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蛋白质化学合成中的可逆化学修饰策略及应用

许玲 ,  崔婷婷 ,  李宜明

化学进展 ›› 2025, Vol. 37 ›› Issue (6) :882-902

PDF (6316KB)
化学进展 ›› 2025, Vol. 37 ›› Issue (6) :882-902 DOI: 10.7536/PC240818
综述与评论
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蛋白质化学合成中的可逆化学修饰策略及应用

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Reversible Chemical Modification Strategies and Applications in Protein Chemical Synthesis

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摘要

蛋白质化学合成技术在制备具有特定序列和功能的蛋白质方面发挥着至关重要的作用。尽管该技术已成功应用于多种蛋白质的合成，但在合成具有高度疏水性和富含二硫键的蛋白质时，溶解性和复性效率的问题仍然是研究者面临的重大挑战。为了克服这些难题，将可逆化学修饰标签引入到蛋白的侧链或骨架结构上提供了一种有效的解决方案。特别地，通过在蛋白质合成过程中引入助溶标签，可以显著增强疏水性肽段的水溶性，从而为后续的蛋白质合成和纯化提供了便利。将糖基化修饰的标签引入到富含二硫键的蛋白可以稳定它们的折叠中间状态，进而促进其结构的正确折叠。此外，这些修饰标签在蛋白质合成完成后，还可以通过特定的化学或生物学方法被高效去除，确保了蛋白质的生物活性和结构完整性不受影响。本文综述了可逆修饰标签的种类、引入策略和去除条件，并深入分析了它们在蛋白质化学合成中的应用。这些策略不仅扩展了蛋白质合成的技术范围，而且为生物医学研究和药物开发提供了强有力的支持，有望推动相关领域的进一步发展。

Abstract

Protein chemical synthesis plays a crucial role in preparing proteins with specific sequences. Although this technology has been successfully applied to the synthesis of various proteins， the issues of solubility and refolding efficiency remain significant challenges for researchers when synthesizing hydrophobic and disulfide-rich proteins. The introduction of reversible chemical modification tags to the side chains or backbone of proteins offers an effective solution. Specifically， the introduction of solubilizing-tag during the protein synthesis process can significantly improve the water solubility of hydrophobic peptide segments， thereby facilitating subsequent protein synthesis and purification. The introduction of glycosylation modification effectively improves the folding of disulfide-rich proteins by stabilization of their folding intermediates. Moreover， these reversible modification tags can ultimately be removed by specific chemical or biological conditions， ensuring that the biological activity and structural integrity of the proteins are unaffected. This review delves into the types， introduction strategies and removal conditions of reversible modification tags and details their important applications in protein synthesis. These strategies not only expand the tools of protein chemical synthesis but also provide strong support for biomedical research and drug development， promising to drive further development in related fields.

Contents

1 Introduction

2 Reversible chemical modification strategies for synthesizing hydrophobic proteins

2.1 Introduction of reversible modification tags in peptide side chains

2.2 Peptide backbone modification

3 Reversible glycosylation modification strategies for the synthesis of difficult-to-fold proteins

4 Conclusion and outlook

Graphical abstract

关键词

蛋白质化学合成 / 疏水性蛋白 / 富含二硫键的蛋白 / 可逆化学修饰 / 助溶标签

Key words

protein chemical synthesis / hydrophobic proteins / disulfide-rich proteins / reversible chemical modification / solubilizing-tag

引用本文

引用格式 ▾
许玲, 崔婷婷, 李宜明. 蛋白质化学合成中的可逆化学修饰策略及应用[J]. 化学进展, 2025, 37(6): 882-902 DOI:10.7536/PC240818
Ling Xu, Tingting Cui, Yiming Li. Reversible Chemical Modification Strategies and Applications in Protein Chemical Synthesis[J]. Progress in Chemistry, 2025, 37(6): 882-902 DOI:10.7536/PC240818

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1 引言

蛋白质作为生物体内执行多种生物功能的关键分子，其结构与活性的精确解析对理解生命过程至关重要[1-4]。化学合成作为获取蛋白质的有效手段，允许科学家在原子级别精确控制蛋白质的结构，为研究蛋白质的结构-功能关系、发现苗头化合物以及理解其在疾病中的作用提供了重要工具[5]。蛋白质化学合成可以分为蛋白质全合成及蛋白质半合成。通常，蛋白质全合成依赖于固相肽合成（SPPS）[6]技术制备C端为硫酯或酰肼的多肽以及N端为半胱氨酸（Cys）的多肽。随后，这些片段在温和的水相介质中，通过自然化学连接（NCL，图式1）[7-8]或蛋白酰肼连接（图式2）[9-11]构建目标蛋白。该策略已被成功用于合成多种复杂分子，包括翻译后修饰蛋白[12-29]、携带化学反应基团的蛋白探针[30-33]、多肽-蛋白药物与诊断分子[34-39]、镜像蛋白[40-47]、活性环肽[48-53]及膜蛋白[54-55]等。尽管取得了里程碑式的成绩，NCL和蛋白酰肼连接均依赖于半胱氨酸残基作为连接位点。为突破这一局限，研究人员开发了多种连接策略，如α-酮酸-羟胺连接（KAHA）[56-58]、Ser/Thr连接（STL）[59-64]、半胱氨酸/青霉胺连接（CPL）[65]、二硒化物-硒酯连接（DSL）[66-69]及酶促连接[70-73]等。表达蛋白连接技术（EPL）是常用的蛋白质半合成方法。EPL利用蛋白重组技术生成具有N端Cys的蛋白片段[74]，或通过内含肽（intein）的N端裂解[75]/Cys促进蛋白C端肼解方法生成具有C端硫酯/C端酰肼的蛋白片段[76]。这些重组产生的蛋白质片段可与化学合成的C端硫酯片段或N端Cys片段通过NCL反应连接，最终合成目标蛋白质。这些多样化方法的建立显著提升了蛋白质化学合成的效率和适用范围。

尽管蛋白质化学合成领域已取得显著进展，但针对含有“困难序列”[77]的疏水蛋白合成仍面临严峻挑战。这些序列通常富含疏水性氨基酸，如亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸或异亮氨酸等，它们与甘氨酸结合时，可能会诱导形成β折叠或α-螺旋结构，导致蛋白质在水溶液中具有高度的聚集倾向和低溶解性[77-80]。这种特性使蛋白在SPPS、纯化、片段连接或复性等关键化学生产步骤中造成了困难。此外，含有多对链内或链间二硫键的蛋白即便能通过常规手段合成，其在复性过程中的错配问题也增加了获取的难度。

为克服这些挑战，研究者们采取了多种策略，包括改变溶剂环境和在多肽序列上引入化学修饰。例如，使用二甲基亚砜（DMSO）[81]、二甲基甲酰胺（DMF）[81-82]、2，2，2-三氟乙醇（TFE）[55]、六氟异丙醇（HFIP）[83]或去污剂如阴离子型十二烷基硫酸钠（SDS）[84]、十二烷基磷酰胆碱（DPC）[85-86]、辛基糖苷（OG）[84-86]，可以改善蛋白质的溶解性。然而，高浓度含氟有机溶剂可能导致肽硫酯的水解，而合适的去污剂通常需要进行繁琐且特定的优化。

在多肽序列上引入化学修饰基团已成为解决疏水性多肽难题的关键策略。其中，由带正电荷的赖氨酸或精氨酸组成的同源寡聚氨基酸标签因其显著的增溶效果而被广泛应用[87]。这类修饰标签可根据需求设计为永久性或可逆性两种形式：永久性标签虽能有效提升疏水多肽的溶解性，但可能对蛋白质的天然构象和生物活性产生不利影响[84,88-89]。相比之下，可逆修饰标签因其可通过化学或物理方法选择性去除的特性，现已成为疏水性蛋白质和难复性蛋白质合成的首选策略。这类标签可灵活地引入多肽的C端、N端或中间位点（包括侧链或骨架），以改善溶解性或增强合成稳定性。针对C端修饰，已发展出多种连接方法，包括硫酯连接[90-91]、氧酯连接[92-94]、酶连接[95]、二硫键连接[96]和二烷氧基苯甲醛连接[97]。而N端修饰则主要采用二硫键连接策略[98-99]。值得注意的是，这些末端修饰通常在肽段连接完成后被移除，无法持续改善连接产物的溶解性。相比之下，将携带助溶标签的可逆化学修饰标签通过连接基团引入到多肽链的中间部分，特别是多肽的侧链或骨架上不仅能够促进疏水肽在合成中的溶解，还能促进连接产物的溶解（图式3）。此外，在富含二硫键的蛋白质侧链引入糖基化修饰标签，可有效稳定其折叠中间态，进而促进正确折叠这些创新策略的不断发展，为具有挑战性的蛋白质合成提供了更有效的解决方案。

本综述系统梳理了近年来在多肽的侧链或骨架上使用可逆化学修饰合成疏水性或难复性蛋白的最新研究进展，主要关注可逆修饰标签的类型、引入策略、移除条件及其在蛋白质合成中的重要应用。通过深入探讨这些策略，本文旨在为合成更具挑战性的蛋白质提供新的视角和解决方案。

2 可逆化学修饰策略合成疏水蛋白

在疏水性蛋白质的化学合成中，通过SPPS过程或合成后将可逆修饰标签引入多肽侧链或骨架，为合成疏水性蛋白提供了一种关键的解决策略。这些修饰标签由两部分组成：助溶标签和连接基团。连接基团在这一体系中扮演着至关重要的角色，它不但决定了助溶标签的附着方式，而且对标签的移除条件有决定性的影响。

2.1 多肽侧链引入可逆修饰标签

引入至多肽侧链的可逆修饰可根据连接基团的性质分为光敏型、金属催化裂解型、pH敏感型、酶特异性识别型和特殊修饰标签等几类。

2.1.1 光敏型的可逆修饰标签

磷脂酰乙醇胺（PE）缀合的LC3-Ⅱ蛋白作为自噬研究的关键脂质化蛋白，其化学合成一直受限于PE基团的强疏水性。2013年，Liu等[100]创新性地开发了一种光敏的邻硝苄基连接体，并构建到9-芴基甲氧基羰基（Fmoc）保护的谷氨酰胺的侧链上（图式4）。SPPS时，该非天然氨基酸被定点引入到多肽片段中。合成后通过选择性脱除侧链保护的烯丙氧羰基（Alloc）从而将多聚精氨酸的助溶标签连接到多肽侧链中。随后采用EPL组装全长蛋白，并通过紫外线光解移除修饰标签，成功制备了带有PE修饰的LC3-Ⅱ蛋白。功能验证实验表明，荧光标记的LC3-Ⅱ蛋白在脂质体中展现出预期的定位特性，证实了其生物学活性。这项研究不仅建立了LC3-Ⅱ蛋白的高效合成方法，更为重要的是为其他脂质化蛋白的合成提供了普适性策略。但需指出的是，该方法的适用性受限于目标蛋白中必须含有谷氨酰胺残基，这一特性可能限制其在某些不含该残基的疏水蛋白合成中的应用。

2.1.2 金属催化裂解型的可逆修饰标签

2016年，Brik等[101]开发了基于烯丙氧羰基-苯基乙酰胺甲基（Alloc-Phacm）的连接子（图式5）。他们首先将其构建到Fmoc保护的半胱氨酸侧链上，然后通过SPPS将其整合到目标序列中。在选择性脱除Alloc保护基团后成功引入助溶标签。该标签的移除也较为简单，使用钯催化试剂即可高效脱除。

他们将这一创新性连接子成功应用于组蛋白H4的合成，并采用一锅法策略巧妙整合了肽段连接、助溶标签移除及脱硫等关键步骤，最终获得高纯度的目标蛋白。通过高效液相色谱（HPLC）、质谱（MS）和圆二色谱（CD）等技术表征，证实合成蛋白的高纯度和正确的二级结构。值得注意的是，Alloc-Phacm连接子既可修饰半胱氨酸的侧链，又能装载到丙氨酸的侧链，为各种疏水肽段的合成提供了新的解决方案。此外，该连接子在生物素及其他生物偶联物的制备中也表现出显著优势，展现出广阔的应用前景。然而，钯催化剂的使用可能导致金属残留，这是在未来研究中需要加以关注和解决的潜在问题。

2018年，Brailsford等[102]在半胱氨酸侧链引入了乙酰氨甲基（Acm）连接子来构建助溶标签，并通过AgOAc的催化作用实现了标签的高效去除（图式6）。该策略被成功用于人类促甲状腺激素（hTSH）β亚基的合成。首先hTSHβ被划分为F1、F2和F3三个片段，其中高度疏水的F1片段通过引入Acm修饰的Fmoc-Cys（AcmNHAlloc）-OH构建模块并连接助溶标签，显著改善了溶解性。通过两次高效的NCL反应完成片段连接后，最终在温和条件下通过AgOAc催化去除Acm保护基，获得完整的目标蛋白。Acm连接子的优势首先在于其合成路线简便经济，可使用廉价原料制备；其次，与常规SPPS完全兼容。此外，Acm连接子与其他氨基酸保护基团的正交性允许助溶标签在SPPS中直接被构建到多肽侧链，极大地简化了操作步骤。这项工作不仅为hTSHβ亚基的合成提供了一种高效解决策略，还为其他疏水蛋白质的合成开辟了新思路，展示出广泛的应用潜力。

2.1.3 pH敏感型的可逆修饰标签

2018年，Yoshiya等[103]报道了一种可逆修饰标签Trt（OH）-K10，该标签由三苯甲基（Trt）连接子和亲水性多聚赖氨酸组成（图式7）。与常规在SPPS期间引入标签的策略不同，Trt（OH）-K10标签是在片段进行NCL后引入的。标签的移除也十分简便，只需使用含有三异丙基硅烷（TIPS）的三氟乙酸（TFA）混合切割试剂即可。为证实该修饰标签的实用性，他们将其应用于乙型肝炎病毒（HBV）核心蛋白（Cp149）合成。在这一过程中，Cp149被划分为三个片段进行合成，其中第二和第三片段在无硫醇的NCL反应中一锅引入Trt（OH）-K10标签。随后完成与第一片段的连接后使用含有TIPS的TFA切割试剂移除标签，成功获得全长Cp149。Trt（OH）-K10标签的优势在于其合成的简便性，可以容易地通过市售的4-（二苯基羟甲基）苯甲酸合成。另外，操作过程简便快捷，为蛋白质化学合成提供了实用工具。然而，由于该标签是在NCL反应完成后引入的，而非在SPPS期间，可能限制了其在本身含有困难序列的多肽合成中的应用。

2019年，Yoshiya等[104-106]进一步评估了Trt（OH）- Kn/Rn修饰标签在不同合成条件下的稳定性（图式8）。实验证明，Trt（OH）-Kn标签在自由基脱硫条件下[107]表现出卓越的稳定性；另外，与Ag介导的硫酯连接法 [108-109]完全兼容。进一步，Trt（OH）-Kn被应用于流感病毒BM2质子通道的BM2（1-51）的合成。首先在HFIP中将C末端带有MeNbz基团的BM2（1-21）肽段与Trt（OH）-K5反应，成功引入了助溶标签。随后在水相中与BM2（22-51）进行NCL连接，经自由基脱硫将Cys22转化为Ala22后，最终移除助溶标签获得目标产物。这一系列研究工作展示了Trt（OH）-Kn/Rn修饰标签在多肽合成中的广泛应用潜力，为合成复杂多肽和蛋白提供了一种高效、灵活的方法。

2018年，Yoshiya等[110]报道了一种基于氨氧基的新型连接子——Canaline（Can）。该连接子在中性条件下展现出卓越的稳定性，而在微酸环境下能够引发特异的自切割，从而实现从多肽链上的高效脱除（图式9）。他们将该连接子应用于大肠杆菌核糖体亚基的LC31蛋白的合成。首先，通过SPPS获得C端带有MeNbz基团的LC31（Met1-Leu39）肽段，随后利用Fmoc-Can（2-Cl-Trt）将Can连接子引入Lys63的侧链，并连接Gly-Lys-Lys-Lys助溶标签，合成了LC31（Cys40-Lys70）肽段。在pH=7.2的NCL反应缓冲液中，两个片段顺利完成连接反应。随后通过pH值为4.5的NH4OAc缓冲液处理，成功实现了助溶标签的温和移除，最终获得目标蛋白。Can连接子的优势在于其可通过常规SPPS技术直接引入到疏水肽中，为疏水蛋白质的合成提供了新的策略。然而，该连接子的氨氧基会与酰肼连接法中使用的NaNO2发生反应，限制了其在酰肼连接法中的应用。此外，含Can肽链无论是在自由基还是非自由基脱硫条件下都面临着挑战，这在一定程度上限制了这种连接子在疏水蛋白质合成中的广泛应用。

2016年，Kay等[111]报道了一种新型的连接子——4，4-二甲基-2，6-二氧杂环己基二烯-3-[2-（2-氨基乙氧基）-乙氧基]-丙基（Ddae），并展示了其在多肽合成中的应用（图式10）。该连接子采用（4，4-二甲基-2，6-二氧杂环己基二烯）-乙基（Dde）保护的赖氨酸作为构建模块，通过SPPS合成嵌入到多肽的特点位点后，使用肼溶液选择性去除Dde保护基团，然后再与Fmoc-Ddae-OH反应，实现Ddae连接子的引入。Ddae连接子同样对肼具有高度敏感性，这一性质使得在合成后期可以通过使用1 M肼溶液选择性地将其从赖氨酸侧链上移除。为展示实用性，他们将其用于辅助分子伴侣L-/D-GroES的合成。GroES蛋白被分为GroES-N和GroES-C两个片段，其中GroES-C的Lys77位引入了Ddae连接的Lys6助溶标签后，通过NCL和自由基脱硫，最终经水合肼处理获得天然结构的产物。Ddae连接子的引入简化了合成过程，并提高了合成效率，减少了蛋白质纯化的次数。随后，Kay等[112]进一步开发了新一代连接子 N-Fmoc-2-（7-氨基-1-羟基庚亚基）-5，5-二甲基环己烷-1，3-二酮（Fmoc-Ddap-OH）。该连接子比Ddae具有更好的稳定性，采用羟胺裂解可大幅加速移除速度。然而，该连接子必须通过赖氨酸残基引入，这限制了其在不含赖氨酸残基的疏水蛋白质合成中的应用潜力。

2.1.4 酶特异性识别的可逆修饰标签

2024年，Zheng等[113]报道了一种基于酶特异性识别的可逆修饰标签，用于辅助镜像疏水蛋白的化学合成（图式11）。该技术的核心在于采用单一的L-Lys作为连接子，被引入到D-Lys/D-Ser/D-Thr的侧链或D-型多肽的N端α-氨基上，添加（Lys/Arg）n助溶标签后能显著改善疏水序列的溶解性。该系统的独特优势在于其高效的特异性酶解机制，即L-Lys连接的修饰标签可被Lys-C蛋白酶精准识别并水解，即使在含有强变性剂或洗涤剂（如40%乙腈、7 mol/L尿素或10%十二烷基-β-D-麦芽糖苷（DDM））的情况下，也能够一次性高效去除多达5个修饰标签。为了验证这一技术的实用性，他们将其应用于程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）IgV结构域的D-对映体和SARS-CoV-2包膜（E）蛋白的D-对映体（DE蛋白）的合成。首先将DE蛋白分为两个片段进行合成，并在DE（1-39）肽段的N端和DE（40-75）肽段的D-Ser55上引入了L-Lys连接的D-Lys10Gly2标签。通过NCL获得含有助溶标签的全长DE蛋白后，在含有7 mol/L尿素和10% DDM的Tris缓冲液中加入Lys-C蛋白酶，成功去除了助溶标签。最后通过透析和尺寸排除色谱对折叠后的DE蛋白进行了纯化，并使用MS和CD对合成的DE蛋白进行了表征，证实其与天然L型E蛋白具有相同的二级结构。相较于传统化学裂解方法，酶催化水解更为温和高效，降低了对蛋白质结构的破坏风险。此外，Lys-C可裂解的修饰标签易于安装在多个位点，且能够在肽合成、连接、脱硫和金属介导的脱保护等反应条件下保持稳定。然而该技术依赖于L-Lys连接子和Lys-C蛋白酶的特性，因此它主要适用于D-蛋白的合成。

2.1.5 特殊修饰标签

2019年，Yoshiya等[114]发展了一种3，4-二氨基苯甲酸（Dbz）连接子，用于含Asp/Asn/Glu/Gln（统称Asx/Glx）的疏水蛋白的合成（图式12）。他们首先设计并合成Fmoc-Asp/Glu[Dbz-Cys（Trt）-NH2]-OH构建模块，然后通过SPPS将其精准引入目标序列。随后利用Trt（OH）-Kn与半胱氨酸残基的特异性反应，实现了助溶标签的高效连接。在去除Dbz连接的助溶标签时，研究者采用了两步法策略：首先使用NaNO2将Dbz基团活化为苯三唑衍生物，随后根据产物的氨基酸组成需求，加入含TCEP的缓冲液或NH4OAc的缓冲液，将氨基酸转化为Asp/Glu或Asn/Gln。为验证该一策略的实用性，他们将其用于淀粉样蛋白Aβ42的合成。具体而言，首先通过 SPPS 合成了Aβ（1-20）和在Glu22位置引入Trt-K5的Cys21-Glu22[Dbz-Cys（Trt-K5）-NH2]-Aβ（23-42）的多肽片段。然后通过NCL、自由基脱硫以及Dbz活化-还原高效移除助溶标签，获得高纯度目标蛋白。

该策略拓宽了蛋白质合成方法学的选择，然而由于助溶标签的引入依赖于Trt（OH）-Kn与半胱氨酸的特异性反应，在多肽中含有多个半胱氨酸残基的情况下，其他半胱氨酸残基必须同时进行保护，以避免非特异性修饰。

2.2 多肽骨架修饰

2.2.1 可移除骨架修饰（RBM）

2014年，Zheng等[54]针对具有多个跨膜结构域的中小型膜蛋白提出了一种创新的可移除骨架修饰策略（图式13）。该策略灵感来源于N-（2-羟基-4-甲氧基苄基）（Hmb）保护基。Hmb直接连接于肽链骨架时，可在三氟乙酸（TFA）条件下被裂解。然而，通过酰化封闭其2-羟基，Hmb基团即可在TFA中保持稳定[115-117]。基于此原理，Zheng等在Hmb 2-羟基位点引入了Boc-N-甲基-N-[2-（甲基氨基）-乙基]-氨基甲酰基作为RBM保护基团，并将其构建在Gly残基的α-氨基上形成Fmoc-GlyRBM0-OH构建块。该构建块可在SPPS时定点引入目标位置。

多肽链组装完成后，选择性脱除RBM基团上的Alloc保护基即可引入助溶标签。当需脱除RBM修饰时，Boc-N-甲基-N-[2-（甲基氨基）-乙基]-氨基甲酰基可以在中性pH条件下通过分子内环化反应自动断裂，使得带有助溶标签的RBM在TFA/TIPS/H2O混合液中被迅速移除。该策略在信号肽酶（SPP）第四个跨膜结构域的合成中得到了验证，他们发现，通过引入4个精氨酸的RBM可以使疏水肽的溶解度提高100倍。这种显著的增溶效果不仅得益于助溶标签本身，还因为骨架修饰破坏了多肽的二级结构，有效避免了因自组装和聚集而导致的溶解度下降。进一步，该策略被用于合成野生型及Ser64位点磷酸化的甲型流感病毒M2质子通道。他们将M2分为两个片段M2（1-49， Gly34RBM）-NHNH2和M2（50-97）（Ser64/pSer64）进行合成，然后利用基于酰肼的NCL在中性pH条件下连接形成全长多肽。在此条件下，Boc-N-甲基-N-[2-（甲基氨基）-乙基]-氨基甲酰基保护基团也同时被移除。随后利用切割试剂移除RBM得到了最终产物。合成的M2蛋白能够在二棕榈酸磷脂酰胆碱（DPPC）囊泡中进行正确的折叠，这一点通过CD得到了验证。此外，单通道电流测量实验进一步证明了M2的生物活性，并且发现Ser64磷酸化对通道活性的影响很小。RBM骨架修饰的特点是可以显著提高疏水蛋白的溶解度，且修饰基团容易从蛋白中移除，这对于膜蛋白的合成和研究具有重要意义。然而Fmoc-GlyRBM0-OH的合成过程较为繁琐且产率较低，限制了其广泛应用。

2016年，Zheng等[118]针对第一代RBM只能用于甘氨酸位点的局限性，发展了第二代RBM，即能够在除脯氨酸外所有氨基酸位点引入RBM，显著提高了该技术的普适性（图式14）[118-121]。该技术的核心在于定点引入了4-甲氧基-5-硝基水杨醛分子，在SPPS过程中该分子可通过还原胺化反应安装到特定氨基酸α-NH2上。随后与下一个氨基酸反应后会自动进行分子内O—N酰基转移形成肽骨架酰胺键。在肽骨架氨基酸添加完成后，RBM分子中的硝基被SnCl2还原为氨基[122]，为后续助溶标签的连接提供了反应位点。为确保在TFA去保护步骤中的稳定性，该分子中的酚羟基需进行乙酰化处理。在去除RBM时，乙酰化的RBM能够在含Cys的中性水溶液中进行水解，然后通过TFA混合溶液定量去除，释放出目标肽段。为验证该方法的实用性，他们将其应用于多种膜蛋白的合成，包括Ⅰ型膜蛋白家族机械蛋白p24的跨膜结构域、M2的跨膜结构域、野生型和位点特异性15N标记的丙型肝炎病毒（HCV）p7离子通道以及四跨膜域蛋白EmrE。同年，他们应用第二代RBM技术，成功制备了毫克级别的Aβ48和Aβ49[123]。第二代RBM骨架修饰的优势在于其能够通过任何氨基酸残基引入标签，突破了第一代技术的局限。

然而，该技术也面临挑战，去除RBM需要更酸性的混合切割试剂或更长的裂解时间，会导致副产物生成。尽管他们在2024年提出将RBM中的氨基通过两步化学反应去除以实现RBM的快速脱除[120]。然而，此举仍需多步化学操作。但第二代RBM策略的发展仍为膜蛋白的化学合成提供了一个更为强大和灵活的工具，推动了该领域的发展。

2019年，Zheng等[125]针对S-棕榈酰化膜蛋白合成中的关键挑战，开发了创新的第三代RBMGABA策略。该技术将第二代RBM的乙酰保护基替换为γ-氨基丁酸（GABA）基团，开发了一种新型的RBMGABA-辅助的STL方法合成S-棕榈酰化膜蛋白（图式15）。这一策略的关键在于GABA基团在STL连接条件下（吡啶/AcOH）能够进行快速的自环化反应从而实现基团的去除。利用这一方法，他们成功合成了S-棕榈酰化的肌脂蛋白（SLN）和M2离子通道。

以S-棕榈酰化M2的合成为例，M2首先被分为M2（1-30）-SAL和M2（31-97，L36， RBMGABA，C50，palm） 两个片段进行合成。接下来，他们利用弱酸性条件去除2-OH位点的GABA生成M2（31-97，L36，RBM，C50，palm）片段。该片段进而与M2（1-30）-SAL进行STL连接形成N，O-苯亚甲基缩醛中间体。最终，该中间体在含1% TIPS的HCl/HFIP的溶液中处理，实现了N，O-苯亚甲基缩醛和RBM标签的去除，成功获得了目标S-棕榈酰化M2蛋白。这项工作不仅突显了非NCL方法在化学蛋白质合成中的重要性，还为研究S-棕榈酰化在膜蛋白功能中的作用提供了独特的研究工具。

为进一步丰富蛋白合成的工具箱，Zheng等[126]还进一步将RBMGABA用于N-C 顺序NCL-STL连接制备了S-棕榈酰化的M2和S-棕榈酰化的干扰素诱导的跨膜蛋白3（IFITM3）。2023年，他们[127]又提出了一种创新的多肽主链骨架安装的分裂内含肽辅助连接（BISIAL）策略。该策略是利用RBMGABA将天然Cfa分裂内含肽的L-CfaN和L-CfaC片段分别安装到两条多肽片段上，致使这两条片段能够在微摩尔级浓度下实现NCL的高效连接反应。他们将该策略成功用于T细胞免疫球蛋白胞外结构域和ITIM结构域以及原肌球蛋白受体激酶C（TrkC）的D型对映体的制备。BISIAL技术不仅为合成具有挑战性的D-型蛋白靶点提供了一种有效的途径，也为蛋白质合成领域带来了新的思路和策略。

2.2.2 基于N，S-苯亚甲基缩醛结构的骨架修饰

2022年，Li等[128]发展了“连接嵌入聚集破坏”（LEAD）的化学合成策略，用于合成具有聚集倾向或胶体肽段的蛋白质（图式16）。该策略通过利用STL连接或Cys/Pen连接[65]（两者统称STC连接）生成的N，O/S-苯亚甲基缩醛五元环暂时改变难溶多肽的二级结构，从而有效破坏多肽聚集。在完成蛋白质合成后，通过简单的TFA处理即可使肽链的骨架恢复成酰胺结构。LEAD策略的有效性通过合成PD-1免疫球蛋白样V型域的C末端尾部序列和抑制性白细胞相关Ig样受体-1（LAIR-1）得到了验证。进一步，该策略被成功应用于 PD-1免疫球蛋白样V型域（PD-1-ID）和细胞外结构域（PD-1-ED）的全合成。在PD-1-ID的合成过程中，他们将PD-1-ID分为4个片段进行合成，并采用了LEAD策略来解决部分片段的溶解和合成问题。通过一锅法STL和NCL连接，以及后续的脱硫和去保护步骤，最终成功合成了线型PD-1-ID，并在优化的重折叠条件下得到了正确折叠的PD-1-ID。LEAD策略的优势在于它不需要在SPPS阶段引入修饰，而是可以在蛋白质合成过程中的化学连接点后安装，这为解决蛋白质合成中的聚集问题提供了一种有效的新方法。这一策略的发展，不仅提高了蛋白质合成的效率，还为合成具有特定功能和结构的蛋白质提供了新的可能性。

2023年，Li等[129-130]进一步发展了可调节骨架修饰（TBM）策略，这一策略是通过在SPPS中引入Alloc保护的氨基酸水杨醛酯（AA-SAL-Alloc），实现了N，S-苯亚甲基缩醛中间体的嵌入（图式17）。TBM策略的关键在于其可调节性，通过乙酰化保护酚羟基使得能够在合成过程中控制中间体的稳定性，从而在后续的TFA处理中恢复肽段的原始酰胺结构。该策略在IL-2的合成中得到应用，IL-2作为一种关键的免疫调节剂，其疏水性和高度聚集性的特性使化学合成尤为困难[131]。Li等将其分为四个片段进行合成，并针对其中疏水性较强的片段F3和F4，通过分别引入TBM显著改善了这些片段的合成效率和溶解性。然后通过顺序的NCL、脱硫、STL反应以及TBM的脱除最终成功获得了具有生物活性的IL-2。TBM策略的简洁性和高效性，以及与现有NCL及脱硫条件的兼容性，使其在蛋白质化学合成领域具有重要的应用前景。然而，每种氨基酸对应的水杨醛酯衍生物需要单独合成，这限制了TBM策略的通用性。

2.2.3 基于2-甲氧基-4-甲磺氧基苄基结构的骨架修饰

2014年，Albericio等[132]开发了一种在SPPS中引入2-甲氧基-4-甲磺氧基苄基（Mmsb）作为主链酰胺保护基的骨架修饰策略（图式18）。Mmsb基团能够在Fmoc SPPS合成和TFA介导的裂解过程中保持稳定，并可通过NH4I/TFA体系高效去除，从而释放出目标肽段。通过合成构建块Fmoc-N（Mmsb）- Ala-OH，研究团队成功地将这一策略应用于H-（Ala）10-NH2模型肽的合成，并进一步扩展到具有生物活性肽段Ac-（RADA）4-NH2和与阿尔茨海默症相关的Aβ（1-42）的合成中。Mmsb的使用不仅提高了多肽合成的产量，还因其破坏二级结构的特性，增加了多肽的溶解性，从而简化了纯化过程。此外，Mmsb保护基团的引入有助于防止副产物如天冬酰胺和二酮哌嗪的生成。然而不同的氨基酸位点整合Mmsb需要提前合成特定的构建块，这可能增加了合成策略的复杂性。此外，Mmsb基团的空间位阻可能会影响到一些氨基酸的偶联效率。

3 可逆糖基化修饰策略合成难复性蛋白

在蛋白质合成领域，二硫键的正确配对对于稳定蛋白质的三维结构至关重要，但同时也是合成过程中的一个重大挑战。传统蛋白质折叠策略虽然在含多对二硫键的蛋白质合成中取得了一定成果，但由于其依赖多步氧化折叠反应和复杂保护基策略，导致合成路线冗长、效率低下，严重制约了规模化制备的可行性[133-137]。为突破这一限制，科研人员相继开发了多种创新性解决方案，如将胱氨酸置换为二氨基二酸[138-149]，小分子、紫外和钯相结合的方法[150]，以及分子伴侣GroEL/ES 辅助的蛋白质折叠策略[151]。尽管这些方法显著提升了蛋白质折叠效率，但在处理某些富含二硫键的蛋白质如铁调素时，其折叠收率仍然不理想[152-153]，白细胞介素-5（IL-5）甚至在体外条件下无法正确折叠[154-155]。

针对这一技术难题，Liu等[156]创新性地提出了可移除的糖基化修饰（RGM）（图式19）。该策略的核心在于通过SPPS在丝氨酸/苏氨酸位点引入β-N-乙酰葡萄糖胺（O-GlcNAc）基团，利用糖基化修饰的空间位阻效应和亲水性特征，引导富含二硫键的蛋白质实现高效正确的三维折叠。特别值得注意的是，这些O-GlcNAc基团在蛋白质折叠完成后可以被O-乙酰氨基葡萄糖苷酶（OGA）高效移除，从而大幅提升合成效率和产物产率。

2022年， RGM策略成功被应用于L-型铁调素和IL-5这两种重要生物活性蛋白的合成。以铁调素的合成为例，他们首先通过SPPS分别一次性合成了Ser17位O-GlcNAc修饰的铁调素多肽以及未修饰的对照多肽（图式20）。然后将两条多肽在含有尿素、EDTA、谷胱甘肽（GSH）、氧化型谷胱甘肽（GSSG）和磷酸盐缓冲液的条件下进行蛋白质折叠。结果表明，糖基化修饰的铁调素多肽在这一过程中迅速氧化折叠，形成了具有4个二硫键的折叠产物，产率达到了56%。相比之下，未修饰的铁调素多肽在同一条件下折叠效率较低，未能正确形成二硫键结构。通过OGA处理，糖基化的铁调素折叠产物在6 h内完全去除糖基化并转化为目标产物。随后通过DQF-COSY、TOCSY和NOESY二维核磁谱证实了铁调素的正确折叠和二硫键的正确配对。RGM策略具有操作简单、实用和成本效益高的特点，在应用RGM策略时，O-GlcNAc基团的安装位置应选择在蛋白质环上或蛋白质的溶剂暴露表面，以最小化对蛋白质结构的潜在干扰。

2024年，Zheng等[157]成功将RGM策略拓展至镜像蛋白质合成领域（图式21）。在D-铁调素模型验证的基础上，该团队进一步合成了D-肿瘤坏死因子α（D-TNFα）同源三聚体和D-奥密克戎刺突蛋白的受体结合域（D-RBD）这两个更具挑战性的目标。以D-TNFα的合成为例，首先通过片段合成和NCL连接，成功获得了带有O-GlcNAc修饰的全长D-TNFα。随后，经过氧化及三聚体组装，得到了D-TNFα同源三聚体。最后采用L-OGA 酶处理该蛋白，成功完成去糖基化，获得高纯度的目标产物。随后他们采用相同的合成路径，成功制备了正确折叠的D- RBD，并展示出与L-肽抑制剂L-covid3高亲和结合的能力。这些成果凸显了RGM策略在促进D-蛋白质合成和折叠中的实用性，为D-蛋白质的高效制备提供了一种简便可靠的途径。这一策略有望加速D-蛋白质在镜像诊断和治疗、消旋蛋白晶体学分析以及镜像生命构建等前沿领域的广泛应用。

4 结论与展望

蛋白质化学合成作为体外合成蛋白质的强大工具，在生物医学研究和药物开发中发挥着至关重要的作用。它突破了传统分子生物学的限制，使科学家能够通过精心设计，对蛋白质分子进行定制化的结构改造，从而制备出在生物体中难以表达的蛋白质，如膜蛋白[158]、镜像蛋白[159-160]以及那些含有非天然氨基酸或翻译后修饰[161-167]的蛋白质。化学合成的蛋白质不仅使研究人员能够深入研究蛋白质的生物活性和功能，还为疾病治疗、疫苗开发、药物筛选以及结构生物学的研究提供了强有力的支持[168-169]。

本综述深入总结了蛋白质化学合成中可逆化学修饰策略的最新发展，为解决疏水蛋白和难复性蛋白的合成提供了有效的解决方案。通过在多肽链的侧链或骨架上引入可逆修饰标签，提升了这些具有挑战性蛋白质的合成效率和溶解性，还促进了难复性多肽在连接后的正确折叠。此外，这些修饰基团在合成后能够被移除，确保了目标蛋白质的生物活性和结构完整性。

尽管可逆化学修饰策略在蛋白质化学合成领域取得了显著进展，但仍面临诸多挑战。例如，一些可逆修饰标签的合成过程复杂、产率低，这限制了它们的广泛应用。还有许多已开发的可逆标签缺乏普适性，在实际应用过程中操作繁琐。另外，一些标签的移除过程使用的试剂可能较为剧烈，增加了副产物的生成风险。未来的研究应着重于以下几个方面：首先，开发新的可逆修饰标签，提高其产率和合成效率，简化操作步骤，以提高这些标签在实际应用中的普适性。其次，开发的标签移除过程应该温和且高效，以减少副产物的生成，从而保证目标蛋白质的高纯度和生物活性；此外，还需探索和设计新型商业化的可逆修饰标签，以提高合成效率和规模化生产的可能性，从而降低成本，推动蛋白质化学合成在工业应用中的可行性；最后，利用化学合成的蛋白质作为工具，深入研究蛋白质的功能和作用机制，以及D-蛋白质在镜像医学中的潜在应用，为疾病治疗和药物开发提供新的视角和策略。

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基金资助

国家自然科学基金项目(22277020)

国家自然科学基金项目(22227810)

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