合成生物学驱动的甜味蛋白创新生产

刘倩; 彭梓昌; 王雅梦; 耿瑶; 任晓敏; 夏小乐

doi:10.7536/PC241215

化学进展 ›› 2025, Vol. 37 ›› Issue (8) :1131-1141 DOI: 10.7536/PC241215

综述与评论

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合成生物学驱动的甜味蛋白创新生产

刘倩 ¹ ,
彭梓昌 ¹ ,
王雅梦 ¹ ,
耿瑶 ¹ ,
任晓敏 ¹ ,
夏小乐 ¹^,²^,^*

作者信息 +

Advancing Production of Sweet-Tasting Proteins Driven by Synthetic Biology

Qian Liu ¹ ,
Zichang Peng ¹ ,
Yameng Wang ¹ ,
Yao Geng ¹ ,
Xiaomin Ren ¹ ,
Xiaole Xia ¹^,²^,^*

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文章历史 +

摘要

甜味蛋白凭借其低热量、高甜度属性，在食品工业中展现出巨大潜力，不仅能够满足消费者对于健康、安全甜味剂的需求，还有望替代传统高热量甜味剂，推动食品工业创新。然而，其商业化进程仍面临原料产地限制、产量低、提取成本高、稳定性差等挑战。本文综述了甜味蛋白的基本特性，探讨了其呈味机制以及结构与甜味活性之间的关系；并提出通过合成生物学和人工智能等手段对甜味蛋白及宿主进行精准设计与改造，从而提高其甜度、稳定性和产量；同时，通过优化宿主、表达与分泌策略以及发酵过程精准控制，进一步提升甜味蛋白的产量和活性。这为解决甜味蛋白商业化应用中存在的问题提供了理论依据和技术参考，对于推动甜味蛋白在食品工业中的广泛应用具有积极意义。

Abstract

Sweet-tasting proteins，characterized by their low calorie and high sweetness attributes，demonstrate significant potential in the food industry. They not only satisfy the demand of consumers for healthy and safe sweeteners but also have the potential to replace traditional high-calorie sweeteners，thus driving innovation in the food industry. However，their commercialization process still faces challenges such as restrictions on the origin of raw materials，low yield，high extraction costs，and poor stability. In this review，the basic characteristics of sweet-tasting proteins were examined，their taste mechanisms and the relationship between their structure and sweet taste activity were investigated. Precise design and modification of sweet-tasting proteins and host through synthetic biology and artificial intelligence methods to enhance their sweetness，stability and yield were proposed. Additionally，optimizing host，expression and secretion strategies，as well as precise control of the fermentation process，can further improve the yield and activity of sweet-tasting proteins. These approaches provide a theoretical basis and technical references for addressing the existing problems in the commercial application of sweet-tasting proteins and have positive implications for promoting their widespread use in the food industry.

Contents

1 Introduction

2 Taste mechanism and structure-function relationship

2.1 Recognition and signal transduction of sweet taste receptors

2.2 Structure-function relationship analysis

3 Customized optimization and production strategies

3.1 Protein precision design and modification

3.2 Optimization of strategies for host cell selection

3.3 Optimization of expression and secretion strategies

3.4 Precise control and optimization of the fermentation process

4 Conclusion and outlook

Graphical abstract

关键词

甜味蛋白 / 呈味机制 / 合成生物学 / 人工智能 / 创新生产

Key words

sweet-tasting proteins / taste mechanisms / synthetic biology / artificial intelligence / advancing production

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刘倩, 彭梓昌, 王雅梦, 耿瑶, 任晓敏, 夏小乐. 合成生物学驱动的甜味蛋白创新生产[J]. 化学进展, 2025, 37(8): 1131-1141 DOI:10.7536/PC241215

Qian Liu, Zichang Peng, Yameng Wang, Yao Geng, Xiaomin Ren, Xiaole Xia. Advancing Production of Sweet-Tasting Proteins Driven by Synthetic Biology[J]. Progress in Chemistry, 2025, 37(8): 1131-1141 DOI:10.7536/PC241215

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1 引言

随着全球健康意识的显著提升，消费者对于食品的选择日益倾向于低热量、高甜度且健康无害的选项。这一趋势不仅推动了食品工业的革新，也加速了低热量甜味剂市场的蓬勃发展^[1]。传统的人工合成甜味剂，如阿斯巴甜、安赛蜜、糖精、纽甜和三氯蔗糖等，尽管因其高甜度和低成本而一度成为市场主流，但其安全性问题日益凸显^[2]，包括潜在的肥胖风险、代谢综合征、心血管疾病和2型糖尿病等健康隐患^[3]，引发了公众和科学界的广泛关注和担忧。

在此背景下，天然甜味剂，尤其是甜味蛋白，以其独特的优势成为食品工业的新宠^[4-5]。相较于人工甜味剂，甜味蛋白不仅具备更高的甜度、极低的热量含量，其代谢路径清晰、安全性高，而且展现出甜味“可编程”的巨大潜力，即通过结构修饰和理性设计，可以定制化调整其甜味特性，满足消费者日益多样化的口味需求^[6]。截至目前，已经发现的甜味蛋白和甜味修饰蛋白一共8种，包括索马甜（Thaumatin）^[7]、布那珍（Brazzein）^[8]、莫内林（Monellin）^[9]、仙茅蛋白（Curculin）^[10]、马槟榔蛋白（Mabinlin）^[11]、培它丁（Pentadin）^[12]、神秘果甜蛋白（Miraculin）^[13]和新果甜蛋白（Neoculin）^[14]。其中，从非洲植物中提取的Thaumatin已于2014年被中国批准在食品中应用，美国甜味蛋白公司Oobli通过精密发酵获得的Brazzein和Monellin也已获得美国食品药品管理局（Food and drug administration，FDA）许可。甚至新型蛋白设计公司Amai Proteins通过人工智能优化获得的甜味蛋白sweelin也已获得包括自认的一般认为安全（Generally recognized as safe，GRAS）和食品香料与萃取物制造者协会（Flavour extract manufactures association，FEMA）的GRAS在内的多项监管部门的批准。

然而，尽管甜味蛋白展现出广阔的应用前景，其商业化进程仍面临原料产地限制、产量低、提取成本高、稳定性差等诸多挑战。因此，本文在综述甜味蛋白基本特性的基础上，将深入剖析其呈味机制与结构特征，以期更好地理解甜味蛋白的功能特性。同时，重点关注其定制化优化与生产策略的探索，包括通过精准设计改造提升甜味特性和生产效率、优化基因表达系统以及精确控制发酵过程提高产量。这些策略的实施将为甜味蛋白的深入研究与产业化应用提供坚实的理论基础和技术支撑，推动其在食品工业中的广泛应用。

2 呈味机制与结构-功能关系

甜味感知，作为哺乳动物味觉系统的重要组成部分，是一个涉及多重分子与细胞交互的复杂过程，其核心在于舌头及软腭上味蕾细胞对甜味分子的感知以及信号的传导。深入探讨甜味蛋白与甜味受体间的相互作用机制可以更好地理解味觉系统的工作原理，为开发新型甜味蛋白提供理论参考和实践指导。

2.1 甜味受体的识别和信号转导

甜味感知始于甜味分子与味蕾细胞膜上受体的结合，该结合触发细胞内信号分子的级联反应。最终通过感觉神经将电化学信号传递至大脑，形成甜味感觉（图1）^[15-16]。

甜味受体的核心结构由T1Rs亚基的两个异二聚体T1R2和T1R3构成，它们作为关键的G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptor，GPCRs），负责识别并结合甜味物质^[17-18]。这些受体亚基具有独特的结构特征，包括一个大的（55 kDa）N端捕蝇草结构域（VFTD），该结构域通过一个短的富含半胱氨酸的结构域（CRD）与一个C端七跨膜结构域（TMD）相连（图1）^[20]。值得注意的是，不同的甜味物质被甜味受体的不同区域特异性地识别。然而，尽管甜味蛋白与甜味受体之间的相互作用至关重要，但它们结合后的精确空间结构还未得到解析，并且其相互作用的确切机制尚未完全阐明^[21]。幸运的是，青鳉鱼细胞外配体结合域^[22]、果蝇^[23]和昆虫^[24]的甜味受体的三级结构已被逐一揭示，为进一步阐释甜味蛋白与甜味受体之间的相互作用机制提供了宝贵的结构和功能信息。

甜味蛋白结合并激活Ⅱ型味蕾中的T1R2/T1R3异二聚体后，信号通过GPCR-Gβγ-IP3通路传递（图1）^[25]。甜味蛋白首先与异二聚体G蛋白（α-味觉素、Gβ3和Gγ13）偶联，激活G蛋白并导致Gβ3/Gγ13异二聚体的分离。随后，这一变化刺激磷酯酶Cβ2（Phospholipase Cβ2，PLCβ2）水解磷脂酰肌醇4，5-二磷酸酯（Phosphatidylinositol 4，5-bisphosphate，P1P2）生成1，4，5-三磷酸酯（1，4，5-trisphosphate，IP3）和二酰甘油（Diacylglycerol，DAG）^[19]。IP3进一步激活Ⅲ型IP3受体（type Ⅲ IP3 receptor，IP3R3），诱导内质网（Endoplasmic reticulum，ER）释放钙离子，从而触发一系列后续反应^[26]。细胞内钙水平的升高可触发瞬时受体电位通道（TRPM5）的开放，导致味蕾细胞（Taste receptor cell，TRC）去极化，随后释放神经递质^[27]。最终，释放的神经递质会刺激传入神经，在大脑的味觉皮层产生与甜味相对应的电信号，身体感知甜味，并响应甜味刺激，引发一系列生理反应和行为反馈。

值得注意的是，除了上述经典的GPCR-Gβγ-IP3通路外，还存在其他甜味感知途径。例如，gustducin基因敲除小鼠可以感知甜味，表明存在额外的甜味感知途径。有研究表明，甜味受体可能激活cAMP依赖性通路，产生较长时间的甜味感觉，而PLC-β2通路可能诱导短时间感知^[19,28-29]。α-味觉素还可以通过激活磷酸二酯酶（Phosphodiesterase，PDE）、抑制磷酸化和Ca²⁺信号效应物脱敏来调节cAMP水平^[19]。并且人类的舌头在结构上和功能上均存在个体差异，而味觉受体的遗传变异则会进一步影响人们对甜味的感觉和甜味剂的摄入偏好^[30]。

2.2 结构-功能关系分析

甜味蛋白与甜味受体间的相互作用是甜味感知机制中的关键环节。近年来，随着结构生物学和分子生物学的快速发展，多种甜味蛋白的结构得以解析，为揭示甜味蛋白与甜味受体之间的相互作用机制提供了宝贵的结构信息。目前，已有多种甜味蛋白的结构得到一定程度的解析，包括Thaumatin（PDB ID：1LR2、PDB ID：3AOK）^[31-32]、Brazzein（PDB ID：2BRZ）^[33]、Monellin（PDB ID：1MOL）^[34]、Curculin（PDB ID：2DPF）^[10]、Mabinlin（PDB ID：2DS2）^[11]、Miraculin（UniProt ID：P13087）和Neoculin（PDB ID：2D04）（图2）^[35]。

目前Thaumatin、Monellin和Brazzein是三大热门研究对象。尽管它们在分子结构上各具特色，缺乏直接的相似性，且与Neoculin均不是通过“甜味指”（Sweet finger）机制来实现其味觉活性^[35-37]，但对于揭示它们与甜味受体蛋白相互作用机制的热情从未减退^[38]。为了深入揭示甜味蛋白与甜味受体蛋白之间的相互作用，科学家们提出了多种理论模型，其中最能揭示甜味蛋白与甜味受体相互作用的可能性的模型是所谓的“楔形模型”^[39-40]。该模型是在mGlu受体模板上构建的T1R2/T1R3受体模型基础上，通过计算机对接研究得出的。它揭示了一种普遍的相互作用机制，即甜味蛋白表面相当大面积的正电荷密度与受体上的互补电荷斑块结合，从而稳定受体的活性构象^[41-42]。进一步的研究为“楔形模型”提供了有力的实验支持。例如，对Monellin单链衍生物MNEI和Brazzein的突变研究表明，更甜的突变体往往与正电荷增加有关^[43-44]。

甜味蛋白的呈味机制还与特定的化学基团密切相关，如二硫键和巯基。Iyengar等^[45]的研究表明，当Thaumatin中的二硫键缺失时，会导致其甜度丧失。类似地，Brazzein中4个二硫键的破坏也会引发甜味消失，进一步证实了二硫键在维持甜味蛋白稳定性和甜味方面的重要性。此外，二硫键还被认为是蛋白质在高温和酸碱环境下保持稳定的关键因素^[46]。Cagan等^[47]则发现，改变Monellin的巯基可以破坏其3D结构，导致甜味丧失，表明巯基在维持甜味蛋白的空间构象和甜味特性方面同样起着不可或缺的作用。

除了化学基团外，甜味蛋白的局部构象和柔韧性在增强甜味方面也发挥着关键作用。Thaumatin等甜味蛋白的关键残基附近的侧链的柔性构象被认为是增强甜味的因素之一。例如，Thaumatin Ⅱ的67位和82位的残基侧链表现出高度柔性，这些柔性构象被认为适合诱导甜味。此外，Thaumatin Ⅰ超甜突变体D21N中21位侧链的相对B因子高于野生型，并且仅在突变体中观察到Lys19的替代构象，这进一步表明19位和21位附近的柔性构象在甜度增强中起重要作用^[48]。另一方面，Brazzein突变体D40K通过消除野生型中残基Gln46和Asp40侧链之间的氢键，增加了蛋白柔韧性，从而使得甜味强度达到野生型的3倍^[49]。然而，当在残基18和19之间插入两个残基时，形成的突变体ins₁₈RI₁₉甜味丧失。这可能是由于其Loop9~19内的Arg-Ile插入导致该环扭曲，使得相邻位点僵硬并失去灵活性，从而影响了甜味的产生^[49]。

对于某些仅在酸性条件下产生甜味的甜味修饰蛋白，如Miraculin和Neoculin，组氨酸在味觉修饰活性中扮演着重要角色^[50]。当Miraculin中30位和60位的丙氨酸被组氨酸替代时，其调节pH产生甜味的能力丧失^[51]。并且，当Neoculin变体中的所有5个组氨酸残基都被丙氨酸取代后，在中性和酸性pH下都会产生强烈的甜味，但没有味觉调节活性^[52]。进一步研究发现，Neoculin碱性亚基（Neoculin basic subunit，NBS）中的His11是引发味觉改变的主要pH感受器。此外，NBS的11位需要芳香族氨基酸（如Phe和Tyr）才能引发pH依赖性活性^[52]。这些发现揭示了组氨酸在酸甜味转换和味觉调节中的关键作用。

3 定制化优化和生产策略

虽然甜味蛋白作为一种新型甜味剂，因低热量、高甜度等特性而备受瞩目。然而，其生产效率与甜味特性和稳定性的优化仍面临诸多挑战。在当今合成生物学技术迅猛发展的前景下，定制化优化与生物制造策略成为提升甜味蛋白生产效率与品质的关键途径。通过蛋白精准设计改造、宿主的选择、表达与分泌优化以及发酵过程精准控制，不仅有助于改善甜味蛋白的特性与生物合成途径，更为甜味蛋白的工业化生产提供了有力的技术支持与创新思路（表1）。

3.1 蛋白质精准设计与改造

针对甜味蛋白的精准设计与改造，是当前提升甜味蛋白性能的重要手段。通过合成生物学、蛋白质工程等手段，结合计算机模拟或人工智能辅助设计，对甜味蛋白进行改造和优化，提高其甜度、稳定性，降低生产成本，是未来的重要研究方向。

在甜味改善方面，主要是基于“楔形模型”理论，通过消除负电荷残基或增加正电荷残基的策略，优化其与甜味蛋白的相互作用，提升甜味蛋白的甜度^[53-54]。Masuda等^[55]针对Thaumatin进行定点突变，选择Asp21位点作为目标，将原本带负电荷的D突变为N，从而获得了超甜突变体D21N，甜度约提升1.65倍。而Esposito等^[56]针对单链Monellin进行了改造，通过将中性残基Y替换为碱性残基R，将甜度增加至原始甜度的1.67倍。Thaumatin突变体D21N和单链Monellin突变体Y65R，是迄今为止已知两种最甜的蛋白质。这一电荷调控策略在Brazzein的改造中得到了进一步验证。Lee等^[44]通过分别减少负电荷和增加正电荷的策略，成功获得了甜度显著提升的Brazzein突变体。特别是增加正电荷的双突变体H31R/E36D，其甜度大约是减少负电荷的双突变体E36D/E41A的2.5倍，说明增加正电荷的效果优于减少负电荷的效果，为进一步优化甜味蛋白的甜度提供了参考。

甜味蛋白在加热和储存过程中往往面临热稳定性不足的问题，限制了其在食品中的应用。甜味蛋白复杂的三维结构和特定的氨基酸序列，对其热稳定性和甜味活性至关重要。例如，Brazzein含有4个分子内二硫键，并且氢-氘交换偶联质谱分析表明，4个二硫键中的Cys16-Cys37对于蛋白质的热稳定性和甜度活性起着重要的作用^[57]。传统的基于随机突变提高蛋白热稳定性的方法不仅成本高昂，而且效率低下，往往难以精准定位到对稳定性有实质性贡献的氨基酸位点^[58]。近年来，通过准确性相对较高和高通量筛选成本较低廉的计算机模拟方法，提高蛋白质稳定性的方法越来越受到关注。Tang等^[59]针对Brazzein、Curculin、Monellin和Thaumatin四种甜味蛋白进行饱和突变，并结合FoldX算法预测分析热稳定性，认为将带负电荷的残基突变为其他不带负电荷的氨基酸是提高甜味蛋白质热稳定性的有效方法。Liu等^[60]聚焦于单链Monellin，同样采用饱和突变策略，并利用PyRosetta预测筛选具有高热稳定性的突变体，最终通过实验验证获得4种热稳定性至少提高20℃的突变体，它们在碱性、酸性和中性环境中表现出卓越的稳定性。

随着人工智能技术的快速发展，未来有望通过深度学习、机器学习等算法精准设计突变体，开发更多具有高甜度和高热稳定性的甜味蛋白（图3）。Chua等^[61]利用蛋白质语言模型设计获得了具有改进热稳定性和潜在更高甜度的新型Brazzein同源物。Amai Proteins公司已经通过Pro-Design AI-CPD（计算蛋白质设计）、Pro-Planet微生物精确发酵和Pro-Taste食品技术获得110 ℃处理10 min后仍然保持稳定的甜味蛋白sweelin。而人工智能驱动的蛋白质制造商Shiru与味之素公司正在布局通过Flourish AI平台设计生产具有强稳定性的甜味蛋白。但在上市批准方面仍存在一些挑战和障碍，其作为新型食品添加剂，需要通过严格的安全性评估，包括毒理学测试、过敏性评价等，这一过程耗时较长。

3.2 宿主细胞优选策略

目前，已经开发了多种生物系统实现蛋白质的异源表达，包括细菌^[8,62]、酵母^[63]、哺乳动物^[64]和植物^[65-66]等。其中，微生物系统，特别是细菌和酵母，具有生长迅速、易于培养、遗传操作简便以及遗传背景清晰等特点，使其成为异源表达甜味蛋白的理想选择。

3.2.1 细菌

在细菌系统中，大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）是最常用的表达宿主^[67-68]。但大肠杆菌在生产具有二硫键和复杂折叠结构的蛋白质，尤其是甜味蛋白时，却面临着严峻挑战。大肠杆菌缺乏糖基化等翻译后修饰系统，导致无法生产修饰蛋白质，且表达的甜味蛋白通常以不溶性包涵体的形式存在，从而丧失了甜味活性^[69-70]。此外，大肠杆菌高细胞密度培养过程中会产生大量对细胞有毒的乙酸盐，这不仅抑制了细胞的生长和蛋白质的表达，还增加了后续纯化的难度和成本^[68]。为了克服这些局限性，研究者们已经开发了一系列优化策略。其中，通过降低诱导温度的方法被证明能有效增加可溶性Brazzein蛋白的表达量，将诱导温度从37℃降低至30℃，可溶性蛋白的表达量可提升约4.37倍^[70]，并且还可以利用还原/氧化谷胱甘肽系统来复性包涵体中的Thaumatin Ⅱ蛋白^[69]。

除了大肠杆菌外，其他细菌在蛋白质表达方面也有各自的特点和限制。乳酸乳杆菌（Lactococcus lactis，L. lactis）生产甜味蛋白的研究较少，目前仅实现了Brazzein、Monellin衍生物（MNEI）以及Mabinlin Ⅱ三种甜味蛋白的异源表达，但表达量过低^[71-73]。随着针对乳酸乳杆菌遗传操作工具的深入研究和开发，通过菌株改造以及发酵条件的优化，有可能提高甜味蛋白的表达量。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）在生产含有二硫键的蛋白质时，蛋白质的分泌受到限制。地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）最近被认为是细胞外异源蛋白表达的新型宿主，具有分泌能力强、生长快、成本效益高等优点^[74]，但在甜味蛋白表达中的应用仍有待探索。

3.2.2 真菌

目前大量的研究利用曲霉菌如泡盛曲霉（Aspergillus awamori，A. awamori）和黑曲霉（Aspergillus niger）等进行生物生产^[75-78]。但由于曲霉菌生长复杂，酵母等物种在蛋白质异源表达方面更具有优势。

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，S. cerevisiae）是一种广泛应用的真核生物表达系统，其能够高效地进行蛋白质翻译后修饰，这对于生产具有复杂结构的甜味蛋白至关重要^[79-80]。但酿酒酵母难于高密度培养、分泌效率低，也不能使所表达的外源蛋白质正确糖基化，而且表达蛋白质的C端往往被截短，这限制了其在甜味蛋白生产中的应用^[81]。

相比之下，毕赤酵母（Pichia pastoris，P. pastoris）在甜味蛋白异源表达领域展现出显著优势。P. pastoris不仅拥有丰富的诱导型和组成型启动子库，为调控基因表达水平、优化生产工艺提供了更多选择^[82]，而且能够在高细胞密度下培养，可显著提高生产效率。此外，P. pastoris具备出色的翻译后修饰能力，能够正确地进行蛋白质折叠、二硫键形成以及糖基化等复杂化过程，这对于保持甜味蛋白的甜味活性和稳定性至关重要。P. pastoris还表现出高效的外源蛋白分泌特性，使得产物易于分离纯化。目前，在P. pastoris中已经实现了Thaumatin^[83]、Brazzein^[84]和Monellin^[85-86]的高效表达和生产，其中Monellin的最大表达滴度可达2.45 g/L，充分展示了P. pastoris在甜味蛋白生产方面的潜力^[85]。然而，P. pastoris在食品应用方面存在一定的安全隐患，主要是其诱导表达系统中甲醇的使用可能带来的毒性问题。

其他非传统酵母，如乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis，K. lactis）^[87]、解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica，Y. lipolytica）^[88]、多形汉逊酵母（Hansenula polymorpha，H. polymorpha）^[89]以及博伊丁假丝酵母（Candida boidinii，C. boidinii）^[90]等，也可能是实现甜味蛋白有效生产的潜在选择^[91]。例如，K. lactis已经实现了Thaumatin Ⅱ和Brazzein的表达，虽然Thaumatin Ⅱ的分泌效率较低，但Brazzein能够以可溶形式表达，产量可达135 mg/L^[92-93]。H. polymorpha则已被广泛用于生产商业上可用的蛋白质。这些非传统酵母的研究和发展，为甜味蛋白的异源表达提供了更多的选择和可能性。

3.3 优化表达与分泌策略

P. pastoris是目前最成熟的甜味蛋白表达体系，其强大的表达和分泌能力使其成为异源蛋白生产的首选平台，本节的甜味蛋白异源表达合成策略主要围绕P. pastoris进行讨论。

3.3.1 高效基因整合工具的开发

游离质粒在P. pastoris系统中无法稳定存在，极易丢失，因此外源基因的稳定整合与高效表达是实现工业化生产的关键。现在甜味蛋白基因的整合多依赖于线性化载体与基因组的同源重组，包括pPICZαA^[85]、pPICZαB^[94-95]、pPIC6αA^[83]、pPIC9^[63]和pPpT4_Alpha_S^[84]等，但这种方法往往效率低下。并且在面临DNA双链断裂时，细胞通常会优先选择非同源末端连接作为修复途径。为了提高同源重组频率，需敲除参与非同源末端连接的KU70或KU80同源编码蛋白^[96]。

为了提高基因编辑效率，已经开发了针对P. pastoris的CRISPR-Cas9系统，通过对同源重组修复途径关键基因PpRAD52进行过表达，可将敲除效率提高54倍以上^[97]；进而，结合解旋酶基因MPH1的敲除，可将同时组装多个片段的能力提高13.5倍，将多个基因盒同时整合到基因组中^[97-98]，进一步提高了基因整合的灵活性和效率。Cai等^[97]鉴定了46个用于稳定基因表达的基因组整合位点，为进行精准、高效的基因整合提供了宝贵的资源。

3.3.2 甜味蛋白的高效表达策略

基因拷贝数和密码子偏好性显著影响外源基因的表达效率。高拷贝数似乎有利于基因的强表达，但基因拷贝数和蛋白质产量之间并不总是呈现直接的线性相关性，特别是对于重组蛋白的分泌生产而言^[99]。Masuda等^[83]通过利用3拷贝的Thaumatin Ⅰ基因，成功实现了Thaumatin Ⅰ的高产，达到100 mg/L的产量。通过优化同义密码子的使用以更好地匹配宿主生物的密码子，可以提高异源基因的翻译效率。密码子优化已成为改善异源基因表达的标准化工具。在Thaumatin、Brazzein和Monellin等异源表达的研究中，大多数都采用了密码子优化的策略^[87,100-101]。

高效转录是基因表达调控的关键阶段。稳健且受调控的启动子是提高蛋白合成水平不可或缺的工具^[102]。在P. pastoris中，甲醇诱导的醇氧化酶1基因（Alcohol oxidase 1，AOX1）启动子因其强效且严格的调控特性被广泛采用。AOX1启动子在驱动甜味蛋白如Thaumatin^[83]、Brazzein^[84]和Monellin^[85]的高产表达中发挥了重要作用。但有毒且易燃的甲醇的使用，给食品安全和工业生产安全带来了潜在的威胁。因此，寻找更为安全、高效的启动子对于甜味蛋白的高效表达至关重要。通过随机诱变等工程手段，甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因（Glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase）启动子GAP已被成功改造，获得了具有严格转录调控能力的启动子^[103]。计算机辅助设计及人工智能技术，为启动子工程的快速发展注入了新的活力，已被应用于大肠杆菌和酿酒酵母中（图4）。例如，Kotopka等^[104]开发了卷积神经网络（Convolutional neural networks，CNNs）模型用于预测酵母启动子文库中的启动子活性。这些方法的引入，为P. pastoris中甜味蛋白基因高效转录的实现提供了有力支持，也为未来开发更多性能优异、安全性更高的启动子奠定了坚实基础。

3.3.3 翻译后修饰和分泌

P. pastoris强大的分泌能力对于增强甜味蛋白的表达以及简化分离纯化过程具有重要意义。经过转录和翻译后，多肽通过易位进入内质网。分子伴侣协助蛋白折叠和修饰，如二硫键形成和中心糖链的添加，确保结构的正确性和稳定性。随后，蛋白质前体通过膜囊泡运输到高尔基体，并进行进一步的加工和修饰，如糖链延伸。最后，成熟和有活性的蛋白质通过膜囊泡运输出细胞或运输到细胞表面（图5）^[105]。但是，蛋白质的分泌可能因分泌效率低、翻译后修饰异常、在分泌途径或细胞壁空间中以细胞相关形式滞留而受到阻碍。因此，对蛋白质分泌途径进行改造，对于提高甜味蛋白的产量和活性具有重要意义。

分泌蛋白通过共翻译或翻译后易位进入内质网腔，是分泌途径的起始环节。在共翻译易位中，新合成蛋白质的信号肽在翻译过程中从核糖体中出来时被信号识别颗粒识别，并引导至内质网膜，从而启动蛋白质的易位过程^[106]。因此，信号肽的效率是决定分泌蛋白最终产量的关键因素之一。为了提高异源蛋白质的分泌效率，酿酒酵母的α交配因子蛋白的前原前导序列常被用作异源蛋白质的信号序列，并已被用于Thaumatin、Brazzein和Monellin的生物制造^[63,83,107]。研究表明，去除N连接糖基化位点的预原前导序列比原始序列更能增强分泌^[108]。Neiers等^[84]比较了7种不同的信号肽对于P. pastoris中Brazzein高效分泌的影响，最后利用来源于红原鸡（Gallus gallus）的Lysozyme信号肽实现了345 mg/L的产量。

在内质网中，正确的蛋白质折叠对于蛋白质进入分泌途径至关重要^[109]。新生肽的错误折叠或分泌蛋白的超载会增加管腔负担，从而导致内质网应激，进而激活未折叠蛋白反应^[110]。通过过度表达蛋白质折叠因子（分子伴侣）和酶可增加目标蛋白质的分泌能力。对于含有多个二硫键的甜味蛋白（如Thaumatin和Brazzein）而言，二硫键的形成是分泌过程中的关键限速步骤。蛋白质二硫键异构酶（Protein disulfide isomerase，PDI）作为参与二硫键形成的关键酶，在甜味蛋白的正确折叠和减少其不溶性表达方面发挥着重要作用。通过将分子伴侣PDI过表达，可以将Thaumatin I的产量提高2倍以上^[100]。

3.4 发酵过程精准控制及优化

P. pastoris的高细胞密度发酵，基本包括两个阶段：细胞生长期，通过使用甘油作为碳源实现高细胞密度培养；连续甲醇诱导期，通过补料甲醇启动重组蛋白表达。发酵优化是提高甜味蛋白生产效率和降低成本的重要手段。通过调整发酵过程中的关键参数，可以显著影响微生物的生长速率、代谢途径以及产物积累。例如，Joseph等^[95]在2022年通过优化培养温度和pH，在P. pastoris中实现了62.79 mg/L的Thaumatin Ⅱ产量；2023年通过在BMGY培养基中添加维生素，将Thaumatin Ⅱ的产量提升至68.60 mg/L^[94]。通过实时监测和自动化控制系统，实现对发酵过程的精确控制，对于提高蛋白质表达水平也具有重要意义（图6）。Jia等^[85]提出在线甲醇/山梨醇共流加策略，通过控制足够的DO，减弱甲醇代谢通量至甲醇异化途径，最终实现了2.45 g/L的Monellin的最大滴度。并且人工智能的发展为精准发酵提供了新的解决方案。美国智能连续发酵技术公司Pow.Bio开发了人工智能驱动的连续发酵平台，将人工智能控制的自动化发酵软件SOFe与创新的硬件系统集成，可将原料的生产率提高5~10倍。

4 结论与展望

本文系统综述了甜味蛋白的基本特性、呈味机制及其与结构和功能的关系，为甜味蛋白的定制化优化与生产提供了理论基础。基于合成生物学的甜味蛋白定制化优化与生产策略，包括精准设计与改造甜味蛋白、提升蛋白表达和分泌效率、优化发酵条件，虽然一定程度上实现了甜味蛋白的初步表达和生产，但距离商业化应用仍有很大空间。

随着合成生物学、蛋白质工程、计算机模拟及人工智能等领域的持续进步，将为甜味蛋白的研发和生产带来前所未有的机遇。利用高通量筛选、计算机辅助设计和人工智能技术，发现更多具有优良性质的甜味蛋白，并通过精准改造提升其甜味特性和稳定性。通过进一步优化蛋白质表达分泌能力和发酵工艺，提高甜味蛋白的产量和降低成本，以满足大规模工业化生产的需求。

值得注意的是，经过设计改造并通过异源表达生产的甜味蛋白，在上市之前还面临一系列的法规批准问题，包括但不限于安全性评估、功能性验证、上市审批以及知识产权保护等多个方面。研发和生产者需密切关注相关法规变化，加强与监管机构的沟通与协作，以确保甜味蛋白产品的合规性和市场竞争力。

总之，甜味蛋白的研发与生产是一个充满挑战与机遇的领域。随着技术的不断进步和法规的逐渐完善，甜味蛋白将在食品工业中发挥越来越重要的作用，为消费者提供更加健康、安全、高效甜味剂的选择。

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