蛋白质羰基化修饰及其分析检测方法

王春雨; 唐子茗; 刘春荣

doi:10.7536/PC240809

化学进展 ›› 2025, Vol. 37 ›› Issue (6) :801-811 DOI: 10.7536/PC240809

综述与评论

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蛋白质羰基化修饰及其分析检测方法

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Protein Carbonylation Modification and Its Analytical Detection Assays

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摘要

蛋白质羰基化修饰是一种重要的调控蛋白质功能的翻译后修饰。细胞蛋白质羰基化的检测与鉴定可以为氧化应激相关蛋白作用网络及相关疾病的病理研究提供重要信息。该综述对氧化应激的来源进行阐述，并介绍了蛋白质羰基化的产生路径及检测方法。我们主要聚焦由脂质衍生亲电试剂（Lipid-derived electrophiles，LDEs）引起的蛋白质羰基化的分析检测研究，介绍基于质谱的化学蛋白质组学策略。

Abstract

Protein carbonylation modification is an irreversible post-translational modification （PTM） that plays a vital role in modulating protein function. The profiling of intracellular protein carbonylation can provide important information for the investigation of the molecular mechanisms of oxidative stress-related protein signaling networks and pathologies of related diseases. Here， we provide a meticulous description and systematic synthesis of recent research progress in protein carbonylation profiling assays development， especially for mass spectrometry-based chemoproteomic platforms for global profiling of protein lipoxidation. Oxidative stress has been regarded as the result of intracellular reactive oxygen species （ROS） exceeding the buffering capacity of antioxidant defenses， triggering oxidative damage towards lipids， DNA， and proteins. Protein carbonylation （PCO） can be produced either directly by amino acid side chain oxidation， protein backbone cleavage pathways， or indirectly via the formation of adducts between protein nucleophilic side chains and lipid peroxidation products or glycosylation products. We focus on the analysis and detection of protein carbonylation caused by lipid-derived electrophiles （LDEs）， and highlight the recent development of protein LDEs profiling assays， especially for mass spectrometry （MS）-based chemoproteomic strategies. Due to the low relative abundance， poor chemical stability， and lack of specific physicochemical properties （e.g. absorption or fluorescence）， many carbonylated proteins could not be detected directly， and their detection and quantification rely on the recognition with specific chemical probes. With these probes， mass spectrometry-based chemo-proteomic platforms emerge as powerful tools for comprehensive profiling of protein carbonylation， offering unparalleled sensitivity and specificity， facilitating the identification of protein targets and modification sites critical for elucidating the molecular mechanisms underlying disease progression.

Contents

1 Introduction

2 Sources of oxidative stress and protein carbonylation

2.1 Oxidative stress

2.2 Sources of protein carbonylation

3 Analytical detection methods for protein carbonylation modifications

3.1 Gel-based approach

3.2 Gel-free method based on mass spectrometry

4 Conclusion and outlook

Graphical abstract

关键词

翻译后修饰 / 蛋白质羰基化修饰 / LDEs / 化学探针 / 蛋白质组学

Key words

post-translational modifications / protein carbonylation modifications / lipid-derived electrophiles （LDEs） / chemical probes / proteomic

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王春雨, 唐子茗, 刘春荣. 蛋白质羰基化修饰及其分析检测方法[J]. 化学进展, 2025, 37(6): 801-811 DOI:10.7536/PC240809

Chunyu Wang, Ziming Tang, Chunrong Liu. Protein Carbonylation Modification and Its Analytical Detection Assays[J]. Progress in Chemistry, 2025, 37(6): 801-811 DOI:10.7536/PC240809

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1 引言

蛋白质作为构成细胞的基础有机组分，不仅参与构建生命体系的基本框架，还承担着驱动生命活动进程的重要作用。mRNA在细胞质中与核糖体结合启动蛋白质的翻译过程，tRNA转运对应的氨基酸在核糖体中组装，生成特定氨基酸序列的肽链。但翻译后的前体蛋白往往不具备生理活性，必须经过正确折叠和修饰后才能发挥其功能。通过共价偶联功能基团或蛋白质、调节亚基的水解拆离或整个蛋白质的降解途径，蛋白质翻译后修饰（Post-translation modification，PTM）可以改变蛋白质的结构^[1]、功能、定位、活性与互作^[2]等，增加蛋白质组的功能多样性，在细胞信号传导、代谢调控和细胞命运决定等生物学过程中起着重要作用，进而影响细胞的诸多核心活动。PTM可以发生在细胞生命周期的任何阶段、发生在不同的氨基酸侧链或肽键上，并产生不同的功能，这进一步增加了蛋白质组的复杂性。同时，异常的PTM往往也是细胞应激和功能失常的重要标志。

氧化应激（Oxidative stress，OS）通常被认为是细胞系统内活性氧（ROS）的累积量超过内源性抗氧化机制的清除能力，导致涉及脂质、DNA和蛋白质的氧化损伤^[3]。蛋白质羰基化修饰是一种不可逆的蛋白质翻译后修饰，也是氧化应激的重要表现之一。蛋白质羰基化可以由蛋白质过氧化直接产生（通过氨基酸侧链氧化和蛋白质骨架裂解途径），也可以由脂质化合物过氧化、糖氧化间接产生（通过蛋白质亲核侧链与脂质过氧化产物或糖基化产物形成加合物）^[4]。在与氧化应激相关的病理条件下，蛋白质羰基含量显著增加^[5-6]。例如，与年轻对照组相比，老年人脑中的蛋白质羰基化含量增加^[7]；阿尔茨海默症患者脑中部分蛋白质的羰基化水平显著高于健康对照组^[8]；心衰恶病质大鼠的蛋白质羰基化水平升高^[9]。因此，蛋白质羰基化是与衰老和多种疾病紧密相关的重要的潜在的生物标志物。同时，蛋白质羰基化会调控蛋白功能，进而影响相关信号转导网络^[10-11]，参与一系列的生理过程。因此，羰基化对于蛋白质功能的发挥具有至关重要的调节作用，生物样本中蛋白质羰基化检测尤其是羰基化位点的鉴定具有重要意义，可以为氧化应激相关蛋白作用网络及相关疾病的分子机制研究提供重要信息^[12]。

蛋白质组学研究被誉为“后基因组学”，是在大规模水平上研究系列蛋白质性质的科学。其研究内容包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白质与其他蛋白质之间或与其他生物分子之间的相互作用等^[13]。随着质谱（MS）仪器和实验方法的快速发展，基于质谱的蛋白质组学已成为在蛋白质水平上阐明生物过程的可靠且必不可少的工具。

本综述介绍了氧化应激与蛋白质羰基化修饰的来源，并聚焦由ROS进攻脂质化合物造成脂质化合物过氧化产生的脂质衍生亲电试剂（LDEs）引起的蛋白质羰基化修饰的检测，讨论了近些年来发展的检测蛋白质羰基的检测鉴定方法，尤其是基于质谱技术的蛋白质羰基化组学技术的发展。最后，本文对蛋白质羰基化修饰的检测分析方法的发展进行了讨论与展望。

2 氧化应激与蛋白质羰基化修饰的来源

2.1 氧化应激

氧气参与细胞有氧呼吸，几乎所有需氧生物都需要氧气参与线粒体呼吸作用供能。活性氧物种（ROS）主要包括H₂O₂、O₂^•-、•OH等具有高反应活性的含氧小分子，并被普遍认为是细胞有氧代谢的天然副产物。活性氧分子的主要源头为超氧阴离子自由基（O₂^•-），主要于线粒体呼吸作用过程中由线粒体电子传递链（ETC）中的电子泄露产生。此外，NADPH氧化酶（NOXs）、黄嘌呤氧化酶（XO）^[14]等涉及电子转移的酶也可催化产生O₂^•-。H₂O₂主要是通过SOD催化的超氧自由基歧化反应形成的，也可在NOX4、黄嘌呤氧化酶等酶催化的反应中直接形成^[15]。正常情况下，细胞中的ROS处于较低水平，部分活性氧物种如H₂O₂承担着细胞信号传导的功能。当细胞ROS水平过高时，会引起氧化应激，细胞中的抗氧化网络协同运作，过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（Prx）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）等相互配合，通过多种ROS清除机制并缓解氧化应激造成的影响^[16-17]（图1）。

氧化应激可导致脂质、DNA和蛋白质等重要生物大分子的过氧化并造成不可逆损伤，这种情况持续较长时间会导致细胞生理能力的部分丧失，甚至导致细胞死亡^[18]。与此一致，氧化应激已被报道与衰老过程的进行以及多种疾病的发生发展密切相关^[19]，包括癌症、心血管疾病、动脉粥样硬化、高血压、糖尿病、阿尔茨海默症、帕金森症、类风湿性关节炎等^[20]。

2.2 蛋白质羰基化修饰的来源

在氧化应激状态下，将活性羰基，主要是醛和酮，引入蛋白质结构的过程称为蛋白质羰基化（Protein carbonylation，PCO）^[21]，其引起蛋白质结构和功能的变化，加重氧化应激或者调控系列下游通路，并参与许多生理过程与疾病的病理过程。早在1962年，Garrison等^[22]利用辐射首次证明了在蛋白质中形成了羰基化修饰。此后，科学家们对其进行了长期研究，并发现蛋白质羰基化主要有四种来源：蛋白质骨架的断裂、蛋白质氨基酸侧链的氧化、脂质过氧化产物对蛋白质的修饰、糖化的氧化产物^[23]（图2）。

2.2.1 蛋白质骨架的断裂

蛋白质的多肽骨架中氨基酸的α-碳原子可与活性氧自由基（ROS）发生反应，生成烷氧基自由基。随后，这些自由基可以遵循两种方式进行裂解：一种是通过二酰胺化反应，另一种则是沿着α-酰胺化反应进行裂解^[24]，如图3a、b所示。第一种情况下（图3a），自由基起始部位的C—C键断裂，使自由基所在一侧的多肽片段形成二酰胺结构，另一侧多肽片段则形成异氰酸酯基团；第二种情况下（图3b），自由基起始位点的C—N键发生断裂，使得来自蛋白质N端的多肽片段转化为酰胺，而蛋白质C端的多肽段则形成N-α-酮羰基酰胺。

2.2.2 蛋白质氨基酸侧链的氧化

此外，当蛋白质侧链（特别是脯氨酸、精氨酸、赖氨酸和苏氨酸）^[25]受到活性氧进攻时，也可生成一个或多个羰基基团（图4）。这些氨基酸侧链氧化产物主要包括由脯氨酸残基氧化得到2-吡咯烷酮、由精氨酸和脯氨酸残基氧化得到的谷氨酸半醛、由赖氨酰残基氧化得到的氨基己二酸半醛以及由苏氨酸残基氧化得到的2-氨基-3-酮丁酸（图5）。其中，精氨酸残基和脯氨酸残基的氧化产物谷氨酸-1-半醛及赖氨酸的氧化产物氨基己二酸半醛可能是细胞中含量最高的两种特定的羰基化产物^[26]。

2.2.3 脂质过氧化产物对蛋白质的修饰

脂质过氧化过程能够生成α和β-不饱和醛、二醛以及酮醛等一系列活性羰基化合物^[27]，这些化合物又被称为脂质衍生亲电试剂（Lipid-derived electrophiles，LDEs），主要包括丙烯醛（ACR）、丙二醛（MDA）和4-羟基-2-壬烯醛（HNE）等（图6）。

以HNE的产生为例，ROS进攻不饱和脂肪酸，形成脂肪酸自由基，自由基再与氧反应形成过氧自由基（LOO·），而LOO·可与邻近的其他多不饱和脂肪酸反应形成氢过氧化物和烷基自由基，并引起链式反应，对更多脂肪酸造成损害。LOO·也可与邻近双键反应，引发脂肪酸主链的断裂生成过氧壬烯醛，最终被还原成羟基壬烯醛^[28-29]（图7）。

这些活性羰基物质生成后，可通过迈克尔加成反应或生成席夫碱的形式加合到半胱氨酸、组氨酸和赖氨酸等亲核氨基酸上^[29]，从而在蛋白质上引入活性羰基基团，产生蛋白质羰基化修饰（图8）。研究表明相较于正常人，阿尔茨海默症患者大脑中4-羟基-2-壬烯醛或丙烯醛等脂质过氧化化合物含量较高，脑脊液和血浆中也可见脂质过氧化产物水平升高^[30-34]。因此，研究LDEs共价修饰不仅对于亲电性化学信号的调控机制研究有着重要的意义，而且对相关疾病的药物（如抗氧化剂和靶向共价抑制剂）开发也具有重要的参考价值^[35-36]。

2.2.4 糖化的氧化产物对蛋白质的修饰

活性羰基基团可以由糖酵解中间体降解产生的乙二醛（MG）^[37]、甲基乙二醛（MGO）^[38]和3-脱氧葡糖醛酮^[39]（3-DG）等小分子醛类加合到蛋白质上来产生。而发生在氨基酸和还原糖之间的非酶促的美拉德反应^[40]，在一系列化学重排之后，也可以在蛋白质侧链引入活性羰基基团。

本文主要聚焦由ROS进攻脂质化合物造成脂质化合物过氧化产生的LDEs引起的蛋白质羰基化的分析检测研究。

3 蛋白质羰基化修饰的分析检测方法

蛋白质羰基化的鉴定和定量分析可以在不同水平进行。例如，可以使用2，4-二硝基苯肼（DNPH）对羰基化蛋白进行衍生化，然后使用分光光度法测量、在凝胶中或ELISA法中用DNPH特异性抗体进行免疫检测，在全局水平上检测和定量蛋白质羰基化^[41]。然而，这些方法只能确定全局水平的羰基化，而不能确定被修饰蛋白质的类型和相应的位点信息。使用质谱方法可以实现对蛋白质修饰更详细的分析。因此，基于质谱的蛋白质组学是目前研究蛋白质羰基化位点及其潜在分子功能的最合适方法。同时，由于羰基化的蛋白质存在相对丰度低、化学稳定性差、缺乏特定的物理化学性质等特点，通常难以通过直接质谱法进行分析，往往需要使用特定的化学探针对羰基化的蛋白质其衍生、富集后再对其进行质谱分析尤其是定量分析。此外，根据样品处理的方式，目前的蛋白质羰基化检测鉴定方法主要分为两种：基于凝胶的方法、无凝胶方法。

3.1 基于凝胶的方法

电泳是一种基于凝胶的技术，广泛用于分析生物样品的蛋白质组成。二维凝胶电泳（2-DE）通过结合两种正交生物二维凝胶物理分离技术——等电聚焦（第一维）和聚丙烯酰胺凝胶电泳（第二维），将含有一千多种蛋白质成分的复杂混合物解析成单个蛋白质点。将蛋白质羰基化的特异性检测方法（如免疫印迹技术）与二维凝胶电泳相结合，不仅可以分离和鉴定蛋白质羰基化，还可以量化每种蛋白质相对于其总量的羰基化程度。羰基化蛋白质缺乏特定的吸收或者荧光等性质，因此直接的检测和定量难以实现，通常需借助特定的化学探针实施衍生化处理。目前，科学家们已开发出一系列用于检测聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质羰基的化学探针，包括DNPH、氚化硼氢化钠（[³H]NaBH₄）、生物素酰肼探针和荧光探针（图9）。

DNPH（2，4-二硝基苯肼）能够与酮类与醛类官能团反应生成2，4-二硝基苯腙（DNP-hydrazone），其在分光光度计中测量，约于370 nm处产生特征紫外吸收。衍生化后蛋白质羰基化的定量可通过测量370 nm处的吸光度实现。Levine等^[42]首次发表了基于该反应的分光光度法，并利用蛋白质印迹免疫测定法检测蛋白质羰基化来评估几种血浆蛋白对氧化修饰的相对敏感性，用DNPH衍生化蛋白质，通过SDS-凝胶电泳分离，并用抗DNP的抗体进行筛选^[43]。如今，羰基化蛋白质的免疫印迹检测（Carbonyl Western Blot）广泛应用于学术研究。该过程主要由4个主要步骤组成：（1）羰基化蛋白质在酸性条件下进行DNPH衍生化；（2）凝胶电泳；（3）电转移至PVDF膜；（4）基于抗体的检测。杨国峰等^[44]运用这种方法，将氧化修饰的蛋白质点切下进行凝胶内酶解，结合串联质谱鉴定了部分人脑中的氧化修饰蛋白质。

蛋白质羰基可以被硼氢化钠（[³H]NaBH₄）还原，这个过程中氚（³H）被选择性地掺入羰基化蛋白中。在SDS-PAGE上分离氚化蛋白质，并且可以切除目的蛋白条带，溶解凝胶后测定放射性对蛋白质羰基化定量。该方法采用SDS-PAGE，并且无需去除标记反应混合物中未反应的NaBH₄，可应用于特定蛋白质的羰基化测量^[45]。

酰肼可以与羰基通过席夫醛的形式发生特异性反应，需要用氰基硼氢化钠还原进行稳定^[46]。生物素和亲和素（或链霉亲和素）之间的亲和力结合是已知最强的非共价相互作用之一^[47]。Regnier等^[46]采用生物素化和亲和素-异硫氰酸荧光素（FITC）亲和染色法，开发了一种二维电泳中羰基化蛋白的检测方法，用生物素-酰肼衍生化羰基化蛋白质并用荧光素标记的亲和素进行检测，在用过氧化氢刺激后的酵母蛋白质组中鉴定出20种羰基化蛋白质^[12]。

此后，科学家们发展了一系列荧光酰肼探针如荧光素-5-氨基硫脲^[48-50]、Cy5和Cy3酰肼以及BodipyFL酰肼^[51]等，并用于蛋白质羰基化检测。Chaudhuri等^[48]使用荧光素-5-氨基硫脲（FTC）探针标记小鼠肝脏中的蛋白质，结合二维凝胶电泳，直接测量了特定蛋白质中蛋白质羰基化水平的变化。

二维凝胶电泳是一种非常有效且广泛使用的蛋白质分析技术。但也存在一定的局限性，如重现性差、灵敏度较低、不易检测低丰度的蛋白质等问题^[52-53]。二维-差分凝胶电泳（2D-DIGE）很好地解决了重现性的问题。DIGE使用荧光染料（例如Cy2、Cy3和Cy5）标记蛋白质样品，允许在同一凝胶上同时分析2~3个样品，在不同波长下扫描，简化了比较几种二维凝胶的步骤^[54]。

3.2 基于质谱法的无凝胶的方法

3.2.1 基于竞争性反应策略的间接鉴定法

如前所述，蛋白质羰基化修饰水平相对丰度低、化学稳定性差，难以通过直接质谱法进行分析。因此，化学家往往使用特定的化学探针对羰基化的蛋白质衍生、富集后再对其进行质谱分析尤其是定量分析。根据作用位点的区别，蛋白质活性羰基基团捕获策略可分为间接鉴定和直接鉴定两种策略。间接鉴定策略是指通过竞争性反应策略间接鉴定半胱氨酸羰基化修饰的策略，即先用可以特异性修饰蛋白质半胱氨酸活性位点的LDEs处理蛋白，剩余的未被修饰的半胱氨酸活性位点使用特异性半胱氨酸巯基反应的化学探针标记；同时，设置一组不加LDEs的对照，结合同位素串联正交蛋白水解-基于活性的蛋白谱分析（Isotopic tandem orthogonal proteolysis-activity-based protein profiling，isoTOP-ABPP）策略和定量蛋白质组学的方法，达到对特定羰基化蛋白质鉴定的作用。其中，碘乙酰胺的炔基衍生化探针（IA-alkyne）是一种在ABPP中广泛应用的亲电小分子探针^[55]。Wang等^[56]基于竞争性isoTOP-ABPP策略，在全局水平上量化特定LDE对人类蛋白质组中半胱氨酸的反应性。主要过程如下：（1）使用LDE处理一蛋白质组，同时设置一组用DMSO（Dimethyl sulfoxide，二甲基亚砜）处理的对照组，再用IA探针标记未修饰的反应性半胱氨酸位点；（2）基于点击化学的策略（叠氮化物和炔烃之间在铜催化下发生环加成反应，CuAAC），将样品中IA标记的半胱氨酸与同位素化的可裂解生物素-叠氮化物标签偶联；（3）IA标记的蛋白使用链霉亲和素珠富集，然后进行胰蛋白酶消化，并切割linker以释放IA-alkyne标记的肽^[57]；（4）使用液相色谱-串联质谱联用技术（LC-MS/MS）分析（图10）。每种含半胱氨酸肽的定量比值（R值，来自LDE处理与未处理的样品）将准确反映每种LDE浓度下LDE对半胱氨酸的修饰程度，R值越高反映对LDE修饰的敏感性越高。

竞争性isoTOP-ABPP策略的优势在于可以直接将化合物分子作为竞争性抑制剂加入蛋白质组中，省去了将其改造成分子探针的繁琐的化学合成步骤^[58]。然而，该方法目前仅限于分析LDE-半胱氨酸的相互作用，组氨酸和赖氨酸上LDEs的修饰难以用该法研究。同时，由于该法中同位素氨基酸试剂价格高昂以及可切割轻重标签试剂的合成冗长、产率较低，使其应用受到了限制^[59]。

3.2.2 基于化学探针的直接鉴定法

相较于依赖竞争性反应策略的间接鉴定法，通过探针与羰基化位点或者羰基化修饰连接的羰基直接反应实现蛋白质羰基化的直接鉴定的方法，具有更高的灵敏度，能有效减少假阳性干扰。基于探针作用对象，直接鉴定方法也可分为两种：代谢标记与靶向羰基的直接标记。

代谢标记通过带有“点击把手”的LDEs类似物探针对特定羰基化类型进行检测鉴定（图11）。Marnett等^[60]在HNE结构的烷基末端引入了叠氮基团或者炔基，并用这些HNE类似物探针标记人结肠腺癌细胞中的蛋白质，再加入与生物素偶联的对应的炔基或者叠氮化物，发生点击化学反应使靶蛋白生物素化，经链霉亲和素珠富集和纯化后进行LC-MS/MS分析，鉴定了538种HNE化修饰的蛋白质。此外，Porter等^[61]开发了一种可由光裂解的叠氮-生物素报告标签，经富集后从链霉亲和素珠上特异性释放HNE-炔烃探针修饰的蛋白质或肽。Codreanu等^[62]用脂质亲电试剂4-羟基-2-壬烯醛和4-氧代-2-壬烯醛的炔基类似物进行了一系列定量修饰实验，研究LDE烷基化损伤的功能影响。在此基础上，Liebler等^[63]使用同位素标记、可由光裂解的叠氮-生物素试剂来选择性地捕获和定量由HNE-炔烃探针标记的细胞靶标，能够对约400个HNE修饰位点进行大规模、原位、位点特异性的鉴定和定量分析。

ONE与HNE结构类似，但是二者的反应性不同^[64]，一般HNE优先与蛋白质组半胱氨酸反应，而ONE对赖氨酸残基表现出更高的化学亲和性。在神经元细胞中，ONE的反应性和细胞毒性比HNE更高。Yang等^[65]使用同位素标记、可见光裂解的叠氮基生物素试剂选择性地捕获和定量由ONE炔基类似物（aONE）标记的细胞中蛋白质靶标，并分析揭示了细胞中ONE修饰的多样性和动力学。

然而，代谢标记也存在明显的局限性。例如，合成特定LDEs类似物探针的步骤繁琐、成本较高；不适于较小结构的LDEs，如ACR，因为任何化学修饰都会影响其反应性^[66]。

对于另一种直接鉴定方法——靶向活性羰基的直接标记而言，已有多种羰基反应试剂被开发，并用于多样化的生物样品中标记LDEs修饰的蛋白质。其中最普遍的是基于酰肼或羟胺生物素化的探针。

带有生物素的酰肼基团与蛋白质羰基化修饰后的活性羰基反应形成酰腙键进行连接，利用链霉亲和素珠的高效亲和性，对生物素化的蛋白质进行特异性捕获与富集，经胰蛋白酶消化后，使用LC-MS/MS进行鉴定和定量。Soreghan等^[67]应用酰肼生物素探针和液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）分析来鉴定老年小鼠大脑蛋白质组中100多种羰基化蛋白质，包括一些以前基于免疫亲和力的方法遗漏的低丰度蛋白。Codreanu等^[68]使用这种方法对人类蛋白质组中HNE修饰的蛋白质进行了首次全面分析，他们用不同浓度的HNE处理RKO细胞（Human colon adenocarcinoma cells，人结肠腺癌细胞），用酰肼-生物素探针标记HNE修饰的蛋白质并用链霉亲和素珠富集，进行LC-MS/MS分析和鉴定HNE的蛋白质靶标，揭示了许多受HNE修饰影响的重要细胞内系统，包括那些涉及蛋白质翻译、折叠和降解的系统。刘长峰等运用生物素酰肼标记、亲和素珠富集和串联质谱的方法分离鉴定了老年大鼠纹状体中的羰基化蛋白质，并结合生物信息学搜索质谱鉴定信息^[69]。

羟胺可以与活性羰基反应生成肟键。N-氨氧基甲基羰基肼D-生物素，也被称为醛反应性探针（Aldehyde-reactive probe，ARP），是一种生物素化的羟胺衍生物。Chavez等^[70]利用ARP富集目标蛋白质，并使用串联质谱法分析鉴定HNE标记的蛋白质靶标。使用这种方法对人类单核细胞系THP-1^[71]以及来自小鼠组织的心脏线粒体^[72]进行蛋白质组学研究，并明确鉴定了通过LDE修饰的多个蛋白质靶标和残基位点。鉴于羟胺与活性羰基反应所生成的肟键，其稳定性显著优于酰肼参与反应生成的腙键^[73]，且此转化过程无需额外的还原步骤，从而简化了操作流程，使得基于羟胺的反应探针（ARP）成为一种备受青睐的酰肼生物素替代方案，在各种研究中广泛使用^[74-75]。

然而，生物素探针鉴定羰基化蛋白的方法面临着假阳性鉴定的问题，例如有些蛋白质或者肽段可以通过与亲和素非特异性结合，以及部分内源性蛋白质本身就携带生物素^[76-77]。为了克服非特异性背景蛋白的潜在问题，Meany等^[78]使用稳定同位素标记亲和纯化后的蛋白质，该策略结合了生物素酰肼标记、亲和素亲和层析、多重iTRAQ试剂稳定同位素标记等技术进行分析，在大鼠肌肉线粒体提取物中富集鉴定出200多种羰基化蛋白质。

酰肼或羟胺生物素化探针能够高效富集多种内源性羰基化蛋白质。然而，在这一过程中引入庞大的生物素基团会影响小分子化合物的活性，进而影响探针对于靶标蛋白的标记效果^[79]。与此同时也增加了质谱（MS）解析的复杂程度^[80]。

Griffin等^[81]提出了一种无标记策略，该方法创新性地使用固相酰肼（SPH）试剂，蛋白质酶解后HNE修饰的肽段与玻璃珠固相负载的酰肼反应形成共价但可逆的腙键进行特异性富集，洗涤除去未反应的肽段后，在酸性条件下断开腙键释放HNE化修饰的肽段并进行LC-MS/MS检测。该法不会在醛基上添加额外的标签（如生物素和荧光团），有利于HNE修饰的氨基酸位点的分析。基于该方法，他们在HNE处理的酵母中鉴定了15种HNE化修饰的蛋白质。类似地，Maier等^[82]将d0/d4-琥珀酸酐标记方法与基于肼功能化微珠（Affi-Hz凝胶）的富集方法相结合，用于检测、鉴定和相对定量生物基质中不同的位点特异性羰基化蛋白/肽段。Prokai等^[83]首先对蛋白质进行差异二甲基标记，使用固相酰肼化学富集羰基化肽段后进行质谱分析，对蛋白质羰基化修饰进行定量和位点的鉴定。此外，Lu等^[84]开发了一种基于氟衍生化探针和氟固相微萃取（FSPE）特异性富集HNE修饰的肽段的方法，氟标签的疏水性可大大增强HNE修饰肽的信号，FSPE能从盐溶液和复杂混合物中选择性富集氟衍生的HNE修饰肽，无需LC-MS/MS分析前的额外脱盐步骤，由此简化操作步骤。

考虑到生物素化标记试剂的缺陷，科学家们发展了基于活性羰基的快速和高特异性共价标记并形成稳定的共价加合物的生物偶联反应，并基于该反应合成带有炔基等点击化学把手的探针，利用点击化学反应引入带有叠氮基团以及可断裂连接子的生物素，经富集、光切或者酶切去掉生物素和纯化后，实现了衍生化羰基化蛋白/肽段的规模化定量研究。

Wang等^[66]发展了一种新的化学蛋白质组学方法，用于鉴定可被HNE修饰的蛋白质种类和位点（图12）。在该策略中，首先用生物正交炔烃基团合成酰肼衍生探针（HZyne）和羟胺衍生探针（AOyne），经比较发现AOyne在HNE处理的蛋白质组中的标记效率比HZyne好，随后，使用AOyne探针，结合还原性二甲基化标记技术^[86-87]和TOP-ABPP（串联正交蛋白水解-ABPP）技术^[88]，鉴定了HEK293T细胞蛋白质组中的4000多个HNE修饰蛋白和约400个修饰位点。

Wang等^[89]还将苯胺衍生探针应用于“铁死亡”（ferroptosis）中的蛋白质羰基化修饰的检测，鉴定出超过400个内源性LDE修饰的蛋白质和20多个修饰位点，并通过isoTOP-ABPP策略对这些位点的敏感性排序，结合生物信息学手段分析这些位点在生物代谢通路中发挥的作用。

在这些标记试剂中，酰肼探针的捕获效率较差，与活性羰基反应生成的亚胺产物结构不稳定，需加入氰基硼氢化钠还原，氰基硼氢化钠还原的选择性较差，整体实验流程较复杂。羟胺衍生探针和苯胺衍生探针的捕获效率受pH影响较大，在中性及弱碱性的环境中捕获效率明显低于酸性环境中的捕获效率，且在碱性环境中产物不稳定，易在胰蛋白酶酶切过程中分解，造成点击把手脱落。因此，新的高效、特异性且具备优异的产物稳定性的标记试剂仍亟待研究。

4 结论与展望

近年来，随着对蛋白质羰基化修饰的研究不断深入，细胞中蛋白质羰基化修饰的检测分析方法获得了一定的拓展，这增强了人们对于羰基修饰生物功能的理解。但是，当前蛋白质羰基化的检测还存在着诸多问题。目前的研究大多集中于对蛋白质巯基的修饰，而对赖氨酸和组氨酸的修饰研究较少。其主要原因可能一方面源自化学标记反应的位点偏好性，另一方面则可能与富集方法的偏好性有关。因此，设计新型的更高效广谱的标记方法并搭配合适的富集策略，将有助于羰基化修饰的赖氨酸和组氨酸位点的鉴定。对于羰基化合物如甲基乙二醛与蛋白质含氮氨基酸位点形成的Schiff修饰而言，由于其修饰的不稳定性，难以通过直接质谱法进行分析鉴定，相关研究较少。新型标记反应的开发对检测方法的开发至关重要。同时，由于蛋白质羰基修饰相对丰度不高，已发展的羰基化标记分析检测方法存在标记效率低、选择性差、产物不稳定、实验流程复杂等问题。开发具有更好选择性和标记效率的探针，以及检测分析方法以实现全局性分析或者精确捕获某种蛋白质的羰基化修饰，有助于应用到广泛的生物样本当中，以了解更多蛋白质羰基化修饰参与的病理过程和生命进程，推动新的药物靶标的合成。

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