生物大分子液-液相分离研究方法

赵楚斌; 汪海林

doi:10.7536/PC230222

化学进展 ›› 2023, Vol. 35 ›› Issue (10) :1486-1491 DOI: 10.7536/PC230222

综述

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生物大分子液-液相分离研究方法

赵楚斌 ¹^,² ,
汪海林 ¹^,²^,^*

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Research Methods for Liquid-Liquid Phase Separation of Biological Macromolecules

Chubin Zhao ¹^,² ,
Hailin Wang ¹^,²^,^*

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摘要

生物大分子液-液相分离是一种普遍存在的生物物理现象,是近年来生命科学领域的新兴研究热点。生物大分子通过多价相互作用不断富集,当分子浓度达到溶液中的溶解阈值,就会以液-液相分离的形式从溶液中析出。这一现象与细胞内许多重要的生物学过程(如无膜细胞器的形成等)息息相关。随着相分离相关研究的不断深入,其研究方法也在不断发展与完善。本文从相分离的原理与特点出发,对目前常用的一些相分离研究方法进行了介绍,为后续相分离研究提供方法依据,促进相分离技术和方法的进一步发展。

Abstract

The liquid-liquid phase separation of biological macromolecules is widely observed in various biological systems, and has become an emerging research focus of life science in recent years. Biological macromolecules are continuously enriched through multivalent interaction. When the molecular concentration reaches the dissolution threshold in solution, they will be precipitated from solution in the form of liquid-liquid phase separation. It is closely related to many important biological processes in cells (such as the formation of membraneless organelles). With the deepening of research on phase separation, its research methods are also developing and improving. Based on the principle and characteristics of phase separation, this paper introduces some commonly used research methods of phase separation. It provides the method basis for the subsequent phase separation research and promotes the further development of phase separation techniques and methods.

Contents

1 Principle and characteristics of liquid-liquid separation

2 Imaging technique for liquid-liquid phase separation

2.1 Optical microimaging

2.2 Single-molecule fluorescence imaging

2.3 Fluorescence correlation spectroscopy

3 Theoretical prediction for liquid-liquid separation

3.1 Phase separation prediction and modeling

3.2 Databases of phase separation related proteins

4 Conclusion and outlook

Graphical abstract

关键词

液-液相分离 / 光学显微成像 / 荧光相关光谱 / 分子模拟

Key words

liquid-liquid phase separation / optical microscopy / fluorescence correlation spectroscopy / molecular simulation

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赵楚斌, 汪海林. 生物大分子液-液相分离研究方法[J]. 化学进展, 2023, 35(10): 1486-1491 DOI:10.7536/PC230222

Chubin Zhao, Hailin Wang. Research Methods for Liquid-Liquid Phase Separation of Biological Macromolecules[J]. Progress in Chemistry, 2023, 35(10): 1486-1491 DOI:10.7536/PC230222

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1 液-液相分离原理与特性

高分子科学中的经典概念表明,多价分子在混合时会自然地组装成大的低聚物或聚合物,并且由于熵驱动效应,这种组装会固有地降低分子的溶解度,当分子浓度达到溶液中的溶解阈值,就会发生相分离^[1]。对于生物大分子(如蛋白质和核酸)来说,这种相分离以一种液滴的形态存在, 称为生物大分子液-液相分离(Liquid-liquid phase separation, LLPS)^[2]。生物大分子的液-液相分离已经被观察到,并被认为可能是无膜细胞器、染色质和肌动蛋白丝动态组装的重要机制^[3⇓~5]。近年来,越来越多的研究表明,液-液相分离参与诸多重要生物学过程的调控,如应激反应、基因表达和信号转导等^[6⇓⇓~9]。

许多蛋白质都含有的结构化相互作用域之间可以引发相分离^[10],如Prolin-rich结构域和SH3结构域,这些相互作用域经常与其他蛋白质中的短线性基序(Short linear interaction motif)相互作用^[3]。蛋白质的内在无序区域(intrinsically disordered regions, IDRs)也被认为是诱发相分离的主要驱动力之一^[11,12]。除此之外,蛋白质与核酸^[13]以及核酸自身^[14]的多价相互作用也能引发相分离。这种多价相互作用引发的液-液相分离现象具有独特的物理性质。相分离液滴在形态上保持球形,具有流动性,接触后会互相融合,可以进行内部重排和外部交换^[15]。异常的相分离则会引发疾病。如,Tau蛋白在健康神经元中能促进微管的组装与稳定^[16];而在患病状态下,Tau蛋白形成的相分离液滴会失去流动性,硬化为固体状态,使Tau-微管相互作用受损,从而导致阿尔茨海默病^[17⇓~19]。因此,对生物大分子液-液相分离的研究具有重要的生理与病理意义。

2 液-液相分离成像技术

2.1 光学显微成像

光学显微成像技术是检测体内外液-液相分离的主要研究工具之一。针对相分离液滴的物理特性,可以直观地检测其球形结构和融合现象,可以定性或定量地观察内部重排和外部交换。依据样品是否含有荧光标记,可以分别用明场显微成像技术和荧光显微成像技术来研究相分离中不同的问题。

明场显微成像技术常用于体外重构的相分离现象,具有样品无需标记、对样品影响小的优点,但是无法确认相分离液滴的分子组成和物质交换等信息。发生体外相分离时溶液会从澄清变得浑浊,观察时会看到类似水中油滴状态的液滴。使用聚乙二醇或者脂类包被载玻片^[20],可以更好地观察和记录相分离现象。Surewicz等^[21]通过明场显微技术结合浊度测定方法,探索了促进相分离液滴成熟的分子基础,探讨了液滴环境对蛋白质聚集的潜在影响。对于体内相分离,则可以利用相衬显微成像技术来反映细胞内部结构^[22]。

荧光显微成像技术广泛应用于相分离体内和体外研究中,其可选择的设备更加丰富,对相分离液滴内部的观察更为清晰,可以明确分子组成和物质交换,进行定量分析。由于只对带有荧光标记的蛋白或核酸进行观察,排除了体内其他细胞器、染色质和蛋白的影响,更有利于体内相分离的研究^[23]。同时由于荧光标记可能对样品产生影响,选择合适的荧光标记对荧光显微成像十分重要。Kanaan等^[24]将荧光标记的Tau蛋白长时间暴露于接近生理水平的细胞质环境下,使用荧光显微成像技术观察到了相分离液滴的形成。Rosen等^[3]利用荧光显微成像技术结合宽场荧光显微镜观察到人工合成的不同多价大分子之间的相互作用驱动了液-液相分离,揭示了相分离的形成机制。Zhuang等^[25]通过荧光显微成像技术结合超分辨率成像,发现过饱和状态的YTHDF蛋白通常在应激颗粒(Stress granule, SG)团簇的外围或连接处形成凝聚体,并可能通过降低活化能屏障和SG团簇形成的临界尺寸来促进SG的形成。

荧光漂白后恢复(Fluorescence redistribution after photobleaching, FRAP)实验,通过高强度激光对选择区域进行光漂白观察该区域荧光恢复过程,已被用于证明几种核仁亚室蛋白能够在体外相分离,但其最常见的用途是用于测量相分离液滴内部流动性和外部物质交换^[26,27]。Alberti等^[28]通过共聚焦显微镜对选择区域进行光漂白,观测到选择区域的荧光在短时间内恢复,从而表明同一应激颗粒内的G3BP1分子迅速重排,并与细胞质和邻近应激颗粒发生物质交换。

2.2 单分子荧光成像

单分子荧光成像技术具有探测体系中大分子的亚组分分布及其动态转化的优势,是研究天然无序蛋白(Intrinsically disordered proteins, IDP)构象与动态的有力工具。单个荧光基团的信号强度很弱,加上荧光漂白的影响,因此需要高灵敏度、低噪声和高速的检测设备。Selvin等^[29]将传统的整体FRET技术拓展到单分子水平,发展了单分子荧光共振能量转移(Single-molecule fluorescence resonance energy transfer, smFRET)技术,使得实时观察单个分子的构象变化以及运动情况成为可能。与整体FRET测量相比,smFRET技术不仅可以观察到分子之间的异质性,确定多种构象的分布,还可以观察到一些短暂存在的中间状态以及不稳定状态,实时测量生化反应的动力学参数。

smFRET是一种单分子测量技术,当荧光供体分子的发射光谱和另一个荧光受体分子的激发光谱有重叠,且它们的空间距离小于10nm时,供体分子的激发能量可以激发受体分子发出荧光,同时其自身发射的荧光强度减弱^[30]。smFRET可用于解释蛋白质在相分离过程中的构象变化^[31]。Wu等^[32]利用smFRET技术研究了Tau蛋白相分离过程中的分子内构象变化及分子间相互作用,发现Tau蛋白在相分离状态下,其N端和C端结构域打开,暴露出位于中间的微管结合区域,促进了Tau蛋白分子间相互作用,形成纳米尺度的寡聚体。Kriwacki等^[33]通过smFRET等方法发现核仁蛋白核色素(NPM1)通过静电驱动的盐依赖性构象压缩或膨胀控制不同相分离机制之间的切换。

2.3 荧光相关光谱

荧光相关光谱(Fluorescence correlation spectroscopy, FCS)是一种统计检测微区内(<10^-15 L)荧光分子的荧光强度随时间波动的相关分析方法,具有高灵敏度和高时间、空间分辨率的优点,可用于研究生物分子的构象结构和分子动力学,检测相分离中局部浓度、解离常数和扩散系数等参数。经典的FCS测量系统基于共聚焦显微镜和激发激光器,激光聚焦成衍射受限的光斑,与共聚焦检测小孔限定一个微小的检测体积,从而有效地激发和检测荧光^[34]。当在FCS测量系统中放置足够低浓度(一般为pmol/L到nmol/L)的荧光团或荧光标记的目标分子溶液时,单分子布朗扩散通过检测微区,导致可检测荧光信号的短时间爆发^[35]。

荧光相关光谱技术长期以来一直被用于研究脂质双分子层中的相分离过程^[36,37]。近年来,FCS已被应用于生物大分子液-液相分离的体内或体外研究,探索相分离液滴内部、外部和边界上的分子性质^[38]。Brangwynne等^[39]利用光诱导低聚物调节活细胞中特定位点的相分离,基于FCS能够在单个活细胞中定量生物分子浓度的能力,构建了体内相分离图。King等^[40]利用FCS在体外测量单链DNA在相分离液滴内外的扩散,研究了单链或双链DNA与阳离子多肽之间多价相互作用诱导的相分离,发现促进相分离的主导因素是柔性的DNA序列,而不是DNA电荷分布。Enderlein等^[41]通过引入双焦点荧光相关光谱(Dual-focus fluorescence correlation spectroscopy, 2fFCS),在两个分离的位置同时探测扩散动力学,得到了荧光染料Cy5扩散系数的第一个精确测量的绝对值。对于常用方法无法捕获的小尺度自由扩散凝聚体,Li等^[42]开发了一种简单而强大的定量工具——双色荧光互相关光谱(Dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy, dcFCCS),同时量化两种不同荧光物种及其在溶液中反应产物的浓度和扩散特性,捕捉到了超出常规荧光显微镜检测极限的纳米尺度凝聚体的形成,并利用此技术定量了凝聚体的尺寸、增长速率、分子组成与被招募分子的结合亲和力。

3 液-液相分离理论预测

3.1 相分离预测与模拟

蛋白的液-液相分离预测与模拟是理解蛋白折叠机制和折叠蛋白功能的强大工具,能够为实验研究提供理论预测,有助于对蛋白分子机制的解释^[43]。对于计算模拟技术,受限于计算机的算力,需要在模拟的准确度与模拟效率之间作出平衡。具有较高准确度的全原子模拟方法与将多个原子简化为单个粒子来提高模拟效率的粗粒度模拟方法是目前在蛋白相分离预测与模拟中常用的方法。

全原子模拟可以提供蛋白质序列的细节特征和与实验测量一致的残基间相互作用^[44],并已应用于Tau蛋白的构象性质研究^[19],但是它仍局限于较小系统。为了描述大尺度的现象,如相分离液滴的形成,就需要建立一个粗粒度模型。粗粒度模型可以通过将多个残基简化为单个球、单个残基简化为单个球或单个残基简化为多个球等方法建立^[45],也可以从更详细的原子模型中派生^[46]。Brangwynne等^[47]为了研究核糖核蛋白(RNP)体内部子室的形成机制,结合体内和体外研究,将每个分子简化到只有几个相互作用位点,在立方晶格上进行粗粒度模拟,结果表明液滴不同组分间的弱优先相互作用可以诱导不同组分的远距离空间结构。

3.2 相分离相关蛋白数据库

生物大分子液-液相分离作为生命科学领域的研究热点,已建立了多个相分离相关的蛋白数据库。其中最主要的几个数据库包括PhaSepDB、PhaSePro、LLPSDB v2.0和DrLLPS。

PhaSepDB^[48](http://db.phasep.pro)是一个手动管理的相分离相关蛋白数据库,目前已更新至PhaSepDB2.1版本^[49]。作为一个相对较大的数据库,PhaSepDB包含1419个相分离相关蛋白条目、770个低通量和7303个高通量无膜细胞器相关蛋白条目(截至2023年2月)。数据库记录了每个蛋白质的基本信息、功能和所属无膜细胞器,提供了所有人类蛋白质的相分离序列模式,有详细的相分离蛋白注释,包括相分离验证实验,不同实验条件的相图、液滴状态和相分离调控信息。但是该数据库没有区分相分离的驱动程序和调节程序,且大多数相分离蛋白没有可靠的证据支持。

PhaSepPro^[50](https://phasepro.elte.hu)是一个小而精的相分离蛋白数据库,包含121种经验证可驱动相分离的相分离相关蛋白(截至2023年2月)。PhaSepPro具有更加严格的筛选标准,完全基于相分离的实验验证案例,提供了全面的相分离驱动蛋白列表,以及关于相分离液滴的生物学相关性和调控的详细注释。

LLPSDB v2.0^[51](http://bio-comp.org.cn/llpsdbv2)是基于LLPSDB^[52](http://bio-comp.org.cn/llpsdb)开发的新版数据库,包含2917个相分离相关蛋白条目(截至2023年2月)。LLPSDB v2.0整理了相分离体外实验中涉及的所有蛋白质及其实验条件,记录了蛋白质结构构象及实验中使用的核酸信息。该数据库提供的验证实验主要集中在体外实验,因此对体内环境可能并不适用。

DrLLPS^[53](http://llps.biocuckoo.cn)是一个综合的相分离蛋白数据库,包含164个真核生物物种中437887个已知和计算检测到的相分离相关蛋白(截至2023年2月)。DrLLPS区分了驱动相分离的支架(scaffold)蛋白,有助于调节相分离的调节(regulatory)蛋白,以及可能参与无膜细胞器形成的潜在被招募(client)蛋白,进行了涵盖蛋白内在无序区域、结构域、翻译后修饰和遗传变异等16个方面的详细注释。但是该数据库大多数相分离蛋白没有可靠的实验证据。

4 结论与展望

生物大分子液-液相分离是一种普遍存在的细胞组织机制,由细胞内组分的液体性质和大分子相互作用驱动。虽然液-液相分离调节多种细胞功能,但其形成的具体机制和驱动因素尚不清楚。目前相分离的研究方法主要包括体外重组和体内原位成像。由于每种技术的局限性,对相分离的研究往往需要结合多种技术方法在体内和体外同时进行验证。分子模拟等计算技术可以帮助填补理论、体内和体外数据的一些空白,但仍有不足。发展更先进的方法应用于相分离的研究,是该领域的主要挑战之一。近几年也有许多新技术应用于相分离现象的研究,如冷冻电镜^[54]、原子力显微镜^[55]和X射线光子相关光谱法^[56]等,虽然方法尚未成熟,但应用前景十分广阔。最近Savitski等^[57]利用细胞原位冷冻电镜对腮腺炎病毒复制体进行三维重构的研究,发现持续的病毒复制工厂是动态凝聚体,且无序的病毒磷蛋白是驱动其组装的重要因素。Hummer等^[58]利用荧光寿命成像-荧光共振能量转移(Fluorescence lifetime imaging of fluorescence resonance energy transfer, FLIM-FRET)技术,结合粗粒度分子模拟,研究核孔复合体(NPC)中FG-NUP内在无序蛋白建立的运输通道,确定了该纳米级运输通道内未知的分子环境可以使得FG结构域采用扩展构象,从而控制细胞核和细胞质之间的物质运输。当前技术的发展以及新方法的开发对探究相分离现象十分重要,如进一步发展高分辨率冷冻电镜在相分离蛋白结构研究中的应用,以及开发人工智能、机器学习等技术提高相分离蛋白预测与建模的效率与准确度等。

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