肿瘤小细胞外囊泡的精准检测

王慧静; 孙蝶; 王睿颖; 张卉

doi:10.7536/PC240318

化学进展 ›› 2024, Vol. 36 ›› Issue (12) :1972-1982 DOI: 10.7536/PC240318

综述

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肿瘤小细胞外囊泡的精准检测

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Precision Detection of Tumor Small Extracellular Vesicles

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摘要

肿瘤小细胞外囊泡是由肿瘤细胞释放的粒径小于200 nm的膜性囊泡，其表面和内部携带各种生物分子信息并参与细胞间通信，是公认的最重要的癌症液体活检物之一。肿瘤小细胞外囊泡表面含有多种蛋白，这些蛋白可以与其相对应的抗体或核酸适配体相结合，利用光学或电化学方法可以实现肿瘤小细胞外囊泡的定量检测。由于小细胞外囊泡的高度异质性和复杂性，单一生物标志物的识别容易受到外界干扰产生假阳性或假阴性信号，因此依靠单一的蛋白很难实现对肿瘤小细胞外囊泡的精准检测。同时分析多种生物标志物可以有效地解决该问题并提供更准确的癌症诊断和预后指导。本文论述了基于表面蛋白的肿瘤小细胞外囊泡的检测方法，如荧光法、比色法、电化学方法以及电致化学发光等，并从多蛋白多信号比例输出、多蛋白逻辑门的使用以及多蛋白邻近连接反应的角度重点讨论了基于表面多蛋白的小细胞外囊泡的高灵敏度的精确检测。

Abstract

Tumor small extracellular vesicles (sEVs) are membranous vesicles, released by tumor cells, with a particle size less than 200 nm. They carry diverse biomolecular information on their surface and inside, participating in intercellular communication and are recognized as one of the most crucial liquid biopsies for cancer. Because sEVs’ surface contains a variety of proteins that can bind to corresponding antibodies or nucleic acid aptamers, quantitative detection of sEVs can be achieved through optical or electrochemical methods. However, due to the high heterogeneity and complexity of sEVs, relying on a single protein for recognition may lead to false positive or false negative signals. Therefore, accurate detection of tumor-derived sEVs requires simultaneous analysis of multiple biomarkers. Simultaneous analysis of multiple biomarkers can effectively address interference caused by phenotypic heterogeneity in sEVs and provide more accurate guidance for cancer diagnosis and prognosis. This paper focuses on the detection methods of sEVs based on surface proteins using fluorescence, colorimetry, electrochemical methods, and electrochemiluminescence techniques. It emphasizes the importance of achieving high sensitivity and accuracy in detecting sEVs through multi-protein multi-signal proportional output approaches, employing multi-protein logic gates and multi-protein proximity linking reactions.

Contents

1 Introduction

2 General analysis method of small extracellular vesicles

2.1 Fluorometry

2.2 Colorimetry

2.3 Electrochemical method

2.4 Electrochemical luminescence

3 Precision detection of small extracellular vesicles based on surface multiproteins

3.1 Multiprotein proportional output

3.2 Multiprotein Logical Computation Output

3.3 Multiprotein proximity ligation reaction

4 Conclusion and outlook

Graphical abstract

关键词

肿瘤小细胞外囊泡 / 外泌体 / 液体活检 / 精准检测 / 表面多蛋白分析

Key words

tumor small extracellular vesicles / exosomes / liquid biopsy / precision detection / surface multiple proteins analysis

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王慧静, 孙蝶, 王睿颖, 张卉. 肿瘤小细胞外囊泡的精准检测[J]. 化学进展, 2024, 36(12): 1972-1982 DOI:10.7536/PC240318

Huijing Wang, Die Sun, Ruiying Wang, Hui Zhang. Precision Detection of Tumor Small Extracellular Vesicles[J]. Progress in Chemistry, 2024, 36(12): 1972-1982 DOI:10.7536/PC240318

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1 引言

细胞外囊泡（Extracellular vesicles，EVs）是由细胞释放的各种具有磷脂双分子膜结构的囊泡统称。根据其粒径和发生方式的不同，分为三种类型：外泌体（50~150 nm）、微泡（MVs，100~1000 nm）和凋亡小体（500~5000 nm）^[1]。其中，外泌体是通过细胞质膜的连续内陷产生的^[2]，如图1所示。因其很难与粒径相近的微泡完全分离，近年来，研究者通常将小于200 nm的细胞外囊泡统称为小细胞外囊泡（Small extracellular vesicles，sEVs）^[3]。相对于传统的检测血液中循环肿瘤细胞以及游离的DNA（cfDNA），sEVs的含量更丰富，所含有的遗传物质种类和数量更多，它们携带着母体细胞提供的各种生物标志物参与细胞间的通讯，其表达水平与肿瘤的发生、发展和转移密切相关^[4⇓-6]。其次，这些小囊泡表面的磷脂双分子层可有效保护其所携带的遗传信息免受降解，稳定性更好^[7-8]。另外，它们不但可以从血液中收集，而且可以从其他体液（如尿液、乳液、汗液）中获取，更加便捷。因此，sEVs是目前公认的最好的癌症液体活检检测物之一^[9⇓-11]。研究表明，癌细胞分泌的sEVs表面既具有常见的跨膜蛋白（如CD9、CD63和CD81等）^[12]，也具有多种来源于母细胞的特征蛋白（如EPCAM、EGFR和PD-L1等）^[13]，这些蛋白可以与相对应的抗体或核酸适配体结合，再利用多种检测方法，可以实现对sEVs的定量检测^[14]。

众所周知，蛋白质是负责细胞功能的主要分子，而sEVs表面蛋白的种类及表达水平与肿瘤的发生、发展和转移密切相关，不同种类的癌细胞在其产生、发展及治疗过程中，所分泌的sEVs具有很大的异质性^[15-16]。因此，在实际样品检测中，仅仅使用一种抗体或核酸适配体对肿瘤sEVs的定量检测难以实现对其亚型的筛分，也无法实现对肿瘤的分级与分期的精准检测。基于此，发展高灵敏度的检测平台用于sEVs表面蛋白的种类、含量和分布的研究，对sEVs亚型的鉴定、肿瘤sEVs的精准分析、癌症的早期诊断和监测具有更重要的意义。同时分析多种生物标志物可以有效解决sEVs表型异质性引起的干扰问题，并提供更准确的癌症诊断和预后指导^[17⇓-19]。本文针对核酸适配体及抗体对于sEVs表面蛋白的识别作用，总结了近年来常见的光谱学方法（荧光法和比色法）和电化学方法（传统电化学方法及电致化学发光）用于sEVs的检测，并重点论述了基于表面多蛋白的sEVs高灵敏度的精确检测。

2 基于表面蛋白的小细胞外囊泡的一般分析方法

sEVs可以通过超速离心、微流控装置、市售的分离试剂盒等进行提取^[20]。sEVs的形态特征可以通过透射电子显微镜、扫描电子显微镜、纳米颗粒跟踪分析和原子力显微镜直接观察到^[21]。蛋白质印迹分析、酶联免疫吸附测定、聚合酶链反应（PCR）和测序技术等可用于分析sEVs表面蛋白和核酸^[22]。通过抗体或核酸适配体对sEVs表面蛋白的识别，利用荧光检测^[23⇓-25]、电化学分析^[26⇓-28]、比色检测^[29]等方法可以实现对sEVs的定量检测。

2.1 荧光法

荧光法检测sEVs主要依赖于荧光基团、荧光染料和荧光纳米粒子的使用，结合信号放大、荧光共振能量转移等策略，可实现对其高灵敏的检测。

DNA序列具有可编程性，并且可以通过DNA之间的杂交反应来构建各种DNA纳米结构，从而实现信号放大以提高检测的灵敏度^[30]。如Zhang 等^[23]设计了一种基于PD-L1核酸适配体特异性识别结合磁性纳米粒子捕获分离sEVs的荧光传感器，用于检测肺癌来源的sEVs。在这项研究中，PD-L1核酸适配体可以特异性地与PD-L1蛋白结合，并利用sEVs触发DNA杂交链反应（HCR），从而形成超长dsDNA。通过将GelRed染料掺入dsDNA结构中，测量荧光信号强度来实现sEVs的定量检测。滚环扩增（RCA）也可以产生高分子量的DNA产物以实现信号放大，Xu等^[31]设计了一种邻近连接测定诱导的RCA策略，通过靶向sEVs蛋白和蛋白质特异性糖基化位点的邻近连接探针来高度灵敏地识别sEVs表面特异性糖蛋白。受益于高效分离、可扩展的双重识别和邻近触发的RCA扩增，提出的策略可以将不同的蛋白质特异性聚糖水平转化为荧光信号的变化，从而实现特定糖基化sEVs蛋白质的准确定量。除此之外，催化发夹组装（CHA）^[32]、链置换反应（SDR）^[33]、DNAzyme反应^[34-35]以及酶联信号放大^[36-37]也被广泛应用于荧光生物传感器。末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）可以合成极长的多核苷酸尾部从而催化信号放大过程，Ren等^[38]通过固定在磁珠上的PD-L1抗体直接从生物样本中捕获PD-L1阳性sEVs，然后捕获的sEVs与胆固醇修饰的DNA探针结合，启动TdT来放大PD-L1 sEVs的信号。Zhao等^[39]设计了一种变构探针去特异性地识别并与目标sEVs结合，从而启动随后的双循环扩增。如图2所示，扩增产物被转录后产生大量单链RNA，单链RNA可以作为CRISPR RNA引导CRISPR-Cas12a酶进行靶单链DNA的识别和切割。该方法易于操作，无需使用超速离心提取分离sEVs，可在1.5 h内完成检测，并且双循环扩增辅助CRISPR-Cas12a可以有效提高灵敏度，检测范围为10²~10⁶ particles/μL。

在DNA链的3′或5′末端修饰荧光基团或猝灭染料并不会影响DNA链之间的杂交。因此，有助于构建基于距离依赖性的荧光猝灭的FRET生物传感器。Feng等^[24]开发了一种新型双选择性sEVs荧光传感器，将磁性分子印迹聚合物（MIP）与MUC1核酸适配体/氧化石墨烯FRET系统相结合，用于选择性捕获分析sEVs，表现出很强的抗背景干扰能力。Yu等^[40]则通过金纳米颗粒对荧光基团的猝灭作用去检测sEVs。sEVs的作用可以触发金纳米颗粒上摆臂DNA的行走去切割底物链从而诱导荧光基团从金纳米颗粒中分离出来，恢复荧光。增加的荧光强度与行走的摆臂链的数量成正比，而行走的摆臂链的数量又与sEVs浓度相关，所提出的方法可以实现跨越5个数量级的宽检测范围，在磷酸缓冲溶液（PBS）中的检测限低至8.2 particles/μL。

荧光法在sEVs检测方面具有响应速度快、灵敏度高、标记简单及多通道检测等优点。然而，在实际应用中，它们仍然面临着荧光标记的稳定性和抗干扰性方面的挑战。为克服这些局限性，未来的研究应更多地关注提高稳定性、灵敏度和可靠性等方面。

2.2 比色法

比色法最大的优势在于从比色生物传感器获得的结果可以用肉眼直接观察到而不需要任何复杂的传感仪器。待测溶液颜色变化引起的吸光度变化可以通过紫外吸收光谱进行检测从而实现对sEVs的定量分析，具有成本低、检测快速简便等优点。

辣根过氧化物酶（HRP）可以催化过氧化氢介导的3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）或2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）显色反应，这种性质被广泛应用于sEVs的比色传感中^[41-42]。He等^[41]通过链霉亲和素-生物素的作用将HRP标记到DNA探针上引入反应系统作为信号转导，目标sEVs被锚定后触发HCR反应，产生HRP标记的重复单元，在过氧化氢存在的条件下催化氧化TMB，溶液颜色由无色变为蓝色指示sEVs的成功检测。Li等^[43]将HRP修饰的金纳米颗粒（GNPs-HRP）与信号探针结合，诱导TMB发生显著颜色变化，构建了一个基于RCA诱导的双信号放大的比色生物传感器，用于白血病来源的sEVs的可视化分析，检测限为100 particles/μL。纳米酶是一类具有类酶催化活性的纳米材料，相比天然酶来说，具有稳定性高、催化活性可调及成本低等独特优点。基于此，Xia等^[44]制备了具有优异水溶性的单壁碳纳米管（SWCNTs），并通过附着DNA提高SWCNTs的过氧化物酶活性进行TMB氧化，构建了一种无标记、快速且可视的核酸适配体传感器来检测sEVs，从而降低了技术和仪器的需求。Zhang等^[45]将TMB负载的石墨烯量子点纳米酶（TMB-GQDzymes）通过RCA封装到DNA纳米花（DFs）中，开发了一种针对人乳腺癌细胞（MCF-7）衍生sEVs的比色/光热双模传感平台，检测限分别为1027 particles/μL（比色法）和2170 particles/μL（光热检测）。

Jiang等^[46]开发了一种以简单方式捕获和分析sEVs蛋白信息的比色传感工具。该传感器利用了核酸适配体的双重性质，核酸适配体作为sEVs的识别部分并控制金纳米颗粒（Au NPs）的聚集。作为一种等离子体纳米材料，不同聚集程度的Au NPs溶液的颜色有着显著的差异，核酸适配体与Au NPs络合可以保护Au NPs在高浓度盐溶液中保持稳定不聚集。而当目标sEVs存在时，核酸适配体与sEVs表面蛋白特异性结合，从而诱导Au NPs的聚集，溶液颜色从红色变为蓝色。基于sDNA对Au NPs聚沉的保护作用，Li等^[47]同样构建了一种多功能的球形核酸和末端脱氧核苷酸转移酶诱导的双信号放大的比色传感平台，用于快速灵敏地检测sEVs，检测限为45 particles/μL。此外，等离子体纳米粒子在生长或刻蚀过程中的变化也伴随着相应溶液的颜色变化，Zhang等^[48]提出了一种基于酶诱导的金纳米棒（Au NRs）上银沉积的灵敏的sEVs多色视觉检测方法（图3）。该检测中不同浓度的sEVs造成Au NRs上银壳层厚度的不同，引起纵向局域表面等离子体共振峰的蓝移，并产生鲜艳的颜色变化，以此来对sEVs进行检测。

比色法在sEVs检测方面具有响应速度快、花费低等优点。然而，由于比色法需要对样品进行目视比较，会受到操作人员主观判断的影响，尽管可以使用仪器检测，但会受到多种因素的影响，灵敏度不高，误差也比较大，未来的研究方向应更多地关注提高灵敏度和检测限。

2.3 电化学方法

电化学方法具有灵敏度高、适应性强、响应速度快、小型化和低成本易操作等优点，近年来，不同类型的电化学方法已被用于sEVs的分析检测^{[49⇓⇓⇓⇓⇓-55]}。

电化学方法检测sEVs主要分为直接检测和间接检测两种。直接检测是指通过核酸适配体或抗体，又或是胆固醇探针直接将sEVs固定在电极上进行检测的过程。Huang等^[56]直接使用抗体将sEVs捕获到电极表面，随后进行RCA反应，产生大量G-四链体，这些G-四链体可以催化H₂O₂电化学反应，从而来定量检测sEVs。Yu等^[57]则通过CD63核酸适配体的作用将sEVs固定在电极上，随后基于点击化学的反应去触发HCR进行信号放大，HRP通过亲和素的作用吸附在HCR产物上催化H₂O₂产生电化学信号用于指示sEVs。Lu等^[58]则借用亚甲基蓝（MB）以及DNA探针功能化的共价有机框架（MB@DNA-COF），与固定在电极上的sEVs结合，形成一种三明治结构，利用电化学信号进行检测。DNA的功能化使COFs能够识别和捕获sEVs，并且在COFs中封装大量MB有助于信号放大，从而增强生物传感器的灵敏度。简单地利用核酸适配体等将sEVs组装在电极表面，核酸适配体的纠缠和聚集以及空间阻碍效应会影响其识别效率。基于此，Jiang等^[59]使用引入核酸适配体修饰的DNA纳米四面体（NTH）来构建电化学生物传感器。DNA NTH具有特定的取向和高度机械的刚性结构，可以确保核酸适配体以精确的方向和密度在电极上分配以提高检测系统的捕获效率。以DNA NTH为识别和捕获单元，Au NPs-DNA偶联物与HRP偶联，实现信号放大。该检测系统检测限低至1.66×10⁴ particles/mL。

由于sEVs不具有导电性，因此直接将sEVs负载在电极上检测会面临着电阻过大从而影响检测的灵敏度。因此，一些研究将sEVs的检测转化为DNA的检测，通过DNA的检测从而间接地检测目标sEVs，并且在这个过程中利用DNA反应以及酶的作用等进行更加方便的信号放大从而提高检测的灵敏度。如图4所示，Dong等^[60]将检测sEVs转化为检测多个具有相同片段的DNA，并且利用核酸外切酶的作用进行循环剪切从而实现信号放大，最佳条件下，检测限低至70 particles/μL。Sun等^[61]则利用内切酶Nb.BbvCI的剪切作用，在sEVs与核酸适配体相互作用之后连接底物，对底物进行原位循环剪切产生大量新的DNA单链，并将该DNA单链去固定在电极上触发HCR，HCR的DNA产物通过静电作用吸附大量电活性物质Ru³⁺产生电化学信号，通过双重扩增实现sEVs的灵敏检测。Wang等^[55]将sEVs作为形成球形核酸的模板，单个sEVs对应多个引物链，引物链通过TdT的作用延伸后作为模板链结合带有信号分子的DNA探针（Probe A），从而Probe A被消化，电化学信号降低。被消化后的Probe A可作为新的引物链继续去触发信号链的循环消化过程，实现了基于SNAs和酶介导的三重信号扩增。Zeng等^[62]利用核酸适配体对sEVs表面蛋白的特异性识别作用，将未结合到sEVs表面特异性蛋白的适配体作为引发链去触发后续反应，同时检测sEVs上的两种特异性蛋白（MUC1和PD-L1）。其中未结合的游离MUC1适配体触发RCA产生富G序列折叠成G-四链体从而嵌入MB分子。因此当不存在MUC1蛋白时，MB的电化学信号很低，存在MUC1蛋白时，MB的电化学信号恢复。而未结合的游离PD-L1适配体可以解离DNA纳米球从而将DNA纳米球富集的阿霉素分子释放。因此不存在PD-L1蛋白时，DOX的电化学信号显著，存在PD-L1蛋白时，DOX的电化学信号猝灭。

电化学在sEVs检测方面具有操作简便、仪器价格便宜、易于小型化等优点。但由于受导电性的影响，直接检测灵敏度并不高，尽管间接检测可有效提高检测灵敏度，但多条DNA的引入，会影响检测的重现性。随着科技的进步，电化学分析方法也在不断的发展，目前一些新兴的电化学分析技术，如微电极、纳米电极等的发展，可以实现sEVs的原位检测，从而有效提高其检测的准确性和灵敏度。

2.4 电致化学发光

电致化学发光（ECL）方法结合了电化学方法与发光技术的优点，在反应物氧化还原的反应过程中包含了发光过程。截至目前，量子点、类石墨氮化碳纳米片（g-C₃N₄ NSs）、三（2,2′-联吡啶基）钌（Ⅱ）（Ru(bpy)₃²⁺）衍生物和鲁米诺等ECL发射体，已经被应用于sEVs检测分析^{[63⇓⇓⇓⇓⇓-69]}。比如，Qiao 等^[70]采用巯基丙酸（MPA）改性掺杂Eu³⁺的CdS量子点（MPA-CdS:Eu NCs）作为ECL发射体，H₂O₂作为共反应剂，使用CD63核酸适配体捕获sEVs到电极表面，当sEVs存在时，通过H₂O₂被消耗而导致的ECL信号猝灭来检测sEVs。Feng等^[71]将Ru(bpy)₃²⁺分子包埋并包装在二氧化硅纳米颗粒中（RuSi NPs）去修饰电极，当sEVs触发DNA Walker行走切割后，葡萄糖氧化酶与DNA的偶联物杂交到电极表面去氧化H₂O₂，从而使RuSi NPs的ECL信号猝灭来实现sEVs的灵敏检测。Xiong等^[72]构建了一种基于Au NPs和聚合物量子点（Pdots）之间局域表面等离子体共振（LSPR）的ECL免疫传感器用于测定胰腺癌sEVs。基于LSPR效应，制备的夹心型ECL免疫传感器具有较高的灵敏度，检测限为400 particles/mL，线性检测范围宽，可用于检测PANC-01细胞来源的sEVs，并且可以实现多重sEVs蛋白质谱分析，提供一个多功能平台来评估来自各种细胞系的sEVs的表面蛋白表达水平。

与传统的电化学方法相比，ECL测定可以有效避免背景电流的干扰，具有浓度响应范围广、灵敏度高及光学设置简单等优势。但对其的要求也比较高，需要合成很好的电致化学发光材料。近年来，结合光学显微镜与电子倍增图像传感器的电化学发光显微镜获得了极大的关注，成为电化学测量中一种创新性的技术手段。未来可以将电化学发光成像应用到sEVs的检测，从而可以更直观、更灵敏地进行检测。

3 基于表面多蛋白的小细胞外囊泡的精准检测

综上所述，通过抗体或核酸适配体对sEVs表面蛋白的识别，利用光谱学和电化学方法等可对sEVs进行定量检测，目前已有多篇文章发表。但来源于癌症的sEVs异质性较高，单一生物标志物识别很容易受到外界干扰并产生错误信号，进而影响检测的准确性。例如，从正常细胞和肿瘤细胞释放的sEVs具有相似的大小，并表现出相似的性质，但蛋白表达水平略有不同。因此，不能仅通过识别一种表面蛋白来区分，必须改进当前的方法并开发在单个sEVs上分析其表面多种蛋白的创新技术。为实现对sEVs的精准检测，近年来科学家们提出了多蛋白比例输出，逻辑门策略及多蛋白邻近连接等策略。

3.1 多蛋白比例输出

多蛋白比例输出是指对sEVs上的多种生物标志物进行综合检测，从而可有效提高分子诊断的敏感性、特异性和准确性^[73⇓-75]。因此，临床诊断非常需要基于多参数sEVs膜的综合分析^[17,76-77]。

Zhang等^[78]选择了三种特定于癌症相关蛋白的核酸适配体（CD63、EpCAM和HER2），以Au NPs作为核心，将三种不同元素（Y、Eu和Tb）掺杂的纳米颗粒（UCNPs）连接起来作为卫星，从而形成三个纳米卫星组件。如图5所示，特异性核酸适配体识别sEVs表面蛋白并释放相应的UCNPs，这些UCNPs可以通过电感耦合等离子体质谱同时进行检测。该体系能够在40 min内同时检测sEVs的三种表面蛋白，检测限为4.7×10³ particles/mL。通过该方法，可以准确地区分来自7种不同细胞系（L-02、HepG1、GES-803、MGC7、AGS、HeLa和MCF-7）的sEVs，在检测多种sEVs表面蛋白和识别早期癌症方面发挥重要作用。

Cheng等^[79]选择CD63（一种普遍存在的sEVs跨膜蛋白）和MUC1（肿瘤细胞中过表达的糖蛋白）作为癌症sEVs的检测靶点。开发了一种基于脚趾介导的DNA链位移信号放大和同步荧光技术的双色DNA纳米器件，用于同时高灵敏度分析sEVs表面的多种蛋白。首先，核酸适配体磁珠的纳米偶联物可以识别sEVs的表面蛋白并导致单链DNA的释放。然后，释放的DNA可以触发脚趾介导的DNA链置换以进行信号放大，实现超灵敏测定sEVs的表面蛋白。Zhang等^[80]构建了一种基于多探针识别策略的一步法多重分析的电化学适体传感器来检测分析乳腺癌sEVs。该体系选择HER2阳性乳腺癌细胞（SK-BR-3）的sEVs作为模型靶标，以CD63核酸适配体、MB标记的HER2核酸适配体和二茂铁（Fc）标记的EpCAM核酸适配体作为特异性识别分子，实现对HER2阳性癌症sEVs的精确检测。两种具有不同电化学活性物质的功能化核酸适配体的Au NPs（即MB-HER2-Au NPs和Fc-EpCAM- Au NPs）与目标sEVs混合，然后添加到CD63核酸适体修饰的电极表面。通过监测两种电活性物质的电流信号，可以在同一电极上一步实现SK-BR-3 sEVs表面蛋白的多重分析。该策略具有灵敏度高、检出限低及操作方便等优点，并且通过多探针鉴定评估不同细胞亚型的乳腺癌sEVs，提高了检测精度，在乳腺癌的筛查和预后中具有潜在的应用价值。

3.2 多蛋白逻辑计算输出

DNA逻辑计算由多个输入产生准确的单个输出。与单一蛋白质检测策略相比，DNA生物计算中的“AND”逻辑可以减少表型异质性的影响，从而提高检测的准确性。Gao等^[81]在细胞膜上开发了一种三适体介导的邻近连接方法，以准确识别细胞亚型并分离特定细胞。Peng等^[82]制备了用于靶细胞表面蛋白双特异性识别和定量的3D-DNA逻辑门纳米机器，大大提高了细胞识别的准确性。Zhao等^[83]采用CD63核酸适配体和EpCAM核酸适配体检测MCF-7细胞分泌的sEVs，只有两种蛋白都存在时才会触发DNA Walker，并且在DNA Walker与核酸外切酶Ⅲ双重信号放大的作用下，检测限为1.3×10⁴ particles/mL，表明该检测方法具有出色的选择性以及较高的灵敏度。Yu等^[84]提出了一种双核酸适配体结合AND逻辑门的检测策略，用于高灵敏度的精确检测肿瘤衍生sEVs。如图6所示，在该测定中，两种在CCRF-CEM sEVs膜上的表达都很丰富的相关蛋白酪氨酸激酶样7（PTK7）和前列腺特异性膜抗原（PSMA）作为DNA逻辑门的输入。只有两种蛋白都存在时，AND逻辑门才会有信号的输出。4种不同肿瘤来源的sEVs被用来验证AND逻辑门的可行性，通过该测定成功检测CCRF-CEM sEVs，这表明该策略在准确的癌症诊断中具有潜在的应用前景。

Hu等^[85]开发了一种聚合酶驱动的逻辑信号放大系统（PLSAS），用于sEVs表面蛋白的高灵敏度检测和乳腺癌鉴定。首先，引入核酸适配体作为传感模块来特异性识别目标蛋白。通过改变输入的DNA序列，合理设计了两种聚合酶驱动的引物交换反应系统进行DNA逻辑计算。这里允许使用“OR”和“AND”逻辑自主靶向有限数量的靶标，实现sEVs表面蛋白的特异性和超灵敏检测。Feng等^[86]选择了三种针对结直肠癌sEVs膜蛋白的延伸核酸适配体，包括EpCAM、CD63和PTK7，分别称为T1-SYL3C、T2-CD63-1和T3-Sgc8c。如图7所示，三个脚趾固定的扩展的DNA核酸适配体作为特定的输入，用于执行AND逻辑门控以区分健康和癌变的EVs。只有在所有三个目标都存在的情况下，才会输出初始信号，否则，信号为负。为了保持该系统中双链DNA的热稳定性，后续采用熵驱动扩增（EDA）来扩增目标信号链。该策略已成功用于分析结直肠癌患者和健康供体临床样本中的sEVs。

3.3 多蛋白邻近连接反应

sEVs在分子特征上具有高度异质性，因此，它们的表面蛋白反映了它们的起源细胞并决定了受体细胞的类型。基于以往的检测方法，非靶sEVs和可溶性靶蛋白的非特异性结合引起的干扰不容忽视。虽然基于双抗体的邻近连接测定可以确定两个标志物在同一sEVs上的同步表达以提高检测特异性，但仍然面临复杂空间位阻的问题。因此，需要一种从肿瘤来源的sEVs中精确定量特定生物标志物的方法。与抗体相比，核酸适配体可以编程设计，无需复杂的DNA-抗体偶联，空间位阻较小，可以有效识别sEVs。此外，还可以简单地替换或增加核酸适配体类型以分析所需的sEVs亚型或实现多重分析^{[87⇓⇓⇓-91]}。Zhao等^[92]设计了一种核酸适配体-胆固醇介导的邻近连接测定法，用于sEVs的高度特异性鉴定和定量。Zhang等^[93]开发了一种邻近诱导的DNA酶链自主组装，用于准确鉴定sEVs。通过结合HCR和DNA酶进行双等温扩增，提高了检测灵敏度。通过同时识别表面蛋白和脂质膜，实现了检测的高特异性。Sun等^[94]提出一种基于双阳性EVs膜蛋白同时结合的识别模式。通过结合双核酸适配体邻近连接介导的脚趾激活G-四链体DNAZyme催化的Au@Ag纳米棒（Au@Ag NRs）蚀刻，开发了一种准确、非纯化、低成本和可视化的sEVs识别策略。Peng等^[95]设计了两个核酸适配体发夹探针，能够分别与细胞膜上的两个相邻蛋白质结合，以激活链置换反应的缔合交织，然后触发二聚体滚环扩增，最终产生显著放大的电化学信号，用于目标CTCs的灵敏定量。Lin等^[96]为了实现对肿瘤来源sEVs的特异性识别，两种sEVs靶向核酸适配体MJ5C17和SYL3C18分别作为针对PD-L1和EpCAM的亲和探针。如图8所示，两个探针都设计有两个功能结构域：一个用于靶标识别的适配子结构域；一个在5′或3′末端具有附加序列的延伸部分，用于邻近连接。该体系中的双核酸适配体可以识别在同一sEVs上同时表达的两种生物标志物，有效消除了sEVs对非肿瘤细胞和可溶性蛋白的干扰，从而大大提高了检测选择性。

Li等^[97]在单个sEVs上使用多个蛋白质生物标志物作为输入和热泳积累来放大输出信号，以实现sEVs的高灵敏度和特异性分析。该策略选择两种乳腺癌相关蛋白，HER2和上皮细胞黏附分子（EpCAM）作为sEVs膜上进行邻近连接反应的输入。其设计的两条ssDNA链（Apt-S-T），每条链由一个核酸适配体序列（Apt），一个间隔序列（S）和一个结合的脚趾激活序列（T）组成。在Apt-S-T探针与EVs膜上的靶蛋白结合后，在连接器序列的帮助下形成结合的脚趾纳米结构。然后使用H1和H2发夹探头启动脚趾激活的HCR以进行信号放大。为了提高检测的灵敏度，首先使用CD63核酸适配体修饰的微珠捕获sEVs。在HCR之后，微珠通过热泳富集以放大输出信号。这种对单个sEVs上EpCAM和HER2的同步检测可以有效提高与乳腺癌密切相关sEVs的识别。

Shi等^[98]设计了一种通过由双核酸适配体引发的HCR编码的sEVs膜上组装纳米催化剂来制造的用于乳腺癌诊断和免疫治疗监测的诊断工具。该双核酸适配体识别策略可有效消除非肿瘤细胞分泌的sEVs和可溶性蛋白的干扰，获得优异的选择性。此外，具有高催化活性的HCR编码Pt@AuNPs组件允许信号放大和彩色信号输出，可以用肉眼或手机摄像头读取。Deng等^[88]使用一步法热泳结合在sEVs表面的邻近连接操作，以均匀、无分离的形式直接从血清中检测同时存在EpCAM和PSMA两种蛋白的肿瘤衍生的sEVs。

Lu等^[99]通过结合双核酸适配体识别诱导的邻近连接串联微流控分离来证明sEVs亚群分离。这种PLA介导的微流控能够顺序分离肿瘤衍生PD-L1 sEVs和非肿瘤衍生PD-L1 sEVs。此外，除了以前的定量分析之外，该平台还可以通过芯片断开和DNA水解实现sEVs亚群的高效率检测和低破坏性回收。Wang等^[100]构建了一种基于共定位依赖系统（Co-DNA-Locker）的传感比率策略，并将其应用于自组装Au NRs垂直阵列的超灵敏sEVs检测。Cy5标记的EpCAM核酸适配体连接在Au NRs上用于捕获sEVs，CD63和HER2蛋白的核酸适配体分别结合这两种蛋白邻近连接形成Co-DNA- Locker，赋予sEVs SERS传感器优异的特异性。其中，EpCAM核酸适配体末端标记的Cy5作为内标信号分子，构建成比例传感平台，降低了背景信号干扰，使所制备的SERS传感器具有较好的精确度，为早期癌症检测提供了创新的技术平台。

4 结论与展望

sEVs在通过细胞间通信调节细胞行为方面发挥着关键作用。肿瘤来源的sEVs的浓度远远大于CTC，稳定性也优于cfDNA，且很容易通过体液获得，已被证实在多种疾病模型中存在明显的表达差异，是最重要的液体活检物之一。对sEVs生物标志物的精确评估及其表面蛋白模式的剖析会大幅度提高对于癌症等疾病的治疗与研究的进展。目前结合多种检测技术，对sEVs的高灵敏度检测已经实现，但其中大多数是批量检测sEVs。批量分析方法往往会忽略sEVs在疾病发展过程中的可变性，从而限制对单个sEVs的深入了解并影响各种疾病诊断和检测的准确性。越来越多的研究表明，对单个sEVs上的多种生物标志物进行综合检测可有效提高分子诊断的敏感性、特异性和准确性，因此越来越多的研究集中在对其精准检测上。另外，一些研究聚焦于单个sEVs的原位成像和跟踪。这种方法有望提供对细胞动力学的更深入的了解，包括EV的生物发生、细胞间运输、摄取和货物释放。而今后还需要开发更高效、更强大的单个sEVs表面多参数多重分析的检测方法，例如同时检测具有高灵敏度和特异性的靶蛋白和micro RNA，这将有助于推进sEVs在液体活检中的应用。

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