结果显示:当肝细胞团簇内含有20%的内皮细胞时,可以更好地模拟非酒精性脂肪肝的发病机理^[41]。此外,在体外构建血管系统是模拟人体组织、实现组织和器官功能的重要方法。因此,Bonanini等开发了一种集成有三维血管网络与原代肝脏细胞的微流控器官芯片平台(图1B)^[42]。该平台主要由384孔板和64个微流控芯片组成,每个芯片都能诱导血管生成。芯片顶部是一个敞开的系统,可以手动置入原代肝细胞团簇。肝细胞团簇在胶原内继续培养,最终与血管内皮细胞相互作用形成稳定、可灌注的血管网络。总之,基于细胞团簇的三维培养,能够模拟体内组织与器官的特征,并且可以维持细胞活性和组织的相关功能。集成于微流控芯片中的微坑阵列能够快速高效地形成肝细胞团簇,对于探索和构建肝脏体外模型及高内涵药物筛选将产生积极作用。

2.3 凝胶培养

具有良好生物相容性的高分子凝胶常被广泛地用于细胞体外三维培养,其三维网络结构与体内细胞外基质分子的结构和性能非常相似。凝胶方法培养的细胞更易黏附,更易促进细胞生长且能够增强细胞与基质之间的相互作用,是一种常用的三维细胞培养方法。相比于传统的凝胶培养细胞,微流控芯片上培养的细胞能维持更高的活性。Revzin等基于胶原培养开发了一种用于长期肝脏培养且能维持肝脏功能的微流控装置^[43]。胶原与肝细胞通过注射器直接注入培养室,胶原中的细胞能在有流体流动的装置内连续培养一个月以上且保持较好的生理功能。而对于96孔板里用胶原培养的肝脏组织,在3~5 d内就会失去表型和功能。因此,该方法可用于未来肝脏疾病建模或个性化肝脏定向治疗。此外,Qin等结合液滴微流控装置,将人诱导多能干细胞封装在液滴里形成水凝胶胶囊,在胶囊内连续培养并最终分化成为肝脏类器官^[44]。该方法易于操作,可扩展且稳定,培养的肝脏器官显示出均一性和良好的细胞活力,为具有更高可控性和保真度的干细胞类器官提供了一种技术平台。基于凝胶方法的三维肝脏芯片常用于构建肝小叶结构^[45]并探究肝实质细胞与血管内皮细胞^[46]、肝星形胶质细胞^[47]或成纤维细胞^[48]之间的相互作用。例如,Banaeiyan等设计了一种高通量的肝小叶芯片^[22]。该芯片包含组织培养区域、给料区域和一个中央出口,其中组织培养区与给料区之间有扩散通道,使得细胞免受流体剪切力的影响。该方法培养的肝组织能够连续培养21 d且在培养期间细胞能维持形态和功能。Wang等利用集成化微流控芯片的方法在体外制造3D肝小叶状微组织(图1C)^[49],芯片中肝细胞和血管内皮细胞均在胶原中培养。实验证明:该装置培养的肝组织保留了很大的药物代谢能力,能够较为准确地分析临床药物之间的相互作用以及引起肝损伤的潜在不良药物反应,为药物代谢和肝毒性分析提供了新方法。总之,基于凝胶方法的三维细胞培养具有更高的可控性及保真度,被广泛应用于肝脏器官芯片的构建中。

2.4 生物打印

生物3D打印技术是采用分层生物制造方法构建肝脏组织工程的新兴技术,有利于精准打印出三维结构以及高通量制造。相较于上述的三种细胞培养方式,生物3D打印技术能够直接打印出个性化的组织细胞或器官,为解决供体缺乏、机体免疫排斥及药物治疗手段的研发等问题提供便利^[50]。Lin等使用自制的喷墨打印机打印出微尺度细胞图案并用于在芯片上实现细胞培养、刺激和分析^[51]。细胞被包裹在海藻酸钠溶液中,通过软件控制使细胞精准分布在载玻片上,随后利用微流控的芯片通道灌入氯化钙溶液,使其立即形成凝胶并固定在芯片底部。该方法有助于提高微流控芯片中的细胞构图功效并减少费力的实验工作。为了能够实现多种细胞分层打印,Cho等借助3D生物打印的方法将肝脏细胞和内皮细胞包裹在不同的水凝胶内,并最终分层打印出来。结果显示:相比于传统的肝脏细胞培养,3D生物打印后继续培养的细胞的肝功能显著增强^[52]。由于3D打印出来的肝细胞缺乏排泄胆汁酸所必需的胆汁系统,不能很好地克服药物开发过程中体外肝脏测试的弊端,他们又开发了具有多种细胞类型的肝芯片^[53]。该芯片具有血管和胆汁系统,显示出了更好的肝脏功能并有望用于体外肝器官测试。为了能够更精准地对细胞的空间分布进行控制,Jin等开发了一种高级3D生物打印方法用于同时实现多细胞培养、多结构的预设,且成功构建了肝小叶结构(图1D)^[54]。该芯片上具有类似肝小叶的结构,包括肝实质细胞、内皮细胞和管腔,显示出较高的肝脏相关代谢活性,如尿素、白蛋白分泌的增强,证明了该方法可以保持结构完整性并改善细胞功能。为了能更便捷地打印出肝小叶结构,Mandal等开发了一种基于肝脏细胞外基质的生物墨水^[55]。预先将肝实质细胞、内皮细胞、肝星状细胞封装在生物墨水里,通过3D生物打印机打印出肝小叶结构。研究结果显示,3D打印出的三维肝脏结构具有较高的代谢能力,且能够更精准地预测药物肝毒性。该方法有助于加快药物开发,为肝毒性筛查提供一个强大的平台。总之,基于3D生物打印技术可以产生解剖学上更为准确的肝脏结构,包括肝脏特定的空间结构和血管网络,为构建用于研究肝病和药物筛选的体外肝脏模型提供了有利工具。

3 微流控三维肝脏芯片的应用

3.1 肝脏相关疾病模型

肝脏是人体新陈代谢的场所,其常见的主要病变包括:酒精性肝病(ALD)、非酒精性脂肪肝(NAFLD)、病毒性肝炎及代谢类疾病II型糖尿病等。能够模拟肝脏生理功能以及细胞状态的微流控肝脏芯片的建立,为深入了解疾病机制以及寻找合适的治疗方案提供了很好的体外模型以及研究平台。

ALD是由于长期大量饮酒导致的肝脏疾病,是广泛流行的肝脏疾病,严重危害人体健康。研究和开发针对性的ALD治疗方法一直是研究的热点之一^[56]。如图2A所示,Lee等构建了基于微流控技术的酒精肝三维体外模型^[57]。他们将大鼠的原代肝细胞和肝星状细胞置入微流控芯片内进行流动下的动态培养,利用自制的渗透泵提供动态培养的环境。肝细胞在不同浓度的酒精处理细胞3 d后,结果显示酒精浓度为60 μL/mL、80 μL/mL时会造成细胞明显的损伤,验证了不同条件下ALD肝功能恢复的可逆和不可逆性。研究表明:肝脏损伤会促进肝星状细胞增殖且肝细胞和肝星状细胞共培养更有利于酒精刺激后肝细胞功能的恢复。该方法有助于重现ALD的生理环境,在生理病理机制的研究和测试药物毒性方面具有较大潜力。

近年来,随着饮食结构的变化,NAFLD成为全球范围内最常见的一种肝病。该疾病与酒精的摄入无关,与过量摄入高糖高脂肪的食物有关,常常会发展成肝纤维化、肝衰竭甚至肝癌。由于缺乏针对NAFLD的药物筛选平台,对其引发的原因理解一直非常有限^[58⇓~60]。如图2B所示,Yu 等开发了一种基于微流控技术的100孔NAFLD药物筛选平台。利用该芯片能生成大小较为均一的肝脏类器官团簇,重塑了NAFLD的主要结构^[61]。相比于预分化后用芯片培养的类器官,在芯片内原位分化的类器官具有更好的化学微环境,能够促进肝脏分化,提高肝功能,增强细胞极性和胆管结构。结果显示,用游离脂肪酸诱导细胞,细胞显示出高水平的脂质累积,影响血糖调节,减少类器官中的AKT磷酸化。该方法作为灵敏的高通量药物测试平台,可有助于加速NAFLD的药物开发。

Ⅱ型糖尿病是一种慢性代谢疾病,占糖尿病患者的90%。Qin等提出了一种微流控多类器官系统^[62]。如图2C所示,人诱导多能干细胞(hiPSCs)自组织形成团簇,诱导分化形成肝脏和胰岛类器官。将类器官团簇灌注在该系统中,可连续共培养一个月。结果显示:肝脏和胰岛类器官的细胞活性良好且器官之间的介质和分泌的代谢产物可以互相交换,适用于探究疾病下人肝-胰岛轴的胰岛素和葡萄糖调节。该方法有助于探究多类器官的相互作用,为研究疾病机制及疾病相关药物的筛选提供了平台。

乙型肝炎(HBV)是由乙型肝炎病毒导致的肝脏传染性疾病^[63]。传统上用细胞系和二维培养的原代细胞往往无法模拟肝脏的复杂性,导致对HBV感染过程的研究受到限制。Dorner等利用3D微流控芯片来研究乙型肝炎病毒感染过程^[64]。如图2D所示,在苯乙烯支架上涂覆胶原用于培养原代人肝细胞,该系统可持续培养40 d,从而可以重构HBV生命周期的各个步骤。该工作证明了肝实质细胞与非实质细胞共培养能够利于鉴定产生免疫效应因子的细胞来源,为临床前期HBV提供了有价值的研究平台。

3.2 肝脏药物筛选模型

研发安全有效的临床药物是一个耗时长、困难大且花费昂贵的过程。据研究表明,从新药研发到获得批准上市需要耗时10年以上,花费17亿美元左右^[65]。在此过程中,大部分的化合物由于具有器官毒性或缺乏药效等原因而遭淘汰。药物的肝毒性作用是临床前药物研发必须面临且亟待解决的问题,也是药物引入市场后又被撤回的重要原因^[66]。临床前通常采用与人类相似的动物模型进行肝毒性等安全性验证,但药物研发初期使用动物模型,不但花费昂贵、耗时,且存在物种差异,也无法随时观察药物对细胞层面的影响,只能通过动物的表现型观察,从而无法探究疾病机制^[67]。因此,开发高效、便捷、可靠的微流控肝脏器官芯片用于快速评价药物肝毒性成为当前研究中的迫切需求。

Lin等制造了一个能够模拟肝脏代谢功能、检测前体药物代谢^[68]的微流控装置。卡培他滨(CAP)作为前体药物本身是对细胞无毒性的,只有在经由肝脏代谢成活性中间体之后才能再转化为对细胞有毒性的有效化疗药物5-氟尿嘧啶(5-FU)。他们在微流控芯片上实现了肝脏细胞(HepG2)和乳腺癌细胞(MCF-7)的二维共培养,并且在芯片上集成了固相萃取柱用于萃取药物成分,通过质谱仪在线检测,能够证明药物被肝脏代谢的过程及药物对肿瘤的毒性作用。在体内代谢过程中,即使药物似乎对肝脏无毒性作用,但可能在其他器官中产生副作用^[65]。因此,开发多器官芯片系统有利于在药物测试过程中尽早发现药物脱靶副作用等风险。器官芯片公司Hesperos的Hickman等构建了一个多器官芯片系统用于预测临床前靶标疗效、肝脏代谢转化及药物脱靶毒性的测定(图3A)^[69]。腔室1用于培养肝脏细胞,用于模拟药物进入人体内的第一步药物代谢,可以直接在其他腔室培养白血病细胞,用于评估药物对骨髓增殖的抑制作用以及肝脏与骨髓之间的相互关系。此外,该芯片也可以在腔室2和4分别培养心肌细胞及测量心肌的微电极阵列,在腔室3和5培养不同的肿瘤细胞,用于评估药物经由肝脏代谢后对心脏和肿瘤的影响。该方法为临床前药物疗效以及安全性评估提供了新的平台和方案。

二维细胞培养是体外药物筛选的主要培养方式,但是二维培养的细胞不具有特定的组织结构,通常需要使用三维细胞模型进行二次筛选。因此,科学家们逐渐将重心转移到开发三维的肝脏器官微流控芯片。如图3B所示,器官芯片公司Emulate的Hamilton等开发了一种基于多孔膜模拟肝脏生理结构的微流控芯片^[70]。该芯片利用多孔膜将芯片分成上下两层:上层用“三明治”法培养肝脏细胞,下层培养肝脏相关细胞(包括内皮细胞、Kuffer细胞和肝星状细胞),从而模拟了肝脏体内的生理复杂结构及理化条件。该方法为检测肝毒性、肝细胞损伤、脂肪变性、胆汁淤积和纤维化以及使用药物处理后的种属特异性方面提供了更有效的方法。在早期药物筛选中,能够及时筛选淘汰具有较大副作用的药物,对于药物研发的整体流程来说是非常重要和必要的。因此,开发一种高通量、高内涵的药物筛选平台具有极大的必要性^[71]。Wheeler等开发了一种基于数字微流控系统的微流控类器官平台用于药物筛选, 如图3C所示^[72]。该装置可以生成可寻址的自由悬浮的肝脏类器官,用来探索不同的实验条件对肝脏类器官的影响。实验结果证明,类器官表现出成纤维细胞依赖的收缩行为,显示出高细胞活性和代谢功能。在早期药物研发阶段,该平台可能成为一种具有成本效益的工具。前体药物是一种活性低于原药但经过肝脏代谢后变为有活性的物质,这一过程会加强药物靶向性且药物的毒性和副作用会降低^{[73⇓⇓~76]}。如图3D所示,Jiang等开发了一种集成的仿生阵列芯片用于前体药物的筛选^[77]。

该芯片由两个功能芯片组合而成:肝脏芯片和肿瘤芯片,并且肝脏和肿瘤均在胶原中三维培养。利用该装置,他们评估了前体药物代谢诱导的抗癌生物活性,并且研究了不同药物间的相互作用。该芯片可以用于同时评估前体药物的抗癌生物活性和可能产生的肝毒性。总体而言,该方法提供了一个具有集成功能以及操作简单且高通量的肝脏器官芯片平台,可以作为一种在药物开发过程中的辅助筛选工具。除了药物的肝毒性之外,心血管毒性也是一个不容忽视的药物副作用^[78,79]。如图3E所示,Khademhosseini等开发了一种集成微流体生物传感器的多器官系统用于检测药物对肝脏及心脏器官的毒性作用^[80]。该装置包含一个多器官芯片和多种生物传感器。多器官芯片上集成了肝脏与心肌细胞的培养,主要用于检测药物对肝脏和心脏的毒性作用。生物传感器主要用于原位连续在线检测细胞分泌的小剂量的生物标志物(如白蛋白、CK-MB等)来判断药物的肝毒性及心脏毒性。此外,该装置还可以检测系统的生理参数如氧气、pH及温度等。该方法有效地将多器官芯片与在线检测的传感器相结合,提供了研究多器官相互作用和同时检测生物标志物的技术平台。

4 结论与展望

肝脏是人体内最重要的解毒器官,承担着几乎所有化合物与药物的代谢转化功能。近年来,动物模型因在预测新药毒性、安全性以及人体药效方面的局限性而受到广泛批评。我国也针对性地发布了一些非临床研究与评价的指导原则,提出当缺少相关动物模型时,可采用基于细胞和组织的模型(如2D或3D组织模型、类器官和微流体模型等)为有效性和安全性的评估提供有用的补充信息。因此,新兴的技术如基于微流控技术的体外微生理系统、器官芯片等正受到人们越来越广泛的关注。在体外构建能够模拟肝脏结构和功能的器官芯片可以更好地探究肝脏的生理病理机制以及药物在肝脏代谢过程中的响应。本文中,我们初步总结了构建三维肝脏器官芯片的四种方式:其中,多孔膜方法和3D生物打印方法便于重塑肝脏生理结构,广泛用于探究肝脏生理病理机制;无支架型的细胞团簇方法和支架型的凝胶方法培养的肝脏器官功能性更强,为探究药物在体内的响应和药物肝毒性作用研究提供了很好的方法。当前,器官芯片技术还存在一些问题:例如,芯片上的器官只是简单地模拟人体器官的结构和功能,其复杂程度终究难以与真实的体内器官相比。其次,体内的生理生化过程极为复杂,常常涉及多种器官相互作用。因此,在芯片上同时实现对多种器官的模拟以及相互链接是当下的挑战。最后,实现器官芯片的标准化以及集成传感检测仍在探索阶段,未来我们还需加大投入,促进器官芯片科研与相关产业的发展,使我国在新一轮的国际器官芯片领域的竞争中占据有利地位。

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原文顺序 | 出版日期 | 本文引用

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