新型分离纯化技术在天然产物中的应用

李文蔚; 朱子煜; 浩天瑞霖; 谢瑶; 罗爱芹; 梁阿新

doi:10.7536/PC230809

化学进展 ›› 2024, Vol. 36 ›› Issue (5) :667-678 DOI: 10.7536/PC230809

综述

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新型分离纯化技术在天然产物中的应用

李文蔚 ¹ ,
朱子煜 ¹ ,
浩天瑞霖 ¹ ,
谢瑶 ²^,^* ,
罗爱芹 ¹^,^* ,
梁阿新 ¹^,^*

作者信息 +

Application of New Separation and Purification Technology in Natural Products

Wenwei Li ¹ ,
Ziyu Zhu ¹ ,
Ruilin Haotian ¹ ,
Yao Xie ²^,^* ,
Aiqin Luo ¹^,^* ,
Axin Liang ¹^,^*

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摘要

Natural products are secondary metabolites retained by natural selection in the long-term evolution of natural organisms, which are widely used in many fields because of their rich medicinal value. With the development of modern science, the demand for high-purity products of natural products is also increasing. Traditional separation methods usually have the disadvantages of large consumption of organic solvents, poor separation effect, high cost and long cycle, which seriously restrict the development and use of natural products in various fields. The emergence of new separation and purification technologies provides new ideas for the extraction, separation and application of natural products. On the basis of summarizing the existing literature, this paper reviews the new separation and purification methods of natural products, and finally summarizes and discusses the research bottlenecks and future development directions of separation and purification of natural products.

Abstract

natural products are secondary metabolites preserved by natural selection in the long-term evolution process of natural organisms,and are widely used in many fields because of their rich medicinal value.With the development of modern science,the demand for high purity products of natural products is also increasing.Traditional separation methods usually have some disadvantages such as large consumption of organic solvents,poor separation effect,high cost and long cycle,which seriously restrict the development and use of natural products in various fields.the emergence of new separation and purification technology provides a new idea for the extraction,separation and application of natural products.On the basis of summarizing the existing literature,this paper reviews the new methods of separation and purification of natural products,and finally summarizes and discusses the research bottleneck and future development direction of natural product separation and purification。

Contents

1 Introduction

2 Novel chromatographic method

2.1 Counter-current chromatography

2.2 Hydrophilic interaction chromatography

3 Supercritical fluid separation

3.1 Ionic liquid separation

3.2 Deep eutectic solvent separation

3.3 Ionic liquid and deep eutectic solvent cooperation

4 Molecular imprinting technology

4.1 Magnetic molecularly imprinted polymer

4.2 Molecular imprinted solid phase extraction

4.3 Deep eutectic solvent-molecularly imprinted polymer

5 Conclusion and outlook

Graphical abstract

关键词

天然产物 / 分离 / 纯化

Key words

natural products / separation / purification

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李文蔚, 朱子煜, 浩天瑞霖, 谢瑶, 罗爱芹, 梁阿新. 新型分离纯化技术在天然产物中的应用[J]. 化学进展, 2024, 36(5): 667-678 DOI:10.7536/PC230809

Wenwei Li, Ziyu Zhu, Ruilin Haotian, Yao Xie, Aiqin Luo, Axin Liang. Application of New Separation and Purification Technology in Natural Products[J]. Progress in Chemistry, 2024, 36(5): 667-678 DOI:10.7536/PC230809

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1 引言

天然产物(Natural product, NP)是指植物、陆地动物、昆虫、海洋生物、微生物等天然基质中的内源性化学成分及其代谢物，是自然界生物在长久进化过程中经自然选择所保留下来的次生代谢物，来源广泛^[1]。天然产物不仅具有维持生物体自身组织器官完整性和正常生长发育的功能，某些成分还具有多种生物活性和医学意义，已经有多项研究证实，天然产物具有抗癌^[2,3]、抗病毒^[4]、治疗白血病^[5]、预防神经退行性疾病^[6]、抗氧化^[7]、降血糖^[8]等丰富的药理作用。天然产物及其衍生物根据各自的生物合成来源分为四类，包括植物来源、动物来源、微生物来源和矿物来源^[9]。天然物质的多样性与多种因素有关，最显著的是水生和陆生物种的巨大生物多样性，它们合成了多种分子结构，具有广泛的生物活性。植物来源的药用天然产物通常是次级代谢产物，它是基因表达的产物，通常不需要繁殖、生长和发育，这些次级代谢产物对维持植物基本生命活动并没有重要作用，而是作为环境适应的结果或是对捕食者的潜在保护策略而形成的，它能够通过与环境的相互作用来提高植物生存和抵抗外界压力的能力^[10]。

因为许多天然产物自身具有很高的药用价值，临床上使用的许多药物都直接或间接来源于天然产物，如吗啡、奎宁、青蒿素、紫杉醇、青霉素等^[11]。药物研发是高成本、高耗时、高风险的过程，近年来不断有围绕新型药物开发的多项新技术和新策略出现，以加速新药的开发应对不同疾病。与直接合成小分子化合药物相比，天然产物在药物开发方面具有更大的独特优势，天然产物在生物体内通过自然界长期进化选择而产生，其特定结构与活性都远远超出人们的想象^[12]。因此，虽然合成药的比例在逐年增加，但天然产物仍是药物或先导化合物的主要来源^[13]。

随着化学、生物学、医学等学科的快速发展，各种新技术被引入到天然产物药物的开发中。其中天然产物的分离、测定、活性筛选、毒性评价等方面还迫切需要经济高效的方法^[14]。要将植物中的天然活性成分作为药物使用，首要解决的就是提取和分离纯化这一问题。获取潜在的高价值化学品是天然产物研究和开发的起始步骤，无论是用于生物活性测定、批量制备，尤其是原材料中间体或成品的质量评估，全球众多分析实验室一直在寻找高效、选择性高、重复性好、成本低、环境友好的方法^[15]。植物界有超过20万种代谢物，包括发育和繁殖所需的初级代谢物，以及环境中竞争所需的次级代谢物，一株植物中多达数千种代谢产物^[16]。即使是同一种特征结构，包含的代表化合物数量也很大，例如，目前已发现的灵芝三萜酸已有400多种，包括灵芝酸A、灵芝酸C2、灵芝酸G等^[17]。

上述原因使得探究天然产物分离纯化新型技术成为非常重要的课题。传统分离纯化方法有分级沉淀法^[18]、凝胶色谱法^[19]、纤维柱色谱法^[20]、制备液相色谱法^[21]、膜分离法^[22]、大孔树脂分离^[23]等，但由于天然产物基质复杂，传统方法会存在分离效率低、成本高、污染大、制备周期长等缺点，这些劣势严重制约了天然产物的发展和应用^[24,25]。目前许多课题组都致力于新型分离纯化技术的开发，以及对传统方法进行补充与优化的相关研究，产生了很多已成功应用的新型技术，例如逆流色谱^[26,27]、亲水相互作用色谱^[28,29]、离子液体萃取^[30,31]以及分子印迹技术分离等^[32⇓~34]。本课题组已完成多种不同物质的分离纯化相关研究，同时成功设计合成多个新型色谱柱固定相，如手性氢键有机框架、金属有机笼、β-环糊精共价有机框架等，利用制备的色谱柱与紫外光谱、气相色谱、超高效液相色谱、质谱等方法联用，极大提高了多种样品的分离能力、选择性以及灵敏度^{[35⇓⇓⇓~39]}。

本综述简要介绍了天然产物的新型分离纯化方法（图1），并分别对不同方法的原理、应用、适用范围以及优缺点进行了概述，最后对目前面临的瓶颈与未来发展的方向进行了总结和展望。

2 新型色谱方法

色谱法一直以来都是天然产物分离分析的常用方法，根据原理的不同，可分为正相色谱、逆流色谱、反相色谱、多维色谱、超临界流体色谱等。传统色谱方法虽然分离效果好，但对溶剂的消耗量大、样品进样量小、分离效率低，因此近年来不断有新的天然产物分离色谱方法出现。

2.1 逆流色谱

逆流色谱法（Counter-current chromatography, CCC）是一种高效的制备分离技术，原理是基于样品在两种互不混溶的溶剂之间的分配作用，由于溶质中各组分在两溶剂中分配系数不同，因此可以利用液-液分布原理对混合物进行分离^[40]，该方法能够在不使用传统的固相载体的情况下，将目标化合物连续分布在不相溶的液-液两相之间达到分离的目的^[41]。传统的天然产物分离方法往往需要通过多个液液萃取步骤，然后再由不同的色谱方法对提取物中的单体化合物进行分离纯化，这些方法存在耗时长、溶剂用量大等缺点，同时还会造成样品变性和不可逆吸附^[42]。高速逆流色谱（High speed counter-current chromatography, HSCCC）在原理上避免了上述劣势，克服了传统柱色谱分离的缺点，具有洗脱方法灵活、上样量大、产品纯度高、操作简单等优点^[43]，已广泛应用于分离和纯化天然植物中的生物活性化合物，如蛋白质、多糖、多酚等^[44]。

虽然逆流色谱有着独特的优势，但由于流动相和固定相都是液体，一相组成的任何变化都可能引起另一相组成的变化，因此色谱条件的优化对分离结果的好坏有很大影响。Yang等^[45]建立了一种新的线性梯度洗脱方法，制备了含有不同比例的庚烷、乙酸乙酯、甲醇和水的双相溶剂系统，并用于优化甲醇等压和线性梯度的逆流色谱分离，得出最优系统为3:7:4:6（v/v/v/v），在该条件下12种木樨草根中极性范围很广的复杂混合物能够被分离。

还有研究将萃取与逆流色谱相结合，以达到减少溶剂消耗的作用。Song等^[46]建立了逆流色谱直接连续进样富集植物提取物的新方法，将正己烷-乙腈- 水溶剂体系分别泵入CCC柱，提取液（45%乙腈）直接连续进样，由于萃取液为流动相，可以大大减少溶剂的消耗，最后进样315.9 g款冬粗提物，单次运行8.5 h，能够得到倍半萜烯类富集物6.8 g，并且分离纯化出3种主要的倍半萜烯类化合物，该方法所得三种化合物的平均回收率分别为96.1%、96.9%和94.6%，而开柱色谱的平均回收率分别为77.7%、66.5%和58.4%，证明逆流色谱从天然产物中富集目标成分的能力优于传统柱色谱，并且处理量大、溶剂消耗少。

由于HSCCC不需要固定载体作为固定相，具有高样本负载力和目标分析物的高回收率，能轻松分离具有相似骨架和极性的物质。但该方法在溶剂体系的选择和优化方面，尚无更充分的理论依据，其分离原理、流体动力学平衡和分离理论、溶剂体系等关键问题尚需进一步深入研究，需要根据主观经验进行多次实验，进而筛选出更优的溶剂体系，存在一定的随机性和不确定性；且分离效果易受到两相密度差、温度、体积流量、转速等的影响；以及消耗溶剂过多、分离时间长等缺点，使得逆流色谱的应用仍受到制约，需要进一步改进与完善。

2.2 亲水相互作用液相色谱

亲水相互作用液相色谱（Hydrophilic interaction chromatography，HILIC）是一种利用极性固定相和极性有机溶剂的水溶液作为流动相的分离技术^[47]，相比于传统的反相液相色谱，具有更为优异的强极性和亲水性化合物分离能力^[48]。HILIC的分离机制比较复杂，目前较为公认的分布机制是由Alpert^[49]提出的：当流动相进入色谱柱时，固定相表面会选择性吸附流动相中的水，在表面形成动态的“富水层”，溶质在大块流动相和部分固定在固定相表面的富水层之间分配，此外，吸附、氢键、偶极-偶极相互作用、静电相互作用、分子形状选择性以及分析物与固定相之间的疏水相互作用等作用力也可能同时存在^[50]，图2形象地说明了这一原理。

与传统的色谱分离方法相同，固定相是HILIC的核心，在过去的二十年中已经引入了多种HILIC固定相，最常用的商业色谱固定相包括无键硅胶、酰胺、二醇、中性离子等，同时，还有许多新开发的固定相，如金属有机骨架（MOF）、共价有机骨架（COF）、石墨烯、磁性元素等^[51]，其中MOF表现出化学稳定性良好、机械强度高、比表面积大、官能团密度大等优点。Si等^[52]用二维MOF-FDM-23纳米片对二氧化硅球进行表面改性，制备了核壳复合材料，该材料对磺胺类、生物碱类、抗生素类、氨基酸类等多极性化合物具有良好的分离性能，此外，该固定相在分离性能、制备重现性和色谱稳定性等方面优于大多数报道的MOF基固定相，拓宽了MOF基复合材料作为色谱固定相的应用范围。

虽然HILIC在分离极性成分时表现出了极大的优势，但还存在一些不足，如HILIC的分离原理不是十分明确，存在多种复杂的相互作用，由于各种作用的影响程度不同，可能导致峰形异常，因此对参数的优化尤为重要，如流速、柱温、固定相键合的基团、pH、缓冲盐的类型等等，同时HILIC柱平衡时间较长，若柱平衡时间太短则会导致保留时间的漂移和重复性变差，不适合变化过快的梯度洗脱系统。针对上述问题，HILIC分离机理的研究以及新型固定相的研发是其未来主要的发展目标。

3 超临界流体分离

超临界流体（Supercritical fluid，SF）在过去10年内已经成为传统分离方法的优秀替代方案^[53]，被广泛应用于生物分析、食品安全和环境监测等方面^[54]，表1展示了SF在天然产物分离中的广泛研究应用。传统的天然产物分离需要用到大量有机溶剂，对环境的污染极大，因此使用绿色溶剂替代传统的挥发性有机溶剂是实现天然产物绿色提取的重要途径^[55]。超临界流体中的离子液体和深共晶溶剂作为新型绿色溶剂受到了广泛关注。离子液体是由阴离子和阳离子通过离子键形成的低温熔盐，在室温或接近室温时呈液态；深共晶溶剂由氢键供体（HBD）和氢键受体（HBA）按一定的比例组成，由于二者之间形成氢键，导致冰点降低，因此在室温下通常也呈液态^[56]。离子液体和深共晶溶剂都具有优异的物理化学性能，如液体范围宽、蒸气压低、不挥发、电导率高、溶解性好、适用性广等^[57]。

3.1 离子液体分离

离子液体（Ionic liquids, ILs）是由离子组成的有机盐，近室温下呈液态，因此被称为室温熔融盐或低温熔融盐，作为一种理想的分离提纯溶剂，也被称为“液体分子筛”，其物理和化学性质受阳离子和阴离子的性质、分子大小、库仑力和范德华力之间的平衡、氢键和π-π键相互作用的影响，这些方面的研究结果对于选择和设计特定应用的离子液体大有裨益^[58]。

液-液萃取是一种最常用的离子液体分离方法。Chen等^[59]将1-乙烯基咪唑和1-氯甲基-4-三甲氧基硅基苯混合反应，所得的离子液体接枝到二氧化硅表面的羟基上，得到IL@SiO₂，以此对青蒿素中的青蒿烯进行吸附分离（图3），二者作为结构相似物，仅有一个双键的区别，传统的柱层析方法并不能达到完全分离的效果，同时离子液体基液-液萃取法也存在一些问题，由于离子间具有强静电和氢键相互作用，使得ILs黏度较高，影响系统传质，降低分离效率。因此，综合考虑，将具有官能团的离子液体接枝到固体材料上是一个很好的选择。离子液体中不饱和键（C=C和芳香环）的引入，增强了SiO₂与青蒿烯之间的n-n共轭相互作用，使其对青蒿烯具有亲和力，克服了传统柱层析方法不能将青蒿烯完全去除的缺点，同时避免了大量有机溶剂的使用，纯化后的青蒿素纯度可达到97.97%，且在循环使用6次后仍具有一定的纯化效果。

温度响应型离子液体（TRIL）是一种能够通过改变环境温度来改变自身状态（亲水性或亲脂性）的离子液体，这种温度响应型特性在不同极性化合物的分离中具有很大的潜力^[60]。Luo等^[61]开发了一种可切换温度响应的离子液体基微乳液，以1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐、1,2-丙二醇和水为原料制备了TRIL，接着将该TRIL作为油相引入到微乳液中，形成了一种具有温度响应的新型无表面活性剂微乳液（TRIL-SFME），无需额外添加化学破乳剂即可破乳，与传统的ILs分离相比，提取率提高了1.50~5.79倍，亲水性化合物（酚酸）和亲脂性化合物（生物碱）在3 min内即可实现原位分离富集，克服了TRIL作为溶剂在萃取过程中存在的传质速率低、萃取效率低的问题，是一种高效绿色的分离策略，可以同时从植物基质中提取、原位分离和富集具有不同极性的天然活性化合物。他们采用DPD方法对萃取过程进行模拟，图4显示了TRIL-SFME和6个目标化合物的组分随时间变化的示意图。

ILs在天然产物分离领域具有良好前景的同时，也存在很多亟待解决的问题，例如：1）虽然ILs的研究应用不断深化，但仍缺乏对其作用机理的基础研究，目前许多研究都集中在咪唑类离子液体，阴阳离子组成的不同导致ILs性质的变化规律还尚未有系统总结；2）虽然ILs与传统有机溶剂相比，蒸气压大幅降低，不易挥发，但仍存在一定的生物毒性；3）ILs的结构、制备工艺以及纯化过程都比传统有机溶剂复杂，利用ILs进行分离的生产成本更高，设法对其进行回收、循环利用，是未来ILs应用的一大挑战。

3.2 深共晶溶剂分离

深共晶溶剂（Deep eutectic solvent, DES）是由Abbott等^[62]于2003年发现，DES的基本形式是Cat⁺X^-zY，其中Cat⁺可以是铵、磺酸或磷，X^-是Lewis碱，Y是Lewis酸或Brønsted酸，Y能够与X^-形成配合物，z表示与阴离子结合的Y分子的数量，这些物质通过相互作用共同形成共晶混合物^[63]。根据氢键供体和氢键受体的不同，可分为几种主要的类型：Ⅰ型DES主要通过金属氯化物和季铵盐结合，Ⅱ型DES由金属氯化物水合物和季铵盐组成，Ⅲ型由羧酸、酰胺或多元醇与季铵盐结合形成，Ⅳ型由金属氯化物水合物和氢键供体（酸、胺或醇）结合形成，最近还有研究报道了三元DES的合成，与二元DES相比，三元DES具有更低的黏度和熔点^[64]。DES的提取能力取决于各项物理化学参数，例如电导率、密度、极性和黏度等，可以通过改变HBD和HBA组分来调节这些特性。IL与DES的合成原料差别较大，IL是由阴离子和阳离子组成的盐，DES中不仅含有盐，还含有碳水化合物、氨基酸和多元醇等，其分子间不是通过共价键或离子键相互作用，而是通过分子间作用力相互作用，因此DES与IL的适用范围也不尽相同^[65]。

1,8-桉树脑广泛存在于植物芳香油中，具有多种生理活性^[66]，然而1,8-桉树脑通常与植物精油中的单萜化合物混合，由于沸点接近，很难通过蒸馏分离^[67]，Liu等^[68]发明了一系列基于乳酸（LA）的深共晶溶剂（LaDESs），并开发了LA和酪氨酸（Tyr）合成的新型LaDESs，将其用于1，8-桉叶脑和单萜烯烃的液液分离，最终产品中1,8-桉树脑的纯度达到99%，该方法具有低能耗、高选择性和安全性的优点。在LA/Tyr/1,8-桉叶脑=1∶1∶1时，LA的羧基氢与1,8-桉树脑的氧之间具有强吸引力，Tyr-LA的 N—H…O和O—H…O键长分别为2.08 Å和1.92 Å，1,8-桉叶脑-LA的O—H…O长度为1.59 Å，这些键长都小于H…O范德华半径2.72 Å，大于O—H的长度0.96 Å；∠N—H…O和∠O—H…O都大于90°，长度和角度都在氢键标准内。1,8-桉叶脑和LaDES的氢键比1,8-桉叶脑-LA的氢键短，表明键能增加，在一定程度上说明了LaDES的提取性能优于纯LA，因为Tyr与1,8-桉叶脑之间不存在竞争关系，因此Tyr的加入可以增强1,8-桉叶脑与LA的相互作用。

目前，多种DES都已被证实了其生物相容性、低毒性、环境友好性、高选择性等优点，与传统有机溶剂相比在分离方面具有多项优势。但一方面，DES的高黏度和弱挥发性限制了其在天然产物分离中的应用，较低的蒸气压使其很难通过减压蒸馏或真空干燥等方法进行有效去除和回收；另一方面，DES的许多潜在应用尚未得到充分研究，例如DES在水中的残留对环境和生物的影响、DES在自然界中的降解性、DES在分离过程中对天然产物生物活性的影响等，这些问题都还未得到深入研究。

3.3 离子液体和深共晶溶剂协同作用

在无机盐或聚合物的作用下，ILs/DESs可形成水两相体系（ATPS）^[69]。基于ATPS对天然产物分离的原理，IL在水中处于稳定的分散状态，然而DESs在水中是不稳定的，因为H₂O分子形成氢键的能力很强，会破坏HBA与HBD之间的氢键^[70]。因此，由DESs构建的ATPS需要控制水的浓度。对于含无机盐的ATPS，盐析作用是影响相分离和萃取的主要作用力^[71]，盐和ILs/DESs对水分子的吸附能力不同，当加入的盐中含有共向离子时，由于共向离子的极化作用，其周围的H₂O分子排列顺序更规律，自由能更低。

Wang等^[72]开发了一种新型的绿色溶剂热切换溶剂体系，即深共晶溶剂/离子液体/水混合物（DIWM），这种新型方法的提出基于他们之前报道的温度响应提取系统，即温度响应型离子液体溶剂体系，该方法能够在65 ℃下同时提取亲水和疏水化合物，只需将提取物冷却至室温即可原位分离提取的化合物。而热开关DIWM与该方法相比具有更低的相变温度（60 ℃），并将提取的目标化合物冷却至25 ℃原位分离，该溶剂系统由ChCl:LA/ [BMIM]PF₆/H₂O（v/v/v=1/2/1）组成，利用该方法成功提取并原位分离了迷迭香叶片中的迷迭香酸（RA）和鼠头草酸（CA），在最佳条件下提取目标化合物，在60 ℃冷却至25 ℃，此时，萃取液从单相系统转换到两相系统，RA主要分布在上相，回收率为88.97%，CA主要分布在下相，回收率为97.46%。具有提取条件温和、能耗低、操作简便、提取效率高等优点，在天然产物的综合提取中具有很大的潜力。

4 分子印迹技术

分子印迹技术（Molecular imprinting technology, MIT）是一种新兴的识别技术，它通过模拟酶与底物、抗体与抗原、细胞内受体与激素之间的相互识别，促进对模板分子的特异性识别，分子印迹聚合物（MIPs）是一种人工合成的结合剂，能够通过靶向结合位点捕获特定模板分子^[82]，其制备方法主要分为两步：（1）在模板分子存在的条件下，使功能单体和交联单体发生共聚，将模板分子包埋在刚性聚合物材料内；（2）采用一定的方法将模板分子从聚合物材料中洗脱出来，就会在聚合物材料上形成一个与模板分子尺寸、形状和结构都匹配的三维孔洞，能够特异性地与模板分子进行识别与结合^[83]。MIT以其高选择性、稳定性、实用性、低成本等突出优势，越来越受到学界重视，并广泛应用于天然产物的分离^[84]，表2展示了近年来分子印迹技术在天然产物分离中的应用。

4.1 磁性分子印迹聚合物

随着纳米颗粒分子印迹技术的发展，磁性分子印迹聚合物（MMIPs）因其优异的磁响应性能、特异的选择性、快速的传质速率和高亲和性而备受关注。MMIPs可以通过在磁性纳米颗粒核上涂覆来制备，能够使材料表面上有更多的识别位点，同时，可以使用外部磁性装置将MMIPs从样品中快速分离，无需任何过滤或离心步骤^[85]。基于上述特点，MMIPs被广泛应用于色谱分离、细胞识别、靶向给药、传感器和食品分析等不同领域^[86]。

溶菌酶（Lysozyme，Lyz）是一种小分子单链蛋白质，它能通过溶解多种细菌细胞壁以达到杀菌作用，对Lys进行高效分离检测具有重要的临床意义。本课题组制备了一种用于Lyz吸附的L-半胱氨酸覆盖的Mn²⁺掺杂ZnS量子点^[87]，在掺杂Mn²⁺的ZnS量子点表面包覆L-半胱氨酸，增加了水分散能力，降低了细胞毒性，并提供了与模板蛋白氨基结合的羧酸基团，使得其能够在液体生物样品中吸附Lyz，同时不会对样品造成破坏。将制备所得的量子点嵌入分子印迹膜（MIM），MIM的结构具有比表面积大、传质快的优点，能够提高吸附能力，对实际生物样品（如蛋清）中的溶菌酶进行吸附，得出稀释后的样品中Lyz的浓度为1.02 μmol/L，加样回收率在93%~103%，RSD在1.9%~3.5%。该实验为开发高效、高特异性、高灵敏度、可回收性好的生物样品中靶蛋白分离方法提供了新的思路。

传统的分离提取通常是在有机溶剂中进行的，为了在高极性溶剂（如甲醇、乙醇、沸水和碱性水）中使用MIP提取，需要考虑高极性溶剂削弱功能单体和印迹模板之间氢键的情况，这会导致MIP的识别能力降低^[88]。Zhang等^[89]将胶束与MIP相结合，提供更大的疏水环境，以Fe₃O₄磁性纳米颗粒为载体，制备了结构稳定、化学性能良好的磁性胶束纳米颗粒（MMNP），并在强极性溶剂中分离了芦丁。4-乙烯基-吡啶（4-VP）通过氢键与模板分子芦丁结合，硼酸与含顺式二醇的芦丁在碱性溶液中形成环硼酸盐化合物，在酸性条件下酯键可迅速断裂，实现分子可逆识别。合成模板功能单体后，利用疏水相互作用将预聚物掺入胶束中，再利用紫外光将其与交联剂交联，即将功能单体的双键固定在胶束上，形成带正电的MIP，通过静电吸附将MMIP吸附到改性的磁性纳米表面，就能形成核-壳MMNIP微球。在优化后的洗脱条件下，MMNIP从药材粗提物中分离芦丁的吸附量为16.58 mg/g。与其他方法相比，磁性胶束分子印迹具有以下优点：1）疏水/亲水性核/壳结构避免了在强极性溶剂中的弱化效应；2）疏水/亲水性核/壳结构具有较大的比表面积，印迹空穴位于表面，有利于模板的吸附和洗脱。

由于兼具高选择性和超顺磁性，MMIPs在多种天然产物分离的领域均得到了较好的应用，但同时，MMIPs也面临着功能单体种类有限、精度低、再生性差、制备成功率低等诸多问题。MMIPs的适用性取决于模板分子的识别能力和在溶剂中的分散性，其在水性介质和极性环境中的分子识别能力较低，未来应从已有的化合物中筛选、合成新的配体、接枝亲水基团等，使其更适用于亲水性聚合反应；同时，可以利用多元功能单体制备具有多识别位点的MMIPs，拓宽其适用范围，提高印迹精度，降低干扰作用；还可对制备流程进行优化、简化制备工艺，减少因多步反应导致的磁响应性能下降和颗粒团聚等问题。

4.2 分子印迹固相萃取

固相萃取（Solid-phase extraction，SPE）是一种液固基质样品制备过程中的常用分离技术，可从流体介质中分离、浓缩和纯化目标分析物，且操作简单、回收率高、可自动化、溶剂消耗少^[90]。SPE的吸附剂是萃取的决定性因素，因此新型SPE吸附剂的开发也受到研究人员的高度关注，MIPs对特定结构的高选择性，以及低成本、高稳定性和重复使用性，使其成为SPE的理想吸附剂^[91]。分子印迹固相萃取装置由熔块和MIP组成，图5展示了分子印迹固相萃取的程序。

绿原酸（CGA）是杜仲中一种高效的酚类抗氧化剂和防腐剂，由咖啡酸和奎宁酸合成，具有通过提高脂肪的抗氧化性来延长食品保质期的功效^[92]，由于深共晶溶剂具有蒸气压低和混溶性强等特性，从深共晶溶剂提取产物中回收活性成分绿原酸具有一定挑战性，传统吸附剂的预处理过程复杂，吸附和洗脱时间较长，MIP能够显著改善该方法在实际样品中选择性差的问题，具有较高的回收率^[93]。Liu等^[94]采用MIPs作为填料进行固相萃取，从杜仲叶深共晶溶剂萃取物中回收目标组分绿原酸，以绿原酸为模板分子，通过本体聚合形成MIP，利用计算模拟了甲基丙烯酸（MAA）、丙烯酰胺（AM）和2-乙烯基吡啶（2-VP）三种功能单体与绿原酸的相互作用，结果表明，MAA与绿原酸的复合体系结合能最大（-282.48 kJ/mol），主要靠绿原酸中的羟基氧原子和羰基氧原子形成氢键和MAA相连接，同时通过模拟得出，具有较大结合能的CGA-MAA在印迹过程中能产生更多的特异性识别位点，形成的MIPs具有较高的吸附量（120.70 mg/g）和选择性（IF=3.72），为从萃取物中提取绿原酸提供了新的思路。

尽管分子印迹固相萃取具有操作简单、特异识别性强、选择性好、重现性好等优点，但该方法主要适用于刚性小分子，对体积大、构象复杂、功能基团多样的生物大分子涉猎较少，因为其洗脱过程会对一些目标分子的构象造成不可逆损伤，导致目标产物损失；同时洗脱剂通常为有机溶剂，限制了分子印迹固相萃取的应用范围；并且由于MIPs与目标分子之间大部分以氢键相连，反应局限在非极性或弱极性溶剂中，在水相溶液中的选择性较差，需要寻找一种适用于水等强极性溶剂的新型功能单体；该技术在实际应用中的成本较高，离实现大规模工业化生产应用还有一定距离。

4.3 深共晶溶剂-分子印迹聚合物

功能单体和交联剂是MIPs形成的两个关键影响因素，决定了印迹位点的形成以及MIPs对生物活性物质的识别特异性和灵敏度^[95]。然而传统的功能单体和交联剂往往受到功能性差和毒性的限制，相比之下，深共晶溶剂作为功能单体和交联剂具有良好的环保性能，同时，由于深共晶溶剂单独对混合物进行分离时，会同时萃取出一些极性和理化性质与目标物质相似的组分，因此将DES引入MIP中，对其吸附性能也有改善^[96]。

芥子酸是一种具有抗氧化作用和抗炎作用的天然酚酸类化合物，广泛分布于植物中^[97]。Sun 等^[98]以油菜花粉为原料，通过对其进行高温焙烧去除外部有机物，制备了一种分层多孔支撑骨架（CRP），同时与不同种类的氯胆碱基DESs作为功能单体和交联剂结合，成功构建了高效的MIP（CRPD-MIP）（图6）。结果表明，该方法对芥子酸的吸附能力达154 mg/g，且具有良好的选择性（IF=3.24）和快速的动力学吸附平衡（60 min），对于从实际样品中提取芥子酸，CRPD-MIPs具有理想的精度和良好的实用可行性，该研究的提出也可以促进生物废弃物资源的再生利用。

深共晶溶剂和MIPs的使用都属于天然产物分离方法中的新型技术，其自身的分离原理以及合成原料的选择还尚未完全明晰，对于两种材料之间相互作用的研究则更加欠缺。由于二者在分离纯化方面都各具有独特的优势，结合使用能够将优势融合，达到取长补短的效果，对天然产物新型分离技术的开发大有裨益。

5 结论与展望

对动植物中的天然产物进行提取分离是目前大多数药物的主要来源，常用的天然产物分离方法包括液相色谱、柱层析、溶剂萃取、膜分离和重结晶等方法。这些方法具有分离效率高、应用范围广、技术成熟等优点，但在很多方面仍存在瓶颈：传统分离体系大多存在提取时间长、溶剂损耗量大、提取率较低等短板，同时选择性也较差，这些困境限制了传统方法在对天然产物进行分离方面的进一步发展，制约了天然产物在社会经济生活中的实际应用。基于此，本文提出了以下展望：①在传统的色谱方法之上，借助新型的仪器与物质创造更易于物质分离的条件，如：相变、高温、高压、超临界流体等；②探索超临界流体和分子印迹技术在天然产物分离技术中的应用，利用软件模拟设计并调整超临界流体和分子印迹聚合物的合成体系，进一步拓展天然产品分离纯化方法的技术谱系。③将多种分离纯化技术结合，取长补短地对天然产物分离方法进行优化改良，延展研发深度。

总之，新型天然产物分离纯化技术已在多种化合物上得到广泛应用，表3展示了不同天然产物分离方法的比较。不断改进对天然产物有效成分的分离纯化策略和方法是一项非常重要的任务，能够提高天然产物的利用效率，同时对于新药开发大有裨益，能够帮助人们解决多种疾病的挑战。相信随着各项科学技术的不断发展与完善，天然产物的分离纯化将进入更高层次的发展。

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