RIfS干涉基底的制备、应用及展望

苏倩倩; 孙宇; 张文文; 彭正得; 钱卫平

doi:10.7536/PC230410

化学进展 ›› 2023, Vol. 35 ›› Issue (12) :1793-1806 DOI: 10.7536/PC230410

综述

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RIfS干涉基底的制备、应用及展望

苏倩倩 ¹^,^* ,
孙宇 ¹ ,
张文文 ¹ ,
彭正得 ¹ ,
钱卫平 ²

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Preparation, Application and Prospect of RIfS Interference Substrates

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摘要

反射干涉光谱(Reflectometric interference spectroscopy,RIfS)是一种利用白光干涉原理来对薄膜光学厚度进行测量的非标记检测技术。干涉基底作为RIfS系统的传感单元,是RIfS技术的核心部分,也是决定RIfS系统性能的关键。目前使用的干涉基底通常被分为两大类:一类是以无机氧化物或聚合物薄膜为代表的平面固体基底,另一类是以多孔硅(pSi)、纳米多孔阳极氧化铝(NAA)以及二氧化硅胶体晶体(SCC)为代表的多孔基底。平面固体基底制备简单且信号稳定,但是检测灵敏度通常比较低;多孔基底具有较大的比表面积,可以捕获更多待测分子,因此与平面固体基底相比检测灵敏度有所提高,并且具有更多的调节空间,非常适合生化传感平台的开发。从pSi到NAA再到SCC,多孔基底制备的可控性及传感性能不断提高,成为RIfS干涉基底的发展方向。本文对RIfS干涉基底发展现状进行了总结和讨论,阐述了基底的常用制备方法,总结了其在生物传感领域代表性的应用,重点讨论了不同基底的优缺点,并对干涉基底未来的发展进行了展望。

Abstract

Reflectometric interference spectroscopy (RIfS) is a label-free detection technique by measuring the optical thickness of thin films which is based on white light interference. Interference effective substrates, as the sensor unit of the RIfS system, the construction of which is the core part of RIfS technology and the key to determining the performance of the RIfS system. Currently used interference substrates are generally divided into two categories: one is the planar solid substrates represented by inorganic oxides or polymer films, and the other is the porous substrates represented by porous silicon (pSi), nanoporous anodic alumina (NAA) and silica colloidal crystals (SCC). The preparation of planar solid substrate is simple and the signal is stable, but the detection sensitivity is usually low. In comparison with planar solid substrates, a porous substrate can provide a three-dimensional structure with a large specific surface area which will result in increased ligand immobilization density and capture of analyte. Therefore, the detection sensitivity is improved and there is more room for adjustment, which is very suitable for the development of a biochemical sensing platform. From pSi to NAA to SCC, the preparation controllability and sensing performance of porous substrates are continuously improved, which is considered a promising development direction of RIfS interference substrate. Here, the research status of RIfS interference substrates has been summarized and discussed, the common preparation methods of substrates are described, their representative applications in biosensing are summarized, the advantages and disadvantages of different substrates are discussed, and the future development directions of RIfS interference substrates has also been outlined.

Contents

1 Introduction

2 Measurement principles of reflectometric interference spectroscopy

3 Interference substrate

3.1 Planar solid substrate

3.2 Porous silicon substrate

3.3 Nanoporous anodic alumina substrate

3.4 Silica colloidal crystals substrate

4 Conclusion and outlook

Graphical abstract

关键词

反射干涉光谱 / 干涉基底 / 纳米多孔阳极氧化铝 / 多孔硅 / 胶体晶体

Key words

reflectometric interference spectroscopy / interference substrate / nanoporous anodic alumina / porous silicon / colloidal crystal

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苏倩倩, 孙宇, 张文文, 彭正得, 钱卫平. RIfS干涉基底的制备、应用及展望[J]. 化学进展, 2023, 35(12): 1793-1806 DOI:10.7536/PC230410

Qianqian Su, Yu Sun, Wenwen Zhang, Zhengde Peng, Weiping Qian. Preparation, Application and Prospect of RIfS Interference Substrates[J]. Progress in Chemistry, 2023, 35(12): 1793-1806 DOI:10.7536/PC230410

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1 引言

在生物医药领域中,能够动态、原位、实时地进行生物分子之间相互作用检测的非标记型生物传感器,已被广泛应用于探索生物大分子之间相互作用过程的动态监测,并且表现出传统分析方法很难达到的效果。反射干涉光谱(Reflectometric interference spectroscopy,RIfS)作为一种利用白光干涉原理来对薄膜厚度进行测量的非标记检测技术^[1],成为构建原位、实时非标记生物传感器的主要技术之一^[2,3]。

简单来说,当一束白光照射通过薄膜的上下表面时,发生了反射和折射,最终会产生两束可以相互干涉的反射光,形成干涉图谱。当有物质吸附或者结合到薄膜的表面或内部时,薄膜光学厚度(薄膜物理厚度d与薄膜折射率n的乘积)发生改变,这种改变会导致干涉图谱中的干涉峰位置发生偏移。通过实时监测这种改变,就可以对分子之间的相互作用进行原位、实时的检测,这是一种非常简单、廉价、稳定且可靠的非标记分析方法^[4]。与其他方法相比,RIfS技术优势在于其简单、便携、小型化潜力和快速响应时间,并能够对反应动力学进行分析,这些优点使其在生物大分子分析领域的应用越来越多^[5]。近年来,生物大分子药物的研发一直都是热门领域,这也为RIfS技术的发展提供了不可忽视的助力。

2 反射干涉光谱的测量原理

早在1937年,Langmuir等^[6]就提出并应用了用于LB(Langmuir-Blodgett)膜分析的光学干涉法。之后,干涉技术就一直被研究,主要应用于膜厚测量领域。20世纪80年代末,RIfS的前身——谱干涉法被提出,作为一种新型的非标记检测技术,它一出现就受到了广泛关注。1993年,Gauglitz课题组使用二极管阵列光谱仪建立了首台可以实时、原位检测薄膜光学厚度变化的反射干涉光谱仪,正式建立了RIfS技术^[7]。

当一束光线R以一定的入射角度α投射到厚度为d、折射率为n的薄膜上时(图1A),它会依次在薄膜的上下两个表面上发生反射和折射。由于上下表面均可使光反射,上表面产生的反射光在遇到下表面时一部分会透过并射出,另一部分会再次反射,所产生的反射光会遇到上表面并再次进行反射……如此往复导致在薄膜的上下表面之间产生多组反射光,并且有多组反射光从下表面射出。用R₁和R₂来表示两束主要的反射光,我们这里只考虑这两束光,因为其对总反射光光强的贡献最大(约99.9%)^[8]。从第一个表面(这里记作薄膜的下表面)直接反射回来的光线记作R₁,其光强记作I₁。另一部分光折射进入薄膜,并从薄膜上表面反射回来,在经过薄膜下表面时,还要发生一次反射和折射,折射后透过下表面的那部分光线记作R₂,其光强记作I₂。

两束光干涉叠加后的光强满足以下公式^[8]:

$I λ = I 1 + I 2 + 2 I 1 I 2 c o s (4 π λ n d 1 - n 02 n 2 s i n α)$

其中,n₀为入射介质的折射率。当光线垂直于薄膜入射时,

s i n α

= 0,上述公式可简化为:

$I λ = I 1 + I 2 + 2 I 1 I 2 c o s 4 π n d λ$

根据上述公式可以看出,两束光线叠加后的光强随着波长呈现周期变化,I_λ的极大值出现在2nd /λ = m处(m = 0,1,2…)。这就是著名的Fabry-Perot薄膜干涉公式,即mλ = 2nd 。由该公式可知,干涉峰的波长λ与n或d直接相关,因此,n或d的任何变化都会导致干涉峰波长的偏移。如图1所示,对于平面基底,物质的结合或解离在薄膜的表面发生,直接改变薄膜的厚度d,从而导致测量得到的干涉图谱中干涉峰的位移(图1B),位移的量通常用图谱中任意相同阶数干涉峰波长的位移Δλ表示;而对于多孔基底,由于比表面积较大,物质的结合或者解离大多发生在多孔的内表面,因此物质结合或者解离带来的改变主要表现为薄膜平均折射率n的变化,根据薄膜干涉公式,这同样会导致干涉峰的位移。

RIfS技术通常将一束白光垂直照射在干涉基底上,并利用光谱仪实时记录反射干涉光谱,再根据干涉公式,通过软件拟合计算出干涉基底的光学厚度(Optical thickness,OT,即干涉基底的物理厚度d与薄膜折射率n的乘积)。分析时跟踪反射干涉光谱中干涉峰的位置变化并实时转变为干涉基底OT的变化,利用OT的实时变化可以更加直观地反映物质的结合或者解离。一般来说,干涉峰的红移反映为OT的增加,代表着物质的结合;干涉峰蓝移反映为OT的减少,代表物质的解离;OT变化的速度代表了结合或者解离的快慢。RIfS技术非常容易获得干涉光谱,整个分析系统简单高效,因此干涉基底的构筑是RIfS技术的关键部分,也是衡量RIfS系统的标准。基底的优缺点在很大程度上直接决定了整个RIfS系统的优缺点,所以,选择合适的干涉基底显得尤为重要。

3 干涉基底

随着RIfS技术的发展,研究人员对干涉基底的研究也越来越深入^[9]。干涉基底的构筑始终是RIfS传感方法的关键部分。干涉基底的好坏决定了以该干涉基底为传感单元的RIfS系统的好坏。目前来说,经常被使用的干涉基底通常被分为两大类:一类是以无机氧化物或者聚合物薄膜为代表的平面固体基底,另一类是以多孔硅(Porous silicon, pSi)、纳米多孔阳极氧化铝(Nanoporous anodic alumina, NAA)以及二氧化硅胶体晶体(Silica colloidal crystals, SCC)为代表的多孔基底。平面固体基底虽然制备上来说比较简单而且信号稳定,但是通常来说检测的灵敏度比较低,而多孔基底,因为具有较大的比表面积,所以使得检测的灵敏度有了一定的提高,并且多孔结构使得基底具有更多的调节空间,成为干涉基底开发和研究的热点。

3.1 平面固体基底

平面固体基底是最早研究和使用的干涉基底,其干涉敏感层以无机氧化物或聚合物薄膜为代表,平面固体干涉基底由于其制备简单和操作简便被大量研究。平面固体干涉基底通常采用高折射率载体表面^[10],通过旋涂、化学气相沉积等方法在其上沉积几微米厚的分析物敏感聚合物/氧化物层作为干涉层,干涉层的平整程度是影响其传感性能的关键。检测时,不同波长的光波被载体表面的干涉层拦截,并在每个界面处发生部分反射,即载体-干涉层界面和干涉层-样品(气体或液体)界面的反射。这两个部分反射的光束叠加并聚焦在同一个检测器上(图1)。由于两束光的光程差,在记录的光谱中观察到交替的相消干涉和相长干涉。气体或液体渗透引起的薄膜膨胀或分子在干涉层上的吸附改变了其中部分光束的光程长度,从而导致干涉图谱的偏移。该偏移量与吸附或渗透到干涉层的分析物量成正比,而观察到偏移量随时间变化符合吸附动力学的特征。基于这些现象,以平面固体薄膜作为干涉基底的RIfS技术成为一种简单而稳健的传感方法^[11,12]。总结来说,干涉光谱中各个干涉峰的波长位置随干涉层OT的变化而变化,干涉条纹取决于干涉层的光学厚度。RIfS利用可见光干涉来证明薄膜折射率变化或厚度增加,进而实现待测物质的检测或者分子之间相互作用的分析^{[13⇓⇓⇓⇓~18]}。

1992年,德国蒂并根大学Gauglitz课题组^[8]第一次发表了从干涉谱图中提取薄膜光学厚度的三种算法:极值跟踪法、傅里叶能谱法以及非线性回归法,总结比较了这三种算法各自的特点以及它们的优劣。随后Gauglitz课题组^[7]又使用二极管阵列光谱仪建立了世界上第一台可以实时、原位检测光学厚度变化的反射干涉光谱仪。在之后的时间里,Gauglitz课题组采用RIfS方法,并以聚合物薄膜或者无机氧化物薄膜作为干涉基底,对许多生物分子之间的相互作用进行了实时、原位的分析,如蛋白质^[19,20]、DNA^[21]和抗体抗原等。此外,国内也有关于RIfS的报道:钱卫平课题组^[22]以自旋涂布法得到了超平整的聚苯乙烯膜,并以其作为干涉基底,对乙肝表面抗原进行了定量分析。

平面固体基底不仅是最早发展起来的一类干涉基底,还是发展最成熟的一类干涉基底,目前已成功地进行了商业化应用。利用RIfS技术原理,以镀在光纤头表面的金膜作为平面干涉基底,Fortiebio公司开发了一系列分子相互作用分析仪,如Octet Red96e型分子互作分析仪可以用于分析分子量低至150Da的分子间相互作用过程。该产品还具有高通量8道平行检测的模式,检测速度更快,检测效率更高,被广泛地应用于药物筛选、蛋白质定量检测、抗体筛选等领域。

平面固体基底制备方法简单、信号稳定,是目前发展最成熟的一类干涉基底,其商业化设备广泛应用于定性、定量以及反应动力学分析。但是,平面固体基底也有一定的缺点:如因为只有平面结构,基底比表面积小,所以在生物分析中产生的光学厚度的变化量就非常有限,有时会导致检测的灵敏度达不到检测的要求,这也成为制约以平面固体基底为干涉层的RIfS技术发展的主要原因,所以开发新的干涉基底就显得尤为重要。

3.2 多孔硅基底

多孔硅(pSi)是一种纳米结构材料,由于其多功能性,在传感、光电子、微机械、生物技术、晶片技术等方面有着大量的应用^[23]。pSi因其比表面积高、特征尺寸可调、光致发光、生物相容性好以及可生物降解等特性在光学和生物传感领域的研究和应用受到广泛关注^{[24⇓⇓⇓⇓⇓~30]}。具有纳米多孔结构的pSi因具有极大的比表面积,可以捕获更多的被分析物从而提高检测灵敏度,很好地弥补了平面固体基底检测灵敏度不够的缺点,因此,以pSi作为干涉基底的研究也越来越多^[31⇓~33]。

pSi是Uhlir^[34]在1956年的一次电化学实验中意外发现的,但直到1990年,当Canham^[35]在室温下发现其固有光致发光(PL)特性时,这种材料才受到应有的重视。图2为多孔硅基底的侧面扫描电子显微镜(SEM)图^[36]。虽然有多种方法制备PSi结构,但在氢氟酸(HF)溶液中对硅片进行阳极电化学刻蚀仍然是最常用的方法。该法通常将硅片作为阳极,铂电极作为阴极,以HF溶液作为电解液,在蚀刻电池的作用下形成蚀刻电流以实现对硅片的刻蚀。这是一种不需要昂贵设备的制造方法,在一定程度上可以控制材料的孔径和光学响应^[37,38],所得pSi通常具有不规则柱状多孔结构(图2),孔径范围从几纳米到几百纳米不等。孔隙率受刻蚀电流密度控制,多孔结构层的厚度也从几百纳米到几微米,一般比平面固体基底厚得多。在基底制备过程中,为了使制造的pSi基底具有良好的再现性,需要精确控制硅片的导电类型、掺杂水平、电解液中氢氟酸的浓度、外加电压、电流密度、光强和温度等多个参数^[39]。不同类型硅片的刻蚀模式也不相同。在实际操作过程中,改变某一参数通常会同时改变所得pSi的孔隙率、孔洞形态以及孔径,想要精确控制pSi的孔洞性状、大小和孔隙率非常困难。因此,pSi制造的重复性是制约其应用的重要原因之一。

pSi结构的光学响应受到其结构特性(如孔隙率、层厚度、孔径和形貌)的影响^[40]。pSi可以根据孔径大小分为微孔硅(孔径d<2 nm)、介孔硅(孔径2 nm<d<50 nm)和大孔硅(直径d>50 nm)^[39]。大孔硅和介孔硅通常用作生物传感平台,因为在这个尺寸范围内,生物分子能够顺利进入多孔结构并附着其中。利用大孔或介孔pSi进行分析时^[41,42],可以通过反射光谱监测分析物的捕获,或者通过介孔中^[43⇓~45]的光致发光监测分析物。

多孔硅基底的一个显著优点是pSi的高表面反应性^[46],通过使用成熟的化学修饰方法^[47,48],可以很容易地将生物分子固定在多孔基质中。Sailor研究组^[49]利用多步修饰将蛋白质A功能化到多孔硅基底的表面,从而实现了对人类IgG的检测,此传感器可以多次循环使用。Tang等^[50]使用pSi作为传感平台,通过在其表面逐步修饰硅烷偶联剂(APTES)、戊二醛以及大肠杆菌抗体来功能化传感基底,结合微流控技术实现了大肠杆菌的检测。细菌密度在10³~10⁷ CFU/ mL范围内与光学厚度的减少呈线性相关。Segal等^[51]开发了一种基于辣根过氧化物酶(HRP)功能化的pSi基底的重金属无标记检测方法,该方法简单快速,很好地弥补了传统重金属检测方法耗时且程序繁琐的问题。他们首先将pSi基底表面氧化,然后使用APTES和二异丙基乙胺(DIEA)对氧化的表面进行氨基修饰,最后利用N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)交联剂活化将HRP固定在基底表面完成基底的功能化。利用该装置,可以实时监测酶的催化活性。当重金属结合后HRP活性位点发生构象变化,从而抑制酶的活性。该生物传感器对Ag⁺、Pb²⁺和Cu²⁺的检测限为60~120 ppb。

此外,由于pSi内部体积大^{[52⇓⇓⇓~56]},可作为其他纳米材料的基底。而这一特性使pSi比其他纳米材料更具有生物传感应用的价值。将不同元素组合到pSi中,增加了开发混合平台的可能性,且在灵敏度、信号增强、信号稳定性和双模检测等方面表现出了更强的生物传感性能。其中,利用抗体作为捕获待测物质的探针而进行分析的免疫传感器最为常见。Zhuo等^[57]报道了一种基于TiO₂-pSi复合基底的免疫传感器,用于快速检测S-层蛋白(SLP),这是一种能在某些细菌菌体表面自组装成规则晶格的单分子表面层的蛋白质。他们将TiO₂溶液旋涂到pSi基底上并结合微流控技术构造复合基底传感平台,并通过逐步将蛋白质A和抗SLP抗体固定在基底表面实现传感基底的功能化,最终实现了SLP的快速分析。该传感器利用TiO₂层提高了基底的折射率,并利用吸附在基底表面的蛋白A作为间隔物,降低空间位阻,改善抗原-抗体相互作用,显著提高了传感器的灵敏度。Myndrul等^[58]开发了一种用于检测黄曲霉毒素B₁ (AFB₁)的pSi/Au免疫传感器,用来检测食品中黄曲霉毒素B₁。该方法首先通过化学或电化学的方法在pSi衬底上沉积一层薄薄的Au膜,并通过在Au膜修饰的11-巯基十一烷酸(MUA)分子固定蛋白质A,最终实现AFB₁抗体的固定。该传感器的检测限可达2.5±0.5 pg/mL,能够在0.01~10 ng/mL范围内实现对AFB1的高灵敏检测。

大多数基于pSi的生物传感器都是非标记生物传感器,光学信号变化依赖于pSi层折射率的变化,这是由于用目标分析物替换孔隙内的空气所致。折射率的变化可通过检测反射光谱中峰波长的偏移获得。很多基于pSi基底的生物传感器被开发出来,表1^[59]总结了使用pSi光学传感平台检测生物分子的情况。能够看出,pSi光学传感平台广泛用于检测不同的生物分子(包括DNA、酶、细胞、细菌等)。上述分析大多是在干净的缓冲液中进行的,在复杂介质中检测分析物仍然是一个挑战。Bonanno等^[60]基于PSi基底开发了一种竞争结合的方法来检测尿液标本中的阿片类药物。他们发现通过改变基底的表面化学性质和添加到多孔基底中尿液样本的体积,可以提高测定的灵敏度和特异性。此外,不同孔隙率的PSi层的制备,改善了孔隙的渗透。他们通过预先氧化,硅烷化连接氨基,牛血清白蛋白(BSA)封闭,最后将吗啡类似物(M3G)通过赖氨酸基团共价结合到PSi基底表面。检测时,如果尿液样本中含有游离阿片类药物,药物则会提前与抗体结合,竞争抗体的结合位点,使抗体无法与固定在基底表面的M3G结合;反之则能够观测到抗体在基底上的结合。该法对阿片类药物的检测限为0.018 μmol/L,操作简单、成本低,在现场诊断分析中具有明显的吸引力。

除了上述诸多优点外,pSi基底的缺点也同样明显。首先,电化学刻蚀的方法一次只能制备一片基底,因此pSi基底的规模化制备较难实现;其次,从pSi的电镜图中也可以看出,其多孔结构是无序且不规则的,制备方法的可控性较差,不同基底之间的重复性是需要注意的关键问题,从一定程度上限制了pSi基底的应用;最后,新刻蚀获得的pSi表面含有大量氢化物端基(如Si-H、Si-H2和Si-H3),这使得pSi非常活泼且不稳定,在水溶液或碱性溶液中极易发生氧化和进一步的降解,从而极大地影响了pSi基底地理化性质和光电特性,如在RIfS传感过程中的基线漂移^[61],因此在使用前需要对基底表面进行充分的氧化以获得稳定的基线,但是稳定的基线并不容易得到,在分析之前往往要进行基线漂移的验证,这在生物传感中是非常不利的,也极大地限制了pSi基底在生物传感方面的应用。

综上所述,pSi基底的优点和缺点都非常明显,但这并不妨碍研究人员对它在生物传感应用中的兴趣,大量基于pSi基底的生物传感应用案例被开发出来。然而,作为干涉基底,多孔硅并不能完全满足分析和传感的需求,因此新的多孔基底有必要被开发出来。

3.3 纳米多孔阳极氧化铝基底

多孔硅(pSi)、纳米多孔阳极氧化铝(NAA)和二氧化钛纳米管阵列(TiNTs),是研究人员作为化学和生物传感基底的首选^[62,63]。NAA具有优异的化学、光学和机械性能,如热稳定性好、硬度大、生物相容性好和比表面积大。特别是当目标分子(分析物)附着在纳米孔内时,NAA的高比表面积对于增强光信号非常有用^[63]。因此,NAA是能够开发先进、智能、简单和经济高效的分析设备的优秀平台,可以通过平台开发实现复杂的相关应用,如选择性分子分离、化学/生物传感、催化、细胞黏附和培养、数据存储、能量生成和存储、药物递送和模板合成^{[63⇓⇓~66]}。最近,NAA也因其有序的纳米多孔结构、优异的光学活性以及结构和化学性质的可变性,被广泛应用于RIfS系统^[62]。与pSi基底相比,NAA基底更稳定,不会因基底表面的氧化导致基线漂移。

1953年,Keller等^[64]首次将阳极生长氧化铝的结构描述为具有阻隔层和紧密堆积的带孔六角柱形多孔层的双重结构。图3为典型的NAA结构的示意图^[65]。如图3所示,NAA的结构可以描述为具有紧密堆积的柱状六边形,其中心具有垂直于铝基板表面生长的圆柱形孔。NAA的主要结构参数是孔径(D_p)、孔间距离(D_int)、孔长(L_p)和氧化物阻隔层厚度(L_b),这些结构特征可以通过阳极氧化条件精确控制。通常,各个参数的变化范围如下^[67⇓~69]:孔径10~400 nm、孔间距离50~600 nm、孔长从几纳米到数百微米、氧化物阻隔层厚度30~250 nm。另外,NAA的其他重要特征参数是其孔密度(

δ

_p)和孔隙率(p),可分别控制在10⁹~10¹¹/cm²和5%~50%之间。值得注意的是,在阳极氧化过程中,孔洞底部氧化物生长与溶解之间的电化学平衡,是维持纳米孔稳定生长和形成六边形带孔柱状结构的关键^[68,69]。

在过去几十年中,人们广泛研究了阳极氧化条件对NAA结构特征和孔自组织的影响^[70⇓~72]。阳极氧化参数,如阳极氧化电压、电解液类型、浓度和温度,是控制自序过程和所得NAA结构几何形状的最关键因素。1995年,Masuda和Fukuda通过两步阳极氧化工艺成功制备了高度自组织的NAA^[73]。在这种方法中,通过第一次阳极氧化获得的多孔氧化物层被选择性地去除以实现铝表面的预构造。这导致在第二次阳极氧化步骤期间孔从上到下的完美自组装。铝表面的预构造改善了两步/多步阳极氧化期间的孔排列。然而,这种温和阳极氧化的固有缺点是孔生长速率较慢,根据条件的不同在2~7 μm/h范围内变化。这一问题通过Gösele等^[67]提出的一种称为硬质阳极氧化(Hard anodizing,HA)的新阳极氧化方法得以解决。在HA条件下(即高压和低温),孔生长速率可以提高至50~100 μm/h,与温和阳极氧化法相比速率有了明显提高。这两种阳极氧化方法在不同的电解条件下结合化学蚀刻,为设计具有所需孔径和形状的NAA结构提供了新方法。NAA的结构(即孔径、孔长和孔间距离)和化学(即杂质的分布和含量、结晶相)特性对确定其光学特性至关重要。因此,制造工艺和结构控制成为设计基于NAA的光学传感器件的关键因素。

An等^[74]研究了孔径对NAA干涉信号的影响,他们通过监测NAA孔内吸附BSA和PSA(前列腺特异性抗原)后NAA有效光学厚度的变化,比较了NAA孔径加宽前后的RIfS性能。结果表明,宽孔径的NAA基底具有更好的灵敏度。Macias等^[75]制造了一种具有不同孔径的双层NAA-RIfS传感平台。这种特殊结构的NAA基底较普通NAA基底具有更加复杂的反射干涉光谱。他们通过观测发现,BSA分子仅能在双层结构孔径较大的上层发生结合,这是因为生物大分子在孔筛的作用下仅能进入上层,这项研究结果提示可以利用孔径实现不同大小分子的同时分析。这种具有特殊结构的新型NAA基底的设计和开发也为NAA基底的应用提供了新的思路。

目前,NAA基底与RIfS结合可用于对气体、有机物和生物分子等进行高灵敏度的定性和定量检测。例如,Pan等^[76]制备了用于互补DNA无标记检测的NAA-RIfS传感平台。Sailor研究组^[77]以pSi为干涉基底构筑了大量的生物传感平台,但是由于pSi基底表面在水溶液中不稳定,需要充分氧化才能使用,他们以NAA替代pSi作为干涉基底构筑了一种免疫传感器,该传感器对pH稳定,且只有当NAA孔内发生特异性的抗原抗体结合反应时,才发生显著的光学厚度变化,在检测过程中显示了非常好的灵敏度。该传感器首次实现了对蛋白质之间相互作用的实时测定,这对反应动力学参数的测定是非常重要的。随后,Losic研究组^{[78⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓~88]}利用改进后更有序的NAA基底构筑RIfS传感系统(图4),开展了一系列研究工作。如图4所示,

Losic研究组Kumeria等^[70]采用3-巯基-二氧基硅烷(MPTES)对NAA基底的多孔表面进行了修饰,实现了Au³⁺的超灵敏检测;其还对NAA的RIfS信号优化进行了全面的研究^[79],通过改变孔径大小、孔径长度和表面涂层等参数,获得了基于RIfS传感平台最优的NAA结构。随后,Losic研究组通过在这种最优的NAA基底上涂上特定的金属层,从而实现了对氢气^[80]、硫化氢及其他挥发性硫化物^[81]的检测。在生物传感方面,Losic研究组探索了该分析技术在肿瘤细胞检测^[82]以及酶活性测定^[83]中的应用,对循环肿瘤细胞(CTCs)的检测范围为1×10³~1×10⁵ cells/mL,检测限<1×10³ cells/mL,检测时间小于5 min。Losic研究组^[84]还利用这类传感系统,实时监测了药物分子(吲哚美辛)在流动的液体中的释放过程,证明了基于NAA基底的RIfS传感系统不仅能够通过对NAA基底多孔表面的修饰来特异性捕获待测分子从而达到检测待测分子的目的,还能够分析固定在NAA基底多孔表面的分子的释放行为。

除了Losic研究组的工作外,基于NAA的生物传感器还在各个领域有着大量的应用。根据固定在基底表面的功能化分子不同,这些生物传感器主要有免疫传感器、核酸适配体传感器、酶基传感器以及多肽传感器等。抗体是生物传感系统中最常用的探针,特异性抗体或其抗原结合片段可作为针对精确抗原的生物传感器分子识别元件。Lee等^[89]以对应的抗体作为功能化探针,实现了肺癌特异性生物标志物血清淀粉样蛋白A1 (SAA1)的定量分析。他们在NAA表面涂上了Ni/Au,然后将SAA1的抗体固定在其上。向样品池注入SAA1溶液后进行测量,光谱中峰波长红移表明SAA1抗原与固定在NAA-Au顶部的抗体相互作用,分析范围为 1 fg/mL ~1 μg/mL,检测限为100 ag/mL。用同样的功能化策略还能够实现对C反应蛋白的分析^[90]。Rajeev等^[91]则通过将肿瘤坏死因子α(α-TNF)抗体固定在NAA基底的表面实现了对α-TNF的检测,检测范围为100~1500 ng/mL。

核酸适配体传感器是一种利用合成的核酸序列作为检测元件的生物传感器^[92]。适配体比抗体小,在相同的表面积下,固定在基底表面的功能化分子数量比免疫传感器多,因此,适配体传感器的线性响应范围在大多数时候都比免疫传感器宽。适配体也成为生物传感器常用的功能化分子,能够分析细胞、蛋白、离子等多种物质。Pol等^[93]研究了一种基于RIfS技术的适配体传感器,用于测定凝血酶(TB)。他们经过一系列修饰后将能够与TB特异性结合的适配体固定在基底表面,利用TB与适配体结合后基底光学厚度的变化实现了TB的实时检测,检测范围0.54~2.70 μmol/L,检测限为7.2 nmol/L。Tabrizi等^[94]研究发现,利用光强的变化来设计定量分析比利用干涉峰迁移设计定量分析的传感器有更高的灵敏度,他们设计了一种利用反射光强度变化来定量分析β-淀粉样蛋白,检测限可以达到0.02 μg/mL。利用适配体作为功能化分子,还可检测纳摩尔浓度范围的铅离子。除了上述传感器外,酶、蛋白质分子或者多肽片段也常被用来作为NAA生物传感器的功能化分子。

通过以上的研究发现,NAA薄膜作为RIfS干涉基底具有以下优点:首先,与pSi基底相比,NAA基底的表面稳定性更好,不需要在使用前进行充分的氧化,便于生物传感系统的构筑;其次,NAA基底的制备方法更加可控,可调节性更好,所得多孔结构也更加规则有序,这对基底制备的重复性是很大的提高;最后,和pSi基底一样,NAA基底表面也很容易进行修饰,可以固定多种分子从而实现NAA基底的功能化。虽然NAA干涉基底有许多优点,但是也同样存在着部分缺点。由于阳极氧化的方法一次只能制备一片薄膜,大规模制造的重现性仍然是一个问题;此外,不管是多孔硅还是NAA基底都是不透明的多孔结构,因此其反射干涉信号只能从多孔结构的上面采集,容易被样品颜色、透明性等性质影响,而有色或者浑浊样品在生物传感中,尤其是实际样品测定中是经常会遇到的情况,因此,这类基底仍然存在着改进的空间。

3.4 胶体晶体基底

胶体晶体是由单分散的胶体颗粒组成的二维或三维有序阵列结构,在重力、静电力或毛细力的作用下组装而成,其具有较高的表面积,其膜厚可控制在几微米内。目前关于胶体晶体已经开展了大量研究,其中大部分工作集中在光子晶体组装以及光子带隙的构建上^[95⇓~97],胶体晶体的应用也多基于这些性质^[98,99]。其中,SiO₂胶体晶体(SCC)薄膜均匀、有序、透明,光学信号可以从SCC薄膜的底部采集,因此即使被分析溶液是有色或者浑浊的,也不影响光学信号的采集^[100]。基于此,以SCC为干涉基底构筑RIfS传感系统获得了研究人员的关注。此外,与NAA薄膜的柱状孔洞不同,SCC基底中的孔是相互连通的,这更有利于被测物分子在孔内的扩散。

截至目前,胶体晶体的制备方法有很多,表2列举了一系列胶体晶体的制备方法及其特点^[101],可根据不同的应用需求选择不同的制备方法。其中Colvin等^[102]通过“垂直沉积法”从单分散的SiO₂纳米球乙醇悬浮液中蒸发乙醇,在载玻片上形成了多层SCC结构。该方法简单、可重复且价格低,主要用于大规模制备SCC球膜。以这种方法制备胶体晶体需要精确控制液体蒸发过程中的各项参数,包括悬浮液中颗粒的体积分数、室温、湿度、溶剂的种类、地面振动以及气流等^[103,104],其中,颗粒的体积分数对所得SCC的厚度影响最大。然而,组装是一个缓慢的过程,一般需要几天的时间来完成溶剂的蒸发以实现胶体晶体的组装,因此悬浮液中的颗粒体积分数并不总是保持不变。至少有两个因素可以改变颗粒体积分数:颗粒体积分数随溶剂蒸发而增加,随颗粒沉降而减少。只有当溶剂蒸发和颗粒沉降引起的体积分数变化处于平衡状态时,颗粒体积分数才能保持不变。因此,沿生长方向上晶体厚度一般会出现梯度变化^[104]。此外,由于SiO₂纳米球不可避免地存在粒度的标准偏差,较大颗粒比较小颗粒沉降得更快,因此在生长过程中颗粒的直径会在悬浮液的顶部和底部之间形成直径梯度,被吸入弯月面区域的颗粒的直径随着时间的推移略微减小,最终形成的SCC薄膜颗粒直径沿生长方向略微减小^[105]。尽管如此,通过合理地控制以上参数,这依然是一种能够获得高质量胶体晶体的制备方法,且所得SCC薄膜的面积较大,是目前制备多层胶体晶体的主要方法。通过合理地控制实验条件,改进实验过程,这种方法还非常适合进行规模化制备^[106,107]。Su等^[105]利用生物染色中常用的染色装置来生长胶体晶体薄膜,将多片载玻片竖直插入不锈钢架中,同时放入玻璃缸中生长,实现了一次同时制备多片性质相同的SCC薄膜,实现了SCC基底的规模化制备。

胶体晶体是由单分散的胶体颗粒组成的高度有序阵列,具有独特的光学性质,即限制某个波长范围内的光通过胶体晶体阵列的布拉格衍射效应。利用这种独特的光学性质,胶体晶体广泛用于光子晶体构筑、结构色材料制备以及非标记传感等各个领域^{[99,108⇓~110]}。利用胶体晶体独特的光学性质来进行结构色材料的构筑是近年来新兴的一项应用领域。这些结构颜色传感器通常由响应材料构成,并可通过相应的刺激(如温度、湿度、pH、离子、分子等)进行调节。Gu等^[108]将介孔SiO₂纳米粒子(MSNs)组装成SCC。由于折射率的变化,所获得的结构色彩图案对不同蒸气具有不同的响应,易于肉眼识别,可用于视觉鉴定,并且增加了造假者伪造副本的难度,在防伪应用方面具有巨大潜力。另外,Huang等^[111]利用二氧化硅胶体晶体作为模板制备了一种pH响应的三维大孔聚合物,该聚合物的溶胀和去溶胀过程会导致其布拉格衍射峰发生变化,利用这种光学信号的变化就可以实现各种溶液的pH值或离子强度的检测。Cai等^[112]制备了一种用于选择性检测真菌病原白色念珠菌的二维胶体晶体蛋白水凝胶传感器。他们利用暴露在病原体中的水凝胶的收缩来改变二维阵列中的粒子间距,从而使胶体晶体衍射峰的蓝移非常明显,能够很容易地用肉眼观察到。该传感器验证了利用微生物细胞表面碳水化合物和凝集素之间的识别来检测水环境中的微生物的可能性。

东南大学的钱卫平教授课题组^{[113⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓~123]}研究了SCC膜的干涉效应,并以此发展了一系列以其为干涉基底的基于RIfS技术的分析应用。钱卫平研究组Su等^[113]采用改进的垂直沉积法成功地制备了不同球径和膜厚的SCC薄膜,系统地研究了SCC薄膜的干涉效应,他们发现构筑RIfS系统最优的SCC薄膜厚度为4~6 μm,并以此为干涉基底监测胰蛋白酶消化明胶的整个过程,证明了该系统具有良好的灵敏度和较宽的线性范围,可实现各过程的实时测量。在此基础上,Su等研究了SCC薄膜作为干涉基底在复杂样品分析中的应用^[100],结果发现即使使用全血进行分析,仍能获得干涉信号,且在分析时,不需进行血细胞分离等步骤,可直接对全血样品进行分析,进一步证明了SCC薄膜作为干涉基底的优势。该研究组Wang等又继续研究了该系统在牛奶样品分析中的应用^[114],他们利用固定在SCC基底微球表面的蛋白质A(SPA)捕获免疫球蛋白G(IgG),通过BSA封闭结合缓冲液冲洗的方式去除复杂体系中非特异性结合对定量分析的干扰,实现了不经过样品前处理,直接对牛奶样品中的IgG进行定量分析。此外,Wang等还利用SPA与IgG结合体系,探索了该传感系统在反应动力学计算以及亲和力评价方面的应用^[115]。

钱卫平研究组将以SCC为干涉基底的RIfS系统命名为有序多孔层干涉测量(OPLI)系统(图5),除了利用此系统研究蛋白质分子之间的相互作用外,他们的工作还集中在两个方面:一是利用水凝胶材料功能化SCC基底,另一个是利用疏水材料(如液晶、油脂)功能化SCC基底。Wu等^[116]将纤维蛋白凝胶负载进SCC基底形成干涉血栓模型,建立了一种新的实时溶栓评价方法,可以直接区分不同的纤溶途径(直接纤溶和激活纤溶酶原的纤溶),该方法提供了更多的时间数据和动力学数据,在血栓疾病的早期治疗中具有潜在的应用价值。Yan等^[117]开发了一种壳聚糖与3-缩水甘油基氧基丙基三甲氧基硅烷(GPTMS)负载在SCC基底上交联形成的控释体系。所构建的水凝胶-多孔膜复合结构在pH刺激下表现出体积相变响应,可以通过控制pH值来调节药物的释放速率和释放时间,有助于设计高生物相容性、个性化治疗和高给药效率的给药系统。Ma等则利用OPLI系统研究了pH与浓度对壳聚糖与胃蛋白酶相互作用的影响^[118]以及壳聚糖分子量对其与酪蛋白^[119]作用的影响,这些研究为设计基于多糖和蛋白质的新型复合材料提供了理论依据。Zhou等^[120]主要研究了疏水材料在SCC基底中的负载及应用。他们将液晶分子负载进SCC基底中,设计了一种基于干涉效应放大由双亲分子介导的液晶定向响应信号的方法。Zhou等^[121]还以SCC的有序多孔结构为支撑构造橄榄油分析界面,用OPLI技术实时记录了脂肪酶水解橄榄油的整个动力学过程,并计算了动力学米氏常数,该方法为食用油的实时消化降解提供了潜在的评价系统。在此基础上,Zhou等^[122]又进一步以负载了三油酸甘油酯的SCC基底为模型脂质层,实时追踪了不同膳食纤维对脂质消化的影响,加深了对复杂食物基质中脂质和膳食纤维相互作用的理解,同时为相关功能性食品的设计提供了依据。

与传统RIfS系统所使用的平面基底或pSi多孔基底不同,SCC基底性质非常稳定,孔隙排列高度有序,孔隙率固定且孔径可调,这有望大大增加传感器的稳定性和灵敏度。与刻蚀方法不同,垂直沉积法能够一次同时制备多片SCC基底,制备方法更适合商业化。另外,SCC基底还是透明薄膜,这就使得在基底的背面获得干涉条纹成为可能,打破了多孔基底RIfS系统都是从正面检测的固有模式,可以开拓更加广阔的应用空间,非常适合用于生物传感器的构筑。

4 结论与展望

近年来,RIfS技术因其操作简单、成本低、获得信息丰富、能够进行原位高通量的检测等优势成为研究分子之间相互作用不可或缺的技术手段。其中干涉基底的构筑是RIfS技术的关键部分,为了满足新分析方法的需要,许多不同类型的干涉基底被不断开发出来。

平面固体基底是最早发展起来的一类干涉基底,也是发展最成熟的一类干涉基底。它不仅制备方法简单,信号稳定,还成功地进行了商业化的应用;但是由于基底的比表面积小,在生物分析中产生的光学厚度的变化量非常有限,所以检测灵敏度有时会达不到要求,这也是制约RIfS技术发展的主要原因。

为了提高检测灵敏度,具有高比表面积的纳米多孔基底被开发出来。pSi基底是最先应用于RIfS技术的多孔基底,因其具有特殊的光电性能及良好的生物相容性,研究人员以pSi为干涉基底,开发出一系列应用示例,包括DNA、IgG等多种生物分子。但是,pSi表面性质不稳定,在水溶液中容易氧化,不利于使用和长期保存,使用时需要花费大量时间以获得稳定的基线,这极大地限制了pSi基底在生物传感中的应用。而且pSi的制备方法为化学刻蚀,所得多孔结构无序且不规则,基底的规模化制备及其可重复性是限制pSi基底应用的另外一个重要原因。

为了改善pSi基底在水溶液中易氧化的问题,NAA被作为一种更稳定的替代品开发出来。与pSi基底相比,NAA基底的表面稳定性更好,不需要在使用前进行充分的氧化,便于生物传感系统的构筑;NAA基底的制备方法更加可控,可调节性更高,表面也很容易进行修饰,可以利用固定在其表面的各种分子实现多种分析需求。大量以NAA作为干涉基底进行传感研究的工作被报道出来,这也进一步证明了NAA结构作为干涉基底的优势。但NAA薄膜是通过阳极氧化的方法在铝基板的表面刻蚀出孔洞制备而成的,这种每次一片的制备方法同样难以商业化,且不同次制备的薄膜之间往往会有差异,不能做到较好的一致性。而且和pSi基底一样,NAA基底也是不透明的多孔基底,只能从基底的正面也就是被分析的溶液上方采集干涉图谱,会明显受到待测样品颜色和浑浊度的影响,而这在生物分析中是非常不利的。因此,NAA基底也存在着改进的空间。

作为一种透明的多孔干涉基底,SCC基底被开发出来,这使得在薄膜的背面获得干涉条纹成为可能,该基底在复杂样品分析中也显现出明显的优势,是一类非常有发展前景的干涉基底。与其他多孔基底不同,SCC基底采用自下而上的方法制备,利用改进的垂直沉积法一次能够制备多片性质相同的基底,在保证基底制备重复性的同时增加了商业化的可能;所得SCC基底的孔隙排列高度有序,孔隙率固定且孔径可调,这在一定程度上增加了传感的稳定性和灵敏度。更重要的是,以SCC作为支撑或者模板,在孔隙中负载水凝胶、脂质、聚苯乙烯或者其他高分子复合材料,可以获得具有多种功能的性能更加有序的干涉基底,这使得利用该类基底构筑生物传感器具有非常广阔的应用前景和发展空间。但SCC作为一种新型干涉基底,对其稳定性的研究尚不够深入,且需要更多的研究数据来综合考察SCC基底的传感性能。另外,与pSi和NAA基底相比,其孔径偏小,孔隙率偏低,这些是否会影响生物分子在其中的扩散及其影响程度等问题都需要更多的实验数据来研究。最后,更多的基于此类基底的应用有待被开发出来,以更好地评价此类基底的优缺点。

与平面固体基底相比,多孔基底具有更大的比表面积,可以通过增加固定于基底表面的功能化分子的数目从而捕获更多被分析物从而增加检测的灵敏度;多孔基底通常具有几个微米厚度的多孔结构层,多孔层整体的厚度、多孔结构的形状、孔洞的直径等参数均可以进行调节和控制,这使得多孔基底比平面固体基底具有更丰富的可调性,在传感分析中也具备更多的可能性;多孔基底还可方便地与其他材料复合以便开发复合基底进行一些特定需求的传感研究。基于以上特点,多孔基底成为干涉基底的发展方向,近年关于干涉基底的研究都集中在几种不同类型的多孔基底上,一系列具有不同功能的非标记传感器被开发出来。但是,与平面固体基底相比,多孔基底也更加复杂,如多孔层的整体厚度、多孔结构的孔径等因素对分子在多孔结构中的扩散速率是否会造成影响?反应动力学模型要如何进行修正以消除扩散速率造成的影响?温度对整个传感过程的影响以及如何更好地设计整个温控系统以对抗这种影响?这些都是后续干涉基底和RIfS技术研究的重点和难点,也需要更多的实验数据支撑,以便研究人员能够更深入理解多孔基底的各项参数在整个传感过程中的重要程度,根据不同分析需求设计结构更合理、性能更优越的干涉基底,进而提升整个RIfS系统的传感性能,增加系统的可控性和稳定性。总之,新型干涉基底的开发与应用,也应伴随着已有干涉基底的不断完善与进步,以便于满足不同传感分析的需求。

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