聚合物修饰蛋白质的功能化及其应用

万江; 张景泽; 陈虹伶; 沈含梅; 王震; 张春

doi:10.7536/PC230706

化学进展 ›› 2024, Vol. 36 ›› Issue (3) :416-429 DOI: 10.7536/PC230706

综述

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聚合物修饰蛋白质的功能化及其应用

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Functionalization and Application of Polymer-Modified Proteins

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摘要

蛋白质作为一类重要的生物大分子，由于其特殊的三维空间结构及高效的催化活性，在生物催化、药物递送以及分子成像等化工及医学领域有着广泛的应用。然而，由于其具有稳定性较低、免疫原性较强、有机溶剂中溶解性差等缺陷，应用受到限制。聚合物修饰是解决上述问题的重要方法之一，能够从多方面改善蛋白质的功能，扩展蛋白质的应用。从此角度出发，本综述聚焦于最新的研究，总结了利用聚合物修饰改善蛋白质稳定性和活性、免疫原性、溶解性、自组装的合成方法、原理、应用、现存问题及解决方法。在此基础上，分析了该策略在商业及临床转化过程中面临的挑战及发展趋势。

Abstract

As a kind of important biological macromolecules, proteins have been widely used in chemical and medical fields, such as biocatalysis, drug delivery, and molecular imaging due to their special three-dimensional spatial structure and high catalytic activity. However, there are a series of problems in the practical application of proteins. For example, proteins are easily inactivated in extreme environments. Protein drugs have strong immunogenicity in vivo, which leads to short half-life of drugs and causes adverse reactions in patients easily. Their low solubility in organic solvents limits their use in organic solvents. In order to solve the above problems, researchers have developed methods such as protein engineering and co-immobilization, but there are corresponding shortcomings. Polymer modification is one of the important methods, which can improve the properties of proteins from many aspects and expand the application of proteins. From this point of view, this review focuses on the latest research and classical literature on polymer-modified proteins, and introduces their ingenious modification methods to synthesize materials with excellent properties. The principle, practical application, existing problems and solutions of improving protein stability and activity, immunogenicity, solubility and self-assembly by polymer modification are summarized. On this basis, the challenges and possible development trends in the commercial and clinical translation of this strategy are analyzed.

Contents

1 Introduction

2 Stability and activity

2.1 Stability to temperature and pH

2.2 Stability to protease hydrolysis

2.3 Stability of chemical denaturants

2.4 Enhanced enzyme activity

2.5 Regulation of enzyme activity

3 Immunogenicity

4 Solubility

5 Self-assembly

5.1 Drug delivery

5.2 Molecular imaging

6 Conclusion and outlook

Graphical abstract

关键词

蛋白质 / 聚合物修饰 / 稳定性和活性 / 免疫原性 / 溶解性 / 自组装

Key words

protein / polymer modification / stability and activity / immunogenicity / solubility / self-assembly

引用本文

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万江, 张景泽, 陈虹伶, 沈含梅, 王震, 张春. 聚合物修饰蛋白质的功能化及其应用[J]. 化学进展, 2024, 36(3): 416-429 DOI:10.7536/PC230706

Jiang Wan, Jingze Zhang, Hongling Chen, Hanmei Shen, Zhen Wang, Chun Zhang. Functionalization and Application of Polymer-Modified Proteins[J]. Progress in Chemistry, 2024, 36(3): 416-429 DOI:10.7536/PC230706

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1 引言

蛋白质是一类重要的生物大分子，被称为生命活动的主要承担者。它在各领域有广泛的应用：蛋白质药物被用于许多疾病的治疗；酶是工业生产中理想的生物催化剂；抗体在分子检测、药物靶向中发挥主要的作用等。但是，蛋白质的应用也存在许多问题：结构易被破坏，其活性降低甚至丧失；具有较强的免疫原性，易被免疫系统作为外来抗原识别、进攻及清除；难溶于有机溶剂而限制了应用范围等^[1⇓~3]。

为了解决上述问题应用了许多方法。如，从极端环境中寻找特殊的天然蛋白质、基于蛋白质的随机或定点诱变技术的蛋白质工程、蛋白质的固定化等是早期改善蛋白质功能的常用方法^[4⇓~6]。这些方法能够在一定程度上提高蛋白质的稳定性，但是寻找性能优越的蛋白质需要花费大量的人力、物力及时间^[7]。蛋白质和无机成分自组装形成的纳米结构能够增强蛋白质的活性和稳定性，但重金属离子的生物相容性较差，限制了其应用范围^[8,9]。蛋白质酶中掺入非经典氨基酸是最近热点，不仅可以提高酶的催化活性，还可以产生催化不同反应的新酶，但该方法有时会明显抑制酶的活性^[10,11]。

聚合物修饰也是改善蛋白质功能的一种常用方法^[10,12,13]。自Abuchowski^[14]在1977年首次将聚乙二醇（poly(ethylene glycol), PEG）与牛血清蛋白（Bovine serum albumin, BSA）偶联以来，聚合物共价修饰技术迅速发展，涌现了各类蛋白质-聚合物偶联物的报道，使其逐渐成为扩展蛋白质应用的一种重要方法^[15⇓~17]。在此过程中，实现聚合物共价修饰的表面接枝方法也在逐渐优化：从最初直接将聚合物偶联蛋白质（grafting-to）到先在蛋白质上连接引发剂，聚合物在引发剂位点生长（grafting-from），再到以聚合物为支架，在聚合物上连接多个蛋白质（grafting-through）。图1介绍了不同的接枝方法的优势及其适应的范围^{[15,18⇓⇓⇓~22]}。与上文中提到的各类方法相比，聚合物修饰具有以下优势：（1）能够多方面地改善蛋白质理化性质^{[15,23⇓~25]}；（2）能够降低蛋白质药物的免疫原性，增加药物的疗效及安全性^[26⇓~28]；（3）能够调节蛋白质的自组装性能，形成各种类型的空间结构作为药物递送载体和分子检测的探针。由于其优异的性能，如今，蛋白质-聚合物偶联物已应用于疾病治疗^[24]、生物催化^[29]、分子成像^[30]、药物递送^[31]等多个领域。

目前已有许多关于蛋白质-聚合物偶联物的综述，但这些综述主要围绕化学合成的角度介绍材料合成的步骤及原理。Kaupbayeva等^[32]和Cobo等^[15]从聚合物表面接枝方法出发，分别介绍了grafting-to，grafting-from，grafting-through三种方法在蛋白质-聚合物偶联当中的应用以及它们各自的优缺点； Xiong等^[33]和Messina等^[20]从聚合物合成方法的角度，介绍了各领域中聚合物修饰蛋白质的应用；Pelegri-O'Day等^[34]和Ekladious等^[24]介绍了各种类型的聚合物在修饰蛋白质中的应用。以上综述对蛋白质-聚合物的合成方法介绍的很全面，但是缺少从聚合物修饰改善蛋白质功能的角度来介绍。改善蛋白质的功能是各类方法的目标，也是解决蛋白质应用过程中存在问题的关键。只有清楚聚合物修饰能够怎样改善蛋白质的功能，才能解决实际问题。尽管Kaupbayeva等^[21]从蛋白质-聚合物的稳定性和活性两个角度总结了蛋白质-聚合物偶联物的应用，但对偶联物功能的综述并不完整。本文从聚合物修饰对蛋白质稳定性和活性、免疫原性、溶解性、自组装的功能改善出发，总结近年来蛋白质-聚合物在各个领域的应用实例、现存问题及解决方法，并预测了蛋白质-聚合物偶联物的发展趋势。

2 稳定性和活性

蛋白质稳定性是指其对极端环境如高温、极端pH等的抵抗力。蛋白质发挥功能需要正确折叠的空间结构，但其易受外界环境的刺激发生改变而影响蛋白质的功能。研究证明聚合物修饰蛋白质可通过调整蛋白质中的相互作用力来增强蛋白质的稳定性和活性^{[1,35⇓⇓⇓⇓~40]}。然而，这一过程一直难以从分子水平进行解释^[41⇓~43]。一种假设为聚合物与蛋白质之间的相互作用改变了蛋白质的性质^{[41,44⇓⇓⇓~48]}。例如，Cummings等^[41]发现不同电荷类型的聚合物对酶的活性影响不同，其中阳离子聚合物降低了酶在极低 pH 值下展开的概率。他们猜想聚合物与蛋白质之间的电荷相互作用是影响其稳定性和活性的一种形式。Munasinghe等^[48]以Cummings等的实验为基础，进一步发现不同电荷类型的聚合物对酶的活性中心产生了不同程度的影响，使酶的活性不同。另一种假设是聚合物与分子伴侣有相似的功能，可以通过稳定蛋白质展开时中间体的结构从而稳定蛋白质，如图2所示。Baker等^[1]通过将不同类型及长度的聚合物偶联到丝氨酸蛋白酶上以探究聚合物修饰对蛋白质构象的影响。他们发现在pH=1时偶联物的空间结构与天然构象相比变化程度最低，且能够长时间保留活性。他们猜测：在酸性条件下，聚合物能够稳定蛋白质的部分展开状态并防止蛋白质进一步展开而失活。并且，亲疏水性不同的聚合物对蛋白质展开时中间体重折叠回天然构象具有不同的影响。因此，聚合物可模拟分子伴侣的作用帮助蛋白质折叠回正确构象。

2.1 对温度和pH的稳定性

聚合物修饰可以提高蛋白质在高温和极端pH下的稳定性。蛋白质药物在医学领域应用十分广泛，然而在储存、运输等过程中环境的变化常导致其活性降低，疗效变差。人生长激素（Human growth hormone, hGH）是治疗矮小症等疾病的常用药物，也存在上述问题。为了提高hGH的稳定性，Grigoletto等^[49]在谷胺酰胺酶的介导下将PEG链连接到hGH的N端和141位的谷氨酰胺（Glutamine, Gln）上，合成了PEG-N端-hGH和PEG-Gln₁₄₁-hGH。他们通过圆二色光谱法测得hGH、PEG-Gln141-hGH、PEG-N端-hGH的热变性温度分别为82、83.8和86 ℃，这说明聚合物能提高酶的热稳定性。此外，他们发现偶联物在高温热变性后能够恢复其二级结构，这有利于蛋白质在热变性后恢复其特定的功能。当然，除了高温，聚合物修饰也可以改善对pH的稳定性。Sharma等^[50]将α-胰凝乳蛋白酶通过碳二亚胺与甲基丙烯酸甲酯聚合物共价偶联，从而提高酶对pH的稳定性。他们将偶联物与天然酶置于pH=5.7~8.0的磷酸缓冲液中，通过测定酶的残留活性发现：与天然酶相比，偶联物的最适 pH 范围变宽，且在pH=6.5及以上的条件下具有更好的稳定性。同时，在pH=5.6，偶联物的残留活性仍有约80%，而游离酶的残留活性约40%，表明聚合物的修饰可以提高酶对pH的稳定性。

聚合物修饰可以同时改善蛋白质对温度和pH的稳定性。木瓜蛋白酶是一种高活性的蛋白水解酶，广泛应用于工业和食品工序中。Verduzco 等^[51] 使用grafting-to方法，将通过可逆加成-断裂链转移方法（Reversible addition-fragmentation chain transfer polymerization, RAFT）合成的聚（乙烯基-2-吡咯烷酮）（poly(vinyl-2-pyrrolidone), PVP）与木瓜蛋白酶进行偶联。他们研究了不同pH值和温度下偶联物与天然酶的催化活性。在酸性条件下，随着pH值的升高，偶联物与天然酶的活性变化趋势相似。然而在pH=9.0时，偶联物仍保留约70%的活性，而天然酶只有约28%的残余活性。另外，他们发现偶联物在不同温度下活性均比天然酶高，在70 ℃时，偶联物仍有约60%的活性，而天然酶仅有约29%的活性。表明聚合物修饰可以提高木瓜蛋白酶对pH和高温的稳定性。

2.2 对蛋白酶水解的稳定性

蛋白质容易受到酶的水解而失去活性，而聚合物的修饰能够掩盖蛋白质的相关反应位点或者阻碍酶与蛋白质的结合从而使蛋白质免受酶的水解。过氧化氢酶是一种工业中常用的抗氧化剂，能够除去漂白废水中的有毒物质达到净化水的效果。然而由于过氧化氢酶对蛋白酶具有较高的敏感性，导致其在应用中受到了很大的限制^[52]。Riccardi等^[53]通过将聚（丙烯酸）（Poly(acrylic acid), PAA）的羧基与过氧化氢酶上的胺基连接，合成了过氧化氢酶-PAA偶联物，从而提高酶的稳定性和活性。他们用胰蛋白酶和糜蛋白酶对偶联物和天然酶进行消化水解，结果发现偶联物在两种酶作用下均保留了超过80%的活性，而天然酶活性大幅度降低。因此，经过PAA修饰的过氧化氢酶抗蛋白酶水解的稳定性显著提高。对于这一现象，他们认为PAA 会产生保护性交联网络并充当蛋白质周围的物理屏障，从而阻止蛋白酶或细菌靠近包埋在其中的酶（如图3）。

2.3 对化学变性剂的稳定性

聚合物偶联也可以增加蛋白质对化学变性剂的稳定性。纤维素酶可以降解纤维素主链中的β-1,4-糖苷键，从而使纤维素作为一种能源物质被利用。然而，由于在水解纤维素时伴随着二甲亚砜或二甲基甲酰胺等试剂的加入，使得纤维素酶在实际应用中易失活^[54]。Wright等^[55]采用RAFT方法将多种聚合物接枝到嗜热纤维素酶上以提高其对化学变性剂的稳定性。他们将各种偶联物在76 vol% 二甲基甲酰胺和24 vol% pH=5的缓冲液组成的培养基中孵育2 h后测试酶的残留活性。结果表明聚合物修饰的酶较天然酶的残留活性更高。除此之外，他们发现丙烯酰胺和N,N-二甲基丙烯酰修饰的酶比天然酶的活性增加了50%。这说明聚合物修饰不仅可以提高其对极端环境下的稳定性，同时还可以提高酶的活性。

2.4 对酶活性的提升

聚合物修饰在多数情况下会导致酶活性的降低。于是，研究者尝试让聚合物修饰同时提升稳定性和活性，从而实现偶联物性能全方位的提升。Cui等^[56]的工作成功达成了这一目标。接着通过定点突变的方法，在无机焦磷酸酶（Pyrophosphatase, PPase）中引入半胱氨酸（Cysteine, Cys）。接着通过氨基葡萄糖和甲基丙烯酰氯的取代反应生成2-甲基丙烯酰胺基吡喃葡萄糖（2-methacrylamido glucopyranose, MAG），然后通过控制链引发剂和MAG的比例，利用RAFT聚合合成不同分子量和比例的PMAG。最后，PMAG与吡啶二硫酯反应并在端位上引入二硫键，与引入Cys的PPase通过二硫化物交换得到PMAG-PPase。不同分子量的PMAG-PPase活性相对于PPase都有提升，最高可提升接近30%。另外，8000 Da的PMAG修饰的PPase在极端pH条件、高盐溶液、胰蛋白酶作用后，活性均得到较好的保留。然而，该聚合物合成步骤较复杂，成本较高，难以普遍运用。于是，为了简化这一过程，Kovaliov等^[39]通过Tucker等^[57]提出的光致电子转移RAFT方法，通过控制光照时间成功合成丁氧基甲基丙烯酰胺）（N-(iso-butoxymethyl) acrylamide, NIBMA）和不同分子量的N-[3-（二甲氨基）丙基]丙烯酰胺（N-[3-(dimethylamino) propyl] acrylamide, DMAPA）修饰的南极假丝酵母脂肪酶和绵阳嗜热丝孢菌。他们发现两种聚合物偶联后均显著提升了酶的催化活性。这可能是因为疏水性底物在聚合物壳中溶解度及亲合力提升，增加了底物的有效浓度。同时，DMAPA的链长越长，偶联物活性提升程度越大，因为聚合物的叔胺部分通过将水分子拉离蛋白质的疏水区域以增加酶活性。另外，偶联物也表现出不同程度的对高温的抵抗性。

聚合物修饰蛋白质能够实现酶级联反应，从而提升酶的活性。当两种或多种酶固定于相邻的空间时，可以一起催化多步反应，诱导两个或多个连续过程，而无需分离反应中间体，此过程被称为酶级联反应^[58]。酶级联能够减少后续反应分离纯化的步骤，使上游反应产物作为底物直接转移到附近催化下游反应的酶，而无需通过平衡，从而增加反应的速率^[58,59]。聚合物修饰是实现酶级联过程的一类重要方法，形成的级联酶具有活性可调、稳定性好、生物相容性高等优势^[60⇓~62]。葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase, GOX）和辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase, HRP）常被联合用于检测血糖含量。Chiang等^[62]首先分别在GOX和HRP上分别接上引发剂，然后将连接引发剂的两种酶混合，并同时进行原子转移自由基聚合（Atom-transfer radical-polymerization, ATRP）反应，得到自组装成胶束结构的GOX/HRP-聚甲基丙烯酸2-羟丙酯（Poly(2-hydroxypropyl methacrylate, PHPMA）偶联物，如图4。他们通过调节GOX和HRP的比例以调节复合酶的活性。尽管在偶联聚合物后，GOX-PHPMA和HRP-PHPMA较天然酶均有下降，但GOX/HRP-PHPMA在特定GOX和HRP比例时，复合酶的活性相较于天然酶有大幅提升，且比商业的葡萄糖分析试剂盒检测葡萄糖的速度更快。因此，聚合物修饰实现酶级联能够增加酶促反应的速率，从而提升酶的活性。

2.5 对酶活性的调节

酶在使用的过程中，有时需要对其活性进行调节，使其在合适的位置和时间进行所需的催化反应，避免副反应的发生或减缓酶“老化”的过程。聚合物能够对酶的活性进行调节，有两种作用方式：首先，聚合物可以在酶上可逆连接，通过聚合物的偶联及脱落影响酶的结构，进而调节酶的活性^[63]；其次，可以使用刺激响应性聚合物，通过对外界环境条件的响应，实现酶活性的调节^[64,65]。Wang等^[63]通过定点突变的方法在PPase上引入Cys，通过巯基与吡啶二硫化物官能化聚（甲基丙烯酸2-羧乙酯）（poly(2-hydroxyethyl methacrylate), PHEMA）偶联，形成PPase-PHEMA。PHEMA偶联后PPase活性几乎完全丧失，但在用8 mmol/L的二硫苏糖醇将PHEMA和PPase之间的二硫键还原后，PPase活性恢复至偶联前相当的水平。Li等^[64]则利用光致电子转移RAFT方法，将温敏性聚合物聚N-异丙基丙烯酰胺（poly(N-isopropylacrylamide), PNIPAAM）偶联在PPase定点突变引入的远离活性中心的Cys上，得到PPase-PNIPAAM。偶联物的催化活性在环境温度处于PNIPAAM相转变温度的两侧具有明显的差异。推测酶活性的热响应性能原理可能是PNIPAAM在低于相转变温度时处于拉伸状态，屏蔽了酶的活性中心，而高于相转变温度时聚合物链压缩折叠，暴露活性中心。

3 免疫原性

免疫原性是限制蛋白质药物在体内的生物利用度的主要因素之一。蛋白质的免疫原性指体内的免疫系统会对外来蛋白质产生免疫反应并将其清除，主要由免疫细胞与蛋白质表面抗原决定簇的结合引发^[34]。许多研究表明，聚合物偶联可以降低蛋白质的免疫原性^[34,66,67]，其具体机制主要有以下两种猜想：（1）聚合物阻碍蛋白质与免疫细胞的特异性识别过程^[34,68]；（2）聚合物屏蔽蛋白质表面抗原基团，使其对抗体“隐身”^[69]。

蛋白质-聚合物偶联物表面的聚合物能够阻碍蛋白质与免疫细胞的特异性识别过程，从而降低蛋白质的免疫原性。病毒衣壳蛋白通常具有较强的免疫原性，是研究聚合物偶联降低蛋白质免疫原性的常用材料。Steinmetz等^[70]在豇豆花叶病毒（Cowpea mosaic virus, CPMV）衣壳表面分别偶联1000 Da和2000 Da的PEG链，并通过染料标记实现“可视化”，结合流式细胞术分析，研究在不影响CPMV生物学活性时不同链长的聚合物对病毒与宿主细胞相互作用的影响程度。他们观察到两种长度的PEG链偶联病毒后宿主细胞对CPMV的结合及摄取率均有不同程度的降低，且PEG2000明显优于PEG1000。由于链长越长，空间位阻越大,说明聚合物偶联能够通过空间位阻作用阻碍蛋白质与细胞表面的相互作用。另外，Mok等^[71]证明PEG化腺病毒（Adenovirus, AD）能够减少AD与免疫细胞的相互作用，从而减少先天性免疫反应。他们观察到与AD-PEG共培养的巨噬细胞分泌白细胞介素（Interleukin, IL）-6的水平相比AD明显降低，且巨噬细胞对AD-PEG的摄取量降低。此外，在分别给小鼠注射AD-PEG和AD后，AD-PEG组小鼠血清中IL-6水平也明显低于AD组。因此，聚合物偶联能够阻碍抗原呈递细胞摄取蛋白质，从而减少免疫刺激因子的生成，减弱机体对蛋白质的先天性免疫反应。在Mok等工作的基础上，Eto等^[72]进一步探究了PEG修饰AD后对大鼠血清中抗AD抗体的水平变化。他们发现PEG修饰后血清中抗AD抗体的水平均显著下降，且修饰率越高，下降程度越高。综上所述，聚合物偶联能够阻碍蛋白质与免疫细胞的识别过程，降低机体免疫反应的产生，减少相应免疫刺激因子及抗体的生成。

聚合物能够屏蔽蛋白质表面的抗原基团，降低与抗体的亲合力，减少与抗体的中和反应^[73,74]。Wu等^[75]将PEG和聚唾液酸（Polysialic acid, PSA）形成的嵌段共聚物偶联尿酸酶，通过酶联免疫分析实验发现偶联物与尿酸酶特异性抗体的亲合力下降。他们使用透射电子显微镜观察尿酸酶-PEG-PSA偶联物纳米颗粒的形状和在溶液中的状态，发现纳米颗粒在溶液中会聚集成微球，且出现较大粒径的球形水合壳层。表面聚合物形成的水合壳层可能会通过空间屏障作用阻碍其与抗体的结合，从而降低与抗体的亲合力。Lee等^[76]将不同类型的聚合物偶联Qβ噬菌体，与抗Qβ血清作用后，发现聚合物偶联后Qβ与抗体的结合率均下降。他们推测不同类型的聚合物在病毒衣壳表面形成不同厚度的壳层，阻碍抗体的结合。另外，聚合物与蛋白质之间会产生不同的相互作用，进而影响与抗体的结合过程。

除上述两种主流的机制外，目前也存在一些其他假设。例如，已知聚合物偶联蛋白质会形成不同形状的纳米粒子，而纳米粒子的不同形状对其与细胞的相互作用、体内分布等过程都存在明显的差异，进而影响蛋白质在体内的免疫原性^[77⇓~79]。因此，聚合物偶联可以从多方面降低蛋白质的免疫原性，延长蛋白质药物在体内的半衰期，改善其疗效及安全性。

4 溶解性

溶解度是蛋白质的一种基本性质，对蛋白质实现功能有重要意义。在无水离子液体或有机溶剂中进行的酶催化反应可有效避免水解副反应并增加非极性底物的溶解度，这有助于反应效率的提高及酶的分离回收^[80⇓~82]。但是，酶分子在有机溶剂中存在稳定性低、溶解度低等问题，导致酶分子活性降低，限制了酶在有机溶剂中的应用^[82⇓~84]。聚合物的修饰可以增加蛋白质在有机溶剂和无水离子液体中的溶解度^[85⇓-87]，拓宽酶的应用范围。此外，通过聚合物改变溶解度是蛋白质纯化中一种重要的提纯方法^[88]。在工业应用中，蛋白质-聚合物对溶解度的改善也使得酶能够被重复利用，从而降低生产成本。

蛋白质-聚合物偶联物可以通过调整聚合物的类型和链长而调节蛋白质的溶解度。Baker等^[88]使用ATRP法合成了具有高接枝密度和不同聚合物链长的溶菌酶-聚合物偶联物。他们选择了两亲性聚甲基丙烯酸羧基甜菜碱（poly(carboxybetaine methacrylate), PCBMA）和中性聚[低聚（乙二醇）甲醚甲基丙烯酸酯]（poly(oligo(ethylene glycol) methacrylate), POEGMA）分别与溶菌酶（Lysozyme, Lyz）偶联，研究聚合物对蛋白质溶解度的影响。在pH=7.0时，Lyz在硫酸铵浓度约为饱和浓度的60%时沉淀，而Lyz-聚合物偶联物则可溶于饱和硫酸铵溶液。他们推测：两亲性聚合物可以防止蛋白质周围的水合层被消耗，或在水合层耗尽时阻止蛋白质沉淀。于是，他们测试了不同长度的两亲性聚合物修饰时蛋白质在硫酸铵溶液中的溶解度。结果表明两亲性聚合物的长度越高，偶联物盐析时硫酸铵饱和度越高。受上述工作的启发，猜想可以通过设计聚合物来调节蛋白质的溶解度，从而简化蛋白质-聚合物偶联物的纯化过程。

聚合物与蛋白质偶联后也可以提升蛋白质在有机相中的溶解度。Takahashi等^[89]将PEG与HRP的氨基偶联，修饰后的酶在苯溶液中易溶解并保留了21%天然酶的活性，首次报道了酶在有机溶剂中的活性和可溶性。此后Inada等^[90]同样发现利用PEG对酶进行化学修饰，可以使酶在有机溶剂中可溶并具有活性。将聚合物与酶偶联改善酶在有机溶剂中的溶解性可以扩展酶的应用范围^[91]。

刺激响应性聚合物与蛋白质偶联可以调控蛋白质在不同环境下的溶解度，使蛋白质-聚合物偶联物具有环境响应性。Yoshihara等^[92]通过将链转移剂引入BSA中，使用“grafting from”方法合成了温度响应性HSA-PNIPAAM偶联物，其中BSA能特异性吸附尿毒症毒素—硫酸吲哚酚（Indoxyl sulfate, IS）。利用偶联物的热沉淀效应，在高于最低临界温度的条件下可回收偶联物，如图5所示。该偶联物有望用于透析治疗，从透析液中回收白蛋白，降低医疗成本。Steiert等^[93]则制备了一种酸响应纳米颗粒。他们将乙烯基醚结合到PEG的主链中，再将偶联物修饰到细胞色素c的表面，形成了pH响应性蛋白纳米颗粒。该纳米颗粒在中性环境下稳定，在酸性条件下，偶联物中的乙烯基醚被降解，大部分 PEG 材料被切割，只有非常小的PEG片段保留在蛋白质表面。这样，蛋白质恢复了其天然的亲水溶解度，单个疏水蛋白质组装体被分解。他们证明了该偶联物对HeLa细胞的无毒性以及在pH=7.4下的稳定性，然后利用该纳米系统封装荧光标记的葡聚糖，并观察到酸性条件下葡聚糖的释放。从这些特性可以推断，该蛋白质-刺激响应性聚合物可以作为药物载体，通过偶联物在弱酸的肿瘤环境下的溶解释放药物而选择性地杀伤肿瘤细胞。

5 自组装

蛋白质自组装成特定的三维结构取决于氨基酸的排列顺序，但这一特性可通过内部相互作用和外部刺激来调控。聚合物修饰能改变蛋白质表面的性质而调节其自组装的过程，从而控制偶联物形成特定的空间结构，有人将这种过程称为聚合诱导自组装^[94⇓~96]。疏水性聚合物与亲水性蛋白质偶联时会形成两亲性分子 ^[78,97,98]。两亲性分子在水介质具有自组装的特性，如，磷脂分子在水中形成球状封闭分子、胶束，棒状结构等^[98]。两亲性蛋白质-聚合物偶联物可以自组装成许多高级结构，如胶束、囊泡、双分子层、薄片等^[99⇓~101]。自组装蛋白质-聚合物偶联物形成的纳米粒子可作为载体，封装药物、酶、荧光分子或其他疏水性的物质，从而实现蛋白质、聚合物、封装物质的功能一体化和多功能系统的构建^{[30,62,78,95]}。功能性聚合物和蛋白质的偶联也能使蛋白质的功能得到扩充和完善^[102⇓~104]。自组装蛋白质-聚合物纳米结构的构建在药物递送、分子检测等领域有独特的应用^[30,105]。

5.1 药物递送

聚合物偶联蛋白质可以自组装成特定的空间结构负载药物。白蛋白易于在肿瘤组织聚集且易被肿瘤细胞摄取，常被用作抗肿瘤药物的靶向载体^[106,107]。如图6，Liu等^[99]将疏水性的马来酰亚胺化聚（ε-己内酯）（poly(ε-caprolactone), PCL）与亲水性的BSA通过马来酰亚胺-硫醇反应连接，通过材料的两亲性自组装制得可降解BSA-PCL囊泡。该囊泡的疏水性内核可装载抗肿瘤药物阿霉素，且表面可偶联抗体进一步提高靶向性。在细胞及动物实验中，该系统的体外抗肿瘤性质相对于阿霉素明显增强。另外，该系统具有高选择性和可生物降解性，降低了阿霉素的体内毒性^[108]。在上述基础上，许多研究进一步分析了BSA-聚合物偶联物的性能^[107]。聚合物的偶联能够增强肿瘤细胞对BSA的吸收。哌嗪衍生物属于化学渗透增强剂，可改变上皮细胞间紧密连接的完整性，通过细胞旁途径增加渗透。Cummings等^[109]采用ATRP法将苯哌嗪丙烯酰胺单体在BSA表面进行生长，制备了含有苯基哌嗪的BSA-聚合物偶联物。在非细胞毒剂量下，该偶联物比BSA对模拟小肠吸收的Caco-2单细胞层的通透性增加了约30倍，具有潜在的口服药物递送前景。

刺激响应性聚合物偶联蛋白质负载药物可以根据环境的变化控制药物释放的时间和部位，增强药物的选择性^[110]。Vanparijs等^[111]通过RAFT法在BSA的赖氨酸残基上生长[（2,2-二甲基-1,3 二氧戊环）甲基]丙烯酰胺（[(2,2-dimethyl-1,3-dioxolane) methyl] acrylamide, DMDOMA），形成了酸可溶性的BSA-PDMDOMA偶联物。他们在BSA-PDMDOMA的疏水性内核中封装免疫刺激分子CL075，使纳米粒子被树突状细胞摄取后在内体酸性环境中溶解并激活免疫系统，增强对肿瘤和细胞内病原体的免疫反应。受上述工作的启发，Viana等 ^[106]在BSA的赖氨酸残基上利用ATRP法同时生长温敏性聚合物N-乙烯基己内酰胺和N,N-二甲氨基乙基甲基丙烯酸酯，制得BSA-嵌段聚合物偶联物。他们通过控制两种温敏性聚合物的比例，调节偶联物的相转变温度至40℃，从而对高于生理温度的肿瘤组织具有潜在的靶向作用。但他们没有相关动物实验来证明该材料能够实现肿瘤组织聚集。

部分蛋白质本身就能作为载体，自组装后其内部形成中空的空间，能够负载药物，例如病毒衣壳、铁蛋白、伴侣蛋白等。此类蛋白质被命名为蛋白笼，并有研究者对相关研究进行了较好的总结^[112,113]。由上文提到的蛋白质应用过程的缺陷，我们可以设想在蛋白笼表面或内部偶联聚合物能够改善其相应的性能，如表面修饰PEG降低其免疫原性等。许多研究从不同角度对蛋白笼进行改造，以增加其作为药物载体的临床应用可能性。Nussbaumer及其小组^[114]通过双芳基胺接头将树枝状聚合物聚丙烯酰胺偶联在伴侣蛋白热聚体（Thermosome, THS）的孔径中，利用电荷作用使正电荷的聚合物负载负电荷的siRNA。该载体系统能够保护siRNA不被降解，对U87肿瘤细胞能发挥较好的基因沉默效应。但THS在药物递送载体中运用的相对较少，其在临床研究中安全性及有效性仍有待考察。病毒衣壳是常用的基因治疗的载体，其中AD是研究的重点。但是AD载体静脉注射时易被免疫细胞摄取失活、与血小板和红细胞相互作用产生毒性、在肝脏蓄积产生肝毒性且肿瘤细胞表面低表达AD受体使基因转导效率较低等问题，限制了其在基因治疗过程中的使用^[115,116]。为了解决这些问题，Kim等^[117]首先通过电荷相互作用在AD表面连接了精氨酸接枝的生物可还原聚合物（Arginine-grafted bioreducible polymer, ABP），提高了AD的转导效率、降低了免疫原性、降低了红细胞毒性，但是由于载体系统粒径高达500 nm，且易于发生聚集，无法通过静脉注射给药。因此他们进一步开发了通过二硫键化学偶联的AD-ABP系统。偶联物尺寸小于150 nm，适合静脉给药，且表面带有正电荷，防止了其发生相互聚集，解决了上述问题^[115]。Thambi等^[116]和Sun等^[118]也综述了AD与不同类型聚合物偶联的相应研究。脱铁铁蛋白也是一种天然来源的蛋白质壳，在pH=2时24个亚基会解离，在中性pH时恢复壳结构，是潜在的pH响应性药物递送载体。Luo等^[119]将聚多糖——透明质酸（Hyaluronic acid, HA）通过EDC-NHS法修饰在脱铁铁蛋白表面，利用HA对肿瘤细胞表面高表达的CD₄₄受体的靶向作用，实现选择性药物递送。他们在蛋白笼内封装了道诺霉素和带负电荷的大分子聚天冬氨酸，通过聚天冬氨酸与正电荷的道诺霉素的吸引作用将药物稳定封装在蛋白笼内部。他们构建的药物递送系统在低pH时释药速率较快，对酸性的肿瘤微环境具有良好的响应行为，同时由于HA与CD₄₄受体的结合，实现对肺癌细胞模型的双重靶向杀伤作用。

5.2 分子成像

随着近年来生物药物的发展，尤其是蛋白质类药物在药物市场份额中所占的比例逐年上升，研发人员希望有一种高效的蛋白质标记技术，能够更好地了解蛋白药物在体内的动态分布。在各类标记方法中，基于荧光聚合物的标记技术因其优异的性能在近年受到了研究人员的关注。其优点包括荧光聚合物链相比于无机或有机纳米粒子尺寸更小，相比于有机染料的亮度更亮，并且具有明显增强的抗光漂白性^[120,121]。此外，由于聚合物的生物相容性、水溶性及能表面修饰多功能基团的特性，研究人员可以利用生物正交反应做到活细胞表面的蛋白质特异性荧光标记，从而实现在细胞成像等领域的应用^[122]。Duret等^[120]成员通过RAFT方法，合成了4-丙烯酰吗啉和丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯（N-acryloxysuccinimide, NAS）的嵌段共聚物。他们将氨基修饰的荧光染料多位点结合在聚合物骨架中NAS的N-羟基琥珀酰亚胺活化酯的侧链上，然后通过聚合物末端的活化酯与蛋白质上的多个赖氨酸残基上的伯胺共价结合，成功标记了链霉亲和素。最后通过生物亲和反应，将材料与生物素标记的抗CD₄₀抗体结合。与树突状细胞共孵育后，用流式细胞术检测，结果显示树突状细胞有较强的荧光亮度。尽管该材料性能良好，但是由于材料合成的步骤较烦琐，成本较高，限制了其推广使用。也有研究人员将荧光聚合物直接连接于抗体分子上，得到荧光信号增强的抗体-聚合物-染料偶联物^[123⇓~125]。赫赛汀是抗肿瘤的单克隆抗体药物，可治疗乳腺癌、卵巢癌、胃癌等疾病。Zhang等^[125]在赫赛汀上结合ATRP引发剂，在此位点同时生长POEGMA和罗丹明修饰的POEGMA，得到位点特异性抗体-聚合物-染料偶联物。他们通过调节ATRP时染料修饰的单体和抗体的比率得到三类赫赛汀-POEGMA-罗丹明偶联物，与直接和赫赛汀二硫键偶联的罗丹明染料相比，抗原检测信号强度均得到明显的增强，并且并不改变赫赛汀抗体与抗原结合的特异性。该研究结合了抗体的靶向性、治疗性和荧光聚合物的成像特性，有助于实现诊断与治疗一体化，是现代医学的重点发展方向之一。

自组装蛋白质-聚合物形成的特定空间结构也能够负载染料分子，同时利用响应性聚合物能在特定的环境下发生结构变化的性质释放其中的染料分子，实现相应的成像过程。聚（2-（二异丙基氨基）乙基甲基丙烯酸酯（poly(2-(diisopropylamino) ethyl methacrylate, PDPA）是一类pH响应型聚合物，其等电点约在6.5。在pH低于等电点时，PDPA的叔氨基发生质子化及水合作用，转变为亲水性聚合物。Li等^[30]通过人血清白蛋白（Human serum albumin, HSA）的Cys上的巯基连接马来酰亚胺官能团化的ATRP引发剂，在此位点生长DPA单体，偶联物自组装形成各种形状的HSA-PDPA胶束。他们通过控制临界胶束浓度得到HSA-PDPA球状胶束，并将吲哚菁绿（Indocyanine green, ICG）掺入胶束的核心中，构成pH响应型荧光纳米探针。在血液pH时，荧光分子由于聚集在胶束内而发生猝灭。而当处于肿瘤部位的pH时，纳米探针会解离成正电荷的单体，引起荧光的增强及肿瘤细胞对该单体的摄取，如图7所示。他们通过相应小鼠实验证明该纳米探针在静脉注射后具有优异的肿瘤荧光成像性能，提供了肿瘤特异性成像的可能性。

6 结论与前景

近年来，由于“点击化学”、“聚合机理”以及“表面接枝改性”等技术与原理的迅速发展，人们可以快速地合成各种功能独特的蛋白质-聚合物偶联物。科学家将各种聚合物接枝于蛋白质表面，合成了大量蛋白质-聚合物偶联物。通过一系列的表征方法，筛选出功能各异的蛋白质-聚合物偶联物运用于各个领域。

在医药领域有近十几项蛋白质偶联聚合物的药物进入了市场，如，聚合物偶联抗血友病因子及hGH都在近几年得到了FDA的批准^{[126⇓⇓~129]}。另外，也有许多聚合物偶联蛋白质的药物正在进行临床I期、II期及III期试验^[130]。聚合物偶联IL-2、精氨酸脱氨酶、抗CD₄₀的抗原结合域等分别在临床II期及III期的实验过程中，且预计会有较好的结果^[130]。另外，蛋白质-聚合物偶联物在纳米材料合成、分子分离和催化等领域也有着十分重要的应用^[131]。Sharma等^[132]报道了BSA-聚合物偶联物作为一种无水溶剂，适用于不同尺寸和表面化学的干燥溶质；环肽-聚合物偶联物形成的纳米管可模拟载体蛋白用于小分子的运输^[133,134]；聚合物偶联能够增强酶的稳定性、活性及可回收性来降低酶的成本^[26,28,55]。

虽然蛋白质-聚合物在各个领域中都有良好的应用前景，但在此过程中涌现的一系列问题无疑又打击了研究人员的信心。聚合物的长度、密度、修饰的位点的不确定都易导致蛋白质活性降低甚至丧失，或产生异质混合物使其活性不稳定^{[44,135⇓~137]}。但在探索过程中，科学家也摸索出了一系列解决这些问题的方法，如图8所示：（1）可逆连接^[138⇓~140]：将聚合物和蛋白质通过可逆共价键连接，在特定环境中或在一段时间过后，聚合物能够从蛋白质上无痕释放；（2）特异位点接枝^{[131,135,141]}：利用化学接头或酶的特异性催化反应使聚合物在蛋白质上特定的位置进行修饰，从而控制修饰位点远离活性中心，降低该过程对酶活性的影响；（3）采用基因工程的手段，编辑产生远离蛋白质活性中心的接枝位点^[142]。除上述常用的方法外，Yang等^[65]提出在进行可控自由基聚合时链转移剂的结构也是影响蛋白质活性的重要因素，且合适的结构可以使得聚合物修饰即便在蛋白质的活性中心附近也并不影响其生物活性。

许多研究报道了在人体内难以降解或免疫原性强的聚合物会引发机体的免疫反应而产生特异性的抗体^[2,24,143]。这可能导致聚合物修饰的蛋白质药物造成严重的过敏反应^[2,144,145]。因此，科学家及药物审批机构开始重新思考聚合物的安全性。虽然在早期有十多项聚乙二醇化蛋白质通过了FDA的批准，但是随着药物审批程序的完善，许多聚合物修饰的蛋白质药物在临床实验中失败^[23]，引发了研究人员对聚合物修饰蛋白质药物安全性的质疑，但也激励着研究人员寻找新一代聚合物避免该副作用。研究人员开始采用人体内源性物质或可降解、免疫原性小的聚合物来代替PEG，如表1介绍了目前正在研究的各类PEG替代品。

蛋白质-聚合物在几十年的探索过程中，研究方向也发生了变化。起初，研究人员主要运用聚合物改变蛋白质的性质，但是最近的许多研究都将蛋白质-聚合物偶联物构成一个系统，使聚合物和蛋白质的功能均得到充分的发挥。另外，也有不少研究将偶联物与其他的功能分子结合形成共聚物，自组装成特定的空间结构包裹其他分子，形成具有多种特殊性能的纳米粒子。最近的研究提供了一种新的思路：我们不仅可以利用聚合物调节蛋白质的性质，也可以结合聚合物本身的功能，拓展蛋白质的应用。我们猜测，构建类似的系统可能是未来聚合物修饰蛋白质应用的主流方向之一。

总之，我们希望这篇文章能够激发科研工作者的灵感，从功能的角度出发设计出智能化响应型蛋白质-聚合物偶联物，使其发挥出理想的效果。

参考文献

原文顺序 | 出版日期 | 本文引用

[1]	Baker S L, Munasinghe A, Murata H, Lin P, Matyjaszewski K, Colina C M, Russell A J. Biomacromolecules, 2018, 19 (9): 3798.

[2]	Liu S J, Jiang S Y. Nano Today, 2016, 11 (3): 285.

[3]	Ingenbosch K N, Vieyto-Nuñez J C, Ruiz-Blanco Y B, Mayer C, Hoffmann-Jacobsen K, Sanchez-Garcia E. J. Org. Chem., 2022, 87 (3): 1669.

[4]	Silva C, Martins M, Jing S, Fu J J, Cavaco-Paulo A. Crit. Rev. Biotechnol., 2018, 38 (3): 335.

[5]	Bosio V E, Islan G A, Martinez Y N, Duran N, Castro G R. Crit. Rev. Biotechnol., 2016, 36 (3): 447.

[6]	Kujawa J, Glodek M, Li G Q, Al-Gharabli S, Knozowska K, Kujawski W. Sci. Total Environ., 2021, 801: 149647.

[7]	Russell A J, Baker S L, Colina C M, Figg C A, Kaar J L, Matyjaszewski K, Simakova A, Sumerlin B S. AIChE. J., 2018, 64 (9): 3230.

[8]	Ge J, Lei J D, Zare R N. Nat. Nanotechnol., 2012, 7 (7): 428.

[9]	Khan S, Babadaei M M N, Hasan A, Edis Z, Attar F, Siddique R, Bai Q, Sharifi M, Falahati M. J. Adv. Res., 2021, 33: 227.

[10]	Pagar A D, Patil M D, Flood D T, Yoo T H, Dawson P E, Yun H. Chem. Rev., 2021, 121 (10): 6173.

[11]	Drienovská I, Roelfes G. Nat. Catal., 2020, 3 (3): 193.

[12]	Pessatti T B, Terenzi H, Bertoldo J B. Catalysts, 2021, 11 (12): 1466.

[13]	Shadish J A, DeForest C A. Matter, 2020, 2 (1): 50.

[14]	Abuchowski A, van Es T, Palczuk N C, Davis F F. J. Biol. Chem., 1977, 252 (11): 3578.

[15]	Cobo I, Li M, Sumerlin B S, Perrier S. Nat. Mater., 2015, 14 (2): 143.

[16]	Schulz J D, Patt M, Basler S, Kries H, Hilvert D, Gauthier M A, Leroux J C. Adv. Mater., 2016, 28 (7): 1455.

[17]	Murata H, Carmali S, Baker S L, Matyjaszewski K, Russell A J. Nat. Commun., 2018, 9 (1): 845.

[18]	Liu X Y, Gao W P. Angewandte Chemie, International Edition, 2021, 60 (20): 11024.

[19]	Cao L M, Shi X J, Cui Y C, Yang W K, Chen G J, Yuan L, Chen H. Polym. Chem., 2016, 7 (32): 5139.

[20]	Messina M S, Messina K M M, Bhattacharya A, Montgomery H R, Maynard H D. Prog. Polym. Sci., 2020, 100: 101186.

[21]	Wright T A, Page R C, Konkolewicz D. Polym. Chem., 2019, 10 (4): 434.

[22]	Giri P, Pagar A D, Patil M D, Yun H. Biotechnol. Adv., 2021, 53: 107868.

[23]	Duncan R. J. Drug Target., 2017, 25 (9-10): 759.

[24]	Ekladious I, Colson Y L, Grinstaff M W. Nat. Rev. Drug Discov., 2019, 18 (4): 273.

[25]	Thakor P, Bhavana V, Sharma R, Srivastava S, Singh S B, Mehra N K. Drug Discov. Today, 2020, 25 (9): 1718.

[26]	Mukherjee I, Sinha S K, Datta S, De P. Biomacromolecules, 2018, 19 (6): 2286.

[27]	Huynh V, Ifraimov N, Wylie R G. Polymers, 2021, 13 (16): 2772.

[28]	MacKenzie K J, Francis M B. J. Am. Chem. Soc., 2013, 135 (1): 293.

[29]	Rahman M S, Brown J, Murphy R, Carnes S, Carey B, Averick S, Konkolewicz D, Page R C. Biomacromolecules, 2021, 22 (2): 309.

[30]	Li P Y, Sun M M, Xu Z K, Liu X Y, Zhao W G, Gao W P. Biomacromolecules, 2018, 19 (11): 4472.

[31]	Kim J S, Sirois A R, Vazquez Cegla A J, Jumai'an E, Murata N, Buck M E, Moore S J. Bioconjugate Chem., 2019, 30 (4): 1220.

[32]	Kaupbayeva B, Russell A J. Prog. Polym. Sci., 2020, 101: 101194.

[33]	Xiong Q Y, Zhang X Y, Wei W F, Wei G, Su Z Q. Polym. Chem., 2020, 11 (10): 1673.

[34]	Pelegri-O'Day E M, Lin E W, Maynard H D. J. Am. Chem. Soc., 2014, 136 (41): 14323.

[35]	Choi J M, Han S S, Kim H S. Biotechnol. Adv., 2015, 33 (7): 1443.

[36]	Averick S, Simakova A, Park S, Konkolewicz D, Magenau A J D, Mehl R A, Matyjaszewski K. ACS Macro Lett., 2012, 1 (1): 6.

[37]	Tian K Y, Tai K E, Chua B J W, Li Z. Bioresour. Technol., 2017, 245 (Pt B): 1491.

[38]	Zaak H, Siar E H, Kornecki J F, Fernandez-Lopez L, Pedrero S G, Virgen-Ortíz J J, Fernandez-Lafuente R. Process. Biochem., 2017, 56: 117.

[39]	Kovaliov M, Allegrezza M L, Richter B, Konkolewicz D, Averick S. Polymer, 2018, 137: 338.

[40]	Milczek E M. Chem. Rev., 2018, 118 (1): 119.

[41]	Cummings C S, Campbell A S, Baker S L, Carmali S, Murata H, Russell A J. Biomacromolecules, 2017, 18 (2): 576.

[42]	Cummings C, Murata H, Koepsel R, Russell A J. Biomacromolecules, 2014, 15 (3): 763.

[43]	Campbell A S, Murata H, Carmali S, Matyjaszewski K, Islam M F, Russell A J. Biosens. Bioelectron., 2016, 86: 446.

[44]	Lucius M, Falatach R, McGlone C, Makaroff K, Danielson A, Williams C, Nix J C, Konkolewicz D, Page R C, Berberich J A. Biomacromolecules, 2016, 17 (3): 1123.

[45]	Rodríguez-Martínez J A, Solá R J, Castillo B, Cintrón-Colón H R, Rivera-Rivera I, Barletta G, Griebenow K. Biotechnol. Bioeng., 2008, 101 (6): 1142.

[46]	Yang C, Lu D N, Liu Z. Biochemistry, 2011, 50 (13): 2585.

[47]	Farhadian S, Shareghi B, Saboury A A, Babaheydari A K, Raisi F, Heidari E. Int. J. Biol. Macromol., 2016, 92: 523.

[48]	Munasinghe A, Baker S L, Lin P, Russell A J, Colina C M. Soft Matter, 2020, 16 (2): 456.

[49]	Grigoletto A, Mero A, Zanusso I, Schiavon O, Pasut G. Macromol. Biosci., 2016, 16 (1): 50.

[50]	Sharma S, Kaur P, Jain A, Rajeswari M R, Gupta M N. Biomacromolecules, 2003, 4 (2): 330.

[51]	Verduzco L E, García-Pérez A L, Guerrero-Santos R, Ledezma-Pérez A, Romero-García J, Torres-Lubián J R. Can. J. Chem., 2021, 99 (1): 10.

[52]	Polizzi K M, Bommarius A S, Broering J M, Chaparro-Riggers J F. Curr. Opin. Chem. Biol., 2007, 11 (2): 220.

[53]	Riccardi C M, Cole K S, Benson K R, Ward J R, Bassett K M, Zhang Y R, Zore O V, Stromer B, Kasi R M, Kumar C V. Bioconjugate Chem., 2014, 25 (8): 1501.

[54]	Sen S, Martin J D, Argyropoulos D S. ACS Sustainable Chem. Eng., 2013, 1 (8): 858.

[55]	Wright T A, Dougherty M L, Schmitz B, Burridge K M, Makaroff K, Stewart J M, Fischesser H D, Shepherd J T, Berberich J A, Konkolewicz D, Page R C. Bioconjugate Chem., 2017, 28 (10): 2638.

[56]	Cui Y C, Li Z H, Wang L, Liu F, Yuan Y Q, Wang H W, Xue L L, Pan J J, Chen G J, Chen H, Yuan L. J. Mater. Chem. B, 2016, 4 (32): 5437.

[57]	Tucker B S, Coughlin M L, Figg C A, Sumerlin B S. ACS Macro Lett., 2017, 6 (4): 452.

[58]	Hwang E T, Lee S. ACS Catal., 2019, 9 (5): 4402.

[59]	Benítez-Mateos A I, Roura Padrosa D, Paradisi F. Nat. Chem., 2022, 14 (5): 489.

[60]	Vaidya B K, Ingavle G C, Ponrathnam S, Kulkarni B D, Nene S N. Bioresour. Technol., 2008, 99 (9): 3623.

[61]	Zhang Y, Wang B-C, Wang P, Ju X-J, Zhang M-J, Xie R, Liu Z, Wang W, Chu L-Y. React. Chem. Eng., 2022, 7 (2): 275.

[62]	Chiang C W, Liu X, Sun J, Guo J, Tao L, Gao W. Nano Lett., 2020, 20 (2): 1383.

[63]	Wang L, Yuan L, Wang H W, Liu X L, Li X M, Chen H. Bioconjugate Chem., 2014, 25 (7): 1252.

[64]	Li X, Wang L, Chen G J, Haddleton D M, Chen H. Chem. Commun., 2014, 50 (49): 6506.

[65]	Yang W K, Zhu L J, Cui Y C, Wang H W, Wang Y W, Yuan L, Chen H. ACS Appl. Mater. Interfaces, 2016, 8 (25): 15967.

[66]	Sheremet'ev S V, Lonshakov D V, Belosludtseva E M, Borisova O V, Sidorova A V, Kalinskii A V. Pharm. Chem. J., 2021, 55 (7): 698.

[67]	Zhang X W, Wang H, Ma Z G, Wu B J. Expert Opin. Drug Metab. Toxicol., 2014, 10 (12): 1691.

[68]	Lee K L, Shukla S, Wu M Z, Ayat N R, El Sanadi C E, Wen A M, Edelbrock J F, Pokorski J K, Commandeur U, Dubyak G R, Steinmetz N F. Acta Biomater., 2015, 19: 166.

[69]	Harris J M, Chess R B. Nat. Rev. Drug Discov., 2003, 2 (3): 214.

[70]	Steinmetz N F, Manchester M. Biomacromolecules, 2009, 10 (4): 784.

[71]	Mok H, Palmer D J, Ng P, Barry M A. Mol. Ther., 2005, 11 (1): 66.

[72]	Eto Y, Yoshioka Y, Ishida T, Yao X L, Morishige T, Narimatsu S, Mizuguchi H, Mukai Y, Okada N, Kiwada H, Nakagawa S. Biol. Pharm. Bull., 2010, 33 (9): 1540.

[73]	Church D C, Davis E, Caparco A A, Takiguchi L, Chung Y H, Steinmetz N F, Pokorski J K. Cell Rep. Phys. Sci., 2022, 3 (10): 101067.

[74]	Crooke S N, Zheng J K, Ganewatta M S, Guldberg S M, Reineke T M, Finn M G. ACS Appl. Bio Mater., 2019, 2 (1): 93.

[75]	Wu J R, Lu S Z, Zheng Z Y, Zhu L, Zhan X B. Prep. Biochem. Biotechnol., 2016, 46 (8): 788.

[76]	Lee P W, Isarov S A, Wallat J D, Molugu S K, Shukla S, Sun J E P, Zhang J, Zheng Y, Lucius Dougherty M, Konkolewicz D, Stewart P L, Steinmetz N F, Hore M J A, Pokorski J K. J. Am. Chem. Soc., 2017, 139 (9): 3312.

[77]	Kinnear C, Moore T L, Rodriguez-Lorenzo L, Rothen-Rutishauser B, Petri-Fink A. Chem. Rev., 2017, 117 (17): 11476.

[78]	Stevens C A, Kaur K, Klok H A. Adv. Drug Deliv. Rev., 2021, 174: 447.

[79]	Hu L, Zhang Y Y, Gao C Y. Progress in Chemistry, 2009, 21: 1254.

[80]	(胡玲, 张裕英, 高长有. 化学进展, 2009, 21: 1254.)

[81]	Konieczny S, Krumm C, Doert D, Neufeld K, Tiller J C. J. Biotechnol., 2014, 181: 55.

[82]	Sheng S L, Farinas E T. Catalysts, 2021, 11 (5): 606.

[83]	Zhao H. Biotechnol. Adv., 2020, 45: 107638.

[84]	Li Y, Zhang R, Xu Y. Int. J. Biol. Macromol., 2021, 168: 412.

[85]	Ismail A R, Kashtoh H, Baek K H. Int. J. Biol. Macromol., 2021, 187: 127.

[86]	Chado G R, Holland E N, Tice A K, Stoykovich M P, Kaar J L. ACS Catal., 2018, 8 (12): 11579.

[87]	Konieczny S, Leurs M, Tiller J C. ChemBioChem, 2015, 16 (1): 83.

[88]	Cummings C S, Murata H, Matyjaszewski K, Russell A J. ACS Macro Lett., 2016, 5 (4): 493.

[89]	Baker S L, Munasinghe A, Kaupbayeva B, Rebecca Kang N, Certiat M, Murata H, Matyjaszewski K, Lin P, Colina C M, Russell A J. Nat. Commun., 2019, 10 (1): 4718.

[90]	Takahashi K, Nishimura H, Yoshimoto T, Saito Y, Inada Y. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1984, 121 (1): 261.

[91]	Inada Y, Takahashi K, Yoshimoto T, Kodera Y, Matsushima A, Saito Y. Trends Biotechnol., 1988, 6 (6): 131.

[92]	Matsushima A, Kodera Y, Hiroto M, Nishimura H, Inada Y. J. Mol. Catal. B: Enzym., 1996, 2 (1): 1.

[93]	Yoshihara E, Sasaki M, Nabil A, Iijima M, Ebara M. Molecules, 2022, 27 (3): 1051.

[94]	Steiert E, Ewald J, Wagner A, Hellmich U A, Frey H, Wich P R. Polym. Chem., 2020, 11 (2): 551.

[95]	Wang L, Gong C C, Yuan X Z, Wei G. Nanomaterials, 2019, 9 (2): 285.

[96]	Varlas S, Maitland G L, Derry M J. Polymers, 2021, 13 (16): 2603.

[97]	Shirinichi F, Ibrahim T, Rodriguez M, Sun H. J. Polym. Sci., 2023, 61 (8): 631.

[98]	Ko J H, Maynard H D. Chem. Soc. Rev., 2018, 47 (24): 8998.

[99]	Hannink J M, Cornelissen J J L M, Farrera J A, Foubert P, De Schryver F C, Sommerdijk N A J M, Nolte R J M. Angewandte Chemie, International Edition, 2001, 40 (24): 4732.

[100]

Liu Z Y, Dong C H, Wang X M, Wang H J, Li W, Tan J, Chang J. ACS Appl. Mater. Interfaces, 2014, 6 (4): 2393.

[101]

Huang A, Paloni J M, Wang A, Obermeyer A C, Sureka H V, Yao H, Olsen B D. Biomacromolecules, 2019, 20 (10): 3713.

[102]

Lam C N, Olsen B D. Soft Matter, 2013, 9 (8): 2393.

[103]

Dutta K, Kanjilal P, Das R, Thayumanavan S. Angewandte Chemie, International Edition, 2021, 60 (4): 1821.

[104]

Moatsou D, Li J, Ranji A, Pitto-Barry A, Ntai I, Jewett M C, O'Reilly R K. Bioconjugate Chem., 2015, 26 (9): 1890.

[105]

Bao C Y, Chen J, Li D, Zhang A T, Zhang Q. Polym. Chem., 2020, 11 (7): 1386.

[106]

Dong X H, Obermeyer A C, Olsen B D. Angewandte Chemie, International Edition, 2017, 56 (5): 1273.

[107]

Viana D B, Mathieu-Gaedke M, Leão N M, Böker A, Ferreira Soares D C, Glebe U, Tebaldi M L. J. Drug Deliv. Sci. Technol., 2023, 79: 103995.

[108]

Jiang Y Y, Wong S, Chen F, Chang T, Lu H X, Stenzel M H. Bioconjugate Chem., 2017, 28 (4): 979.

[109]

Bartnikowski M, Dargaville T R, Ivanovski S, Hutmacher D W. Prog. Polym. Sci., 2019, 96: 1.

[110]

Cummings C S, Fein K, Murata H, Ball R L, Russell A J, Whitehead K A. J. Control. Release, 2017, 255: 270.

[111]

Li Z C, Li G K, Hu Y L. Progress in Chemistry, 2017, 29: 1480.

[112]

(李子程, 李攻科, 胡玉玲. 化学进展, 2017, 29: 1480.)

[113]

Vanparijs N, De Coen R, Laplace D, Louage B, Maji S, Lybaert L, Hoogenboom R, De Geest B G. Chem. Commun., 2015, 51 (73): 13972.

[114]

Edwardson T G W, Levasseur M D, Tetter S, Steinauer A, Hori M, Hilvert D. Chem. Rev., 2022, 122 (9): 9145.

[115]

Rother M, Nussbaumer M G, Renggli K, Bruns N. Chem. Soc. Rev., 2016, 45 (22): 6213.

[116]

Nussbaumer M G, Duskey J T, Rother M, Renggli K, Chami M, Bruns N. Adv. Sci. (Weinheim, Ger.), 2016, 3 (10): 1600046.

[117]

Kim P H, Kim J, Kim T I, Nam H Y, Yockman J W, Kim M, Kim S W, Yun C O. Biomaterials, 2011, 32 (35): 9328.

[118]

Thambi T, Hong J, Yoon A R, Yun C O. Cancer Gene Ther., 2022, 29 (10): 1321.

[119]

Kim P H, Kim T I, Yockman J W, Kim S W, Yun C O. Biomaterials, 2010, 31 (7): 1865.

[120]

Sun Y P, Lv X Q, Ding P T, Wang L, Sun Y J, Li S, Zhang H M, Gao Z B. Acta Biomater., 2019, 97: 93.

[121]

Luo Y N, Wang X N, Du D, Lin Y H. Biomater. Sci., 2015, 3 (10): 1386.

[122]

Duret D, Haftek-Terreau Z, Carretier M, Berki T, Ladavière C, Monier K, Bouvet P, Marvel J, Leverrier Y, Charreyre M T, Favier A. Polym. Chem., 2018, 9 (14): 1857.

[123]

Duret D, Haftek-Terreau Z, Carretier M, Ladavière C, Charreyre M T, Favier A. Polym. Chem., 2017, 8 (10): 1611.

[124]

Berki T, Bakunts A, Duret D, Fabre L, Ladavière C, Orsi A, Charreyre M T, Raimondi A, van Anken E, Favier A. ACS Omega, 2019, 4 (7): 12841.

[125]

Zhang Y C, Gambardella A, Üçüncü M, Geng J, Clavadetscher J, Bradley M, Lilienkampf A. Chem. Commun., 2020, 56 (89): 13856.

[126]

Majonis D, Ornatsky O, Weinrich D, Winnik M A. Biomacromolecules, 2013, 14 (5): 1503.

[127]

Zhang L B, Zhao W G, Liu X Y, Wang G L, Wang Y, Li D, Xie L Z, Gao Y, Deng H T, Gao W P. Biomaterials, 2015, 64: 2.

[128]

Chatelain P, Malievskiy O, Radziuk K, Senatorova G, Abdou M O, Vlachopapadopoulou E, Skorodok Y, Peterkova V, Leff J A, Beckert M, Group T T G W. J. Clin. Endocrinol. Metab., 2017, 102 (5): 1673.

[129]

Sprogøe K, Mortensen E, Karpf D B, Leff J A. Endocr. Connect., 2017, 6 (8): R171.

[130]

Ebied A M, Patel K H, Cooper-DeHoff R M. Am. J. Med., 2020, 133 (6): 675.

[131]

Chowdary P, Fosbury E, Riddell A, Mathias M. J. Blood Med., 2016, 7: 187.

[132]

Javia A, Vanza J, Bardoliwala D, Ghosh S, Misra L A, Patel M, Thakkar H. Int. J. Pharm., 2022, 623: 121863.

[133]

Chen C J, Ng D Y W, Weil T. Prog. Polym. Sci., 2020, 105: 101241.

[134]

Mukhopadhyay A, Das T, Datta A, Sharma K P. Biomacromolecules, 2018, 19 (3): 943.

[135]

Brendel J C, Catrouillet S, Sanchis J, Jolliffe K A, Perrier S. Polym. Chem., 2019, 10 (20): 2616.

[136]

Brendel J C, Sanchis J, Catrouillet S, Czuba E, Chen M Z, Long B M, Nowell C, Johnston A, Jolliffe K A, Perrier S. Angewandte Chemie, International Edition, 2018, 57 (51): 16678.

[137]

Hu J, Wang G L, Zhao W G, Liu X Y, Zhang L B, Gao W P. Biomaterials, 2016, 96: 84.

[138]

Morgenstern J, Gil Alvaradejo G, Bluthardt N, Beloqui A, Delaittre G, Hubbuch J. Biomacromolecules, 2018, 19 (11): 4250.

[139]

Tucker B S, Stewart J D, Aguirre J I, Holliday L S, Figg C A, Messer J G, Sumerlin B S. Biomacromolecules, 2015, 16 (8): 2374.

[140]

Rose D A, Treacy J W, Yang Z J, Ko J H, Houk K N, Maynard H D. J. Am. Chem. Soc., 2022, 144 (13): 6050.

[141]

Diehl K L, Kolesnichenko I V, Robotham S A, Bachman J L, Zhong Y, Brodbelt J S, Anslyn E V. Nat. Chem., 2016, 8 (10): 968.

[142]

Liu B, Ianosi-Irimie M, Thayumanavan S. ACS Nano, 2019, 13 (8): 9408.

[143]

Zhao E L, Soltani M, Smith A K, Hunt J P, Knotts T A IV, Bundy B C. J. Biotechnol., 2022, 345: 55.

[144]

Li H, Yang Y Y, Li G P, Wang X, Hu J X, Rong M X, Rong J. Chinese Journal of Biologicals, 2021, 34: 941.

[145]

(李欢, 杨玉莹, 李国攀, 王席, 胡基雄, 荣明轩, 荣俊. 中国生物制品学杂志, 2021, 34: 941.).

[146]

Khalil A, Würthwein G, Golitsch J, Hempel G, Fobker M, Gerss J, Möricke A, Zimmermann M, Smisek P, Zucchetti M, Nath C, Attarbaschi A, Von Stackelberg A, Gökbuget N, Rizzari C, Conter V, Schrappe M, Boos J, Lanvers-Kaminsky C. Haematologica, 2022, 107 (1): 49.

[147]

Risma K A, Edwards K M, Hummell D S, Little F F, Norton A E, Stallings A, Wood R A, Milner J D. J. Allergy Clin. Immunol., 2021, 147 (6): 2075.

[148]

Bigini P, Gobbi M, Bonati M, Clavenna A, Zucchetti M, Garattini S, Pasut G. Nat. Nanotechnol., 2021, 16 (11): 1169.

[149]

Zhang R S, Jain S, Rowland M, Hussain N, Agarwal M, Gregoriadis G. J. Diabetes Sci. Technol., 2010, 4 (3): 532.

[150]

Duncan R, Vicent M J. Adv. Drug Deliv. Rev., 2010, 62 (2): 272.

[151]

Smorodinsky N, Von Specht B U, Cesla R, Shaltiel S. Immunol. Lett., 1981, 2 (5/6): 305.

[152]

Viegas T X, Bentley M D, Harris J M, Fang Z H, Yoon K, Dizman B, Weimer R, Mero A, Pasut G, Veronese F M. Bioconjugate Chem., 2011, 22 (5): 976.

[153]

Thomas A, Müller S S, Frey H. Biomacromolecules, 2014, 15 (6): 1935.

[1]	Baker S L, Munasinghe A, Murata H, Lin P, Matyjaszewski K, Colina C M, Russell A J. Biomacromolecules, 2018, 19 (9): 3798.
[2]	Liu S J, Jiang S Y. Nano Today, 2016, 11 (3): 285.
[3]	Ingenbosch K N, Vieyto-Nu?ez J C, Ruiz-Blanco Y B, Mayer C, Hoffmann-Jacobsen K, Sanchez-Garcia E. J. Org. Chem., 2022, 87 (3): 1669.
[4]	Silva C, Martins M, Jing S, Fu J J, Cavaco-Paulo A. Crit. Rev. Biotechnol., 2018, 38 (3): 335.
[5]	Bosio V E, Islan G A, Martinez Y N, Duran N, Castro G R. Crit. Rev. Biotechnol., 2016, 36 (3): 447.
[6]	Kujawa J, Glodek M, Li G Q, Al-Gharabli S, Knozowska K, Kujawski W. Sci. Total Environ., 2021, 801: 149647.
[7]	Russell A J, Baker S L, Colina C M, Figg C A, Kaar J L, Matyjaszewski K, Simakova A, Sumerlin B S. AIChE. J., 2018, 64 (9): 3230.
[8]	Ge J, Lei J D, Zare R N. Nat. Nanotechnol., 2012, 7 (7): 428.
[9]	Khan S, Babadaei M M N, Hasan A, Edis Z, Attar F, Siddique R, Bai Q, Sharifi M, Falahati M. J. Adv. Res., 2021, 33: 227.
[10]	Pagar A D, Patil M D, Flood D T, Yoo T H, Dawson P E, Yun H. Chem. Rev., 2021, 121 (10): 6173.
[11]	Drienovská I, Roelfes G. Nat. Catal., 2020, 3 (3): 193.
[12]	Pessatti T B, Terenzi H, Bertoldo J B. Catalysts, 2021, 11 (12): 1466.
[13]	Shadish J A, DeForest C A. Matter, 2020, 2 (1): 50.
[14]	Abuchowski A, van Es T, Palczuk N C, Davis F F. J. Biol. Chem., 1977, 252 (11): 3578.
[15]	Cobo I, Li M, Sumerlin B S, Perrier S. Nat. Mater., 2015, 14 (2): 143.
[16]	Schulz J D, Patt M, Basler S, Kries H, Hilvert D, Gauthier M A, Leroux J C. Adv. Mater., 2016, 28 (7): 1455.
[17]	Murata H, Carmali S, Baker S L, Matyjaszewski K, Russell A J. Nat. Commun., 2018, 9 (1): 845.
[18]	Liu X Y, Gao W P. Angewandte Chemie, International Edition, 2021, 60 (20): 11024.
[19]	Cao L M, Shi X J, Cui Y C, Yang W K, Chen G J, Yuan L, Chen H. Polym. Chem., 2016, 7 (32): 5139.
[20]	Messina M S, Messina K M M, Bhattacharya A, Montgomery H R, Maynard H D. Prog. Polym. Sci., 2020, 100: 101186.
[21]	Wright T A, Page R C, Konkolewicz D. Polym. Chem., 2019, 10 (4): 434.
[22]	Giri P, Pagar A D, Patil M D, Yun H. Biotechnol. Adv., 2021, 53: 107868.
[23]	Duncan R. J. Drug Target., 2017, 25 (9-10): 759.
[24]	Ekladious I, Colson Y L, Grinstaff M W. Nat. Rev. Drug Discov., 2019, 18 (4): 273.
[25]	Thakor P, Bhavana V, Sharma R, Srivastava S, Singh S B, Mehra N K. Drug Discov. Today, 2020, 25 (9): 1718.
[26]	Mukherjee I, Sinha S K, Datta S, De P. Biomacromolecules, 2018, 19 (6): 2286.
[27]	Huynh V, Ifraimov N, Wylie R G. Polymers, 2021, 13 (16): 2772.
[28]	MacKenzie K J, Francis M B. J. Am. Chem. Soc., 2013, 135 (1): 293.
[29]	Rahman M S, Brown J, Murphy R, Carnes S, Carey B, Averick S, Konkolewicz D, Page R C. Biomacromolecules, 2021, 22 (2): 309.
[30]	Li P Y, Sun M M, Xu Z K, Liu X Y, Zhao W G, Gao W P. Biomacromolecules, 2018, 19 (11): 4472.
[31]	Kim J S, Sirois A R, Vazquez Cegla A J, Jumai'an E, Murata N, Buck M E, Moore S J. Bioconjugate Chem., 2019, 30 (4): 1220.
[32]	Kaupbayeva B, Russell A J. Prog. Polym. Sci., 2020, 101: 101194.
[33]	Xiong Q Y, Zhang X Y, Wei W F, Wei G, Su Z Q. Polym. Chem., 2020, 11 (10): 1673.
[34]	Pelegri-O'Day E M, Lin E W, Maynard H D. J. Am. Chem. Soc., 2014, 136 (41): 14323.
[35]	Choi J M, Han S S, Kim H S. Biotechnol. Adv., 2015, 33 (7): 1443.
[36]	Averick S, Simakova A, Park S, Konkolewicz D, Magenau A J D, Mehl R A, Matyjaszewski K. ACS Macro Lett., 2012, 1 (1): 6.
[37]	Tian K Y, Tai K E, Chua B J W, Li Z. Bioresour. Technol., 2017, 245 (Pt B): 1491.
[38]	Zaak H, Siar E H, Kornecki J F, Fernandez-Lopez L, Pedrero S G, Virgen-Ortíz J J, Fernandez-Lafuente R. Process. Biochem., 2017, 56: 117.
[39]	Kovaliov M, Allegrezza M L, Richter B, Konkolewicz D, Averick S. Polymer, 2018, 137: 338.
[40]	Milczek E M. Chem. Rev., 2018, 118 (1): 119.
[41]	Cummings C S, Campbell A S, Baker S L, Carmali S, Murata H, Russell A J. Biomacromolecules, 2017, 18 (2): 576.
[42]	Cummings C, Murata H, Koepsel R, Russell A J. Biomacromolecules, 2014, 15 (3): 763.
[43]	Campbell A S, Murata H, Carmali S, Matyjaszewski K, Islam M F, Russell A J. Biosens. Bioelectron., 2016, 86: 446.
[44]	Lucius M, Falatach R, McGlone C, Makaroff K, Danielson A, Williams C, Nix J C, Konkolewicz D, Page R C, Berberich J A. Biomacromolecules, 2016, 17 (3): 1123.
[45]	Rodríguez-Martínez J A, Solá R J, Castillo B, Cintrón-Colón H R, Rivera-Rivera I, Barletta G, Griebenow K. Biotechnol. Bioeng., 2008, 101 (6): 1142.
[46]	Yang C, Lu D N, Liu Z. Biochemistry, 2011, 50 (13): 2585.
[47]	Farhadian S, Shareghi B, Saboury A A, Babaheydari A K, Raisi F, Heidari E. Int. J. Biol. Macromol., 2016, 92: 523.
[48]	Munasinghe A, Baker S L, Lin P, Russell A J, Colina C M. Soft Matter, 2020, 16 (2): 456.
[49]	Grigoletto A, Mero A, Zanusso I, Schiavon O, Pasut G. Macromol. Biosci., 2016, 16 (1): 50.
[50]	Sharma S, Kaur P, Jain A, Rajeswari M R, Gupta M N. Biomacromolecules, 2003, 4 (2): 330.
[51]	Verduzco L E, García-Pérez A L, Guerrero-Santos R, Ledezma-Pérez A, Romero-García J, Torres-Lubián J R. Can. J. Chem., 2021, 99 (1): 10.
[52]	Polizzi K M, Bommarius A S, Broering J M, Chaparro-Riggers J F. Curr. Opin. Chem. Biol., 2007, 11 (2): 220.
[53]	Riccardi C M, Cole K S, Benson K R, Ward J R, Bassett K M, Zhang Y R, Zore O V, Stromer B, Kasi R M, Kumar C V. Bioconjugate Chem., 2014, 25 (8): 1501.
[54]	Sen S, Martin J D, Argyropoulos D S. ACS Sustainable Chem. Eng., 2013, 1 (8): 858.
[55]	Wright T A, Dougherty M L, Schmitz B, Burridge K M, Makaroff K, Stewart J M, Fischesser H D, Shepherd J T, Berberich J A, Konkolewicz D, Page R C. Bioconjugate Chem., 2017, 28 (10): 2638.
[56]	Cui Y C, Li Z H, Wang L, Liu F, Yuan Y Q, Wang H W, Xue L L, Pan J J, Chen G J, Chen H, Yuan L. J. Mater. Chem. B, 2016, 4 (32): 5437.
[57]	Tucker B S, Coughlin M L, Figg C A, Sumerlin B S. ACS Macro Lett., 2017, 6 (4): 452.
[58]	Hwang E T, Lee S. ACS Catal., 2019, 9 (5): 4402.
[59]	Benítez-Mateos A I, Roura Padrosa D, Paradisi F. Nat. Chem., 2022, 14 (5): 489.
[60]	Vaidya B K, Ingavle G C, Ponrathnam S, Kulkarni B D, Nene S N. Bioresour. Technol., 2008, 99 (9): 3623.
[61]	Zhang Y, Wang B-C, Wang P, Ju X-J, Zhang M-J, Xie R, Liu Z, Wang W, Chu L-Y. React. Chem. Eng., 2022, 7 (2): 275.
[62]	Chiang C W, Liu X, Sun J, Guo J, Tao L, Gao W. Nano Lett., 2020, 20 (2): 1383.
[63]	Wang L, Yuan L, Wang H W, Liu X L, Li X M, Chen H. Bioconjugate Chem., 2014, 25 (7): 1252.
[64]	Li X, Wang L, Chen G J, Haddleton D M, Chen H. Chem. Commun., 2014, 50 (49): 6506.
[65]	Yang W K, Zhu L J, Cui Y C, Wang H W, Wang Y W, Yuan L, Chen H. ACS Appl. Mater. Interfaces, 2016, 8 (25): 15967.
[66]	Sheremet'ev S V, Lonshakov D V, Belosludtseva E M, Borisova O V, Sidorova A V, Kalinskii A V. Pharm. Chem. J., 2021, 55 (7): 698.
[67]	Zhang X W, Wang H, Ma Z G, Wu B J. Expert Opin. Drug Metab. Toxicol., 2014, 10 (12): 1691.
[68]	Lee K L, Shukla S, Wu M Z, Ayat N R, El Sanadi C E, Wen A M, Edelbrock J F, Pokorski J K, Commandeur U, Dubyak G R, Steinmetz N F. Acta Biomater., 2015, 19: 166.
[69]	Harris J M, Chess R B. Nat. Rev. Drug Discov., 2003, 2 (3): 214.
[70]	Steinmetz N F, Manchester M. Biomacromolecules, 2009, 10 (4): 784.
[71]	Mok H, Palmer D J, Ng P, Barry M A. Mol. Ther., 2005, 11 (1): 66.
[72]	Eto Y, Yoshioka Y, Ishida T, Yao X L, Morishige T, Narimatsu S, Mizuguchi H, Mukai Y, Okada N, Kiwada H, Nakagawa S. Biol. Pharm. Bull., 2010, 33 (9): 1540.
[73]	Church D C, Davis E, Caparco A A, Takiguchi L, Chung Y H, Steinmetz N F, Pokorski J K. Cell Rep. Phys. Sci., 2022, 3 (10): 101067.
[74]	Crooke S N, Zheng J K, Ganewatta M S, Guldberg S M, Reineke T M, Finn M G. ACS Appl. Bio Mater., 2019, 2 (1): 93.
[75]	Wu J R, Lu S Z, Zheng Z Y, Zhu L, Zhan X B. Prep. Biochem. Biotechnol., 2016, 46 (8): 788.
[76]	Lee P W, Isarov S A, Wallat J D, Molugu S K, Shukla S, Sun J E P, Zhang J, Zheng Y, Lucius Dougherty M, Konkolewicz D, Stewart P L, Steinmetz N F, Hore M J A, Pokorski J K. J. Am. Chem. Soc., 2017, 139 (9): 3312.
[77]	Kinnear C, Moore T L, Rodriguez-Lorenzo L, Rothen-Rutishauser B, Petri-Fink A. Chem. Rev., 2017, 117 (17): 11476.
[78]	Stevens C A, Kaur K, Klok H A. Adv. Drug Deliv. Rev., 2021, 174: 447.
[79]	Hu L, Zhang Y Y, Gao C Y. Progress in Chemistry, 2009, 21: 1254.
[79]	(胡玲, 张裕英, 高长有. 化学进展, 2009, 21: 1254.)
[80]	Konieczny S, Krumm C, Doert D, Neufeld K, Tiller J C. J. Biotechnol., 2014, 181: 55.
[81]	Sheng S L, Farinas E T. Catalysts, 2021, 11 (5): 606.
[82]	Zhao H. Biotechnol. Adv., 2020, 45: 107638.
[83]	Li Y, Zhang R, Xu Y. Int. J. Biol. Macromol., 2021, 168: 412.
[84]	Ismail A R, Kashtoh H, Baek K H. Int. J. Biol. Macromol., 2021, 187: 127.
[85]	Chado G R, Holland E N, Tice A K, Stoykovich M P, Kaar J L. ACS Catal., 2018, 8 (12): 11579.
[86]	Konieczny S, Leurs M, Tiller J C. ChemBioChem, 2015, 16 (1): 83.
[87]	Cummings C S, Murata H, Matyjaszewski K, Russell A J. ACS Macro Lett., 2016, 5 (4): 493.
[88]	Baker S L, Munasinghe A, Kaupbayeva B, Rebecca Kang N, Certiat M, Murata H, Matyjaszewski K, Lin P, Colina C M, Russell A J. Nat. Commun., 2019, 10 (1): 4718.
[89]	Takahashi K, Nishimura H, Yoshimoto T, Saito Y, Inada Y. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1984, 121 (1): 261.
[90]	Inada Y, Takahashi K, Yoshimoto T, Kodera Y, Matsushima A, Saito Y. Trends Biotechnol., 1988, 6 (6): 131.
[91]	Matsushima A, Kodera Y, Hiroto M, Nishimura H, Inada Y. J. Mol. Catal. B: Enzym., 1996, 2 (1): 1.
[92]	Yoshihara E, Sasaki M, Nabil A, Iijima M, Ebara M. Molecules, 2022, 27 (3): 1051.
[93]	Steiert E, Ewald J, Wagner A, Hellmich U A, Frey H, Wich P R. Polym. Chem., 2020, 11 (2): 551.
[94]	Wang L, Gong C C, Yuan X Z, Wei G. Nanomaterials, 2019, 9 (2): 285.
[95]	Varlas S, Maitland G L, Derry M J. Polymers, 2021, 13 (16): 2603.
[96]	Shirinichi F, Ibrahim T, Rodriguez M, Sun H. J. Polym. Sci., 2023, 61 (8): 631.
[97]	Ko J H, Maynard H D. Chem. Soc. Rev., 2018, 47 (24): 8998.
[98]	Hannink J M, Cornelissen J J L M, Farrera J A, Foubert P, De Schryver F C, Sommerdijk N A J M, Nolte R J M. Angewandte Chemie, International Edition, 2001, 40 (24): 4732.
[99]	Liu Z Y, Dong C H, Wang X M, Wang H J, Li W, Tan J, Chang J. ACS Appl. Mater. Interfaces, 2014, 6 (4): 2393.
[100]	Huang A, Paloni J M, Wang A, Obermeyer A C, Sureka H V, Yao H, Olsen B D. Biomacromolecules, 2019, 20 (10): 3713.
[101]	Lam C N, Olsen B D. Soft Matter, 2013, 9 (8): 2393.
[102]	Dutta K, Kanjilal P, Das R, Thayumanavan S. Angewandte Chemie, International Edition, 2021, 60 (4): 1821.
[103]	Moatsou D, Li J, Ranji A, Pitto-Barry A, Ntai I, Jewett M C, O'Reilly R K. Bioconjugate Chem., 2015, 26 (9): 1890.
[104]	Bao C Y, Chen J, Li D, Zhang A T, Zhang Q. Polym. Chem., 2020, 11 (7): 1386.
[105]	Dong X H, Obermeyer A C, Olsen B D. Angewandte Chemie, International Edition, 2017, 56 (5): 1273.
[106]	Viana D B, Mathieu-Gaedke M, Le?o N M, B?ker A, Ferreira Soares D C, Glebe U, Tebaldi M L. J. Drug Deliv. Sci. Technol., 2023, 79: 103995.
[107]	Jiang Y Y, Wong S, Chen F, Chang T, Lu H X, Stenzel M H. Bioconjugate Chem., 2017, 28 (4): 979.
[108]	Bartnikowski M, Dargaville T R, Ivanovski S, Hutmacher D W. Prog. Polym. Sci., 2019, 96: 1.
[109]	Cummings C S, Fein K, Murata H, Ball R L, Russell A J, Whitehead K A. J. Control. Release, 2017, 255: 270.
[110]	Li Z C, Li G K, Hu Y L. Progress in Chemistry, 2017, 29: 1480.
[110]	(李子程, 李攻科, 胡玉玲. 化学进展, 2017, 29: 1480.)
[111]	Vanparijs N, De Coen R, Laplace D, Louage B, Maji S, Lybaert L, Hoogenboom R, De Geest B G. Chem. Commun., 2015, 51 (73): 13972.
[112]	Edwardson T G W, Levasseur M D, Tetter S, Steinauer A, Hori M, Hilvert D. Chem. Rev., 2022, 122 (9): 9145.
[113]	Rother M, Nussbaumer M G, Renggli K, Bruns N. Chem. Soc. Rev., 2016, 45 (22): 6213.
[114]	Nussbaumer M G, Duskey J T, Rother M, Renggli K, Chami M, Bruns N. Adv. Sci. (Weinheim, Ger.), 2016, 3 (10): 1600046.
[115]	Kim P H, Kim J, Kim T I, Nam H Y, Yockman J W, Kim M, Kim S W, Yun C O. Biomaterials, 2011, 32 (35): 9328.
[116]	Thambi T, Hong J, Yoon A R, Yun C O. Cancer Gene Ther., 2022, 29 (10): 1321.
[117]	Kim P H, Kim T I, Yockman J W, Kim S W, Yun C O. Biomaterials, 2010, 31 (7): 1865.
[118]	Sun Y P, Lv X Q, Ding P T, Wang L, Sun Y J, Li S, Zhang H M, Gao Z B. Acta Biomater., 2019, 97: 93.
[119]	Luo Y N, Wang X N, Du D, Lin Y H. Biomater. Sci., 2015, 3 (10): 1386.
[120]	Duret D, Haftek-Terreau Z, Carretier M, Berki T, Ladavière C, Monier K, Bouvet P, Marvel J, Leverrier Y, Charreyre M T, Favier A. Polym. Chem., 2018, 9 (14): 1857.
[121]	Duret D, Haftek-Terreau Z, Carretier M, Ladavière C, Charreyre M T, Favier A. Polym. Chem., 2017, 8 (10): 1611.
[122]	Berki T, Bakunts A, Duret D, Fabre L, Ladavière C, Orsi A, Charreyre M T, Raimondi A, van Anken E, Favier A. ACS Omega, 2019, 4 (7): 12841.
[123]	Zhang Y C, Gambardella A, ü?üncü M, Geng J, Clavadetscher J, Bradley M, Lilienkampf A. Chem. Commun., 2020, 56 (89): 13856.
[124]	Majonis D, Ornatsky O, Weinrich D, Winnik M A. Biomacromolecules, 2013, 14 (5): 1503.
[125]	Zhang L B, Zhao W G, Liu X Y, Wang G L, Wang Y, Li D, Xie L Z, Gao Y, Deng H T, Gao W P. Biomaterials, 2015, 64: 2.
[126]	Chatelain P, Malievskiy O, Radziuk K, Senatorova G, Abdou M O, Vlachopapadopoulou E, Skorodok Y, Peterkova V, Leff J A, Beckert M, Group T T G W. J. Clin. Endocrinol. Metab., 2017, 102 (5): 1673.
[127]	Sprog?e K, Mortensen E, Karpf D B, Leff J A. Endocr. Connect., 2017, 6 (8): R171.
[128]	Ebied A M, Patel K H, Cooper-DeHoff R M. Am. J. Med., 2020, 133 (6): 675.
[129]	Chowdary P, Fosbury E, Riddell A, Mathias M. J. Blood Med., 2016, 7: 187.
[130]	Javia A, Vanza J, Bardoliwala D, Ghosh S, Misra L A, Patel M, Thakkar H. Int. J. Pharm., 2022, 623: 121863.
[131]	Chen C J, Ng D Y W, Weil T. Prog. Polym. Sci., 2020, 105: 101241.
[132]	Mukhopadhyay A, Das T, Datta A, Sharma K P. Biomacromolecules, 2018, 19 (3): 943.
[133]	Brendel J C, Catrouillet S, Sanchis J, Jolliffe K A, Perrier S. Polym. Chem., 2019, 10 (20): 2616.
[134]	Brendel J C, Sanchis J, Catrouillet S, Czuba E, Chen M Z, Long B M, Nowell C, Johnston A, Jolliffe K A, Perrier S. Angewandte Chemie, International Edition, 2018, 57 (51): 16678.
[135]	Hu J, Wang G L, Zhao W G, Liu X Y, Zhang L B, Gao W P. Biomaterials, 2016, 96: 84.
[136]	Morgenstern J, Gil Alvaradejo G, Bluthardt N, Beloqui A, Delaittre G, Hubbuch J. Biomacromolecules, 2018, 19 (11): 4250.
[137]	Tucker B S, Stewart J D, Aguirre J I, Holliday L S, Figg C A, Messer J G, Sumerlin B S. Biomacromolecules, 2015, 16 (8): 2374.
[138]	Rose D A, Treacy J W, Yang Z J, Ko J H, Houk K N, Maynard H D. J. Am. Chem. Soc., 2022, 144 (13): 6050.
[139]	Diehl K L, Kolesnichenko I V, Robotham S A, Bachman J L, Zhong Y, Brodbelt J S, Anslyn E V. Nat. Chem., 2016, 8 (10): 968.
[140]	Liu B, Ianosi-Irimie M, Thayumanavan S. ACS Nano, 2019, 13 (8): 9408.
[141]	Zhao E L, Soltani M, Smith A K, Hunt J P, Knotts T A IV, Bundy B C. J. Biotechnol., 2022, 345: 55.
[142]	Li H, Yang Y Y, Li G P, Wang X, Hu J X, Rong M X, Rong J. Chinese Journal of Biologicals, 2021, 34: 941.
[142]	(李欢, 杨玉莹, 李国攀, 王席, 胡基雄, 荣明轩, 荣俊. 中国生物制品学杂志, 2021, 34: 941.).
[143]	Khalil A, Würthwein G, Golitsch J, Hempel G, Fobker M, Gerss J, M?ricke A, Zimmermann M, Smisek P, Zucchetti M, Nath C, Attarbaschi A, Von Stackelberg A, G?kbuget N, Rizzari C, Conter V, Schrappe M, Boos J, Lanvers-Kaminsky C. Haematologica, 2022, 107 (1): 49.
[144]	Risma K A, Edwards K M, Hummell D S, Little F F, Norton A E, Stallings A, Wood R A, Milner J D. J. Allergy Clin. Immunol., 2021, 147 (6): 2075.
[145]	Bigini P, Gobbi M, Bonati M, Clavenna A, Zucchetti M, Garattini S, Pasut G. Nat. Nanotechnol., 2021, 16 (11): 1169.
[146]	Zhang R S, Jain S, Rowland M, Hussain N, Agarwal M, Gregoriadis G. J. Diabetes Sci. Technol., 2010, 4 (3): 532.
[147]	Duncan R, Vicent M J. Adv. Drug Deliv. Rev., 2010, 62 (2): 272.
[148]	Smorodinsky N, Von Specht B U, Cesla R, Shaltiel S. Immunol. Lett., 1981, 2 (5/6): 305.
[149]	Viegas T X, Bentley M D, Harris J M, Fang Z H, Yoon K, Dizman B, Weimer R, Mero A, Pasut G, Veronese F M. Bioconjugate Chem., 2011, 22 (5): 976.
[150]	Thomas A, Müller S S, Frey H. Biomacromolecules, 2014, 15 (6): 1935.