利用生物逆合成工具优化代谢路径

刘夫锋; 刘旭芝; 李金壁; 路福平

doi:10.7536/PC230906

化学进展 ›› 2024, Vol. 36 ›› Issue (4) :501-510 DOI: 10.7536/PC230906

综述

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利用生物逆合成工具优化代谢路径

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Optimizing Metabolic Pathways by Using Bioretrosynthesis Tools

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摘要

Biocatalysis has become an important technology in the field of biosynthesis because of its mild reaction conditions, high efficiency, high specificity and low price. There are a series of highly integrated metabolic networks in the biosynthetic system, and the study of multi-enzyme catalytic system has become an inevitable trend in the field of biosynthesis, so it is of great significance to explore the unknown multi-enzyme catalytic retrosynthetic pathway based on the known products. In this review, the concepts of multi-enzyme system and retrosynthetic pathway are introduced, and the design methods of retrosynthetic pathway construction tools and their advantages and disadvantages are illustrated. Then they are mainly divided into host-based and host-free tools, and some representative retrosynthesis tools for each type are listed to illustrate their respective design processes and differences. Then the possibility of artificial intelligence-assisted multi-enzyme system was further discussed, and the optimization and development of multi-enzyme pathway construction tools were prospected.

Abstract

Biocatalysis has become an important technology In the field of biosynthesis because of its mild reaction conditions,high efficiency,high specificity and low price.There are a series of highly integrated metabolic networks in the biosynthesis system,and the study of multi-enzyme catalytic system has become an inevitable trend in the field of biosynthesis,so it is of great significance to explore the unknown multi-enzyme synthesis path based on the known products.in this review,the concepts of multi-enzyme system and retrosynthesis process are introduced.and the design methods,advantages and disadvantages of retrosynthesis tools are summarized.Then the tools are divided into host-based and host-less tools.For each of these two types,some representative retrosynthesis tools are listed to analyze their respective design processes and differences.Finally,the possibility of artificial intelligence-assisted multi-enzyme system is discussed and the optimization and development of multi-enzyme pathway construction tools are forecasted。

Contents

1 Introduction

2 Multienzyme catalysis

3 Methods for building retrosynthesis tools

4 Introduction to the retrosynthesis tools

4.1 Host-based retrosynthetic tools

4.2 Host-free retrosynthetic tools

5 Artificial intelligence fuels the development of multi-enzyme systems

6 Conclusion and outlook

Graphical abstract

关键词

多酶催化 / 路径设计 / 逆合成 / 生物逆合成工具

Key words

multi-enzyme catalysis / path design / retrosynthesis / biological retrosynthesis tool

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刘夫锋, 刘旭芝, 李金壁, 路福平. 利用生物逆合成工具优化代谢路径[J]. 化学进展, 2024, 36(4): 501-510 DOI:10.7536/PC230906

Liu Fufeng, Liu Xuzhi, Li Jinbi, Lu Fuping. Optimizing Metabolic Pathways by Using Bioretrosynthesis Tools[J]. Progress in Chemistry, 2024, 36(4): 501-510 DOI:10.7536/PC230906

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1 引言

随着越来越多的基因组规模代谢网络被重建，生物学中挖掘出来的数据逐渐增多，所以需要更多的理论、算法以及工具的支持。酶作为具有催化功能的元素，与化学催化剂相比，存在很大的优势^[1,2]，可以通过合理设计及多重组装形成复合催化体系，实现级联催化功能^[3,4]。酶级联催化可以在短时间内生产出各种转化率高的化工产品^[5]。在多酶级联催化反应中了解选定的酶如何将生物原料转化为生物化学品，可以作为生物催化、代谢工程和合成生物学应用的重要基础，从而实现环境友好的绿色生物工艺^[6~9]，同时酶催化的利用对于转化非天然化合物也是非常有价值的^[10]。多酶级联反应系统以及体外细胞器的构建进一步使复杂结构化合物的合成成为可能，从而解决生物合成应用中出现的一系列问题^[11⇓~13]。然而在探索多酶合成路径的过程中，基于已知产物探索其最佳合成反应路径仍然是一个挑战，仅根据个人先验知识手动设计存在经验不足、数据不全面等限制因素，所以研究人员基于多酶反应相关信息（图1）开发出了数据驱动的工具模型用于目标化合物的逆合成路径分析，并且这些工具应用测试的结果也很优异^[14]。由此可见，自动化的逆合成路径分析法以及相关的工具模型在多酶合成网络研究中有着非常重要的作用^[15]。基于此，为便于使用者合理有效地选择这些工具，本文对构建逆合成路径的计算工具做了简要介绍以及总结。

2 多酶催化

多酶催化是并发的多酶一锅法生物催化反应以及按顺序添加组分或将工艺步骤伸缩的反应，因其反应环境友好并且降低了反应中间体转化的成本，在单酶催化与全细胞催化之间建立起了桥梁，从而一直是生物催化领域研究人员关注的焦点^[16,17]。在整个反应过程中酶级联的使用是生物催化的一个特别有吸引力的方面，因为它具有一般的反应相容性，并且能够在无细胞系统（体外）或整个细胞中实现多步反应^[18]。除此之外，多酶催化不仅减少了底物的运输和反应时间，还减少了因扩散而产生的中间损失，产生的副产物和污染物更少^[19]。近年来，多酶催化反应的应用对工业开发具有重大意义，在合成药物、化妆品、营养化合物方面取得了重大进展^[20]。

目前多酶级联催化系统主要有体内多酶催化系统和体外多酶催化系统。体内多酶催化主要指生物体内进行的某种底物在多种酶的作用下通过多步催化反应生成特定产物的过程，它可以评估宿主生物体内源性代谢系统特定环境下的路径适用性，但因其依赖宿主细胞的特点导致可行性路径范围有限。体外多酶催化是合成生物学领域发展非常迅速的一种研究方法,它是利用纯化的酶以及辅酶,通过一定的生物化学反应,将某种底物转化为目标产物的过程^[21]。体外多酶级联反应通常是天然代谢途径的细胞外重建，或组装不同类型的人工酶，以实现底物向靶产物的转化。细胞提取物和纯酶通常用于体外构建多酶级联催化系统^[22]。体外多酶级联反应具有很多优点：具有更强的合成复杂分子的能力、不需要中间分离、能够减少不利平衡向产物的转移，例如毒性效应等^[23,24]。然而在一个单一的系统中，要达成对所有酶都是最佳的一致反应条件是很有挑战性的;此外酶的稳定性是一个大问题，它们的性能可能会因为级联组分之间的不稳定或抑制性相互作用或不协调的反应条件而受损^[25]。因此，此类系统的优化通常是不可避免的，许多参数，如合成路线的设计、酶的选择、反应条件或工艺设计，都可以改变体外酶级联反应的性能（图2），故可以通过实验方法与数据驱动的工具模型相结合来优化体外多酶催化系统^[26]。

3 逆合成工具构建方法

基于多酶催化反应的相关应用发展，多酶级联反应系统在不同领域都得到了广泛的应用，出现了很多成功设计合成生物途径的案例，但其反应步骤往往比较长。与此同时，逆合成领域出现了一些生物逆合成路径设计的工具模型。生物逆合成主要用于从可再生资源或工程酶中生产高价值化合物，基于微生物代谢网络设计最佳合成途径，作为合成生物学中代谢路径的来源^[27]。生物逆合成设计首先需要定义想要合成的目标分子，然后通过一致的生化反应规则作为模板进行构建，来识别潜在的前体和反应所需的酶^[28]，最终构建的反应路径步骤比较短且反应效率能够显著提高。为了能够探索可行代谢物转化的一些未知领域，开发新的生物逆合成途径的计算工具是很有必要的。

通过对已有的逆合成路径设计方法的进展分析，我们发现逆合成路径设计的方法主要有三种（图3）^[29]：基于已有知识的路径搜索、基于模板的路径构建方法、基于无模板的路径构建方法。

早期研究人员都是基于已有知识手动进行路径搜索，根据已有的反应数据库（MetaCyc（Metabolic Pathways From all Domains of Life）^[30]、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）^[31]等）提取可能的生物合成路径并基于经验对路径进行排名。对于复杂的化合物，数据库中无该类化合物的合成路径时，这些方法通常不适用。

随着数据驱动的进一步发展，ML（Machine learning）成为了逆合成路径设计方面的主要工具，并被应用到路径设计流程的每个步骤^[32,33]。通过对该类逆合成路径设计工具进行分析，发现基于机器学习的逆合成工具在设计代谢途径的过程中主要差别在于是否依赖于模板。基于模板构建合成路径是基于模板或规则的模型（NovoStoic^[34]、RetroPathRL^[35]等^[36]）将查询分子与广义反应规则的集合相匹配，即分子的子图模式突出显示生化反应期间的变化。规则由专家手动总结^[37]或从反应数据库提取。其原理是基于目标分子根据模板库中的反应规则模板转化为反应物。虽然基于规则的方法已经在逆转录生物合成中产生了有希望的结果，但忽略了长程取代基对反应中心的影响，此外过于具体或过于一般的反应规则将分别导致预测的路线过于保守或不切实际^[38]，从而需要专家进行费力且耗时的优化，而且它们无法预测数据库之外的反应^[39]。而无模板构建合成路径则使用没有预定义反应模板的模型来预测前体，其原理是基于分子序列（如SMILES序列）将产物分子的SMILES序列转化为反应物分子的SMILES序列或者基于分子图将产物的化学键分割后适当增补形成反应物。无模板逆合成工具（BioNavi-NP^[40]等）使用反应数据库来训练ML模型，以通过输入感兴趣的分子来预测前体。

不管是依赖模板的还是无模板的，基于机器学习的逆合成途径设计工具主要工作流程都是通过四步来实现的（图4）。

（1）设计代谢路径，生成代谢网络。这些工具首先结合数据库中的已知反应，通过同源性比对来检索所需分子且基于反应规则构建新的代谢途径，或者基于目标分子序列以及结构随机断键来转化为可能的前体，其中各种预测算法则是一个非常重要的驱动因素。

（2）精炼数据。在第一步中生成的代谢网络会包含生成目标产物所有可能的反应物和酶，仅基于分子结构式随机断键可能会输出大自然中并不存在的候选前体，逆合成工具需要评估最有可能发生的反应以及最优反应物，期间会除去一些不必要的物质以及代谢路径。

（3）辨别并删减路径。通过将代谢网络中的路径同含有生物代谢途径的数据库（MetaCyc、KEGG等）中的信息做对比，辨别该路径是否属于新的路径，此外还可以获取反应化合物以及反应的一些生化特性。

（4）对生成路径进行评分以及优先级排序。通过前三步中获得的结果可以对路径评分以及排序，以便于精准定位到最有可能产生目标分子的最优途径。除此之外，逆合成工具还会考虑到化合物的毒性、产量、经济等因素，从而建议一条适合投入生产的最佳途径^[41]。

4 逆合成工具介绍

截至目前已经出现多种设计生物合成代谢途径的计算工具，基于实用性及用户使用习惯考虑，这些工具主要分为两类，一类是在宿主体内（例如大肠杆菌、蓝藻等）探索目标化合物的逆合成路径，最终得到反应步骤短、中间体易获得且成本低廉的反应路径，表1是对基于宿主的一些逆合成工具的概括分析。

此外还有一类工具是不考虑宿主的情况下在体外环境中基于已知产物进行生物逆合成反应的多种路径设计。这类工具一般（表2）是对无宿主的设计体外合成路径。

4.1 基于宿主的生物逆合成工具

基于宿主的逆合成工具主要是模拟生物体内环境设计目标化合物的合成路径，从而构建完整的体内代谢网络，有利于细胞内反应实验的应用，但是宿主类型单一，往往很难实现对多个宿主的选择，现有的主要工具有以下几种。

4.1.1 EcoSynther

EcoSynther是一个以大肠杆菌为宿主，探索大肠杆菌体内目标物质代谢途径的工具，该工具是基于Rhea^[42]、KEGG数据库和大肠杆菌基因组代谢网络开发的，它允许在目标物质前体未知的情况下对其合成路径进行自动检索，同时以大肠杆菌在特定条件下的生理状态作为参考因素。利用EcoSynther构建合成路径的过程中可以设置主要碳源以及对氧气的需求，根据设置的参数以及反应数据库来集中检索异源反应，然后将其引入大肠杆菌模型，从而构建完整的宿主体内的代谢网络，最后根据底物、反应条件以及用户设置的参数来进行通量平衡分析^[43]并计算目标化合物的理论产率^[44]。对于输出路径结果，EcoSynther以可视化界面的形式展示，方便用户查看与记录。EcoSynther可以成功检索到番茄红素的合成路径以及白藜芦醇的合成途径，其中包含酪氨酸等前体物质。

该工具不需要指定前体分子，这有助于探索不同的前体在大肠杆菌生成目标化合物的路径，并试图减少异源代谢物在生成途径中造成的影响。但由于其构建路径依赖于特定数据库，所以数据量受到一定限制，有待进一步提升。

4.1.2 Pathway hunter Tool (PHT)

Pathway hunter Tool(PHT)是一个运行快速、架构稳定并且对用户十分友好的工具，主要是用来探索宿主体内生物代谢合成的最短路径。除此之外， PHT还可以计算平均最短路径、平均备用路径以及代谢网络中节点匹配度最高的10种代谢物等。该工具首先利用代谢物原子质量值、CDK（Chemistry Development Kit）^[45]中的指纹算法以及Tanimoto算法^[46]来对代谢物结构进行相似性搜索和计算。然后在设计最短路径的过程中，PHT运用了BFS（Breath First Search）算法^[47]以及霍尔逻辑^[48]预先排除可能会导致路径中断或路径延长的副代谢物。该工具将底物和产物间的反应步骤的最小数量作为最短路径，最终基于结构相似性及BFS算法输出两个代谢物之间的最短路径。在使用PHT从头设计代谢路径时有四种选择：一种底物对一种产物的最短代谢途径、一种底物对多种可行性产物的最短代谢途径、多种可行性底物对一种产物的最短代谢途径以及对代谢途径的统计分析。该工具最终的输出可行性路径的结果有三种形式：基于文本形式、基于GML文件的形式、酶-酶连接矩阵的形式。目前丁德武等^[49]利用PHT分析了E.coli K-12 MG1655代谢网络中α-D-葡萄糖和丙酮酸之间的最短路径和反应所需相关酶。

该工具分析快速，计算准确，可视化界面对用户十分友好，便于用户操作，允许用户在选择宿主时有大量选择，在此基础上不足的是它只会输出酶在宿主体内的可用性，除此之外，该工具以BRENDA^[50]、PROSITE^[51]、KEGG等作为相关的基础数据库，可加载的代谢物数据存在局限性。

4.1.3 PathPred

PathPred是预测酶催化代谢途径的Web服务器，可以根据局部RDM模式^[52]匹配以及全球化学结构和反应物数据库的比对，预测目标化合物的多步合成途径。与其他工具不同的是，该工具在构建合成路径的过程中有两种选择：（1）细菌中外源生物降解途径;（2）植物中次生代谢物的酶催化途径，PathPred另一个独特的功能是它有可能将预测结果与基因组信息联系起来。该工具首先通过SIMCOMP程序^[53]对数据库进行一个全局相似性搜索，之后对匹配的化合物进行局部相似性搜索，利用匹配模式来查询反应中间体，该步骤不断循环，最后根据路径得分和候选化合物之间的最大相似性得分之和对化合物进行排序，结果以树状图的形式显示预测的合成路径^[54]。而且PathPred成功实现了从1,2,3,4-四氯苯到乙醇酸盐的反应途径预测以及四氯儿茶醇到四氯脲酸盐的反应预测。

PathPred可视化的界面有利于用户操作，但该工具中仍然存在很多途径并没有被收集，如环境化合物的生物降解途径和次生代谢产物的生物合成途径，而且该工具无法评估预测途径在宿主体内特定环境下的适用性。

4.1.4 PATHcre8

PATHcre8可以构建蓝藻等生物中的代谢途径，在得到所需代谢网络后，它会根据反应热力学、中间产物的毒性、产物消耗以及宿主的特异性信息对途径进行排名且排名准确度较其他工具而言更高。PATHcre8数据来源主要是KEGG数据库的化合物和反应信息，利用提取的数据构建一个独立的二分通用代谢网络^[55]来表示化合物以及代谢反应，然后将反应分数和复合分数分配给代谢网络并使用宿主的吉布斯能量（ΔG）和酶拷贝数（eCN）组合来估计反应分数，并使用KEGG正交法以及复合毒性评分（cTOX）和假设产品消耗评分（cPC）的组合来识别反应路径所需的酶以及估计反应打分情况，根据综合分数对路径进行排序，最后基于k-最短无环路径算法^[56]来获得前k条目标路径。PATHcre8在探索异戊二烯合成途径的过程中，可以检索到已经被实验证实的乙酰乙酰辅酶A为底物生成异戊二烯的途径，此外还预测了可卡因的有效合成途径。

PATHcre8的验证结果仅适用于蓝藻，首选的宿主生物体通常具有被竞争反应消耗的化合物，从而降低所需产品的产量^[57]。另一方面，首选的宿主生物可能没有产生目标化合物所需的自然代谢反应。因此，逆合成路径设计工具需要能够筛选最有效的多酶催化反应路径。

4.1.5 FMM

FMM是一个用于不同物种之间重新构建由一种代谢物到另一种代谢物的代谢途径并进行分析的Web服务器。其数据源主要基于KEGG数据库以及其他综合生物数据库。此外，FMM还有一个独特的优势：它可以实现对不同KEGG图谱中代谢物的连接操作。该工具首先收集KEGG数据库中的代谢物、酶以及反应信息，使用BFS算法利用这些信息来构建一个反应矩阵，之后凭借反应矩阵中的标识符来构建不同物种间一种代谢物到另一种代谢物的反应路径。最后基于代谢途径比对评分的方法(M-PAS)^[58]识别所有候选的代谢路径并排序，比较分析排序结果来确定哪些物种的哪些基因可以被克隆到这些微生物中来生成目标产物。在FMM中可以检索4-香豆酸酯到柚皮素的代谢途径以及反应所需的三种酶，此外还可以探索从酪氨酸到白藜芦醇代谢途径以及反应所需的三种酶。

FMM在确定两种感兴趣的代谢物后，可以从四个种类来选择物种：动物、植物、真菌和原核生物，在比较代谢途径的时候会生成主要物种栏中的一个（合成生物学中常用的微生物）和比较物种栏中多个（实验室中常用的几种生物体）的代谢途径，并且在外源途径中会建议引入外源酶。但FMM工具收集的化合物以及反应信息受KEGG数据库的限制，数据量还需要不断完善并更新^[59]。

4.1.6 MRE

到目前为止，调节竞争内源性途径的表达已经成为优化异源生产途径的有效策略之一^[60]。而MRE是一个考虑宿主内源竞争性反应的前提下，为外源代谢反应提供实际的酶并生成一种代谢物与另一种代谢物之间的反应路径的Web服务器，其数据资源主要来自于KEGG数据库。在从头设计代谢途径的时候，MRE首先会构建一个有向图来代表独立于宿主的代谢网络，其中包括数据库中已有反应信息，接着会对用户给定的宿主中内源酶反应和外来酶反应做一个分类，然后以热力学数据为依据为代谢反应分配权重，结果输出独立宿主的代谢网络并且根据净热力学偏好的衡量方法对路径进行排名。MRE在探索L-酪氨酸产生柚皮素的异源生物合成途径时，检测出了香豆酰辅酶A转化为柚皮素查尔酮的过程，此外MRE还成功验证了1,3-丙二醇、1,2-丙二醇和青蒿酸的合成途径。

MRE在路径搜索时不但速度快，而且MRE输出的代谢途径中排名靠前的途径与目前已知的最先进的途径完全相同，此外还能够在内源性代谢系统的基础上推荐外源酶，但KEGG数据库中仍然有部分物质没有EC编号以及相关基因注释，这将限制MRE探索更加有效的代谢路径^[61]。

4.2 无宿主的生物逆合成工具

无宿主的生物逆合成工具主要是利用体外多酶系统在无宿主的环境下设计目标化合物的合成路径，设计一系列合成路径网络并从中筛选出最佳路径。它没有细胞结构的限制，对于路径筛选的范围更广，要优于基于宿主的工具，目前主要的逆合成工具有以下几种。

4.2.1 RetroPath2.0

RetroPath2.0是一个基于反应规则的逆合成自动化开源工作流，其数据源主要是MetaNetX 2.0数据库^[62]，该工作流可以在可视化软件KNIME中运行。首先它以一组代谢物SMILES序列作为输入，然后将一组底物转化为一组产物时键合模式的变化进行编码作为反应规则，而对于逆转录合成应用，将规则颠倒则可以探寻产物的合成途径。在输出合成路径后该工具根据反应所需的的酶序列的能力对反应进行评分，通过SMARTS规则^[63]中底物泛化能力来评估酶的特异性，从而删除一部分低于预定义值的路径信息，输出合适的候选路径。RetroPath2.0检索了苯乙烯的合成路径，其中发现利用异源酶从苯丙氨酸生物生产苯乙烯的途径以及大肠杆菌内源性化合物的五种替代途径。

RetroPath2.0的交互式界面允许用户进行快速测试和原型设计，而且操作简单，有利于没有编程经验的用户快速了解并使用该工具来构建逆合成路径。此外该工具的反应规则不是围绕酶委员会的命名法建立的，而是从数据库中提取的酶反应的自动翻译，这提供了酶能力的精确视图^[64]。但是RetroPath2.0无法评估宿主生物体内源性代谢系统特定环境下的路径适用性且数据来源并不完善，此外RetroPath2.0对于路径排名的鉴定忽略了专家的知识及经验，所以还需要不断改进。

4.2.2 RetroPath RL

RetroPath RL是一个用于构建逆合成路径的模块化命令行工具，是RetroPath2.0的升级版。该工具以目标化合物和反应规则作为输入，使用蒙特卡洛搜索算法^[65,66]来构建可行的反应，基于键在反应中心周围的距离来筛选原子，以此来选择合适的前体，然后根据直径规则来构建反应路径并使用基于化学相似性和酶序列可用性估计的生化评分，同时还会预测化合物的毒性。基于人工整理的20种化合物的数据集的训练结果显示，在严格设置下RetroPath RL 能实现75%的文献中描述的确切路径。通过RetroPath RL 可以输出丙酮酸、乙酰辅酶A等不同底物生成中糠酸的多条合成途径。

RetroPath2.0运用的穷尽搜索算法的内存需求基本上限制为5步路径，而RetroPath RL可以探索更长的路径，在相同的时间内能找到更多的解决方案;而且可以对路径进行单独排序。但它仍然依赖于代谢数据库，在数据库数据量受限的情况下，该工具训练的准确性也受限，并且它提供的微生物菌种数量有限，有待进一步提升。

4.2.3 Retrobiocat

Retrobiocat是一个生物催化反应和级联的计算机辅助合成规划工具，相比Chematica^[67]或ASKCOS^[68]等CASP（Computer-Aided Synthesis Planning）工具，该工具能够很好地描述酶的反应步骤以及反应规则的使用。该工具的使用通常遵循三个步骤：第一步，从已知数据库中提取反应规则并编码成一套专业编码反应规则^[69]，基于此生成生物催化逆合成的通路;第二步，该工具会在每一步反应中确定特定的酶，在选定特定酶时该工具可以对文献先例中使用的酶进行识别并提供是否适用于当前路径的建议，其中文献先例的来源是研究人员开发的合成生物转化文献先例数据库。然后根据目标底物的可用性以及反应路径的步骤数等因素来构建潜在的路径。第三步，会对建议的酶以及反应路径基于底物可用性、酶选择性、热力学、辅助因子使用及底物溶解度等因素进行评分。在探索潜在的合成途径方面，该工具主要通过两种方法来实现：一种是CASP网络探索模式，用户可以通过扩展生物催化网络探索到目标分子的不同路径，网络探索模式对于不熟悉生物催化的科学家非常有用，以可视化的形式展示给用户每一个中间体的催化网络;一种是路径探索模式，该工具会根据用户定义的加权分数进行排序之前自动生成路径，然后依靠加权分数来确定哪些路径最有希望^[70]。

RetroBioCat开发了一个直观且方便用户使用的交互式界面，并且为反应所建议的酶都提供了文献先例，是一个非常宝贵的资源，并且研究人员自主构建了合成生物转化数据库，除此之外BiocatDB提供了一个搜索门户，用于研究特定酶或反应的底物特异性，可以更详尽地了解可用于特定生物转化的酶。整体来看，Retrobiocat在路径构建的测试中准确率和搜索范围都要优于Retropath2.0及RetroPath RL，然而该工具目前编码的反应规则还不足以构建更多的反应路径，如果要扩展的话需要用到更先进的路径生成算法，例如蒙特卡洛树搜索算法，并且一些酶促反应还不完整，因此，比较复杂的目标化合物可能无法构建其合成路径，该工具仍需要不断地优化。

目前已有Retrobiocat成功应用于实验的案例。高登科等以Retrobiocat工具作为辅助成功构建了L-高苯丙氨酸的高效多酶催化合成路径^[71]，如图5所示，该路径以丙酮酸和苯甲醛通过全细胞方式生成L-高苯丙氨酸，并且通过蛋白质工程提高限速酶的表达水平，实现高效生产L-高苯丙氨酸，在Retrobiocat构建过程中，将初始步骤设置为4，最大初始节点设置为7，以2-氧代-4-苯基丁酸为原料，以游离氨为氨基供体，经苯丙氨酸脱氢酶(PHEDHS)合成L-HPA，有利于工业化应用。RetrobioCat提示(E)-2-氧代-4-苯基丁-3-烯酸可以通过烯还原酶催化的烯还原反应合成。最终该路线经过人工优化实现L-高苯丙氨酸的高效合成。由此可见Retrobiocat可以有效地构建多条酶催化级联逆合成反应路径，可以作为计算机辅助构建逆合成路径的有力工具，并且可以为逆合成路径设计工具的优化提供参考。

4.2.4 Bionavi-NP

BioNavi-NP是通过端到端的变压器神经网络使用一般有机和生物合成反应来训练的单步生物逆合成预测模型，其数据源主要来源于MetaCyc（版本23.5）和KEGG数据库。该工具通过训练NLP（Natural Language Process）模型^[72]，使用Seq 2Seq（Sequence to Sequence）^[73]方法，结合62 000个类似天然产物的有机反应和33 000个生物化学反应来解决预测酶促反应过拟合问题。在构建逆合成路径的过程中，BioNavi-NP以目标化合物的SMILES序列作为输入，将提取的每个反应分成用于模型训练的源序列和靶序列，每步的预测由变压器神经网络^[74]进行，该变压器神经网络由Pytorch^[75]和OpenNMT^[76]框架构建、训练和测试。之后使用波束搜索程序、最佳性能模型、Retro*算法来预测多个可行性前体并输出最佳建议路径。该工具用USPTO_NPL数据集与BioChem数据训练的结果显示，比现有的传统基于规则的方法准确1.7倍。BioNavi-NP预测了sterhirsutin J和戊二酸的合成路径。Sterhirsutin J分解为多角烷型倍半萜和Colletorin D acid，其后通向确定的生物合成途径;戊二酸的合成路径其中包括赖氨酸降解途径以及谷氨酸生成途径，均属于确定的合成途径。

BioNavi-NP是典型的无规则训练的模型，不需要基于模板训练，相较于基于模板的RetroPath 2.0和Retrobiocat，其搜寻合成路径的范围更广，准确率更高，但也存在一些缺陷，例如读取分子准确率不高，可能会出现语义错误，无法读取等情况，且变压器神经网络还有待进一步优化。

5 人工智能助力多酶体系的发展

在数据驱动的大环境下，计算机辅助设计在酶的设计以及路径构建方面具有至关重要的地位。目前机器学习在这方面已经有很多的应用，然而传统的机器学习已经显现出了一定的劣势，例如自回归抽样策略的限制、数据集类型分类不明确、算法信息源不精确等，人工智能的助力则很好地解决了这一问题并应用于酶的人工设计^[77⇓~79]。基于深度学习的逆合成路径构建工具通过使用一系列算法进行编码对输入的分子对象基于分子指纹^[80,81]（如SMILES等）、IUPAC^[82]和分子图进行识别并构建可能的前体结构以及对所需的酶进行解析。目前已经出现了类似的逆合成路径设计工具，然而模型仍然是黑盒子模型，外行人没有必要的知识，难以解释模型详细的构建流程，对于可解释性方法仍然需要额外的知识^[83]。此外大部分模型的输入主要是基于SMILES格式，仍然存在语义不一致、读取错误等问题^[84,85]，这些问题会导致模型性能的降低，双重验证则可以有效地解决这一问题。目前已经存在部分模型采取图神经网络来识别输入的分子结构^[86,87]，而且3D图神经网络在医学领域已有应用，所以将SMILES与图神经网络的双重结合验证有望能解决这一问题^[88]。对于依赖反应数据库的逆合成工具在构建前体的过程中仍然存在反应数据库数据量、模板的准确率、数据库集成的不一致性以及数据的不完整性，包含两可的、包含错误、冗余或与文献不一致等。因此，对于数据库非标准化的命名法需要一种变通方法，这就需要不断映射，而且随着新知识的发现，可能还需要定期更新。故人工智能在助力多酶体系方面还有待进一步优化。

6 结论与展望

目前设计已知目标化合物合成路线的最有效方法是将化学和生物逆合成分析结合到一个工具中。这种方法不仅需要访问含有催化反应的大型数据库、了解生物和化学催化剂如何以生产方式结合、来缩短任何合成过程，还需要进行基础研究以了解在级联途径中进行生物和化学催化的优势和局限性，从而有效解决反应中催化剂失活和产生有害副产物等问题。此外计算机性能的局限性以及对自然代谢的理解是常见的问题，这些问题减缓了逆合成工具合理设计合成路径的步伐。所以我们仍然需要不断地挖掘新的信息来完善数据库并更新数据库，并且进一步优化逆合成工具的开发方法来提高性能，达到更高的准确率，为生物逆合成领域做出更大的贡献。

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2023-09-16	2024-04-24	2023-11-02
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2024-02-23

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